Ο ρόλος της οξειδάσης της ξανθίνης στην οξειδοαναγωγική κατάσταση κατά την άσκηση Αριστείδης Σ. Βεσκούκης, PhD Βιοχημικός - Βιοτεχνολόγος Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών 11o Επιστημονικό Σεμινάριο ΙΣΑΑ ΚΕΤΕΑΘ Τρίκαλα, 24 Νοεμβρίου 2010
Ελεύθερες ρίζες και οξειδωτικό στρες Άτομο ή μόρια, με ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική στιβάδα και με δυνατότητα αυτοδύναμης ύπαρξης Οξειδωτικό στρες Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί Ελεύθερες ρίζες
Αντιοξειδωτικά Αντιοξειδωτικό Ελεύθερες ρίζες Ελεύθερες ρίζες
Ενζυμικοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX): GSH + R GSSG + R καταλάση (CAT): 2H 2 O 2 Ο 2 + Η 2 Ο υπεροξειδική δισμουτάση (SOD): 2Ο 2 - + 2H + H 2 O 2 + O 2 Κυριότεροι αντιοξειδωτικοί μεταβολίτες Γλουταθειόνη Ουρικό οξύ Αλβουμίνη Πολυφαινόλες
Πολυφαινόλες Αντιοξειδωτικά φυτικής προέλευσης Πολυφαινόλες Φλαβονοειδή Μη Φλαβονοειδή Φαινολικά οξέα Λιγνάνες Στιλβένια R 1 O R 1 HO OH R 2 R 3 OH R 2 O OH OH Υδροξυκινναμικά οξέα Υδροξυβενζοϊκά οξέα trans-ρεσβερατρόλη Φλαβονόλες Φλαβανόλες Φλαβόνες Φλαβανόνες Ισοφλαβόνες Ανθοκυανιδίνες
Η οξειδάση της ξανθίνης παράγει ελεύθερες ρίζες και ουρικό οξύ κατά την άσκηση NAD + + H 2 O NADH + 2H + NAD + + H 2 O NADH + 2H + XDH XDH Υποξανθίνη Ξανθίνη Ουρικό οξύ Α O 2 + H 2 O O 2 + 2H + O 2 + H 2 O O 2 + 2H + XO XO Υποξανθίνη Ξανθίνη Ουρικό οξύ
Θεμελιώδες ερευνητικό ερώτημα Οι ελεύθερες ρίζες που παράγονται κατά την άσκηση επηρεάζουν την απόδοση; Για να δωθεί απάντηση σε αυτό το ερώτημα πρέπει να αναστείλουμε την παραγωγή τους
Η αλοπουρινόλη είναι ένας χημικός αναστολέας της οξειδάσης της ξανθίνης Υποξανθίνη Ξανθίνη XO XO Αλοπουρινόλη Ξανθίνη Ουρικό οξύ
Πειραματικός σχεδιασμός του πειράματος χορήγησης αλοπουρινόλης Control Χορήγηση DMSO Αλοπουρινόλη Χορήγηση Αλοπουρινόλης Χορήγηση DMSO Αλοπουρινόλη & Χορήγηση Αλοπουρινόλης -1,5h πριν μετά 5h
Η αλοπουρινόλη χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε δόση ίση με 50mg kg -1 σωματικού βάρους των επίμυων 1,5h πριν την έναρξη του πειραματικού πρωτοκόλλου Οι επίμυες ασκήθηκαν ατομικά μέχρι εξάντλησης σε δεξαμενή με νερό θερμοκρασίας 33-36 C Στη βάση της ουράς τους προσδέθηκε σταθερό βάρος ίσο με το 4% του σωματικού τους βάρους
Αναστολή της οξειδάσης της ξανθίνης στο πλάσμα μετά από τη χορήγηση αλοπουρινόλης Οξειδάσητηςξανθίνηςστοπλάσμα(U/mL) 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 # πριν μετά 5h # Αλοπουρινόλη Αλοπ. + Άσκ. Veskoukis et al. Appl Physiol Nutr Metab. 33(6):1140-54, 2008
Η αναστολή της οξειδάσης της ξανθίνης μειώνει την απόδοση 80 Χρόνος άσκησης (min) 60 40 20 0 DMSO control Αλοπουρινόλη
Οξείδωση πρωτεϊνών και λιπιδίων Πρ. καρβονύλια στα ερυθροκύτταρα (nmol/mg Hb) TBARS στα ερυθροκύτταρα (μmol/g Hb) 10 8 6 4 2 0 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 # Αλοπουρινόλη Αλοπ. + Άσκ. πριν μετά 5h Αλοπουρινόλη # πριν μετά 5h Αλοπ. + Άσκ. Αλοπουρινόλη Αλοπ. + Άσκ.
Γλουταθειόνη A GSH στα ερυθροκύτταρα (nmol/g Hb) 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 πριν μετά 5h Αλοπουρινόλη Αλοπ. + Άσκ. Β GSSG στα ερυθροκύτταρα (μmol/g Hb) 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 # πριν μετά 5h Αλοπουρινόλη Αλοπ. + Άσκ. Γ 12 Αλοπουρινόλη GSH/GSSG στα ερυθροκύτταρα 10 8 6 4 2 # Αλοπ. + Άσκ. Αλοπουρινόλη 0 πριν μετά 5h Αλοπ. + Άσκ.
Αποτελέσματα στους άλλους ιστούς Γαστροκνήμιος μυς : Αλοπουρινόλη: Πρωτεϊνικά καρβονύλια TBARS Πρωτεϊνικά καρβονύλια TBARS TAC, GSH/GSSG Καρδιακός μυς Ήπαρ : Καταλάση : GSH Αλοπουρινόλη: Πρωτεϊνικά καρβονύλια Αλοπουρινόλη: GSH
Η αναστολή της οξειδάσης της ξανθίνης μειώνει σημαντικά την απόδοση Αναστολή οξειδάσης της ξανθίνης Μείωση παραγωγής ελευθέρων ριζών και Μείωση παραγωγής ουρικού οξέος Φαίνεται ότι η αναστολή του ουρικού οξέος συμβάλλει στην πτώση της απόδοσης
Το οξειδωτικό στρες εκτιμάται με τη μέτρηση πολλών δεικτών και ορισμένες φορές τα αποτελέσματα είναι δυσνόητα
Προσπάθεια εύρεσης νέων δεικτών οξειδωτικού στρες Αλβουμίνη Επηρεάζεται από τις μεταβολές του οξειδωτκού στρες στο αίμα και τους ιστούς;
Ιδιότητες της αλβουμίνης Συμβάλλει στη διατήρηση της οσμωτικής πίεσης των ιστών, μπορεί να δράσει ως ένζυμο και έχει αντιοξειδωτικές ιδιότητες λόγω της ύπαρξης ομάδων θειόλης (Ellmerer et al., 2000; Drmanovic et al., 1999; Masson et al., 2007) Ηοξειδωμένη(διμερής) αλβουμίνη έχει προταθεί σα δείκτης οξειδωτικού στρες (Lamprecht et al., 2009)
Η άσκηση αυξάνει την αλβουμίνη στους σκελετικούς μύες A Αλβουμίνη στο γαστροκνήμιο μυ (mg/mg protein) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 πριν μετά 5h Allopurinol Αλοπουρινόλη Exercise Αλοπ. + Άσκ. B Αλβουμίνη στον υποκνημίδιο μυ (mg/mg protein) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 πριν μετά 5h Allopurinol Αλοπουρινόλη Exercise Αλοπ. + Άσκ. Γ Αλβουμίνη στον EDL (mg/mg protein) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Allopurinol Αλοπουρινόλη Exercise Αλοπ. + Άσκ. πριν μετά 5h Αλοπουρινόλη Αλοπ. + Άσκ.
Η άσκηση αυξάνει τη μονομερή και τη διμερή αλβουμίνη στον EDL A Control B Control 66000 Μονομερής αλβουμίνη 110000 Διμερής αλβουμίνη 37000 GAPDH 37000 GAPDH Μονομερής αλβουμίνη ατον EDL (arbitrary unitsl) 200 150 100 50 0 Control Διμερής αλβουμίνη ατον EDL (arbitrary units) 200 150 100 50 0 Control Veskoukis et al. Appl Physiol Nutr Metab. 35:244-250, 2010
Συμπεράσματα Η άσκηση οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα μονομερούς και διμερούς αλβουμίνης ως πιθανού αντιοξειδωτικού μηχανισμού Το γεγονός ότι η αλοπουρινόλη (που προκάλεσε οξειδωτικό στρες) δεν επηρέασε τα επίπεδα της αλβουμίνης υποδηλώνει ότι η μεταβολή στη συγκέντρωσή της εξαρτάται από το ερέθισμα Η παρατήρηση αυτή είναι ένας περιορισμός για τη χρησιμοποίηση της αλβουμίνης ως δείκτη οξειδωτικού στρες
Το οξειδωτικό στρες εκτιμάται με τη μέτρηση δεικτών κυρίως στο αίμα και πιο σπάνια στο σκελετικό μυ σε εργασίες στον άνθρωπο
Οι ελεύθερες ρίζες που μετρώνται στο αίμα μετά από παρεμβάσεις, οι οποίες μεταβάλλουν την οξειδοαναγωγική κατάσταση δεν προέρχονται μόνο από το σκελετικό μυ Nikolaidis & Jamurtas Arch Biochem Biophys 490:77, 2009
Το αίμα αντανακλά ικανοποιητικά το οξειδωτικό στρες των ιστών Veskoukis et al. Free Radic Biol Med 47:1371, 2009
Συμπέρασμα Σκελετικός μυς Καρδιακός μυς Πρωτεϊνικά καρβονύλια (πλάσμα) Καταλάση, GSH, GSSG (ερυθροκύτταρα) TBARS, Πρωτεϊνικά καρβονύλια (πλάσμα) Καταλάση, GSSG (ερυθροκύτταρα) Ήπαρ TBARS (πλάσμα) GSSG (ερυθροκύτταρα)
in vivo versus in vitro βιολογικά ενδιαφέρον in vivo σύστημα δύσκολα προσβάσιμο πειραματικά βιολογικά λιγότερο ενδιαφέρον in vitro σύστημα προσβάσιμο πειραματικά Strand R. Foundations of Chemistry 1: 271 294, 1999
Ορισμένες φορές ο ορισμός ενός συστήματος ως in vitro ή in vivo εξαρτάται απότοπείραμα Ένα in vivo σύστημα μπορεί να είναι το ήπαρ ενός επίμυος και ένα in vitro σύστημα η καλλιέργεια των ηπατοκυττάρων Σε άλλη περίπτωση, ένα in vivo σύστημα μπορεί η καλλιέργεια μίας κυτταρικής σειράς και ένα in vitro σύστημα το ομογενοποίημα της κυτταροκαλλιέργειας Ή στην προκειμένη περίπτωση... ένα in vivo σύστημα είναι οι ιστοί που λήφθηκαν από έναν επίμυ μετά από τη χορήγηση εκχυλίσματος και ένα in vitro σύστημα η μελέτη της δράσης των εκχυλισμάτων στην οξειδάση της ξανθίνης και την καταλάση μέσα στο δοκιμαστικό σωλήνα
Ή καταχρηστικά... ένα in vitro σύστημα για την εκτίμηση του οξειδωτικού στρες είναι η μέτρηση δεικτών στο αίμα και ένα in vivo σύστημα η μέτρηση δεικτών στους ιστούς
Richard Fleischer s film Fantastic Voyage
Salvador Dali. Fantastic Voyage
Η in vitro αντιοξειδωτική δράση δε συνεπάγεται απαραίτητα και in vivo αντιοξειδωτική δράση Ο όρος«αντιοξειδωτικό» είναι σχετικός και εξαρτάται από το σύστημα στο οποίο μελετάται