Εργαστηριακή άσκηση 5: Ανοσοφθορισμός Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδασκαλίας: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία
Φθορισμός Ο φθορισμός είναι ένα φυσικοχημικό φαινόμενο κατά το οποίο ορισμένες ουσίες, μετά από διέγερση, εκπέμπουν ακτινοβολία με μήκος κύματος μεγαλύτερο από εκείνο της διεγείρουσας ακτινοβολίας. Υπάρχουν στη φύση ουσίες που εμφανίζουν "πρωτογενή φθορισμό" ή "αυτοφθορισμό". Οι περισσότερες όμως ουσίες ή κυτταρικές δομές δεν εμφανίζουν πρωτογενή φθορισμό και θα πρέπει να σημανθούν, για να δώσουν φθορισμό. Στόχος είναι ο φθορισμός ορισμένων μόνο περιοχών, ουσιών ή οργανιδίων. Ο εξειδικευμένος φθορισμός μπορεί να επιτευχθεί με χρήση φθοριοχρωμάτων, τα οποία χρησιμοποιούνται όπως ακριβώς και οι συνηθισμένες ιστολογικές χρωστικές. Ο φθορισμός που παρατηρείται στα παρασκευάσματα που έχουν σημανθεί με φθοριοχρώματα αναφέρεται ως "δευτερογενής φθορισμός". Το φαινόμενο χρησιμοποιείται στη μικροσκοπία φθορισμού. Μερικές από τις πιο σημαντικές εφαρμογές στη διάγνωση και στην έρευνα είναι ο ανοσοσφορισμός και η υβριδοποίηση με φθοριοχρώματα (τεχνική FISH).
Φθορισμός (2) Ο φθορισμός βασίζεται στην αρχή της μετατροπής της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην περιοχή του υπεριώδους (μη ορατή) σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού φωτός. Ο χρόνος στον οποίο εκτελείται το φαινόμενο είναι πολύ πολύ μικρός, δηλαδή λιγότερο από 1/100.000 του δευτερολέπτου. Μηχανισμός: Υπάρχουν κάποια στοιχεία που απορροφούν ενέργεια και αργότερα την αποβάλλουν με τη μορφή φωτός. Η διαδικασία γίνεται σε 2 βήματα. 1) τα μόρια του στοιχείου απορροφούν ενέργεια (με τη μορφή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας δηλαδή φωτονίων) και διεγείρονται, δηλαδή ηλεκτρόνια φεύγουν από κάποια εσωτερική τροχιά και μεταβαίνουν σε κάποια άλλη μακρύτερα από τον πυρήνα. 2) όταν τα ηλεκτρόνια επιστρέφουν στην κανονική τους κατάσταση αποβάλουν ένα φωτόνιο στην περιοχή του ορατού φωτός.
Φθοριοχρώματα ή φθορίζουσες χρωστικές Χημικές ουσίες που έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν. Στην τεχνική του ανοσοφθορισμού χρησιμοποιούνται για τη σήμανση των αντισωμάτων. Ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη (FITC) Απορρόφηση: 495 nm Εκπομπή: 528 nm πράσινο χρώμα Ισοθειοκυανική τετραμεθυλοροδαμίνη (TMRITC) Απορρόφηση: 550 nm Εκπομπή: 570 nm κόκκινο χρώμα Φυκοερυθρίνη (PE) Απορρόφηση: 488 nm Εκπομπή: 575 nm πορτοκαλί χρώμα
Ανοσοφθορισμός (IF;Immunofluorescence) Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη χρησιμοποίηση αντισωμάτων σημασμένων με φθορίζουσες ουσίες για την ανίχνευση και εντόπιση αντιγόνων ή αντισωμάτων σε ιστούς ή κύτταρα Υποστρώματα για εφαρμογή του ανοσοφθορισμού τομές ιστών μονόστιβες κυτταροκαλλιέργειες εναιωρήματα ζωντανών κυττάρων επιχρίσματα κυττάρων ή μικροοργανισμών Η τεχνική του ανοσοφθορισμού εφαρμόζεται με 2 μεθόδους : άμεσο ανοσοφθορισμό Και έμμεσο ανοσοφθορισμό
Άμεσος ανοσοφθορισμός (Direct Immunoflurorescence) Αναγνώριση κατανομής του αντιγόνου στον ιστό ή σε διαμερίσματα του κυττάρου. Tο σημασμένο ειδικό αντίσωμα τοποθετείται πάνω στο παρασκεύασμα που περιέχει το ομόλογο αντιγόνο και δημιουργείται φθορίζον σύμπλεγμα. Διαδικασία 1. Πάνω σε τομή ιστού που περιέχει τα αντιγόνα που ψάχνουμε προστίθεται το αντίσωμα συζευγμένο με φθοριόχρωμα. 2. Ακολουθεί πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων και απομάκρυνση του πλεονάζοντος αντισώματος. 3. Ακολουθεί μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού.
Άμεσος ανοσοφθορισμός (Direct Immunoflurorescence) Πλεονεκτήματα Σύντομος χρόνος εκτέλεσης Απλή διαδικασία Χρήση πολλαπλών Abs: ανίχνευση 2 ή περισσότερων Ags στο ίδιο υπόστρωμα Μειονεκτήματα Ασθενέστερο σήμα Υψηλότερο κόστος Μικρότερη ευελιξία Δυσκολίες στις διαδικασίες σήμανσης όταν δεν υπάρχουν εμπορικά διαθέσιμα σημασμένα Abs
Έμμεσος ανοσοφθορισμός Ανίχνευση αντισωμάτων σε δείγμα ορού του ασθενή 1. Διαδοχικές αραιώσεις του ορού του ασθενούς τοποθετούνται πάνω σε κύτταρα ή σε τομή ιστού που περιέχει το αντιγόνο. 2. Ακολουθεί έκπλυση για την απομάκρυνση των μη συνδεδεμένων αντισωμάτων (πρωτογενές αντίσωμα). 3. Κατόπιν προστίθενται αντι-ισοτυπικά αντισώματα συζευγμένα με φθορίζουσα ουσία (δευτερογενές αντίσωμα) 4. Ακολουθεί νέα έκπλύση για απομάκρυνση των μη συνδεδεμένων αντι-ισοτυπικών αντισωμάτων. 5. Ακολουθεί μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. 6. Το αποτέλεσμα αναλόγα της έντασης του φθορισμού χαρακτηρίζεται σαν αρνητικό ή θετικό.
Έμμεσος ανοσοφθορισμός Το κύριο αντιδραστήριο που δείχνει ότι έγινε ανοσοαντίδραση, αν δηλαδή στον εξεταστέο ορό υπάρχουν αντισώματαέναντι του αντιγόνου, είναι η σημασμένη αντιανθρώπινη γ-σφαιρίνη (anti-igg;αντίσωμα προς την γ σφαιρίνη του ανθρώπου) Πλεονεκτήματα Μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι του άμεσου Ενίσχυση του σήματος: Σύνδεση 1 ή περισσότερων δευτερογενών Abs στο πρωτογενές Ab Χρήση πολλαπλών Abs: ανίχνευση 2 ή περισσότερων Ags στο ίδιο υπόστρωμα Μειονεκτήματα Πιθανά διασταυρούμενη αντίδραση Ανάγκη εύρεσης πρωτογενών Abs που έχουν αναπτυχθεί σε διαφορετικά είδη ή διαφορετικών ισοτόπων (πολλαπλή σήμανση) Το δευτερογενές Ab αλληλεπιδρά με ενδογενείς Igs μη ειδικός φθορισμός
Μικροσκόπιο φθορισμού
Εφαρμογές ανοσοφθορισμού Ανίχνευση μικροοργανισμών Ανίχνευση αντισωμάτων έναντι μικροοργανισμών Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων: Ανάλογα με το είδος του αυτοαντιγόνου που προσανατολίζει τη χυμική ανοσολογική απόκριση, τα αυτοαντισώματα διακρίνονται σε οργανοειδικά και μη οργανοειδικά ή συστηματικά. Στην πρώτη περίπτωση τα αυτοαντισώματα στρέφονται κατά εξειδικευμένων ιστών και μόνο, οπότε παρουσιάζουν ειδικότητα όσον αφορά στη δράση τους, αλλά και στην ιστική βλάβη που πιθανά να προκαλέσουν. Τυπικό παράδειγμα αποτελεί η παρουσία αντιθυρεοειδικών αντισωμάτων (αντι- TPO, αντι-tg) στην αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα. Στην δεύτερη περίπτωση τα αυτοαντισώματα στρέφονται κατά αυτοαντιγόνων που υπάρχουν σχεδόν σε όλους τους ιστούς του ανθρώπινου οργανισμού και εκφράζουν την παθογενετική τους δράση μέσω ανοσοσυμπλεγμάτων. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα αντιπυρηνικά (ΑΝΑ) αντισώματα που αποτελούν κριτήριο ταξινόμησης στη διαγνωστική προσέγγιση των συστηματικών αυτοάνοσων νοσημάτων. Ανίχνευση συμπληρώματος Ανίχνευση αντιγόνων λεμφοκυττάρων, μακροφάγων, κοκκιοκυττάρων, ερυθρών αιμοσφαιρών
Ανοσολογικές εξετάσεις Αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA): Αντι-dsDNA, Αντι ΕΝΑ, Αντικεντρομεριδιακά, Αντι-Scl70, Αντι-Jo-1 Αντισώματα έναντι κυτταροπλάσματος των ουδετεροφίλων (ΑΝCA) Αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα: Anti-CL, LA
Αντιπυρηνικά αντισώματα Τα ΑΝΑ αποτελούν μια ετερογενή ομάδα αυτοαντισωμάτων, τα οποία στρέφονται έναντι διαφόρων αντιγονικών συστατικών του πυρήνα, όπως το DNA, οι ιστόνες, μη ιστονικές πρωτεΐνες, συμπλέγματα RNA- πρωτεΐνης, πυρηνισκικά αντιγόνα, κ.α.
Αντιπυρηνικά αντισώματα Για την ανίχνευση των ΑΝΑ, χρησιμοποιείται σήμερα η μέθοδος του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IIF), σε υποστρώματα καλλιεργούμενων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών (κυρίως Hep-2 επιθηλιακών κυττάρων από καρκίνο λάρυγγος ανθρώπου, ΚΒ επιθηλιακών κυττάρων από καρκίνο στοματοφάρυγγος ανθρώπου, HeLa κυττάρων ανθρώπου από καρκίνο τραχήλου μήτρας, ανθρώπινων αμνιακών κυττάρων κ.α). Τα υποστρώματα από ανθρώπινες κυτταροκαλλιέργειες περιέχουν μεγάλη ποικιλία αντιγόνων, περιέχουν αντιγόνα που δεν εκφράζονται στις ιστικές τομές των τρωκτικών (που χρησιμοποιούνται παλαιότερα) (αντικεντρομεριδιακά, αντι- PCNA/ proliferating cell nuclear antigen), έχουν μεγαλύτερη συγκέντρωση ορισμένων αντιγόνων σε σχέση με τις ιστικές τομές (Ro αντιγόνο), έχουν μεγάλους πυρήνες που διευκολύνουν την παρατήρηση των τύπων φθορισμού, καθώς και του φθορισμού των κυττάρων στη φάση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που βρίσκονται. Με τα υποστρώματα αυτά δίνεται η δυνατότητα αναγνώρισης και επιπλέον τύπων, όπως του αντικεντρομεριδιακού, του κυτταροπλασματικού και των μικτών τύπων φθορισμού.
Τύποι φθορισμού Έξι κύριοι τύποι φθορισμού παρατηρούνται συχνότερα σε υπόστρωμα Hep- 2 κυττάρων: 1. Διάχυτος ή ομοιογενής 2. Περιφερικός 3. Στικτός 4. Φθορισμός πυρηνιδίου 5. Αντικεντρομεριδιακός 6. Κυτταροπλασματικός 7. Μικτός, σε συνύπαρξη περισσοτέρων του ενός αντισωμάτων (πχ διάχυτο και στικτό, στικτό και πυρηνιδίου κλπ).
Στικτός τύπος φθορισμού. Ο αριθμός των κοκκίων είναι απροσδιόριστος στα μεσοφασικά κύτταρα. Στα μιτωτικά κύτταρα (βέλος), η κεντρική χρωμοσωμική περιοχή εμφανίζεται σκοτεινόχρωμη, ενώ υπάρχει περικεντρική εντόπιση κοκκίων. Ομοιογενής τύπος φθορισμού. Στα μεσοφασικά κύτταρα οι πυρήνες χρωματίζονται ομοιόμορφα (καμπυλωτό βέλος) καθώς και η χρωμοσωμική περιοχή των μιτωτικών κυττάρων (βέλος).
Φθορισμός πυρηνικής μεμβράνης Χαρακτηριστική δακτυλιοειδής χρώση των πυρήνων (περιφερειακή), ενώ το πυρηνόπλασμα εμφανίζεται σκοτεινόχρωμο (βέλος) Κοκκιώδης κεντρομεριδιακός τύπος φθορισμού. Είναι χαρακτηριστική η εντόπιση 46 ή 92 κοκκίων στους πυρήνες των μεσοφασικών κυττάρων. Η χρωμοσωμική περιοχή των μιτωτικών κυτταρών (βέλος) εμφανίζει επίσης κοκκιώδη φθορισμό Κοκκιώδης τύπος φθορισμού. Στους πυρήνες των μεσοφασικών κυττάρων εντοπίζονται 10-20 κοκκία. Στα μιτωτικά κύτταρα (βέλος) η χρωμοσωμική περιοχή φαίνεται σκοτεινόχρωμη.
Κλινική σημασία των αντιπυρηνικών αντισωμάτων
Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ) Φαινόμενο Raynaud Σκληρόδερμα CREST Σύνδρομο Sjögren 19
Κλινική σημασία των αντιπυρηνικών αντισωμάτων Ιστόνες Αντιγόνα Συμβολική ονομασία H1, H2A, H2B, H3 Η4 Πάθηση Φαρμακευτικός λύκος (95-100%) ΣΕΛ (30 50%) Ρευματοειδή αρθρίτιδα (15 20%) Smith Sm ΣΕΛ (20 30%) Φαινόμενο Raynaud Ριβονουκλεοπρωτε snu1-rnp Ήπιος ΣΕΛ ΐνη (RNP70, RNPA, Σκληρόδερμα RNPC) Σύνδρομο Sjögren Sjögren SSA/Ro, SSB/La ΣΕΛ Σύνδρομο Sjögren Σκληρόδερμα 70 Scl-70 Σκληρόδερμα (20-60%) Φαινόμενο Raynaud Σύνδρομο Sjögren John 1 (συνθετάση ιστιδυλ-trna) Εικόνα Έμμεσου Ανοσοφθορισμού Διάχυτος ομοιογενής φθορισμός πυρήνα Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα ή πυρηνισκικός φθορισμός Jo-1 Πολυμυοσίτιδα (30%) Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα ή περιφερικός φθορισμός Αντικεντρομεριδια κά ACA (CENP-A, CENP-B, CENP-C) Σκληρόδερμα CREST Λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα Διπλή έλικα DNA ds-dna ΣΕΛ Διάχυτος ομοιογενής φθορισμός πυρήνα
Αδρός ή λεπτός στικτός φθορισμός πυρήνα 21
Αντιπυρηνικά Κυτταροπλασματικά Αντιγόνα -Antinuclear Cytoplasmatic Antigens (ANCA) Ομάδα αντισωμάτων που αναγνωρίζουν συστατικά του κυτταροπλάσματος των μονοκυττάρων και ουδετεροφίλων Κυτταροπλασματικά ANCA (c-anca) Περιπυρηνικά ANCA (p-anca) 22
Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης Δημιουργία παρασκευάσματος ανοσοφθορισμού Hep-2 1. Φέρνουμε τα συστατικά του kit σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Ανοίγουμε τα φακελάκια στα οποία περιέχονται οι πλάκες του ανοσοφθορισμού με προσοχή χωρίς να αγγίξουμε το υπόστρωμα. Αραιώνουμε το πυκνό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS). 3. Πραγματοποιούμε αραιώσεις των εξεταζόμενων ορών με PBS σε αναλογία 1/40 (ή 1/80 ανάλογα με το εξεταζόμενο αντιγόνο). Αν οι οροί είναι θετικοί τότε επαναλαμβάνεται η δοκιμασία κάνοντας μεγαλύτερες αραιώσεις (1/160, 1/320). Αραιώσεις δειγμάτων πριν τις μετρήσεις ΑΝΑ: 1/160 ΑΝCA: 1/80 SMA/PCA/AMA: 1/40 Crithidia lucidiae: 1/10
Δημιουργία παρασκευάσματος ανοσοφθορισμού Hep-2 4. Προσθέτουμε 25 μl του αραιωμένου ορού καθώς και του αρνητικού και θετικού μάρτυρα σε ξεχωριστές θέσεις εξέτασης της πλάκας, καλύπτοντας πλήρως το υπόστρωμα. 5. Αμέσως επωάζουμε το πλακίδιο σε θάλαμο υγρασίας για 30 min στους 25 C μέσα σε υγρό θάλαμο. Για την δημιουργία του υγρού θαλάμου τοποθετούμε μέσα σε ένα τρυβλίο ένα κομμάτι διηθητικού χαρτιού διαποτισμένο με PBS. Τοποθετούμε την πλάκα terassaki μέσα στο τρυβλίο και κλείνουμε το καπάκι του. 6. Ξεπλένουμε τα πλακίδια με (PBS) αποφεύγοντας τις επιμολύνσεις μεταξύ των βυθισμάτων και χρησιμοποιώντας πιπέττα ή υδροβολέα. Προσέχουμε να μην ρίχνουμε απευθείας πάνω στα πλακίδια. 8. Στεγνώνουμε τα πλακίδια προσεκτικά με απορροφητικό χαρτί χωρίς να αγγίζουμε το υπόστρωμα. Οι θέσεις εξέτασης που περιέχουν το υπόστρωμα πρέπει να παραμείνουν υγρές, όπως και σε ολόκληρη τη διαδικασία. 9. Προσθέτουμε 25μl αντιϊσοτυπικών αντισωμάτων συζευγμένων με FITC σε όλες τις θέσεις εξέτασης (δείγματα και μάρτυρες. Επωάζουμε τα πλακίδια ξανά σε θάλαμο υγρασίας για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 25
Δημιουργία παρασκευάσματος ανοσοφθορισμού Hep-2 10. Προσθέτουμε δύο με τρεις σταγόνες στερεωτικού (mounting medium) στην επιφάνεια της πλάκας μεταξύ των βυθισμάτων. 11. Προσαρμόζουμε την καλυπτρίδα στην επιφάνεια του πλακιδίου, προσέχοντας ώστε να μην δημιουργηθούν φυσαλίδες. 12. Εξετάζουμε τα πλακίδια σε μικροσκόπιο φθορισμού (250-400Χ) το ταχύτερο δυνατό. Ο φθορισμός μπορεί να διατηρηθεί για λίγες μέρες, αν τα πλακίδια διατηρηθούν στην ψύξη (2-8 C). Προσοχή πριν από κάθε μικροσκόπηση τα πλακίδια θα πρέπει να παραμείνουν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 min. 26