ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ο ρόλος της έκκρισης HLA-G από τα ανθρώπινα έμβρυα στην επιτυχία της εξωσωματικής γονιμοποίησης Μαρία Κατσιφοδήμου Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ.1 ΠΕΡΙΛΗΨΗ..2 ABSTRACT..3 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ..4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5 1. Η ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ 5 2. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΜΒΡΥΟΥ 7 2.1. Στρατηγικές προστασίας του ημιαλλογενούς εμβρύου από τις μητρικές αποκρίσεις απόρριψης.....9 2.1.1. Το μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (major histocompatibility complex MHC) στον άνθρωπο και πως αυτό επηρεάζει την εγκυμοσύνη......9 2.1.2. MHC, HLA-G και εγκυμοσύνη....11 3. ΤΑ HLA ΓΟΝΙΔΙΑ..11 3.1. HLA-G: Ένα καινούργιο γονίδιο που εκφράζεται στον πλακούντα.13 3.1.1. Τι είναι μη κλασικό στο HLA-G:...18 Δομικά χαρακτηριστικά του HLA-G:.....18 3.1.2. Εναλλακτικά συρραμένες μεμβρανοσυνδεόμενες και διαλυτές ισομορφές του mrna του μορίου HLA-G.. 20 3.1.3. Πολυμορφισμός του HLA-G...22 3.2. Έκφραση και λειτουργία του HLA-G....28 3.2.1. Πρότυπα έκφρασης του HLA-G....28 3.2.2. Υποδοχείς για το HLA-G....33 3.3. Λειτουργίες του HLA-G...34 3.3.1 Το HLA-G στην αναπαραγωγή του ανθρώπου....35 Η έκφραση και η λειτουργία του HLA-G κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης και εγκυμοσύνης:....35 3.3.2 Αλληλεπιδράσεις του HLA-G με τα Τ λεμφοκύτταρα. 37
3.3.3. Οι αλληλεπιδράσεις των HLA-G με τα B λεμφοκύτταρα....39 3.3.4. Αλληλεπιδράσεις του HLA-G με τα κύτταρα φυσικούς φονιάδες (ΝΚ)...41 3.3.5. Αλληλεπιδράσεις με αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC).. 43 4. ΤΟ HLA-G ΣΤΗ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ..46 5. ΤΟ HLA-G ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ...47 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ..49 1. ΑΣΘΕΝΕΙΣ.49 2. ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΩΟΘΗΚΩΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ 50 3. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΜΒΡΥΩΝ.52 4. Η ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ...55 4.1. Ανάλυση Sandwich ELISA....55 5. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ SHLA-G 56 6. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ..59 6.1. Οι ομάδες μελέτης (n=64).. 59 6.2. Στατιστική ανάλυση.....60 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.62 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 74 ΕΠΙΛΟΓΟΣ.82 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..86
ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών του Τομέα Εφαρμοσμένης Γενετικής και Βιοτεχνολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Εκπονήθηκε κάτω από την καθοδήγηση του Καθηγητή του τμήματος Βιολογίας κ. Κωνσταντίνου Τριανταφυλλίδη και της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας του τμήματος Βιολογίας κ. Αναστασίας Κουβάτση και τη συνεργασία του Αναπληρωτή Καθηγητή Μαιευτικής/Γυναικολογίας Νικόλαου Πράπα στο εργαστήριο εξωσωματικής γονιμοποίησης του ιατρικού κέντρου Ιάκεντρο. Με το κλείσιμο του κύκλου της ερευνητικής αυτής εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα: Τους καθηγητές μου κ. Κωνσταντίνο Τριανταφυλλίδη και κ. Αναστασία Κουβάτση για την εμπιστοσύνη με την οποία με περιέβαλαν, και την πολυτιμη καθοδήγηση, Τον Αναπληρωτή καθηγητή Γυναικολογίας/Μαιευτικής της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. κ. Νίκο Πράπα για την τιμή που μου έκανε να με δεχτεί στο εργαστήριο εξωσωματικής γονιμοποίησης Ιάκεντρο καθώς και για την ανάθεση του συγκεκριμένου θέματος. Τον Αναπληρωτή καθηγητή κ. Μηνά Γιάγκου, μέλος της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για το ενδιαφέρον του, το χρόνο που διέθεσε για την ανάγνωση του κειμένου και για τις πολύτιμες υποδείξεις και συμβουλές του. Τον Βιολόγο κ. Ιωάννη Παναγιωτίδη καθώς και όλο το προσωπικό του εργαστηρίου εξωσωματικής γονιμοποίησης για την ουσιαστική βοήθεια και την αμέριστη συμπαράσταση, τον Παθολόγο κ. Κύρο Σιώμο για την ουσιαστική συμβολή του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της εργασίας. Κλείνοντας, πιο προσωπικές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στους γονείς μου, για την αγάπη τους αλλά και για την υλική και ηθική υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια. Μαρία Χ. Κατσιφοδήμου 1
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η αναγνώριση χημικών δεικτών σε μέσα καλλιέργειας εμβρύων που σχετίζονται με την ποιότητα του εμβρύου και την πιθανότητα εμφύτευσης θα μπορούσε να είναι ένα αξιόλογο εργαλείο στην επιλογή του εμβρύου για εμβρυομεταφορά. Η εμβρυική έκκριση διαλυτού αντιγόνου G των ανθρώπινων λευκοκυττάρων (human leukocyte antigen G shla-g) φαίνεται να είναι ένας μάρτυρας εμβρυικής ικανότητας. Αυτή η μελέτη διερευνά τις συγκεντρώσεις του shla-g στα σταγονίδια μέσων καλλιέργειας 3 ης ημέρας εμβρύων που επιλέχθηκαν για μεταφορά, καθώς και αυτών που καταψύχθηκαν. Μετρήθηκε ένα σύνολο 193 υπερκείμενων μέσων καλλιέργειας από 64 γυναίκες. Διαλυτό HLA-G ανιχνεύτηκε σε 103 από τα 193 δείγματα που ελέγχθηκαν. Σε 49 μεταφορές στις οποίες μεταφέρθηκε τουλάχιστον ένα έμβρυο θετικό ως προς το shla-g, το ποσοστό εγκυμοσύνης ήταν 49% (24/49). Αντίθετα, γυναίκες που έλαβαν μόνο έμβρυα που ήταν αρνητικά για το shla-g είχαν ένα χαμηλότερο ποσοστό εγκυμοσύνης 7,7% (1/13). Η έκφραση του shla-g επίσης σχετιζόταν θετικά με αυξανόμενη κυτταρική φάση. Η συγκέντρωση του shla-g στα μέσα καλλιέργειας εμβρύων ποικίλλει και σε χαμηλό εύρος (1-8 ng/ml). Τα δεδομένα υποδεικνύουν μια σχέση μεταξύ πιθανότητας εμφύτευσης και εμβρυικής έκκρισης του shla-g. Η εμπορική συσκευασία ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε επέτρεψε τη μέτρηση έκκρισης του shla-g την ίδια ημέρα. Η προσθήκη της μέτρησης του shla-g στα παραδοσιακά μορφολογικά κριτήρια μπορεί να είναι χρήσιμη ως κλινικό εργαλείο για την επιλογή των εμβρύων. 2
ABSTRACT Identification of chemical markers in human embryo culture media that relate to embryo quality and implantation potential could be an invaluable tool in embryo selection for transfer. Embryonic secretion of soluble human leukocyte antigen G (shla-g) has been postulated to be a marker for embryonic competence. This study examines shla-g concentrations in day 3 culture media droplets of embryos that were selected for transfer, as well as those being cryopreserved. A total of 193 embryo culture supernatants from 64 patients were assayed. Soluble HLA-G was detected in 103 of the 193 samples tested. In the 49 transfers in which at least one embryo selected for embryo transfer was positive for shla-g, the pregnancy rate was 49% (24/49).In contrast, patients receiving only embryos that were negative for shla-g had both a lower pregnancy rate of 7,7% (1/13). Expression of shla- G was also related to increasing cell stage. Concentration of shla-g in embryo culture media was variable and in the low range (1-8 ng/ml). These data suggest an association between implantation potential and embryonic secretion of shla-g. The commercial assay kit utilized allowed for same day assessment of shla-g secretion. Addition of shla-g status to traditional morphological criteria may be useful as a clinical tool for embryo selection. 3
ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της εργασίας αυτής είναι: 1) Η αναγνώριση ενός χημικού μάρτυρα στα μέσα καλλιέργειας των ανθρώπινων εμβρύων που σχετίζεται με την ποιότητα του εμβρύου και την πιθανότητα εμφύτευσης. 2) Σε αυτήν την εργασία προσπαθήσαμε να καθορίσουμε, χρησιμοποιώντας ένα υψηλά ευαίσθητο sandwich ELISA, αν τα ανθρώπινα έμβρυα που αποκτήθηκαν από εξωσωματική γονιμοποίηση πριν τη μεταφορά εκκρίνουν HLA-G και 3) να αναλύσουμε αν η ανίχνευση του διαλυτού HLA-G σχετίζεται με την ανάπτυξη του εμβρύου και/ή το αποτέλεσμα της εγκυμοσύνης από εξωσωματική γονιμοποίηση. 4) Επίσης ερευνήσαμε την πιθανότητα ότι η έκκριση HLA-G από τα ανθρώπινα έμβρυα δίνει πληροφορίες σχετικά με τη δυναμική του εμβρύου. 5) Ακόμη, ανιχνεύτηκε η σχέση με ποιότητα του εμβρύου και πιθανότητα εμφύτευσης.η ανίχνευση αυτού του χημικού παράγοντα θα μπορούσε να είναι ένα ανεκτίμητο εργαλείο σε σύγκριση με τις μορφολογικές παραμέτρους στην επιλογή του εμβρύου για μεταφορά. 4
ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ Η ανάπτυξη των θηλαστικών αρχίζει όταν ένα ωάριο γονιμοποιηθεί από ένα σπερματοζωάριο. Η ανάπτυξη είναι μια διαδικασία που μεταβάλλει τελικά το γονιμοποιημένο ωάριο του ζυγώτη σε έναν πολυκύτταρο οργανισμό. Η γονιμοποίηση ξεκινάει τις πιο πολλές φορές στη λήκυθο του ωαγωγού. Ο ζυγώτης καθώς περνάει από τον ωαγωγό υφίσταται κυτταρική διαίρεση ή αυλάκωση σχηματίζοντας έναν αριθμό κυττάρων που ονομάζονται βλαστομερίδια και καταλήγει στο σχηματισμό ενός μοριδίου. Το μορίδιο μπαίνει στη μήτρα, αναπτύσσει κοιλότητα, και γίνεται μια βλαστοκύστη η οποία εισχωρεί στο ενδομήτριο της μήτρας μέχρι την πλήρη εμφύτευση του (εικόνα 1). ΕΙΚΟΝΑ 1: Σχηματική περίληψη του ωοθηκικού κύκλου, της γονιμοποίησης και εξέλιξης του ωαρίου στη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας. (Μοοre Κ., 1978). 5
Η σταδιακή ανάπτυξη του εμβρύου και του πλακούντα οδηγεί στο σχηματισμό ενός ολοκληρωμένου αυτάρκη οργανισμού (εικόνα 2). ΕΙΚΟΝΑ 2: Σχηματική παράσταση του εμβρύου και του ώριμου πλακούντα μέσα στη μήτρα. (Μοοre,1978). Η επιτυχής όμως έκβαση της εγκυμοσύνης βασίζεται σε ένα πλέγμα αλληλεπιδράσεων τόσο κυτταρικών όσο ορμονικών και ανοσολογικών που συμβαίνουν στην κυκλοφορία μητέρας-πλακούντα-εμβρύου. Ο πλακούντας εκτός από τις τρεις πιο ζωτικές λειτουργίες που είναι η ανταλλαγή αερίων, η προμήθεια θρεπτικών ουσιών και η απομάκρυνση προϊόντων μεταβολισμού αποτελεί και ανοσολογικό φραγμό μεταξύ εμβρύου και μητέρας (εικόνα 3). 6
ΕΙΚΟΝΑ 3: Σχηματική παράσταση εγκάρσιας τομής ενός ώριμου πλακούντα (Μοοre Κ.,1978). 2. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΜΒΡΥΟΥ Η περίεργη αλλά τόσο συνηθισμένη ανοχή του ημιαλλογενετικού εμβρύου από τον οργανισμό της μητέρας που είναι για αυτήν ένα αλλομόσχευμα προκαλεί σημαντικό ερευνητικό ενδιαφέρον. Το έμβρυο που αποτελείται από πατρικά και μητρικά γενετικά στοιχεία είναι μόσχευμα του ίδιου είδους αλλά όμως είναι γενετικά ξένο ως προς τη μητέρα και τον πατέρα. Παρ όλη την έκφραση αλλοαντιγόνων στο εξωτερικό τροφοβλαστικό στρώμα του ημιαλλογενετικού πλακούντα που έρχεται σε επαφή με τη μητρική κυκλοφορία, τόσο στον άνθρωπο όσο και στα ποντίκια, οι μηχανισμοί απόρριψης του μοσχεύματος δεν λειτουργούν (Raghupathy et al., 1981). Η επιτυχία της εγκυμοσύνης στον άνθρωπο, όπου το έμβρυο διαμένει αναπαυτικά μέσα στη μήτρα της μητέρας για 9 μήνες, αψηφάει τους κανόνες της ανοσοβιολογίας. Ο Medawar ήταν ο πρώτος που προσπάθησε να διαχωρίσει τις στρατηγικές που χρησιμοποιούνται στην εγκυμοσύνη για την 7
παράκαμψη της απόρριψης του εμβρύου από τη μητέρα (Medawar, 1953). Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί περιλάμβαναν φυσικό διαχωρισμό μητρικών και εμβρυικών ιστών, έλλειψη εμβρυικών αντιγόνων που μπορούσαν να ενεργοποιήσουν την απόρριψη μοσχεύματος, και ανάπτυξη της ανθεκτικότητας. Σήμερα έχουν καθοριστεί συγκεκριμένες πλευρές αυτών των στρατηγικών: η κυκλοφορία του αίματος του εμβρύου είναι εξ ολοκλήρου διαφοροποιημένη από της μητέρας. Στο έμβρυο τα αντιγόνα μεταμόσχευσης εμφανίζονται αργά. Η ανθεκτικότητα και η ανοσοβιολογική ασυλία στην εμβρυο-μητρική διεπιφάνεια έχει καθοριστεί. Τρεις ουσιώδεις παραδοχές που αναδεικνύονται από αυτές τις μελέτες είναι ότι: 1) διάφοροι μηχανισμοί παρέχουν προστασία, 2) τόσο το έμβρυο όσο και η μητέρα συμβάλλουν στην ανάπτυξη και διατήρηση της εγκύου μήτρας ως μιας ανοσοβιολογικά προστατευμένης περιοχής, και 3) εμβρυικοί παράγοντες καθοδηγούν τις αλλαγές στις ανοσοβιολογικές αποκρίσεις της μητέρας. Το γεγονός ότι το έμβρυο θεωρήθηκε από κάποιους ερευνητές αντιγονικά ανώριμο, και η μήτρα περιοχή προστατευμένη από το περιφερικό ανοσολογικό σύστημα της μητέρας, ευνοείται η ανάπτυξη του εμβρύου. Oι επικρατέστερες υποθέσεις που εξηγούν το «παράδοξο» της κύησης είναι ο μηχανισμός της ανοσοκαταστολής (Chaouat et al., 1984) και του ανοσοτροφισμού (Athanassakis et al., 1987). Σύμφωνα με την πρώτη τα εμβρυϊκά αλλοαντιγόνα στον πλακούντα διεγείρουν ανοσοκαταστολή στη μητέρα έτσι ώστε να αποφεύγεται η αναγνώριση και απόρριψη του εμβρυϊκού ιστού. Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτής της αντίδρασης παίζουν και τα κορτικοστεροειδή τα οποία παρεμποδίζουν την ανοσολογική απόκριση. Η θεωρία αυτή τεκμηριώνεται ακόμη με την ανίχνευση κατασταλτικών παραγόντων και κυττάρων στο περιφερικό αίμα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης (Clark et al., 1990). Η δεύτερη υπόθεση παραδέχεται ότι τα Τ λεμφοκύτταρα διεγείρονται από αλλοαντιγόνα του εμβρύου και εκκρίνουν παράγοντες που ενδυναμώνουν την ανάπτυξη του πλακούντα και κατ επέκταση την εμβρυϊκή επιβίωση (Athanassakis et al., 1987). Ενώ κατά την αρχική εκτίμηση οι δυο υποθέσεις φάνηκαν αντίθετες, πλέον πιστεύεται ότι και οι δύο ισχύουν σε διαφορετικά στάδια της κύησης με σκοπό να διατηρούν την ισορροπία στη μητέρα. 8
2.1. Στρατηγικές προστασίας του ημιαλλογενούς εμβρύου από τις μητρικές αποκρίσεις απόρριψης Κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, το μητρικό ανοσοβιολογικό σύστημα είναι ενεργό, και κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες μπορεί να συμβάλλει στην εμβρυική καταστροφή. Κάποιες συγκεκριμένες παθολογικές διαδικασίες περιλαμβάνουν την καταστροφή εμβρυικών ερυθροκυττάρων (αντιγόνο Rh, ερυθροβλάστωση) και αιμοπεταλίων από μητρικά αντισώματα και μολύνσεις της εγκυμοσύνης, όπου τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εκκρίνοντας υψηλά επίπεδα κυτοκινών τύπου Th1 τροποποιούν την ευαίσθητη ισορροπία στην εμβρυική-μητρική διεπιφάνεια (Hunt, 1989). Μέχρι τώρα με ένα ολοφάνερα ενεργό ανοσοβιολογικό σύστημα της μητέρας, οι μητέρες συνήθως φαίνεται να ανέχονται παρά να απορρίπτουν τα γενετικά διαφορετικά έμβρυά τους. Πολλαπλοί μηχανισμοί αποτελούν το θεμέλιο της εκπληκτικής προθυμίας των μητέρων να ανεχθούν γενετικά διαφορετικούς εμβρυικούς ιστούς κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Πρωταγωνιστές αυτών είναι συγκεκριμένα αντιγόνα του μείζοντος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (major histocompatibility complex MHC), τα οποία στους ανθρώπους ονομάζονται αντιγόνα των λευκοκυττάρων του ανθρώπου (human leukocyte antigens HLA). 2.1.1. Το μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (major histocompatibility complex MHC) στον άνθρωπο και πως αυτό επηρεάζει την εγκυμοσύνη. Όπως προαναφέραμε τα εμβρυϊκά ΜΗC αλλοαντιγόνα παρουσιάζονται από τον πλακούντα στο ανοσολογικό σύστημα της μητέρας, δίνοντας ανοσοκατασταλτικά ή ανοσοτροφικά σήματα για την ολοκλήρωση της εγκυμοσύνης ή τη διακοπή της. Στην επιφάνεια των κυττάρων τα τάξης Ι μόρια αναγνωρίζονται από CD8+Τ λεμφοκύτταρα (Tc/s), ενώ τα τάξης ΙΙ μόρια αναγνωρίζονται από CD4+Τ λεμφοκύτταρα (Th) και τα δύο μέσω ειδικών υποδοχέων TCR (α/β ή γ/δ) των παραπάνω λεμφοκυττάρων. 9
Τα μόρια MHC τάξης Ι και ΙΙ είναι επιφανειακές γλυκοπρωτεΐνες με σχετικά κοινή δομή και λειτουργία. Πιο συγκεκριμένα, τα τάξης Ι μόρια αποτελούνται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες την α (ή βαριά αλυσίδα) και την β2 μικροσφαιρίνη (β2 -microglobulin), ενώ τα τάξης ΙΙ μόρια σχηματίζονται από δύο αλυσίδες, τις α και β (Cresswell, 1994). Στο ποντίκι, τα γονίδια του κυρίου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητος (MHC) βρίσκονται στο χρωμόσωμα 17, ενώ το γονίδιο που κωδικοποιεί για την β2 μικροσφαιρίνη βρίσκεται στο χρωμόσωμα 2. Τα γονίδια του MHC του ανθρώπου βρίσκονται στον κοντό βραχίονα του χρωμοσώματος 6, ενώ τα γονίδια της β2 μικροσφαιρίνης στο χρωμόσωμα 15. Η περιοχή του MHC εκτείνεται σε 4 Mb και κωδικοποιεί τουλάχιστον 130 λειτουργικά γονίδια. Αυτά που έχουν περιγραφεί καλύτερα είναι τα κλασικά HLA τάξης Ia τα οποία ονομάζονται HLA-A, -B, -C στον άνθρωπο και H2-K, -D, -L στο ποντίκι. Στον άνθρωπο βέβαια έχουν βρεθεί και τρία μη κλασικά γονίδια τάξης Ι ή Ιb που όλα κωδικοποιούν και για την β2 μικροσφαιρίνη και ονομάζονται HLA-E, -F, - G (Wei and Orr 1990). Στο ίδιο σύμπλοκο βρίσκονται και τα γονίδια τάξης ΙΙ HLA-DR, -DQ, -DP, -DM για τον άνθρωπο, ενώ για το ποντίκι τα H2-A, -E, - M,-O. Τέλος υπάρχει και μια γονιδιακή περιοχή τάξης ΙΙΙ από όπου κωδικοποιούνται πρωτεΐνες συμπληρώματος (C4) και οι κυτοκίνες ΤΝFα,β (The MHC Sequencing Consortium, 1999). Όλα αυτά τα γονίδια είναι πολύ γνωστά για το ρόλο τους στη μεταμόσχευση οργάνων και στην παρουσίαση πεπτιδίων-αντιγόνων και για τη συσχέτισή τους με μια ποικιλία αυτοάνοσων ασθενειών (Doherty and Zinkernagel, 1975; Svejgaard et al., 1983). Ωστόσο, από το τέλος της δεκαετίας του 1980, έχει αποδειχθεί η παρουσία άλλων ομάδων ενδιαφέροντος των λεγόμενων μη κλασικών HLA class Ib γονιδίων (Redman et al., 1984). Το μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας έχει δυο βασικά πλεονεκτήματα για την άμυνα του οργανισμού απέναντι στην επίθεση πληθώρας παθογόνων. Πρώτον είναι πολυγονιδιακό, δηλαδή έχει πολλά διαφορετικά γονίδια τάξης Ι και ΙΙ που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες με διαφορετική ειδικότητα σύνδεσης αντιγονικών επιτοπίων και δεύτερον είναι πολυμορφικό, δηλαδή υπάρχουν πολλαπλά αλληλόμορφα για κάθε γονίδιο με αποτέλεσμα να αυξάνει περισσότερο το φάσμα πεπτιδίων που αναγνωρίζονται. 10
2.1.2. MHC, HLA-G και εγκυμοσύνη Γενικά: Ένα βασικό χαρακτηριστικό του πλακούντα είναι η απουσία έκφρασης τάξης ΙΙ αντιγόνων του κύριου συμπλόκου ιστοσυμβατότητας τόσο από την σπογγιοτροφοβλαστική όσο και τη λαβυρινθική τροφοβλαστική ζώνη (Bulmer & Johnson, 1985). Η διέγερση της έκφρασης των τάξης ΙΙ πρωτεϊνών οδηγεί σε αποβολή (Αthanassakis-Vassiliadis & Papamatheakis, 1991). Είναι γνωστό ότι η έκφραση των τάξης ΙΙ MHC ρυθμίζεται από την IFN-γ θετικά, από τον TGF-β2 αρνητικά, ενώ θετικά και αρνητικά από τον TΝF-α σε μεταγραφικό επίπεδο. Η επαγωγή μορίων τάξης ΙΙ στην σπογγιοτροφοβλαστική ζώνη από IFN-γ και poly I-C ή στην λαβυρινθική ζώνη από 5-Azac έχει δειχθεί να οδηγεί σε εμβρυϊκή αποβολή ή σε υπολειπόμενη ενδομήτρια ανάπτυξη. Ανάλογες παρατηρήσεις έχουν γίνει και στον άνθρωπο όπου έκφραση ΗLA-DR στον πλακούντα συνοδεύεται με εμβρυϊκές αποβολές και αυξημένη παραγωγή ανοσοσφαιρινών (Αthanassakis-Vassiliadis & Papamatheakis, 1991). Είναι φανερό ότι η αλληλεπίδραση της λαχνώδους τροφοβλάστης με τάξης ΙΙ αντιγόνα, τόσο σε φυσιολογικό πλακούντα, όσο και σε πλακούντα από γυναίκες με ιστορικό επαναλαμβανόμενων αυτόματων αποβολών οφείλεται σε πρόσδεση τάξης ΙΙ αντιγόνων σε υποδοχείς που αναπτύσσονται στην περιοχή των λαχνών (Labarrere & Faulk, 1990). Ενώ η απουσία τάξης ΙΙ αντιγόνων από τους τροφοβλάστες εξασφαλίζει την ανοσογονικότητα του πλακούντα, η ύπαρξη μη κλασικών τάξης Ι μορίων εξασφαλίζει την αλλοαναγνώριση του εμβρύου και την ενεργοποίηση του μητρικού οργανισμού. 3. ΤΑ HLA ΓΟΝΙΔΙΑ Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα μη κλασικά HLA αντιγόνα τάξης Ib βρίσκονται στο χρωμόσωμα 6p21 στο μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (MHC), στο τελομερικό άκρο της περιοχής του HLA (εικόνα 4). Παρόλο που αυτή η περιοχή περιλαμβάνει 20 με 25 HLA γονίδια τάξης I, σχετικά λίγα μεταγράφονται ή μεταφράζονται. Τα περισσότερα είναι ψευδογονίδια ή 11
τμήματα γονιδίων. Τα γονίδια τάξης Ι που εκφράζονται υποδιαιρούνται σε τάξη Ia, η οποία περιλαμβάνει τα HLA-A, -B, και -C, και σε τάξη Ib, η οποία περιλαμβάνει τα HLA-E, -F, και -G. Τα HLA γονίδια τάξης II (HLA-D), αν μεταγραφούν, δεν μεταφράζονται στα κύτταρα της τροφοβλάστης του ανθρώπου ακόμα και κάτω από συνθήκες ενεργοποίησης (Hunt et al., 1987) και δεν θα συζητηθούν περισσότερο στη εργασία αυτή. Η εικόνα 4 απεικονίζει το χάρτη της χρωμοσωμικής περιοχής των HLA τάξης I (6p21-3), που δείχνει την περιοχή των κλασικών (μωβ), μη κλασικών (ροζ) HLA γονιδίων τάξης I, μεταξύ των οποίων και το HLA-G, τα ψευδογονίδια HLA τάξης I και τα ψαλιδισμένα γονίδια (κίτρινο), γονίδια που σχετίζονται με τα τάξης class I (πορτοκαλί) και κάποια (αλλά όχι όλα) από τα μη τάξης Ι HLA γονίδια (πράσινο). Αυτός ο χάρτης είναι μια συλλογή δεδομένων που περιγράφηκε και αναφέρθηκε νωρίτερα από τον Le Bouteiller (1994). ΕΙΚΟΝΑ 4: Σχηματικός χάρτης της χρωμοσωμικής περιοχής των HLA τάξης I (6p21-3) (Le Bouteiller 1994). Μια αξιοσημείωτη διαφορά μεταξύ των γονιδίων HLA τάξης Ia και Ib είναι ότι τα πρώτα είναι υψηλά πολυμορφικά, με πολλά αλληλόμορφα, ενώ τα τελευταία έχουν λίγες παραλλαγές. Κύριες διαφορές έχουν παρατηρηθεί σε γλυκοπρωτεΐνες που σχετίζονται με αυτές τις δυο υποομάδες της τάξης Ι αντιγόνων. Γενικά, τα αντιγόνα τάξης Ia είναι μεμβρανοσυνδεόμενα. Αντίθετα, ένα μέλος της ομάδας τάξης Ib, το HLA-G, είναι αποτέλεσμα διαφορετικής συρραφής. Έχουν αναγνωριστεί εφτά εναλλακτικά μεταγραφήματα, από τα 12
οποία τα τέσσερα κωδικοποιούν μεμβρανοσυνδεόμενες πρωτεΐνες και τα άλλα τρία κωδικοποιούν διαλυτές πρωτεΐνες. Μια τελευταία διαφορά είναι ότι τα αντιγόνα τάξης Ia εκφράζονται παντού, ενώ η έκφραση των αντιγόνων τάξης Ib μπορεί να είναι ειδική για ιστούς/όργανα και/ή εξαρτημένη. Τα κύτταρα της τροφοβλάστης στον άνθρωπο εκφράζουν ένα μόριο τάξης Ia (HLA-C) καθώς και τα τρία μόρια τάξης Ib. Το γονίδιο HLA-C είναι μετρίως πολυμορφικό, και θα μπορούσε να ενεργοποιήσει τη μητρική αντιεμβρυική επίκτητη ανοσία όταν τα πατρικά αλληλόμορφα διέφεραν από τα μητρικά. Μέχρι τώρα η ανομοιότητα των αλληλομόρφων στην περιοχή του HLA-C δεν φαίνεται να είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας στη γονιμότητα ή στον τερματισμό της εγκυμοσύνης. Τα άλλα HLA αντιγόνα τάξης I που εκφράζονται από τα κύτταρα της τροφοβλάστης είναι τα HLA-E, -F, και -G. Το γονίδιο HLA-E έχει δυο αλληλόμορφα (Grimsley and Ober, 1997) και το γονίδιο HLA-G έχει πέντε αλληλόμορφα (Ober and Aldrich, 1997). Δυο παραλλαγές του HLA-F δημοσιεύτηκαν σε online βάσεις δεδομένων (http://genome.ucsc.edu), τα οποία είναι μάλλον σπάνια στο γενικό πληθυσμό. Επιπλέον, οι περισσότεροι πολυμορφισμοί στο γονίδιο HLA-G δεν αλλάζουν την αμινοξική ακολουθία. Κάποια που την αλλάζουν δεν αλλάζουν παρόλα αυτά τη δευτεροταγή δομή των βαριών αλυσίδων (Ober and Aldrich, 1997). Από τα μόρια HLA τάξης Ib που εκφράζονται στα κύτταρα της τροφοβλάστης, το HLA-G ήταν το πρώτο που αναγνωρίστηκε και μένει ένα αντιγόνο μεγάλου ενδιαφέροντος ακόμα και ως ένας δείκτης αξιολόγησης (Hunt and Orr 1992). 3.1. HLA-G: Ένα καινούργιο γονίδιο που εκφράζεται στον πλακούντα Γενικά για το HLA-G: Το HLA-G είναι ένα μη-κλασικό αντιγόνο τάξης Ιb του μείζοντος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) με περιορισμένη κατανομή σε ιστούς κάτω από μη-παθολογικές συνθήκες (Carosella et al., 2003, Crisa et al., 1997). Παρόλο που είναι ικανό να δρα ως ένα μόριο παρουσίασης πεπτιδίου, οι ισχυρές ανοσοκατασταλτικές του ιδιότητες χαρακτηρίζουν το HLA-G σαν ένα μόριο μεσολάβησης στην ανοσολογική ανοχή, με ειδικότητα σε 13
απαραβίαστες ανοσολογικά περιοχές όπως η τροφοβλάστη ή ο θύμος. Επίσης εκφράζεται στην κυτοτροφοβλαστική ζώνη του ανθρώπινου πλακούντα (Carosella et al., 1995), καθώς και στον αμνιακό σάκο (Houlihan et al., 1995). Παρόλο που κατ αρχήν είναι ικανό για παρουσίαση αντιγόνων στα CD8 κύτταρα, το HLA-G ασκεί πάνω απ όλα λειτουργίες αρνητικής ανοσοβιολογικής ρύθμισης: το HLA-G αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των αλλογενών T κυττάρων (Wiendl et al., 2003), την κυτταροτοξικότητα των κυττάρων φυσικών φονιάδων (Riteau et al., 2001), καθώς και την κυτταροτοξικότητα των αντιγονοειδικών Τ κυττάρων (Wiendl et al., 2003). Το HLA-G ασκεί την άμεση ανοσο-καταστολική λειτουργία μέσω τριών μέχρι τώρα καθορισμένων κατασταλτικών υποδοχέων, ILT2 = CD85j, ILT4 = CD85d και KIR2DL4 = CD158d (Navarro et al., 1999). Οι Le Bouteiller and Mallet (1997) ανίχνευσαν 2 ισομορφές του HLA-G, ικανές για πρόσδεση του ίδιου αριθμού ενδοκυττάριων πεπτιδίων. Ο υποδοχέας τους περιλαμβάνει τρία αμινοξέα -άγκυρες- που είναι όμοια με τα κλασσικά HLA Ι μόρια. Οι διαφορετικές αυτές μορφές πιθανόν να αντανακλούν τη διαφορετική ικανότητα επαγωγής κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων ή καταστολής της λειτουργίας των φυσικών φονιάδων (ΝΚ) τουλάχιστον στο πρώτο τρίμηνο της εγκυμοσύνης (Burt et al., 1991). Η χαμηλή πολυμορφικότητα του γονιδίου όπως αναφέρεται από τους παραπάνω συγγραφείς υποθέτει ότι το HLA-G είναι ένα κοινό δεσμευτικό μόριο για τον υποδοχέα των ΝΚ λεμφοκυττάρων το οποίο προστατεύει τις τροφοβλάστες και προσφέρει ανοσολογική ανοχή στον εμβρυϊκό ιστό. Επίσης η αλληλεπίδραση των Τγ/δ λεμφοκυττάρων του φθαρτού με τα μη κλασικά τάξης Ι αντιγόνα HLA-G είναι πιθανόν να προστατεύει από μολυσμένες ή τροποποιημένες λαχνώδεις τροφοβλάστες (Μincheva-Nilsson et al., 1993). Η ικανότητα του HLA-G να διεγείρει CD8+ Τ λεμφοκύτταρα και να αναγνωρίζει μάρτυρες διαφοροποίησης στην επιφάνεια των κυττάρων αυτών, προϋποθέτει ότι το HLA-G μπορεί να λειτουργεί ως αναγνωριστικός και ως παράγοντας ενεργοποίησης για τα CD8+ κατασταλτικά/κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα. (Stoynowski and Lindahl 1994). Τα αντιγόνα τάξης Ι και ΙΙ βρίσκονται και ως διαλυτά αντιγόνα στον ορό. Οι μελέτες είναι εκτεταμένες κυρίως στον άνθρωπο. Έτσι έχει βρεθεί ότι 14
διαλυτά αντιγόνα τάξης Ι αυξάνονται στο δεύτερο τρίμηνο της εγκυμοσύνης, ενώ μειώνονται σε χαμηλότερα από τα φυσιολογικά όρια στο τρίτο τρίμηνο, για να ομαλοποιηθεί η τιμή τους στη μεταλόχεια περίοδο (Inostroza et al., 1997). Φαίνεται επίσης ότι τα διαλυτά ΗLA αντιγόνα προκαλούν την παραγωγή αλλο- και αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων που καταστέλλουν τα πρώτα (Reed et al., 1991). Φυσιολογικά, θα περιμέναμε η μητέρα να παράγει αντισώματα ενάντια στο έμβρυο μόσχευμα και κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (cytotoxic T lymphocytes (CTL) στα ξένα (πατρικά) HLA ή άλλα αντιγόνα που εκφράζονται από τα εμβρυικά κύτταρα. Παρόλο που οι μητέρες και οι πατέρες είναι τελείως διαφορετικοί σε πολλές HLA περιοχές, δεν υπάρχουν στοιχεία για την υπόθεση ότι η απόρριψη του εμβρύου είναι επακόλουθο της μητρικής αναγνώρισης του πατρικού HLA ως ξένο. Παρόλο που τα αντιπατρικά αντιγόνα HLA είναι κοινά στις έγκυες γυναίκες, δεν προκαλούν καμιά βλάβη. Ακόμα και νέα αντιγόνα HLA που εκφράζονται στις εμβρυικές μεμβράνες είναι μάλλον ανθεκτικά παρά ανοσογονικά (Hunt et al., 2003). Η επίθεση από μητρικά CTL επίσης ανατρέπεται αποτελεσματικά, όπως περιγράφεται λεπτομερώς παρακάτω. Έτσι, οι μηχανισμοί που τονίζουν τη μητρική ανθεκτικότητα είναι συχνά αποτελεσματικοί και δημιουργούν το κρίσιμο ερώτημα του πώς η ανοσολογική ασυλία μπορεί να καθοριστεί στη φυσική κατάσταση της εγκυμοσύνης έτσι ώστε να εξασφαλιστεί η επιβίωση του εμβρύου. Η εικόνα 5 δείχνει την παραδοχή ότι μητρικές και εμβρυικές διαδικασίες συμβάλλουν στη δημιουργία ενός ασφαλούς περιβάλλοντος. 15
προσταγλανδίνε ορμόνες κύτταρα ΝΚ Μήτρα μακροφάγα κυτοκίνες χημειοκίνες Εμφύτευση Αλληλεπίδραση μητέρας/εμβρύου Τοκετός ρυθμιστικές πρωτείνες συμπληρώματος ρυθμισμένο HLA οικογένεια Β7 ορμόνες Πλακούντας χημειοκίνες προσταγλανδίνε υπεροικογένεια TNF κυτοκίνες ΕΙΚΟΝΑ 5: Διάφοροι μηχανισμοί που αποτελούν τη βάση της ανθεκτικότητας του εμβρύου απέναντι στο μητρικό ανοσολογικό σύστημα (Hunt et al., 2005). Μέσα στη μήτρα, συμβαίνει μια δραματική αλλαγή στους ενδομήτριους υποπληθυσμούς λευκοκυττάρων ως συνέπεια της εμφύτευσης. Μετά από σφοδρή φλεγμονώδη αντίδραση που προκαλείται από τη διάρρηξη του επιθηλίου της μήτρας από τη βλαστοκύστη (μια αντίδραση περισσότερο τεκμηριωμένη στα τρωκτικά), το τροποποιημένο ενδομήτριο (που τώρα ονομάζεται φθαρτός υμένας) σταθεροποιείται σε μια δομή όπου παρέχεται τοπική προστασία από την έμφυτη ανοσοβιολογική αντίδραση. Από αυτό το σημείο και πέρα, τα κύρια στοιχεία στην επίκτητη ανοσία, τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, αναγνωρίζονται κυρίως στο μυομήτριο περιφεριακά στους εμβρυικούς ιστούς όπου μέλη του συστήματος της έμφυτης ανοσίας, κύτταρα φυσικοί φονιάδες (natural killer NK) και μακροφάγα, επικρατούν στο φθαρτό υμένα (Bulmer et al., 1988). Μια εξαίρεση αποτελεί η υποομάδα Treg των κυττάρων CD4/CD25, τα οποία παράγουν ιντερλευκίνη-10 (interleukin-10 IL- 10) και μεταμορφωτικό παράγοντα ανάπτυξης-1 (transforming growth factor-1 (TGF-1), και πιστεύεται ότι είναι κρίσιμη στη διατήρηση της ανοχής (Read and Powrie 2001). Αυτά τα κύτταρα, των οποίων ο πολλαπλασιασμός 16
ενεργοποιείται από οιστρογόνα (Polanczyk et al., 2004) περιλαμβάνουν το 14% των CD4 κυττάρων στον πρώιμο φθαρτό υμένα (Heikkinen et al., 2004). Σε πειράματα που έγιναν αρχικά σε ποντίκια, δείχνουν ότι τα δίκτυα κυτοκινών στη μήτρα, συμμετέχουν σε αντιδράσεις τύπου Th1 (Simon et al., 1995), επικρατούν σε σχέση με άλλου είδους κυτοκίνες και αντιδράσεις τύπου Th2 (Wegmann et al., 1993). Παρόμοιες μελέτες έχουν εφαρμοστεί σε εγκυμοσύνες ανθρώπων (Lysiak et al., 1995). Ανοσορυθμιζόμενες ορμόνες όπως η προλακτίνη, η χοριονική γοναδοτροπίνη και η προγεστερόνη είναι άφθονες. Οι χημειοκίνες δρουν ελέγχοντας τους αριθμούς και τους τύπους των ανοσοποιητικών κυττάρων. Η συμβολή του εμβρύου είναι μοναδική. Η εικόνα 6 δείχνει ότι το έμβρυο, το οποίο προέρχεται από την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης, απομονώνεται μέσα σε ένα προστατευτικό περίβλημα που αποτελείται από κύτταρα τροφοβλάστης που προέρχονται από το τροφοεξωδερμικό στρώμα της βλαστοκύστης. Πλακούντας Μήτρα Λευκοκύτταρα Μήτρα Άμνιο Συνδετικός ιστός Βασική μεμβράνη Χόριο Μήτρα ΕΙΚΟΝΑ 6: Μια σχηματική εικονογράφηση του ανθρώπινου εμβρύου, πλακούντα και εξωπλακουντικών μεμβρανών, και του τροποποιημένου ενδομητρίου γνωστό ως φθαρτός υμένας (Hunt et al., 2005). 17
Είναι έτσι βαριά η ευθύνη των κυττάρων της τροφοβλάστης να αλληλεπιδρούν κατάλληλα με το μητρικό περιβάλλον και να προστατεύουν το έμβρυο από τη μητρική ανοσοβιολογική επίθεση. Όπως φαίνεται στην εικόνα τα κύτταρα της τροφοβλάστης παρακάμπτουν τη βλάβη από τα αντισώματα εκθέτοντας υψηλά επίπεδα των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του συμπληρώματος (Hsi et al., 1991), και μειώνουν την κυτταρική ανοσία εκφράζοντας κατασταλτικά μέλη της οικογένειας B7 (Petroff et al., 2003), και μέλη της οικογένειας συνδετών (ligands) του παράγοντα νέκρωσης όγκου (tumor necrosis factor TNF ) που ενεργοποιούν την απόπτωση (Chen et al., 1991). Όπως και τα κύτταρα του φθαρτού υμένα, τα εμβρυικά κύτταρα παράγουν ανοσοκατασταλτικές κυτοκίνες, χημειοκίνες, και προσταγλανδίνες οι οποίες αμβλύνουν τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και εξάγουν υψηλά επίπεδα ανοσοκατασταλτικών ορμονών όπως η προγεστερόνη. Το πιο σημαντικό είναι ότι, τα κύτταρα της τροφοβλάστης ρυθμίζουν αυστηρά την έκφραση των γονιδίων HLA και την παραγωγή των πρωτεϊνών τους. Αυτές είναι οι πρωτεΐνες που, αν αναγνωριστούν ως ξένες από τα μητρικά ανοσοποιητικά κύτταρα, μπορούν να διεγείρουν τα μητρικά αντιεμβρυϊκά CTL που είναι ικανά να καταστρέψουν τα εμβρυικά κύτταρα που εκφράζουν HLA (Le Bouteiller 1994). Ανταυτού, τα αντιγόνα που εκφράζονται στα κύτταρα της τροφοβλάστης προγραμματίζουν τα μητρικά λευκοκύτταρα σε μηχανισμούς ανοχής. 3.1.1. Τι είναι μη κλασικό στο HLA-G: Πιθανοί διαφορετικοί μοριακοί ρυθμιστικοί μηχανισμοί ελέγχουν την έκφραση των τάξης Ια και τάξης Ιb μορίων ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο, το στάδιο διαφοροποίησης και το στάδιο της εγκυμοσύνης (Le Bouteiller et al., 1996). Δομικά χαρακτηριστικά του HLA-G: Το HLA-G1 έχει μια δομή παρόμοια με αυτήν των μορίων κλασικού HLA τάξης I: μια βαριά αλυσίδα συνδεδεμένη με β2-μικροσφαιρίνη και ένα πεπτίδιο. Παρόλ αυτά είναι μοναδική από τις περισσότερες άλλες πλευρές. Η 18
αλληλουχία του γονιδίου HLA-G είναι επίσης υψηλά ομόλογη με αυτή των κλασικών γονιδίων HLA τάξης I. Το γονίδιο HLA-G έχει οχτώ εξώνια τα οποία κωδικοποιούν: ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο (εξώνιο 1), τις 1, 2, και 3 περιοχές (εξώνια 2, 3, και 4, αντίστοιχα), τη διαμεμβρανική περιοχή (εξώνιο 5), και την ενδοκυτταρική περιοχή (εξώνια 6 και 7). Οι περιοχές 1, 2 και 3 αποτελούν το εξωτερικό τμήμα του μορίου HLA-G. Οι α1 και α2 συνεισφέρουν στην πεπτιδιο-συνδεόμενη αύλακα. Επιπλέον το HLA-G διαθέτει εφτά ιντρόνια και μια 3 -αμετάφραστη περιοχή (Carosella et al., 1999) (εικόνα 7). Υπάρχει μια υψηλή συντήρηση των βρόχων (loops) που συνδέονται στα CD8 και έχει δειχθεί μια αλληλεπίδραση μεταξύ HLA-G και CD8. ΕΙΚΟΝΑ 7: Οι περιοχές του γονιδίου του HLA-G και οι διάφορες πρωτεΐνες που προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή του mrna (Hunt et al., 2005). Ωστόσο, ένα ανώριμο κωδικόνιο λήξης καταλήγει σε μια ψαλιδισμένη κυτταροπλασματική ουρά που αποκαλύπτει ένα κρυφό μοτίβο (cryptic retrieval motif). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παρατεταμένη έκφραση των HLA-G στην κυτταρική επιφάνεια, και πιθανά την ανεπαρκή παρουσίαση εξωγενών πεπτιδίων. Ο Park και οι συνεργάτες του το ερμήνευσαν ως ένδειξη 19
ότι η πρωταρχική λειτουργία του HLA-G δεν είναι η παρουσίαση αντιγόνου αλλά ως ένας κατασταλτικός συνδέτης (ligand) για τα κύτταρα NK (Park et al., 2001). Η κρυσταλλική δομή του HLA-G έχει καθοριστεί πρόσφατα (Clements et al., 2005). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η περιοχή σύνδεσης για τον λευκοκυτταρικό Ig υποδοχέα 1 (LIR-1 or ILT2) και LIR-2 (or ILT4), (κατασταλτικοί υποδοχείς) είναι στην α3 περιοχή του HLA-G, και αυτή η περιοχή είναι δομικά διαφορετική από την α3 περιοχή των κλασικών μορίων του MHC τάξης I. Το HLA-G μπορεί να προσδέσει πεπτίδια. Σε κύτταρα που έχουν επιμολυνθεί με HLA-G (B lymphoblastoid cell line 721.221), τα μόρια HLA-G συνδέονται με πεπτίδια που προέρχονται από μια ποικιλία ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών. Ωστόσο, η περιπλοκότητα των συνδεμένων πεπτιδίων μπορεί να είναι χαμηλότερη απ οτι αυτή κάποιων μορίων HLA τάξης Ia (Diehl et al., 1996). In vivo, στον πλακούντα, ένα απλό πεπτίδιο που προέρχεται από μια πρωτεΐνη που σχετίζεται με κυτοκίνη αποτελεί το 15% της μοριακής αναλογίας των πεπτιδίων που συνδέονται με το HLA-G. Η σημαντικότητα αυτού δεν είναι γνωστή. Επιπλέον, η περιπλοκότητα των πεπτιδίων που συνδέονται με μόρια HLA-G στον πλακούντα φαίνεται να είναι χαμηλότερη από αυτή των πεπτιδίων που συνδέονται με HLA-G σε διαμολυνσμένα κύτταρα (Ishitani et al., 2003). Η σύνδεση των πεπτιδίων στο HLA-G φαίνεται να είναι ένας ασυνήθιστος τρόπος σύνδεσης που θυμίζει αυτόν του μορίου HLA-E (Clements et al., 2005). Η HLA-G μεμβρανική πρωτεΐνη πλήρους μήκους αγκυροβολεί στην κυτταρική μεμβράνη με τη διαμεμβρανική περιοχή (εξώνιο 5). Ανάμεσα στα αντιγόνα HLA τάξης I, το HLA-G είναι ειδικό γιατί εκφράζεται σε διαφορετικές μεμβρανικές και διαλυτές ισομορφές που παράγονται από εναλλακτική συρραφή του HLA-G mrna (Fujii et al., 1994) (βλ. παρακάτω). 3.1.2. Εναλλακτικά συρραμένες μεμβρανοσυνδεόμενες και διαλυτές ισομορφές του mrna του μορίου HLA-G Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του HLA-G είναι ότι κωδικοποιεί πολλαπλές ισομορφές ως αποτέλεσμα εναλλακτικής συρραφής. Το mrna 20
του HLA-G μπορεί να συρραφεί εναλλακτικά σε βραχύτερα μετάγραφα από τα οποία λείπουν περιοχές συμπληρωματικές με ένα ή περισσότερα ολόκληρα εξώνια (εικόνα 8). Πέντε από τα εφτά μετάγραφα που προκύπτουν από την εναλλακτική συρραφή φαίνονται στην εικόνα 8. ΕΙΚΟΝΑ 8: Οι διάφορες ισομορφές του HLA-G που προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή του mrna (Bainbridge et al., 2001). Μ αυτόν τον τρόπο, έχουν περιγραφεί τέσσερις διαφορετικές HLA-G ισομορφές που κωδικοποιούν ψαλιδισμένες μεμβρανοσυνδεόμενες πρωτεΐνες (HLA-G1, -G2, -G3 και HLA-G4) (Carosella et al., 1999). Η ισομορφή HLA-G1 πλήρους μήκους είναι δομικά παρόμοια με άλλα γονίδια της τάξης I, εκτός από την ψαλιδισμένη κυτταροπλασματική ουρά η ισομορφή G2 προκύπτει από τη μετακίνηση του εξωνίου 3 και ομοδιμερίζεται για να σχηματίσει μια δομή παρόμοια με HLA τάξης II (Morales et al., 2003). Αυτές οι δυο ισομορφές εκφράζονται ως διαλυτές πρωτεΐνες (HLA-G5 και -G6, αντίστοιχα) λόγω του ότι στο ώριμο mrna περιλαμβάνονται αλληλουχίες του ιντρονίου 4, έχοντας σαν αποτέλεσμα την έκκριση πρωτεϊνών με 21 επιπρόσθετα αμινοξέα (που κωδικοποιείται από αλληλουχίες του ιντρονίου 4) μετά την περιοχή 3 (Fujii et al., 1994). Επιπλέον, η διατήρηση του ιντρονίου 4 στο πρωτογενές HLA-G μετάγραφο (περιλαμβάνοντας ένα ανώριμο κωδικώνιο λήξης) προστατεύει τη 21
μετάφραση τόσο των διαμεμβρανικών όσο και των κυτταροπλασματικών περιοχών δημιουργώντας με αυτόν τον μοναδικό τρόπο τρεις επιπλέον διαλυτές ισομορφές (HLA-G5, -G6 και HLA-G7) (Carosella et al., 2000). Η θεωρούμενη πρωτεϊνική δομή ολόκληρης της ισομορφής HLA-G1 μοιάζει με ένα από τα κλασσικά HLA μόρια, που αποτελείται από τρεις σφαιρικές εξωκυτταρικές περιοχές που συνδέονται με την β2-μικροσφαιρίνη 5. Αυτό αναφέρεται επίσης και στη διαλυτή μορφή HLA-G5 πλήρους μήκους (εικόνα 8). Το HLA-G3 προκύπτει από την απομάκρυνση των εξονίων 3 και 4. Τα mrnas των HLA-G4 και -G7 (δεν φαίνονται στην εικόνα 8) δεν υπάρχουν σε αφθονία στον πλακούντα. Το εξώνιο 4 (που κωδικοποιεί την 3 περιοχή) αναδιπλώνεται έξω από το μετάγραφο HLA-G4. Το μετάγραφο HLA-G7 περιλαμβάνει το εξώνιο 2 και μέρος του ιντρονίου 2 και προβλέπεται ότι κωδικοποιεί μια μικρή διαλυτή ισομορφή. Οι βραχύτερες μορφές που δεν έχουν εξώνιο 3 (HLA-G2, -G4, ή HLA- G6) μπορεί εναλλακτικά να υπάρχουν ως ψαλιδισμένα μόρια μη συνδεδεμένα με β2-μικροσφαιρίνη, δημιουργώντας σύμπλοκα ομοδιμερών παρόμοια με τα μόρια HLA τάξης II. Μέχρι σήμερα, η μεγαλύτερη σε μήκος HLA-G ισομορφή φαίνεται να είναι η μόνη, η δομή της οποίας επιτρέπει σταθερή έκφραση στα διαμολυνσμένα κύτταρα (Le Bouteiller and Solier, 2001). 3.1.3. Πολυμορφισμός του HLA-G Έρευνες στο γονίδιο HLA-G και των πρωτεϊνικών του προϊόντων (Kovats et al., 1990) δείχνουν ότι το HLA-G είναι σχετικά μη πολυμορφικό. Αυτό έρχεται σε έντονη αντίθεση προς τα γονίδια της κλασικής τάξης Ia και II, HLA-A, -B και -C, τα οποία είναι ανάμεσα στα πιο πολυμορφικά όλων των ανθρώπινων γονιδίων. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί ως τώρα μόνο τέσσερις πολυμορφισμοί αμινοξέος στις πρωτεΐνες HLA-G. Αυτό το αρχικό εύρημα επιβεβαιώθηκε από δεδομένα αλληλουχίας που προήλθαν από διάφορους πληθυσμούς ανθρώπων (Moreau et al., 1998). Η εικόνα 9 δείχνει την περιοχή των 13 πολυμορφισμών στα εξώνια 1 4 που έχουν αναγνωριστεί μέχρι σήμερα και έναν στην 3_UTR. Όσον αφορά 22
το HLA-G, πολυμορφισμός έχει αναφερθεί επίσης στην 5 -ανοδική ρυθμιστική περιοχή (upstream regulatory region - 5 URR), στην περιοχή του προαγωγέα και στην 3 -αμετάφραστη περιοχή (3 -untranslated region - 3 UTR) του γονιδίου (Harrison et al., 1993; Hviid et al., 2003). Πολυμορφισμοί στο κωδικόνιο 31 στην περιοχή 1 (Thr3Ser), στο κωδικόνιο 110 στην περιοχή 2 (Leu3Ile), και στο κωδικόνιο 258 στην περιοχή3 (Thr3Met) προκύπτουν απο αντικατάσταση αμινοξέως. Πολυμορφισμοί στο νουκλεοτίδιο 15 και 36 στο εξώνιο 1, στα κωδικόνια 35, 57, και 69 στο εξώνιο 2, στα κωδικόνια 93, 100, και 107 στο εξώνιο 3, και στο κωδικόνιο 188 στο εξώνιο 4 δεν τροποποιούν την αμινοξική αλληλλουχία της πρωτεΐνης. Ένα έλλειμμα απλής βάσης (base pair bp) στο νουκλεοτίδιο 1597 προκαλεί μετατόπιση στο αμινοξύ 130 (Suarez et al., 1997), έχοντας ως αποτέλεσμα τις μη λειτουργικές πρωτεΐνες HLA-G1 και -G5 (Ober et al., 1998). Οι πολυμορφισμοί που τροποποιούν την πρωτεϊνική αλληλουχία καθορίζουν πέντε αλληλόμορφα, που ονομάζονται G*0101, G*0103, G*0104, G*0105N, και G*0106. Σιωπηλές παραλλαγές ανάμεσα σε αυτές τις αλληλομορφικές τάξεις καθορίζουν υποτύπους που αναφέρονται ως G*010101, G*010102, κλπ. Ο μικρός αριθμός των HLA-G αλληλομόρφων που ανακαλύφθηκαν κωδικοποιούσαν μόνο τρεις διαφορετικές αμινοξικές πρωταρχικές αλληλουχίες το αρχικό G*0101 αλληλόμορφο, το G*0103 [που κωδικοποιεί μια αντικατάσταση θρεονίνης (Thr) σε σερίνη (Ser) στο κωδικόνιο 55 ενός ανοιχτού αναγνωστικού πλαισίου (open reading frame (ORF) στην α1 περιοχή] και το G*0104 [που κωδικοποιεί μια αντικατάσταση λευκίνης (Leu) σε ισολευκίνη (Ile) στο κωδικόνιο 134 του ORF στην α2 περιοχή]. Αυτός ο σχετικά μη πολυμορφισμός του HLA-G αποτέλεσε τον πυρήνα πολλών θεωριών για τη λειτουργία του πατρικά κληρονομούμενα HLA-G γονίδια που εκφράζονται από το έμβρυο μπορεί να παράγουν πρωτεΐνες σχεδόν πανομοιότυπες με αυτές της μητέρας. Έτσι, το HLA-G θεωρήθηκε ότι είναι ένα μόριο τάξης Ι που θα μπορούσε να εκφράζεται στην τροφοβλάστη, και ασκεί κάποια μη ειδική ανοσολογική λειτουργία, χωρίς να αναγνωρίζεται ως ξένο από το μητρικό ανοσοποιητικό σύστημα. Αυτή η ιδέα του HLA-G ως ένα πανομοιότυπο στο μητρικό μόριο τάξης Ι ανατράπηκε με μια εργασία που δημοσιεύτηκε το 1994, η οποία πρότεινε ότι το HLA-G, σε αντίθεση με παλαιότερα ευρήματα, είναι πολυμορφικό σε έναν Αφροαμερικανικό πληθυσμό (van der Ven and Ober, 23
1994). Στη συγκεκριμένη εργασία, αναγνωρίστηκαν πολλές παραλλαγές του HLA-G που μάλλον κωδικοποιούν πρωτεΐνες διαφορετικές από αυτές που κωδικοποιούνται από προηγούμενα δημοσιευμένες HLA-G αλληλουχίες ολόκληρων των εξωκυττάριων περιοχών α1, α2 και α3. Οι συνέπειες αυτού του ευρήματος για την εξέλιξη και λειτουργία του HLA-G ήταν απόλυτα ασαφείς. Η αντίληψη ότι το HLA-G παρουσιάζει συγκριτικά μικρό πολυμορφισμό ήρθε να θεωρηθεί κεντρική στην προτεινόμενη λειτουργία του ως ένα πλακουντικό μόριο του MHC που δεν θα ενεργοποιούσε μια αλλοαντίδραση. Ίσως θα μπορούσε να λειτουργεί με αυτόν τον τρόπο σε κάποιους ανθρώπινους πληθυσμούς αλλά όχι σε άλλους; Επίσης, αν το HLA- G είναι μονομορφικό στους περισσότερους ανθρώπους, τι δυνάμεις δρουν για να διατηρήσουν πολλαπλές αλληλομορφικές παραλλαγές στους Αφρομερικάνους; Αυτή η σύγχυση λύθηκε το 1999 από τις σχεδόν ταυτόχρονες επανεξετάσεις του πολυμορφισμού του HLA-G από δυο διαφορετικές ερευνητικές ομάδες. Η πρώτη μελέτη χρησιμοποίησε καθιερωμένες γονιδιωματικές τεχνικές PCR σε δείγματα αφροαμερικανών και δεν βρήκαν κάποια εμφανή διαφοροποίηση με τη μελέτη του 1994 (Ishitani et al., 1999). Η δεύτερη ομάδα χρησιμοποίησε μια διαφορετική προσέγγιση, και συνέκριναν προϊόντα PCR που προήλθαν από γονιδιωματικό DNA και τροφοβλαστικό cdna από νεογνά Βρετανών Καυκάσιων με Βρετανούς Αφροκαραϊβικανούς. Ξανά, μικρός πολυμορφισμός ανακαλύφτηκε σε μια άλλη ομάδα, αλλά οι επιπλέον πολυμορφισμοί που ανιχνεύθηκαν στην Αφροαμερικανική μελέτη έδειξαν να προέρχονται από τη χρήση εκκινητών που σχεδιάστηκαν να είναι συμπληρωματικοί στα ελλειπώς καθορισμένα ιντρόνια του HLA-G (Bainbridge et al.,1999). Τα αποτελέσματα αυτών των δυο μελετών, καταργούν την υπόθεση ότι οι κωδικοποιούσες περιοχές του HLA-G είναι πολυμορφικές σε κάποιους ανθρώπινους πληθυσμούς. Στο αμετάφραστο εξώνιο 8 υπάρχει ένας πολυμορφισμός προσθήκης/ελλείμματος 14 bp. Σε αντίθεση με την περιοχή HLA τάξης Ia, αντικαταστάσεις αμινοξέως στα κωδικόνια 31 και 110 στις περιοχές 1 και 2, αντίστοιχα, είναι συντηρητικές αλλαγές που συμβαίνουν σε μονομερή που δεν προβλέπεται να αντιδράσουν με συνδεδεμένο πεπτίδιο ή υποδοχέα Τ κυττάρων (Ober and Aldrich 1997). Ο τρίτος αμινοξικός πολυμορφισμός στο κωδικόνιο 258 είναι μια μη συντηρημένη αντικατάσταση στην περιοχή 3 η 24
οποία είναι υψηλά συντηρημένη στα γονίδια τάξης Ia (Hviid et al., 2001). Βρίσκεται στη δομή πτυχωτού φύλλου της περιοχής 3, όπου μπορεί να επηρεάσει την αναγνώριση του CD8 στις HLA-G1 και -G5 ισομορφές, ή τη σύνδεση στο CD4 στις HLA-G2 και -G6 ισομορφές (Hunt et al., 2003). Τέλος, ένα πολυμορφικό έλλειμμα 1 bp ενός μονομερούς κυτοσίνης (C) στο κωδικόνιο 130 έχει ως αποτέλεσμα ένα ανενεργό αλληλόμορφο (ονομάζεται G*0105N), που δεν κωδικοποιεί λειτουργικές πρωτεϊνικές ισομορφές HLA-G1 ή -G5. Αυτή η μετάλλαξη, που ονομάζεται 1597C, εμφανίζεται στην ομόζυγη μορφή σε φαινομενικά υγειή άτομα, δείχνοντας ότι οι ισομορφές HLA-G1 και - G5 δεν είναι ουσιώδεις για την εμβρυική επιβίωση (Ober et al., 1998). Σε αυτές τις περιπτώσεις άλλες ισομορφές αρκούν (Menier et al., 2000). Ωστόσο, αυτό το ανενεργό αλληλόμορφο έχει σχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο για καθ έξιν αποβολές (Aldrich et al., 2001), προτείνοντας ότι οι πρωτεΐνες HLA-G1 και/ή -G5 παίζουν πραγματικά έναν σημαντικό ρόλο στην αναμονή εγκυμοσύνης και ότι μειωμένα επίπεδα της μιας ή και των δυο είναι ένας παράγοντας επικινδυνότητας για καθ έξιν αποβολές. Ένας πολυμορφισμός προσθήκης/ελλείμματος 14 bp στο αμετάφραστο εξώνιο 8 περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Harrison και τους συνεργάτες του (Harrison et al., 1993), αλλά έχει δειχθεί πρόσφατα ότι επηρεάζει το μέγεθος και τη σταθερότητα του mrna μετάγραφου. Η παρουσία του αλληλομόρφου προσθήκης 14 bp παράγει ένα έλλειμμα 92 bp στο 3_UTR των mrnas του G*01012 και του G*01013, πιθανά επειδή δρα ως κρυφή θέση συναρμολόγησης (Hiby et al., 1999). Μετάγραφα με το έλλειμμα 92 bp σχετίστηκαν με πιο σταθερά mrna σε κύτταρα JEG-3 (τα οποία είναι ομόζυγα για το G*01013) και σε μια M8 κυτταρική σειρά που επιμολύνθηκε με G*01012, ίσως επειδή ήταν λιγότερο επιρρεπείς στη διάσπαση (Rousseau et al., 2003). Επιπλέον, η σχετική αφθονία των εναλλακτικά αναδιπλωμένων μετάγραφων μπορεί να επηρεαστεί από πολυμορφισμούς στο HLA-G. Για παράδειγμα, μελετώντας το mrna από στελεχιαία κύτταρα τροφοβλάστης, οι Hviid et al., (2003) έδειξαν ότι οι ετεροζυγώτες για το αλληλόμορφο G*01012 (αλλά όχι το αλληλόμορφο G*01013) έχουν μειώσει τα επίπεδα των μεταγράφων που κωδικοποιούν μεμβρανοσυνδεόμενες ισομορφές (G1, G2, G3) με την προσθήκη 14 bp, ενώ οι ετεροζυγώτες για το αλληλόμορφο G*01013 (αλλά όχι για το αλληλόμορφο G*01012) είχαν υψηλότερα επίπεδα 25
από τα μετάγραφα G2/G4 παρά το αλληλόμορφο G*01011 (Hviid et al., 2003). Παρόλο που η σημαντικότητα αυτών των ευρημάτων δεν είναι ξεκάθαρη, είναι αξιοσημείωτο ότι ο αριθμός των μελετών έχουν δείξει μειωμένη έκφραση των HLA-G mrna ή της πρωτεΐνης σε εγκυμοσύνες με προεκλαμψια (αύξηση της αρτηριακής πίεσης της μητέρας μετά την 20ή εβδομάδα της κύησης) (Colbern et al., 1994). Η έλλειψη σχέσης μεταξύ του ανενεργού αλληλομόρφου G*0105N και της προ-εκλαμψίας (pre-eclampsia) σε μια μελέτη πρότεινε ότι οι βλάβες των HLA-G1 και/ή -G5 ισομορφών δεν ήταν ένας παράγοντας επικινδυνότητας για προ-εκλαμψία (Aldrich et al., 2000), αλλά μειωμένη έκφραση άλλων ισομορφών, όπως το βραχύ G3 μετάγραφο, μπορεί να επηρεάσει τον κίνδυνο. Στην πραγματικότητα, η σχετική αφθονία των μεταγράφων και μη κωδικών πολυμορφισμών στο HLA- G έχουν σχετιστεί με προ-εκλαμψία (O'Brien et al., 2001), προτείνοντας ότι η ρύθμιση της έκφρασης του HLA-G επηρεάζεται από τη γενετική ποικιλομορφία. Αυτή η πρόταση υποστηρίζεται περεταίρω από την πρόσφατη ανακάλυψη ποικιλομορφίας στην 5-ανοδική ρυθμιστική περιοχή του HLA-G (Ober et al., 2003). Σε αντίθεση με τον περιορισμένο πολυμορφισμό στα εξώνια, οι ανοδικές περιοχές που περιλαμβάνουν όλους τους γνωστούς προαγωγείς και τα ρυθμιστικά στοιχεία είναι πάρα πολύ πολυμορφικές (εικόνα 9). 26
ΕΙΚΟΝΑ 9: Παραλλαγές στην 5 -ανοδική ρυθμιστική περιοχή του HLA-G (Hunt et al., 2005). Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 18 πολυμορφισμοί στο σημείο 1300 bp ανοδικά από το εξώνιο 1. Οι περισσότεροι είναι πολύ κοινοί πολυμορφισμοί με μικρές συχνότητες αλληλομόρφων (<20%), και μερικοί βρίσκονται μέσα ή κοντά σε θέσεις σύνδεσης μεταγραφικών παραγόντων (εικόνα 7). Αυτοί οι πολυμορφισμοί ορίζουν τουλάχιστον οχτώ μοναδικούς απλότυπους (Ober et al., 2003). Κάποιοι απλότυποι της περιοχής του προαγωγέα παρουσιάζονται σε σχέση με αλληλόμορφα που διαφέρουν στις κωδικοποιούσες περιοχές τους (για παράδειγμα, τα G*01012, G*0105N, και G*01061 έχουν πανομοιότυπες αλληλουχίες της περιοχής του προαγωγέα), ενώ κάποια αλληλόμορφα με πανομοιότυπες κωδικοποιούσες περιοχές έχουν διαφορετικούς απλοτύπους των κωδικοποιουσών περιοχών (π.χ., το κοινό αλληλόμορφο G*01011 σχετίζεται τουλάχιστον με τρεις διαφορετικές αλληλουχίες περιοχής του προαγωγέα). Μια παραλλαγή, 725G, αλλάζει την κατάσταση μεθυλίωσης ενός δινουκλεοτιδίου CpG στην περιοχή του προαγωγέα και έχει σχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο για σποραδικές αποβολές σε ένα τυχαίο δείγμα υγειών γυναικών, το οποίο προτείνει ότι τουλάχιστον 27
κάποιοι από αυτούς τους πολυμορφισμούς μπορεί να επηρεάσουν τη μεταγραφή και την αφθονία του mrna (Ober et al., 2003). 3.2. Έκφραση και λειτουργία του HLA-G 3.2.1. Πρότυπα έκφρασης του HLA-G Μια από τις πιο σημαντικές ιδιότητες του HLA-G είναι οι τοποθεσίες έκφρασής του. Η έκφραση του αντιγόνου HLA τάξης I είναι περιορισμένη και αναγνωρίστηκε αρχικά και έχει περιγραφεί σε εναιωρήματα κυτταρικής καλλιέργειας από κυτταρικές σειρές που προέρχονται από τροφοβλάστη (Fournel et al., 1999), στον κυτταρικό πληθυσμό της εξωλαχνώδους τροφοβλάστης, με πρωτεΐνες κυρίως εμφανείς σε κύτταρα άμεσα γειτονικά στο φθαρτό υμένα τόσο σε πρώιμη όσο και σε προχωρημένη κύηση, στα μακροφάγα του πλακούντα και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στις μεσεγχυματικές χοριονικές λάχνες (Le Bouteiller et al., 1999). Επίσης το HLA-G εκφράζεται πάνω σε κύρια κύτταρα του ανοσοβιολογικού συστήματος (στις περισσότερες περιπτώσεις μονοκύτταρα) και στο θύμο (Rebmann et al., 2003). Τα κύτταρα της τροφοβλάστης είναι ανοσοβιολογικά ουδέτερα: δεν εκφράζουν ούτε μόρια MHC-I ούτε μόρια MHC-II. Τα κύτταρα που δεν έχουν κανένα από τα δυο MHC's συνήθως καταστρέφονται. Ωστόσο, το HLA-G καταστέλλει αυτή την απόκριση. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης HLA-G περιορίζεται σε ανοσολογικά προστατευμένες περιοχές όπως ο πλακούντας και ο θύμος (Le Bouteiller and Solier, 2001). Σε αυτούς τους ιστούς δεν εκφράζουν HLA-G όλοι οι κυτταρικοί τύποι μόνο τα κύτταρα της εξωλάχνιας κυτοτροφοβλάστης, τα αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα, τα εμβρυικά επιθηλιακά κύτταρα και τα μακροφάγα στο μεσέγχυμα των χοριονικών λαχνών των πρώτων και τα επιθηλιακά κύτταρα του μυελού στα τελευταία (Crisa et al., 1997). Μια τόσο περιορισμένη ιστική και κυτταρική διαφοροποίηση υποδηλώνει ότι η μετα-μεταγραφική ρύθμιση του HLA-G είναι θεμελιώδης για αυτήν την έκφραση. Οι διαλυτές μορφές του HLA-G έχουν 28
ανιχνευτεί σε αμνιακό υγρο, πλακουντικά μακροφάγα, περιφερικό μητρικό αίμα και αίμα του λώρου (Schust et al., 1999). Ωστόσο, το αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται συχνότερα για την αναγνώριση αυτών των αντιγόνων σε τομές ιστών ή απομονωμένα κύτταρα, το μονοκλωνικό αντίσωμα W6/32 του ποντικού, απαιτεί σύνδεση ελαφριάς αλυσίδας (2m)/βαριάς αλυσίδας, και έτσι δεν ανιχνεύτηκαν ελεύθερες βαριές αλυσίδες ούτε ισομορφές όπως HLA-G2 και -G6 που δεν συνδέονται με 2- μικροσφαιρίνη (2m). Πιο πρόσφατες μελέτες που χρησιμοποίησαν μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν την αμινοξική ακολουθία που προέρχεται από νουκλεοτίδια του ιντρονίου 4 (16G1 το οποίο παρήχθη από τον D. Geraghty είναι ένα καλό παράδειγμα) έχει πρόσθετα δεδομένα περιοχών πάνω στις βαριές αλυσίδες των HLA-G5 και -G6. Νέα αντισώματα ειδικά για ισομορφές δείχνουν ότι το HLA-G5 υπάρχει παντού στον πλακούντα και μέσα στη χοριονική μεμβράνη, στο φθαρτό υμένα, και στο μητρικό αίμα. Σε λαχνώδη CTB κύτταρα, το HLA-G5 είναι πιθανόν να μην έχει βαριές αλυσίδες αφού λείπει η 2 μικροσφαιρίνη. Ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει τα HLA-G2 και -G6 δείχνει ότι μια ή κάποια άλλη από αυτές τις ισομορφές είναι εμφανείς στα κύτταρα της εξωλαχνώδους κυτοτροφοβλάστης περιφερικά στις λάχνες του πλακούντα, στα κύτταρα της κυτοτροφοβλάστης που φιλτράρουν το φθαρτό υμένα, και κάποια κύτταρα κυτοτροφοβλάστης της χοριονικής μεμβράνης (Morales et al., 2003) (εικόνα 10). 29
ΕΙΚΟΝΑ 10: Οι HLA-G2/G6 ισομορφές μειώνονται κατά τη διάρκεια της μετανάστευσης της κυτοτροφοβλάστης (Hunt et al., 2005). Το HLA-G2/G6 βρίσκεται στα ίδια κύτταρα όπως το HLA-G1, προτείνοντας ότι σε γυναίκες που διαθέτουν το ανενεργό (σιωπηλό) αλληλόμορφο (G*0105N), που δεν κωδικοποιεί λειτουργικές HLA-G1 ή -G5 πρωτεϊνικές ισομορφές, το HLA-G2/G6 μπορεί να αποτελεί ένα επαρκές υποκατάστατο (Ober et al., 1998). Στην παρακάτω εικόνα (εικόνα 11), οι κυτταρικοί τύποι που εκφράζουν HLA-G στην επιφάνειά τους είναι τονισμένοι με φουξίνη. Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης HLA-G μπορεί μερικές φορές να παρατηρηθεί στις μυϊκές ίνες και στη χολή, καθώς και στα νεφρικά σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα (Creput et al., 2003). Το HLA-G μπορεί να ανιχνευτεί σε ορό/πλάσμα τόσο γυναικών όσο και ανδρών, αλλά υπάρχει μια αντιπαράθεση στις διάφορες δημοσιευμένες εργασίες για το αν το shla-g μπορεί να ανιχνευτεί στο αίμα όλων των ανδρών και μη εγκύων γυναικών κάτω από φυσιολογικές συνθήκες (Hviid et al., 2004). 30