ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΕΝ ΟΓΕΝΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΕΛΑΙΟΛΑ ΟΥ ΣΕ W/O ΝΑΝΟΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΕΛΑΙΟΛΑ Ο ΧΩΡΙΣ ΣΥΝ- ΕΠΙΦΑΝΕΙΟ ΡΑΣΤΙΚΗ ΟΥΣΙΑ - ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ Ι ΙΟΤΗΤΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥΣ Μ. Κατσούλη, Β. Πολυχνιάτου, Κ.Τζιά Eργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, Σχολή Χηµικών Μηχανικών Ηρώων Πολυτεχνείου 5, Πολυτεχνειούπολη, Ζωγράφου, ΑΘΗΝΑ, 15780 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία εξετάζεται η δυνατότητα σχηµατισµού και οι φυσικοχηµικές ιδιότητες w/o νανογαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο µε ενσωµάτωση ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου µε αµφιφιλικό χαρακτήρα, χρησιµοποιώντας µη-ιονικούς γαλακτωµατοποιητές (Tween 20 και Tween 40), χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Τα ενδογενή συστατικά που µελετήθηκαν ήταν: γαλλικό οξύ, καφεϊκό οξύ, κερσετίνη, συριγγικό οξύ, βανιλικό οξύ και ασκορβικό οξύ. Αρχικά, µε βάση τα ψευδο-τριµερή διαγράµµατα φάσης (έλαιο-νερό-γαλακτωµατοποιητής) που κατασκευάστηκαν, όπου παρουσιάζονται τα σταθερά νανο-γαλακτώµατα, προσδιορίστηκε η γαλακτωµατοποιητική ικανότητα καθενός ενδογενούς συστατικού χωριστά όπως και του γαλακτωµατοποιητή. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν νανογαλακτώµατα στις επιτρεπόµενες αναλογίες όπως καθορίστηκαν από τα διαγράµµατα φάσης και επεξεργάστηκαν τα δεδοµένα που προέκυψαν από τον προσδιορισµό των ιδιοτήτων τους. Η επίδραση καθενός ενδογενούς συστατικού χωριστά, όπως και του είδους του γαλακτωµατοποιητή και της συγκέντρωσής του στα συστήµατα νανογαλακτωµάτων αξιολογήθηκε µε βάση τη διάµετρο των σταγονιδίων, τη σταθερότητα, τη θολότητα, το ιξώδες, και το χρώµα των γαλακτωµάτων. Από τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης συµπεραίνεται αρχικά ότι είναι δυνατόν να παρασκευαστούν σταθερά w/o νανογαλακτώµατα µε βάση το ελαιόλαδο χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Επιπλέον αποδείχτηκε ότι η προσθήκη ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου επηρέασε θετικά τις ιδιότητες των γαλακτωµάτων. Τέλος, προσδιορίστηκε ο πιο αποτελεσµατικός τύπος ενδογενούς συστατικού και γαλακτωµατοποιητή καθώς και η βέλτιστη αναλογία στην οποία πρέπει να προστεθεί στο σύστηµα. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα w/o (νερό-σε-έλαιο) νανογαλακτώµατα παρουσιάζουν µεγάλο ενδιαφέρον για τη βιοµηχανία τροφίµων και βρίσκουν χρήση σε διάφορες εφαρµογές τροφίµων. Περιέχουν σταγονίδια πολύ µικρής διαµέτρου (10<d<500 nm) και έχουν έναν αριθµό δυνητικών πλεονεκτηµάτων έναντι των συµβατικών γαλακτωµάτων για τον εγκλεισµό και τη διανοµή υδρόφιλων ουσιών (βιοενεργών συστατικά) σε τρόφιµα και ποτά [1,2]. Χαρακτηρίζονται από υψηλή οπτική καθαρότητα, κινητική σταθερότητα και αυξηµένη βιοδιαθεσιµότητα. Μπορούν να βελτιώσουν τη διαλυτότητα µη αναµίξιµων, κατά τα άλλα, υγρών, ενώ προσδίδουν µεγάλη επιφάνεια αλληλεπίδρασης ανάµεσα στο νερό και τη λιπαρή φάση. Τα συστήµατα αυτά περιέχουν µικροδοµές διαφορετικής πολικότητας µέσα στο µονοφασικό διάλυµα που µπορούν να θεωρηθούν ως νανοφάσεις [3]. Το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο επιλέχθηκε ως κύριο συστατικό των νανογαλακτωµάτων, λόγω της υψηλής θρεπτικής του αξίας και της µεγάλης σταθερότητάς του στην οξείδωση. Είναι ανώτερο σε σύγκριση µε άλλα φυτικά έλαια, καθώς χρησιµοποιείται σε φυσική µορφή και έχει µοναδικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Το ελαιόλαδο περιέχει φυσικά αντιοξειδωτικά συστατικά και σε συνδυασµό µε τη σύνθεση των λιπαρών οξέων του έχει θετική επίδραση στην υγεία και ως εκ τούτου θεωρείται λειτουργικό τρόφιµο [4]. Παράλληλα υπάρχει τάση για αντικατάσταση των χηµικών γαλακτωµατοποιητών από φυσικές ουσίες καθώς µπορεί να προκαλέσουν προβλήµατα υγείας ή να µειώσουν τη διατροφική αξία των τροφίµων. Οι έρευνες προσανατολίζονται στην εύρεση αµφιφιλικών ουσιών εγκεκριµένων για τρόφιµα µε γαλακτωµατοποιητικές ιδιότητες [5]. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να παρουσιάζουν αντίστοιχα τεχνολογικά χαρακτηριστικά µε τους χηµικούς γαλακτωµατοποιητές, να έχουν παρόµοιες λειτουργικές ιδιότητες και χαµηλό κόστος. Τέτοιες αµφιφιλικές ουσίες εµφανίζονται στα ακατέργαστα έλαια ως ενδογενή µικροσυστατικά των ελαιούχων καρπών ή σπόρων και είναι υπεύθυνα για διάφορους φυσικούς κολλοειδείς σχηµατισµούς [5]. Από έρευνες έχει αποδειχθεί ότι ορισµένα ενδογενή φαινολικά µικροσυστατικά του ελαιόλαδου, λόγω της χηµικής δοµής τους, µπορούν να λειτουργήσουν ως επιφανειοδραστικές ουσίες, προσφέροντας γαλακτωµατοποιητική σταθερότητα, ενώ παράλληλα µπορούν να αυξήσουν την οξειδωτική σταθερότητα της ελαιώδους φάσης. Πιο συγκεκριµένα έχει αποδειχθεί ότι η προσθήκη των φαινολικών συστατικών: κερσετίνη και γαλλικό οξύ σε γαλακτώµατα µε βάση το ελαιόλαδο αυξάνει την οξειδωτική και γαλακτωµατοποιητική σταθερότητά τους [6-11].
Για τους παραπάνω λόγους, µελετήθηκε η δυνατότητα σχηµατισµού και οι φυσικοχηµικές ιδιότητες w/o νανογαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο µε ενσωµάτωση ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου µε αµφιφιλικό χαρακτήρα, χρησιµοποιώντας µη-ιονικούς γαλακτωµατοποιητές (Tween 20 και Tween 40) και χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Τα ενδογενή συστατικά του ελαιόλαδου που µελετήθηκαν ήταν: το γαλλικό οξύ, το καφεϊκό οξύ, η κερσετίνη, το συριγγικό οξύ, το βανιλικό οξύ και το ασκορβικό οξύ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Για τα νανογαλακτώµατα χρησιµοποιήθηκε εξευγενισµένο ελαιόλαδο, χορηγία της Μινέρβα Α.Ε. Χρησιµοποιήθηκαν οι χηµικοί γαλακτωµατοποιητές: µονολαυρική πολυοξυαιθυλενο-σορβιτάνη (Tween 20) (HLB=16,7), µονοπαλµιτική πολυοξυ-αιθυλενο-σορβιτάνη (Tween 40) (HLB=15,6), γαλλικό οξύ (gallic acid), ασκορβικό οξύ (ascorbic acid), βανιλικό οξύ (vanilic acid), καφεϊκό οξύ (caffeic acid), συριγγικό οξύ (syringic acid) και κερσετίνη (quercetin) της Across Organics (New Jersey, USA), και απιονισµένο νερό. ΜΕΘΟ ΟΙ Κατασκευή διαγραµµάτων φάσης των νανογαλακτωµάτων Για την κατασκευή των διαγραµµάτων φάσης ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Σε ορισµένη ποσότητα ελαιόλαδου, το οποίο διατηρείται στους 40 o C (µε τη βοήθεια υδατόλουτρου), προστίθεται κατάλληλη ποσότητα γαλακτωµατοποιητή, ώστε η τελική ποσότητα του µίγµατος να είναι 50 g, και γίνεται ανάµιξη του µίγµατος µε οµογενοποιητή υψηλής ταχύτητας (CAT Unidrive 1000 homogenizer) στις 12,000 rpm για 10 min. οκιµάστηκαν αναλογίες γαλακτωµατοποιητή-ελαίου από 0-6% κ.β. του τελικού µίγµατος µε βήµα µεταβολής 2% κ.β. Στη συνέχεια προστίθεται απιονισµένο νερό, ίδιας θερµοκρασίας, στάγδην, µε ρυθµό (50 µl/30 s) µέχρις ότου το γαλάκτωµα να µην προκύπτει διαυγές, όπως επιβεβαιώνεται µέσω µέτρησης της θολότητάς του. Παρασκευή νανογαλακτωµάτων Τα νανογαλακτώµατα παρασκευάστηκαν στις αναλογίες (έλαιο:γαλακτωµατοποιητής:υδατική φάση) που ήταν εφικτό να σχηµατιστούν, όπως προέκυψε από τα διαγράµµατα φάσης και µε την ίδια διαδικασία όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το ελαιόλαδο αναµιγνύεται µε την επιθυµητή ποσότητα γαλακτωµατοποιητή (αναλογίες: 1, 2, 4, 6 % κ.β. γαλακτωµατωποιητή/τελικό µίγµα) στους 40 o C για 10 min και ακολούθως προστίθεται η υδατική φάση 40 o C σε αναλογία 2% κ.β. στο τελικό µίγµα στάγδην (50 µl/30 s) στις 12,000 rpm, στην οποία έχουν διαλυτοποιηθεί προηγουµένως τα φαινολικά συστατικά του ελαιόλαδου σε αναλογία 0,1 % υπό συνεχή ανάδευση. Προσδιορισµός σταθερότητας γαλακτώµατος µε βάση το ελαιόλαδο Η σταθερότητα των γαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο προσδιορίστηκε βάσει του διαχωρισµού φάσης λόγω διαφοράς ειδικού βάρους: 20 ml του παρασκευαζόµενου γαλακτώµατος µεταφέρονται σε γυάλινους βαθµονοµηµένους σωλήνες των 20 ml και αποθηκεύονται για 4 εβδοµάδες στους 25 C. Η αποκορύφωση των λιπαρών και η δηµιουργία ιζήµατος προσδιορίζεται από την αναλογία του όγκου της κορυφής και του ιζήµατος επί του συνολικού όγκου του γαλακτώµατος. Ο είκτης σταθερότητας γαλακτώµατος (ESI) υπολογίζεται από το ύψος της κορυφής (HC) και το ύψος του ιζήµατος (HS) και δίνεται ως ποσοστό του αρχικού ύψους γαλακτώµατος (ΗΕ): ESI (%) = 100 [HE-(HS + HC)] / HE (1) Προσδιορισµός ιξώδους γαλακτώµατος Το ιξώδες των γαλακτωµάτων προσδιορίστηκε µε το ιξωδόµετρο Brοοkfield (Brookfield Engineering Laboratories Inc., Stoughton, MA). Συγκεκριµένα σε θερµοκρασία δωµατίου προστέθηκαν 60 ml από το γαλάκτωµα προς µέτρηση σε ειδικό δοχείο. Στη συνέχεια επιλέγεται το στέλεχος S61 και λαµβάνεται η µέτρηση σε σταθερή θερµοκρασία 25 o C. Προσδιορισµός µεγέθους σταγονιδίων, διασποράς και ζ-δυναµικού γαλακτώµατος Το µέγεθος των σταγονιδίων, η κατανοµή του µεγέθους τους καθώς και το ζ-δυναµικό των σταγονιδίων των νανογαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο προσδιορίστηκε µε υναµική Σκέδασης Φωτός - Dynamic Light Scattering DLS (Zetasizer nano-zs 2000, Malvern Instruments Ltd, UK). Οι µετρήσεις έγιναν στους 25 o C και οι τιµές του ζ-δυναµικού υπολογίστηκαν από την εξίσωση Helmholtz-Smoluckowski, ενώ τα δεδοµένα διορθώθηκαν µέσω του ιξώδους, του δείκτη διάθλασης και της διηλεκτρικής σταθεράς του δείγµατος. Προσδιορισµός θολότητας γαλακτώµατος Η θολότητα των νανογαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο προσδιορίστηκε µε θολοσίµετρο (HACH 2100N) στους 25 o C ως µέτρο της αναλογίας και του µεγέθους των σταγονιδίων της διεσπαρµένης φάσης. Προσδιορισµός χρώµατος γαλακτώµατος
Το χρώµα των νανογαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο µετρήθηκε µε χρήση χρωµατόµετρου (Minolta CR 200 colorimeter). Το συνολικό χρώµα Ε, σύµφωνα µε τη µέθοδο CIELAB, παριστάνεται σε τρισδιάστατο σύστηµα µε συνιστώσες L*, a*, b*, όπου η L* αντιστοιχεί στη φωτεινότητα ή λαµπρότητα και κυµαίνεται από 0 έως 100, η παράµετρος α* µεταβάλλεται από πράσινο σε κόκκινο και η παράµετρος b* από µπλε σε κίτρινο, και υπολογίζεται από τη σχέση: 2 2 2 E= a + b + L (2) Στατιστική επεξεργασία αποτελεσµάτων Τα δεδοµένα των µετρήσεων προέκυψαν ως µέσος όρος τριών επαναλήψεων, ενώ η επεξεργασία τους έγινε µε ανάλυση διακύµανσης (ANOVA) και µε χρήση του κριτηρίου διαφοράς Duncan's test µε το λογισµικό STATISTICA v. 7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, USA). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα συστήµατα νανογαλακτωµάτων µπορούν να σχηµατιστούν µε κατάλληλες αναλογίες ελαίου, νερού και γαλακτωµατοποιητή. Προκειµένου να σχεδιαστούν w/ο νανογαλακτώµατα µε βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο δοκιµάστηκαν διάφοροι συνδυασµοί ελαίου-νερού-επιφανειοδραστικού, ενώ στην υδατική φάση δοκιµάστηκε η προσθήκη 6 διαφορετικών ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου, ώστε να βρεθεί ο καλύτερος τύπος και αναλογία γαλακτωµατοποιητή, αλλά και να προσδιοριστεί η επιφανειοδραστική ικανότητα των ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου. Κατασκευή ιαγραµµάτων Φάσης µε χηµικούς γαλακτωµατοποιητές Προκειµένου να διερευνηθεί η επίδραση του είδους του γαλακτωµατοποιητή, αλλά και της προσθήκης ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου στην υδατική φάση w/o νανογαλακτωµάτων χωρίς την προσθήκη συνεπιφανειοδραστικής ουσίας κατασκευάστηκαν χωριστά διαγράµµατα φάσης για τους δύο γαλακτωµατοποιητές (Tween 20, Tween 40) σε συνδυασµό µε τα 6 ενδογενή συστατικά του ελαιόλαδου (γαλλικό οξύ, ασκορβικό οξύ, καφεϊκό οξύ, συριγγικό οξύ, βανιλικό οξύ, κερσετίνη) σε αναλογία 0,1% w/w επί της υδατικής φάσης που µελετήθηκαν καθώς και τυφλό δείγµα (Σχήµα 1). Η περιοχή κάτω από τη γραµµή τάσης στο διάγραµµα φάσης περιγράφει το πεδίο των αναλογιών των τριών συστατικών που µε ανάµιξή τους µπορούν να αποδώσουν νανογαλάκτωµα. Σχήµα 1. Τριαδικά διαγράµµατα φάσης νανογαλακτωµάτων µε εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο-υδατική φάσηγαλακτωµατοποιητή στους 40 C. Η συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή αυξάνεται από τα αριστερά προς τα δεξιά και η συγκέντρωση του νερού από κάτω προς τα πάνω (a. Tween 20-τυφλό, b. Tween 40-τυφλό, c. Tween 20-γαλλικό, d. Tween 40-γαλλικό, e.tween 20-ασκορβικό, f. Tween 40-ασκορβικο, g. Tween 20-βανιλικό, h. Tween 40-βανιλικό, i. Tween 20-συριγγικό, j. Tween 40-συριγγικό, k. Tween 20-καφεϊκό, l. Tween 40-καφεϊκο m. Tween 20-κερσετίνη, n. Tween 40-κερσετίνη, αντιστοίχως)
Από τα παραπάνω διαγράµµατα προέκυψε αρχικά ότι είναι δυνατή η παρασκευή w/o νανογαλακτωµάτων µε βάση το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Το γεγονός, ότι η το εύρος που ορίζεται από τη γραµµή τάσης είναι µικρό, οφείλεται στο ότι το ελαιόλαδο έχει µικρή διηλεκτρική σταθερά (ε 5) και εποµένως είναι δύσκολο να παρασκευαστούν σταθερά ηλεκτροστατικά συστήµατα νανογαλακτωµάτων µε µη πολική συνεχή βάση. Σε όλες τις περιπτώσεις, αύξηση της συγκέντρωσης των γαλακτωµατοποιητών είχε ως αποτέλεσµα τη διαλυτοποίηση µεγαλύτερης ποσότητας νερού στο σύστηµα µε µορφή νανογαλακτώµατος µέχρι µίας συγκεκριµένης συγκέντρωσης γαλακτωµατοποιητή (~16-18%). Σε ένα σύστηµα νανογαλακτώµατος, η συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή πρέπει γενικώς να είναι υψηλή, ώστε να παρέχεται ο αριθµός των επιφανειοδραστικών µορίων που απαιτούνται για τη σταθεροποίηση των µικροσταγονίδιων που παράγονται κατά την οµογενοποίηση του νανογαλακτώµατος. Ωστόσο, στα περισσότερα από τα συστήµατα που µελετήθηκαν, συγκέντρωση γαλακτωµατοποιητή µεγαλύτερη από 30% w/w είχε ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία παχύρευστου µίγµατος µε µορφή πηκτής καθώς δεν ήταν δυνατή η περαιτέρω διαλυτοποίηση γαλακτωµατοποιητή. Η προσθήκη ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου σε κάθε περίπτωση είχε θετική επίδραση στη δυνατότητα παρασκευής νανογαλακτώµατος. Εξαίρεση αποτελεί ο συνδυασµός του γαλακτωµατοποιητή Tween 40 µε την κερσετίνη. Η προσθήκη κερσετίνης επέδρασε αρνητικά στη γαλακτωµατοποιητική ικανότητα του γαλακτωµατοποιητή. Το εύρος της δυνατότητας παρασκευής νανογαλακτωµάτων επηρεάστηκε τόσο από το είδος του γαλακτωµατοποιητή όσο και από το είδος του ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου (Ρ<0.05). Ο γαλακτωµατοποιητής Tween 20 έδωσε καλύτερα αποτελέσµατα σε σχέση µε τον Tween 40. Όσον αφορά στα ενδογενή συστατικά το βανιλικό, καφεϊκό και συριγγικό οξύ διαφοροποιήθηκαν σηµαντικά, προσφέροντας µεγαλύτερο εύρος δυνατών συγκεντρώσεων για παρασκευή νανογαλακτωµάτων. Το ασκορβικό και το γαλλικό οξύ αύξησαν λιγότερο το εύρος, ενώ η κερσετίνη είχε ασήµαντη έως αρνητική επίδραση στη δηµιουργία νανογαλακτώµατος. Προσδιορισµός Σταθερότητας Γαλακτωµάτων Τα εµπορικά νανογαλακτώµατα είναι σηµαντικό να έχουν µεγάλο χρόνο ζωής και σταθερά ποιοτικά χαρακτηριστικά. Για αυτό εξετάστηκε η σταθερότητα των συστηµάτων και η επίδραση του χρόνου στο είκτη Σταθερότητας Γαλακτώµατος (ESI) ( ιάγραµµα 1). Στην παρούσα µελέτη προέκυψε ότι ο γαλακτωµατοποιητής Tween 20 προσέφερε µεγαλύτερη σταθερότητα σε όλα τα δείγµατα από ότι ο γαλακτωµατοποιητής Tween 40. Επιπλέον, τα δείγµατα χωρίς την προσθήκη γαλακτωµατοποιητή είχαν χαµηλότερη σταθερότητα από ότι τα δείγµατα µε αναλογίες γαλακτωµατοποιητή 1%, 2%, 4% και 6%. Τα νανογαλακτώµατα µε τη µέγιστη αναλογία (6%) γαλακτωµατοποιητή παρουσίασαν τη µεγαλύτερη σταθερότητα. Η σταθερότητα των γαλακτωµάτων χωρίς την προσθήκη γαλακτωµατοποιητή ήταν γενικώς χαµηλή. Το είδος και η αναλογία του βιοδραστικού συστατικού πρόσφερε επιπλέον σταθερότητα στα νανογαλακτώµατα. Τη µεγαλύτερη σταθερότητα στα νανογαλακτώµατα πρόσφεραν το βανιλικό και το γαλλικό οξύ. Από τις παραµέτρους που εξετάστηκαν (είδος και αναλογία γαλακτωµατοποιητή, είδος συστατικού), µόνο η αναλογία του γαλακτωµατοποιητή επηρέασε σηµαντικά το δείκτη σταθερότητας των γαλακτωµάτων (Ρ<0.05).
ιάγραµµα 1. Μεταβολή του δείκτη σταθερότητας των γαλακτωµάτων συναρτήσει του γαλακτωµατοποιητή και του είδους του συστατικού Ιξώδες Tο ιξώδες εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τη δοµή του νανογαλακτώµατος, τον τύπο και το σχήµα των συσσωµατωµάτων, όπως και από τη συγκέντρωση και τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των διεσπαρµένων σωµατιδίων. Στην παρούσα µελέτη όλα τα νανογαλακτώµατα που δοκιµάστηκαν ήταν νευτωνικά ρευστά και η τιµή του ιξώδους κυµάνθηκε από 52,7 έως 80,5 cp ( ιάγραµµα 2). Όλα τα δείγµατα µετρήθηκαν σε θερµοκρασία 25 ο C. Παρατηρήθηκε τάση αύξησης του ιξώδους τους (cρ) αυξανοµένης της αναλογίας του γαλακτωµατοποιητή. Η µέγιστη τιµή ιξώδους παρουσιάστηκε για αναλογία γαλακτωµατοποιητή 6% και συγκεκριµένα στο γαλάκτωµα µε 6% Tween 20. Οι αναλογίες 1%, 2% και 4% και τα νανογαλακτώµατα χωρίς γαλακτωµατοποιητή είχαν τις µικρότερες τιµές ιξώδους. Τα νανογαλακτώµατα µε ενσωµατωµένο καφεϊκό οξύ παρουσίασαν τις µεγαλύτερες τιµές ιξώδους, ενώ τα αντίστοιχα χωρίς ενσωµάτωση κάποιου ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου τη µικρότερη τιµή ιξώδους. Τα νανογαλακτώµατα µε καφεϊκό και συριγγικό οξύ έδειξαν επίσης µεγάλες τιµές ιξώδους, ενώ το γαλλικό οξύ, το ασκορβικό οξύ, το βανιλικό οξύ και η κερσετίνη παρουσίασαν ενδιάµεσες τιµές ιξώδους. Από τις παραµέτρους που εξετάστηκαν (είδος και αναλογία γαλακτωµατοποιητή, είδος ενδογενούς συστατικού), η αναλογία και το είδος του γαλακτωµατοποιητή όπως και το είδος του ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου επηρέασαν σηµαντικά την τιµή του ιξώδους των γαλακτωµάτων (Ρ<0.05). ιάγραµµα 2: Μεταβολή της τιµής του ιξώδους συναρτήσει του γαλακτωµατοποιητή και του ενδογενούς συστατικού του ελαιολάδο Μέση διάµετρος σταγονιδίων (MD) Η κατανοµή µεγέθους σωµατιδίων θεωρείται ως το πιο σηµαντικό χαρακτηριστικό για την αξιολόγηση της σταθερότητας των γαλακτωµάτων. Έχουν πραγµατοποιηθεί έρευνες σχετικά µε το πώς επιδρούν τα συστατικά στο µέγεθος των σταγονιδίων. Το παρακάτω διάγραµµα ( ιάγραµµα 3) δείχνει το µέσο µέγεθος των σωµατιδίων των νανογαλακτωµάτων που παρασκευάστηκαν συναρτήσει της περιεκτικότητας του γαλακτωµατοποιητή (% w/w) και των διαφόρων ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου. Όπως παρατηρήθηκε τη µικρότερη µέση διάµετρο (MD) την εµφάνισαν τα δείγµατα µε 6% Tween 40 χωρίς προσθήκη κάποιου ενδογενούς συστατικού, όπως και το γαλάκτωµα στο οποίο είχε ενσωµατωθεί βανιλικό οξύ στην υδατική και δεν περιείχε καθόλου γαλακτωµατοποιητή. Το βανιλικό, το γαλλικό οξύ και το ασκορβικό οξύ παρουσίασαν τις µικρές τιµές µέσης
διαµέτρου σταγονιδίων. Όµως από τις µεταβλητές που εξετάστηκαν καµία δεν επηρέασε στατιστικά το µέγεθος των σταγονιδίων (MD) (Ρ>0.05). ιάγραµµα 3. Μεταβολή της τιµής της µέσης διαµέτρου (MD) των σταγονιδίων συναρτήσει του γαλακτωµατοποιητή και του ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου είκτης Πολυδιασποράς (PDI) Ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI) υποδεικνύει τον τρόπο µε τον οποίο τα σταγονίδια διασπείρονται στη συνεχή φάση. Χαµηλό PDI σηµαίνει µονοδιεσπαρµένα νανογαλακτώµατα µε υψηλή σταθερότητα, ενώ υψηλό PDI πολυδιεσπαρµένα νανογαλακτώµατα µε χαµηλή σταθερότητα αντίστοιχα. Οι τιµές του δείκτη πολυδιασποράς κυµάνθηκαν µεταξύ του 0,029 και του 1 ( ιάγραµµα 4). Τα νανογαλακτώµατα µε συριγγικό, γαλλικό και καφεϊκό οξύ παρουσίασαν τις µεγαλύτερες τιµές PDI, ενώ τα νανογαλακτώµατα χωρίς ενσωµατωµένα ενδογενή συστατικά του ελαιόλαδου και τα νανογαλακτώµατα µε ενσωµατωµένο ασκορβικό οξύ εµφάνισαν τις µικρότερες τιµές δείκτη πολυδιασποράς. Τέλος, τα νανογαλακτώµατα µε ενσωµατωµένο βανιλικό οξύ και κερσετίνη εµφάνισαν µία ενδιάµεση τιµή δείκτη πολυδιασποράς (PDI). Από τους παράγοντες που εξετάστηκαν, το είδος του φαινολικού συστατικού επηρέασε την τιµή του δείκτη πολυδιασποράς (PDI) (P<0.05). ιάγραµµα 4. Μεταβολή της τιµής του δείκτη πολυδιασποράς (PDI) συναρτήσει του γαλακτωµατοποιητή και του ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου Μέτρηση θολότητας Τα παρασκευασµένα νανογαλακτώµατα αξιολογήθηκαν ως προς τη θολότητά τους, καθώς η µέτρηση αυτή παρέχει ένδειξη του µέσου µεγέθους και του βαθµού διασποράς των σταγονιδίων όπως επίσης και ένδειξη για τη σταθερότητά τους. Τα διαυγή και οµογενή νανογαλακτώµατα µε χαµηλή θολότητα εµφανίζουν χαµηλή πολυδιασπορά. Στην παρούσα εργασία, οι τιµές θολότητας κυµάνθηκαν από 149 έως 2660 NTU ( ιάγραµµα 5). Παρατηρήθηκε ότι η θολότητα των νανογαλακτωµάτων µειώνεται µε την αύξηση της ποσότητας του γαλακτωµατοποιητή και παρατηρήθηκε µεγαλύτερη µείωση της τιµής της θολότητας για τις µεγαλύτερες αναλογίες του γαλακτωµατοποιητή Tween 40. Οι χαµηλότερες τιµές θολότητας παρουσιάστηκαν στα δείγµατα
που παρασκευάστηκαν µε το γαλακτωµατοποιητή Tween 40, και συγκεκριµένα στο δείγµα που δεν είχε ενσωµατωµένο κάποιο ενδογενές συστατικό. Από τις παραµέτρους που εξετάστηκαν (είδος και αναλογία του γαλακτωµατοποιητή, είδος ενδογενούς συστατικού), το είδος και η αναλογία του γαλακτωµατοποιητή επηρέασαν σηµαντικά τη θολότητα των γαλακτωµάτων (Ρ<0.05). Πιο συγκεκριµένα τα δείγµατα που παρασκευάστηκαν µε γαλακτωµατοποιητή Tween 20 παρουσίασαν µεγαλύτερη θολότητα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα δείγµατα που περιείχαν 0% και 1% γαλακτωµατοποιητή εµφάνισαν πολύ υψηλές τιµές θολότητας. Αντιθέτως τα δείγµατα µε 2%, 4% 6% και γαλακτωµατοποιητή εµφάνισαν χαµηλή τιµή θολότητας. ιάγραµµα 5. Μεταβολή της θολότητας νανογαλακτωµάτων συναρτήσει του είδους και του ποσοστού του γαλακτωµατοποιητή και του περιεχόµενου ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου Προσδιορισµός Χρώµατος Η µελέτη του χρώµατος των γαλακτωµάτων βοηθά στην κατανόηση της µικροδοµής τους. Οι σχετικές αναλογίες του φωτός που µεταδίδονται και αντανακλώνται σε διαφορετικά µήκη κύµατος εξαρτώνται από τη σκέδαση και την απορρόφησή του από το γαλάκτωµα. Οι τιµές του δείκτη χρώµατος Ε κυµάνθηκαν από 38,504 έως 55,812 ( ιάγραµµα 6). Το γαλάκτωµα µε 4% Tween 40 και µε ενσωµατωµένο καφεϊκό οξύ είχε τη µεγαλύτερη τιµή δείκτη Ε. Από το παρακάτω διάγραµµα προέκυψε ότι ο γαλακτωµατοποιητής Tween 40 παρουσίασε τις µεγαλύτερες τιµές δείκτη χρώµατος Ε, σε αντίθεση µε το γαλακτωµατοποιητή Tween 20. Τέλος, τα νανογαλακτώµατα χωρίς ενσωµατωµένο ενδογενές συστατικό στην υδατική φάση παρουσίασαν τις µικρότερες τιµές δείκτη χρώµατος Ε. Από τις παραµέτρους που εξετάστηκαν (είδος και αναλογία γαλακτωµατοποιητή, είδος ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου), όλες οι παράµετροι επηρέασαν σηµαντικά την τιµή του δείκτη χρώµατος Ε των γαλακτωµάτων (Ρ<0.05). ιάγραµµα 6. Μεταβολή της τιµής του παράγοντα E συναρτήσει του γαλακτωµατοποιητή και του ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η δυνατότητα σχηµατισµού και οι φυσικοχηµικές ιδιότητες w/o νανογαλακτωµάτων µε βάση το ελαιόλαδο µε ενσωµάτωση ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου µε αµφιφιλικό χαρακτήρα, χρησιµοποιώντας µη-ιονικούς γαλακτωµατοποιητές (Tween 20 και Tween 40) και χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Τα ενδογενή συστατικά του ελαιόλαδου που µελετήθηκαν ήταν: το γαλλικό οξύ, το καφεϊκό οξύ, η κερσετίνη, το συριγγικό οξύ, το βανιλικό οξύ και το ασκορβικό οξύ.
Από τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης συµπεραίνεται αρχικά ότι είναι δυνατόν να παρασκευαστούν σταθερά w/o νανογαλακτώµατα µε βάση το ελαιόλαδο χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Από τα διαγράµµατα φάσης προέκυψε επίσης ότι η συγκέντρωση του γαλακτωµατοποιητή πρέπει γενικώς να είναι υψηλή, ώστε να παρέχεται ο αριθµός των επιφανειοδραστικών µορίων που απαιτούνται για τη σταθεροποίηση των µικροσταγονιδίων που παράγονται κατά την οµογενοποίηση του νανογαλακτώµατος. Ωστόσο, συγκέντρωση γαλακτωµατοποιητή µεγαλύτερη από 30% w/w είχε ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία παχύρευστου µίγµατος µε µορφή πηκτής. Ο γαλακτωµατοποιητής Tween 20 έδωσε καλύτερα αποτελέσµατα σε σχέση µε τον Tween 40. Όσον αφορά στα ενδογενή συστατικά του ελαιόλαδου που δοκιµάστηκαν το βανιλικό, το καφεϊκό και το συριγγικό οξύ διαφοροποιήθηκαν σηµαντικά, προσφέροντας µεγαλύτερο εύρος δυνατών συγκεντρώσεων για παρασκευή νανογαλακτωµάτων. Η προσθήκη ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου, πλην της κερσετίνης, είχε θετική επίδραση στη δυνατότητα παρασκευής νανογαλακτώµατος. Στο δεύτερο µέρος της µελέτης, αποδείχτηκε ότι η προσθήκη ενδογενών συστατικών του ελαιόλαδου επηρέασε θετικά τις ιδιότητες των γαλακτωµάτων. Η προσθήκη συστατικού του ελαιόλαδου ενίσχυσε τη γαλακτωµατοποίηση, µε αποτέλεσµα την παρασκευή γαλακτωµάτων µε µικρότερη διάµετρο σταγονιδίων. Προσδιορίστηκε επίσης, ότι µε χρήση γαλλικού οξέος και βανιλικού οξέος όπως και µε χρήση γαλακτωµατοποιητή Tween 20 παρασκευάστηκαν σταθερότερα γαλακτώµατα. Tα δείγµατα χωρίς την προσθήκη γαλακτωµατοποιητή παρουσίασαν πολύ χαµηλή σταθερότητα. Τη µεγαλύτερη σταθερότητα στα νανογαλακτώµατα προσέφεραν το βανιλικό και το γαλλικό οξύ. Από τις παραµέτρους που εξετάστηκαν, µόνο η αναλογία του γαλακτωµατοποιητή επηρέασε σηµαντικά το δείκτη σταθερότητας των γαλακτωµάτων. Οι χαµηλότερες τιµές θολότητας παρουσιάστηκαν στα δείγµατα που παρασκευάστηκαν µε το γαλακτωµατοποιητή Tween 40 και συγκεκριµένα στο δείγµα που δεν είχε ενσωµατωµένο κάποιο ενδογενές συστατικό του ελαιόλαδου. Επιπλέον, προσδιορίστηκε ότι η τιµή του δείκτη πολυδιασποράς (PDI) επηρεάζεται από το είδος του φαινολικού όχι όµως από το είδος του γαλακτωµατοποιητή. Τα γαλακτώµατα που είχαν ενσωµατωµένα ενδογενή συστατικά εµφάνισαν τις µικρότερες τιµές δείκτη πολυδιασποράς. Όσον αφορά στη µέση διάµετρο σταγονιδίων, τις µικρότερες τιµές εµφάνισαν τα δείγµατα µε γαλακτωµατοποιητή Tween 40 µε ενσωµατωµένο ασκορβικό οξύ και µε βανιλικό οξύ. Όσον αφορά στη µεταβολή του ιξώδους, η αναλογία και το είδος του γαλακτωµατοποιητή όπως και το είδος του ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου επηρέασαν σηµαντικά την τιµή του. Τέλος, ο δείκτης χρώµατος Ε επηρεάστηκε σηµαντικά από το είδος και από την αναλογία του γαλακτωµατοποιητή, αλλά και από το είδος του ενσωµατωνόµενου ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. McClements, D.J., Rao, J. Food-grade nanoemulsions: formulation, fabrication, properties, performance, biological fate, and potential toxicity. Crit Rev Food Sci Nutr, 51, p.285 330 (2011). [2]. Polychniatou V., Tzia C. Study of Formulation and Stability of Co-surfactant Free Water-in-Olive Oil Nano- and Submicron Emulsions with Food Grade Non-ionic Surfactants. JAOCS, 91:1, p.79-88 (2014). [3]. Ghosh, V., Mukherjee, A., Chandrasekaran, N. Ultrasonic emulsification of food-grade nanoemulsion formulation and evaluation of its bactericidal activity. Ultrason Sonochem, 20, p.338-344 (2013). [4]. Ambrosone L., Cinelli G., Mosca M., Ceglie A. Susceptibility of Water-Emulsified Extra Virgin Olive Oils to Oxidation. JAOCS, 83, p.165-170 (2006). [5]. Chaiyasit, W., Elias, J.R., McClements, D.J., Decker, E.A. Role of physical structures in bulk oils on lipid oxidation. Crit Rev Food Sci Nutr, 47: p.299 317 (2007). [6]. Xenakis, A., Papadimitriou, V., Tzika, E.D., Pispas, S., Sotiroudis, T.G. Microemulsions based on virgin olive oil: A model biomimetic system for studying native oxidative enzymatic activities. Colloids Surf A, 382, p.232 237 (2011). [7]. Di Mattia, C.D., Sacchetti, G., Mastrocola, D., Pittia, P. Effect of phenolic antioxidants on the dispersion state and chemical stability of olive oil O/W emulsions. Food Res Int, 42, p.1163 1170 (2009). [8]. Di Mattia, C.D., Sacchetti, G., Mastrocola, D., Sarker, D.K., Pittia, P. Surface properties of phenolic compounds and their influence on the dispersion degree and oxidative stability of olive oil O/W emulsions, Food Hydrocolloids, 24:6 7, p.652 658 (2010). [9]. Chaiyasit, W., Elias, J.R., McClements, D.J., Decker, E.A. Role of physical structures in bulk oils on lipid oxidation. Crit Rev Food Sci Nutr, 47, p.299 317 (2007). [10]. Sotiroudis, T.G., Sotiroudis, G.T., Varkas, N., Xenakis, A. The Role of Endogenous Amphiphiles on the Stability of Virgin Olive Oil-in-Water Emulsions. JAOCS, 82:6, p. 415-420. (2005). [11]. Garti, N. What can nature offer from an emulsifier point of view: trends and progress?, Colloid Surface A, 152:1-2, 125-146 (1999).