Α)Ανάλυση αιθερίων ελαίων

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ BΑΡΝΑΒΑ ΚΥΡΙΑΚΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α)Ανάλυση αιθερίων ελαίων Β)Φυτοχημική ανάλυση του φυτού Calendula officinalis και έλεγχος αντιοξειδωτικής δράσης και αναστολής του ενζύμου LOX (φυτικής προέλευσης) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Μέρος Α ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ 1. Σκοπός..Σελ 5 2. Αιθέρια Έλαια Φυσικές Ιδιότητες...Σελ 6 3. Χημεία Αιθερίων ελαίων.σελ 8 4. Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή και την σύσταση των αιθερίων ελαίων.. Σελ 18 5. Ρόλος των αιθερίων ελαίων.σελ 21 6. Προετοιμασία δείγματος.σελ 22 7. Χρήσεις αιθερίων ελαίων.σελ 25 8. Μεθόδοι ανάλυσης αιθερίων ελαίων...σελ 26 9. Calendula officinalis Σελ 29 10. Lavandula angustifolia Σελ 38 11. Εucalyptus globulus Σελ 45 12. Πειραματικό Μέρος Αιθερίων Ελαίων.Σελ 49 13. Αποτελέσματα ανάλυσης αιθερίων ελαίων... Σελ 51 Μέρος Β ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ Calendula officinalis Σελ 74 1. Eισαγωγή Σελ.75 2. Βοτανική Ταξινόμηση..Σελ. 75 3. Βοτανική Περιγραφή Σελ. 76 4. Φαρμακολογικές Ιδιότητες. Σελ. 78 5. Τοξικολογικές Μελέτες και Αντενδείξεις Σελ 82 6. Φυτοχημική Ανάλυση Σελ. 83 α. Τερπενοειδή Σελ.83 β. Φλαβονοειδή Σελ. 85 γ. Κουμαρίνες..Σελ.88 δ. Κινόνες Σελ.89 ε. Καροτενοειδή Σελ.89 στ. Αμινοξέα Σελ. 91 ζ. Άλλα συστατικά..σελ.94 7. Ελεύθερες Ρίζες : Βασικές Έννοιες,Σχηματισμός και Σταθερότητα..Σελ.95 8. Φαρμακολογικές ιδιότητες.σελ. 105 9. Φασματοσκοπικά χαραχτηρηστικά των φαινολικών ενώσεων..σελ.109 10. Έλεγχος Αντιοξειδωτικής Δράσης-Πειραματικές Μέθοδοι Σελ.110 Μέρος Β (II) : Πειραματικό Μέρος Σελ.120 1. Υλικά και Μεθοδοι. Σελ.120 2

2. Αποτελέσματα. Σελ.124 3. Ένωση 1 Σελ.126 4. Ένωση 2 Σελ.135 5. Ένωση 3.Σελ.138 6. Ένωση 4 Σελ.140 7. Ένωση 5 Σελ.148 8. Ένωση 6 Σελ. 154 9. Μελέτη αντιοξειδωτικής ικανότητας Σελ.158 10. Ικανότητα των εκχυλισμάτων για αναστολή του ενζύμου λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης. Σελ.162 11. Συμπεράσματα. Σελ.163 12. Βιβλιογραφία. Σελ.165 3

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέπων καθηγητή μου κ. Ευγένιο Κοκκάλου, Καθηγητή Φαρμακογνωσίας και Πρόεδρο του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, ο οποίος δέχτηκε να ενταχθώ στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα ειδίκευσης του Τομέα της Φαρμακογνωσίας και παρακολούθησε με ενδιαφέρον την πρόοδο των σπουδών μου. Επίσης τον ευχαριστώ για την επιλογή του θέματος της διατριβής μου. Ευχαριστώ θερμώς την Επίκουρη καθηγήτρια κ. Διαμάντω Λάζαρη για τις πολύτιμες συμβουλές που μου προσέφερε σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας. Ευχαριστώ θερμώς την τριμελή εξεταστική μου επιτροπή, τον Καθηγητή κ. Ευγένιο Κοκκάλου, την Καθηγήτρια κ. Δήμητρα Χατζηπαύλου Λίτινα και τον καθηγητή κ. Βασίλη Δημόπουλο,καθώς επίσης και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια κ.κωνσταντινίδου Μ. για τη βοήθειά της στα βιολογικά πειράματα για τους in vitro ελέγχους της αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους ικανότητας των εκχυλισμάτων. Ευχαριστώ επίσης θερμά την Δρ. κ. Χρυσή Γαβριέλη για την συμπαράστασή της αλλά κυρίως για την πολύτιμη βοήθειά της στην αποτίμηση των αποτελεσμάτων των φασμάτων μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού (NMR). Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους μου από το Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας του ΑΠΘ. 4

Σκοπός της εργασίας Τα αιθέρια έλαια χρησιμοποιούνται κυρίως στην αρωματοποιία αλλά και στην ιατρική. Ήταν ήδη διαδεδομένη η χρήση τους για την αντιμετώπιση μιας μεγάλης ποικιλίας σωματικών και ψυχικών δυσαρμονιών, τόσο από τους βοτανολόγους όσο και από τους γιατρούς, που διατηρήθηκε μέχρι τα τέλη του 19ου αιώνα. Η προβλεπόμενη ετήσια αύξηση της αγοράς των αιθέριων ελαίων καθώς και οι μεγάλες ποσότητες που παράγονται από περιορισμένο αριθμό φυτών, αποδεικνύουν την οικονομική δυνατότητα των αρωματικών φυτών ως ανερχόμενες καλλιέργειες. Στο Άγιο Όρος καλλιεργούνται φυτά από τα οποία συλλέγεται το αιθέριο έλαιο και χρησιμοποιείται σε καλλυντικά σκευάσματα. Στόχος της ανάλυσης των αιθερίων ελαίων ήταν η απομόνωση και η ταυτοποίηση των συστατικών των αιθερίων ελαίων καθώς επίσης και η σύγκρισή τους με τα βιβλιογραφικά δεδομένα καθώς φημολογείται ότι λόγω της ιδιαιτερότητας της γης στο Αγ.Όρος τα φυτά διαφέρουν από αυτά που συναντιώνται εκτός Αγ.Όρους Επιπλέον για τα αιθέρια έλαια πραγματοποιήθηκε ανάλυση δύο αντικουνουπικών σκευασμάτων δύο διαφορετικών εταιρειών που διατίθενται στο εμπόριο και έγινε η μεταξύ τους σύγκριση. Όσον αφορά τη φυτοχημική ανάλυση του φυτού, η Calendula officinalis είναι μεν ένα αρκετά μελετημένο φυτό, αλλά θέλαμε να μελετήσουμε την Calendula officinalis που καλλιεργείται στο Αγ.Όρος για να επισημάνουμε τυχόν διαφορές που έχει σε σύγκριση πάντα με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Εκχυλίσματα από το φυτό καθώς και το αιθέριο έλαιο και το λάδι του φυτού χρησιμοποιούνται από τους μοναχούς σε φυτοθεραπευτικά παραδοσιακά σκευάσματα κατά των μωλώπων, οιδημάτων, και για ενυδατικούς και αντιγηραντικούς σκοπούς, 5

Α)Ανάλυση αιθερίων ελαίων 6

ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ Τα αιθέρια έλαια είναι πτητικά αρωματικά συστατικά που λαμβάνονται από τα φυτά συνήθως με απόσταξη με υδρατμούς. Τα αιθέρια έλαια είναι υγρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και δεν έχουν καμία σχέση με τα «λίπη και έλαια». Τα συστατικά των αιθερίων ελαίων διακρίνονται σε τερπενικούς και μη τερπενικούς υδρογονάνθρακες.το χαρακτηριστικό άρωμα κάθε αιθέριου ελαίου είναι συνισταμένη όλων των συστατικών του, αλλά πολλές φορές η παρουσία ενός μόνο συστατικού σε αναλογία 1% ή και μικρότερη, έχει σαν αποτέλεσμα την αλλαγή του αρώματος. 7

Φυσικές ιδιότητες Τα αιθέρια έλαια είναι υγρά, εύφλεκτα, πτητικά σε κανονική θερμοκρασία και δεν αφήνουν κηλίδα σε διηθητικό χαρτί, σε αντίθεση με τα λιπαρά έλαια. Είναι άχρωμα έως υποκίτρινα με ελάχιστες εξαιρέσεις όπως το γαρυφαλλέλαιο που είναι κιτρινοκαστανόχρωμο και όσα περιέχουν αζουλένιο είναι μπλε. Κατά την παραμονή τους επί πολύ χρόνο σκουραίνουν, ρητινοποιούνται και αλλοιώνεται η οσμή τους. Αιτία γι' αυτό είναι οι αυτοοξειδώσεις, ο πολυμερισμός και οι υδρολύσεις των εστέρων. Η υγρασία, η θερμοκρασία και το φως επηρεάζουν τα αιθέρια έλαια γι' αυτό πρέπει να φυλάσσονται σε μικρά, γεμάτα και καλά κλεισμένα και προστατευμένα από το φως και τη θερμοκρασία δοχεία. Η πυκνότητα τους είναι γενικά χαμηλότερη από του νερού. Χαρακτηρίζονται από υψηλό δείκτη διάθλασης. Τα περισσότερα είναι οπτικώς ενεργά με στροφική ικανότητα που είναι συνήθως πολύτιμη διαγνωστική ιδιότητα. Δεν διαλύονται παρά ελάχιστα στο νερό, ενώ είναι διαλυτά στον αιθέρα, πετρελαϊκό αιθέρα, αλκοόλη και στους περισσότερους οργανικούς διαλύτες και στα λιπαρά λάδια. ΧΗΜΕΙΑ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Από χημικής άποψης τα αιθέρια έλαια έχουν σύνθετες δομές για μελέτη. Ωστόσο, η κατανόηση της χημικής τους δομής μπορεί να βοηθήσει για την κατάταξη της χρήσης τους για θεραπευτικούς σκοπούς. Επίσης η γνώση της χημείας του αιθερίου ελαίου μας δίνει και γνώση για την επικινδυνότητα του. Τα συστατικά των αιθερίων ελαίων διακρίνονται σε τερπενικούς και μη τερπενικούς υδρογονάνθρακες. Μη τερπενικοί υδρογονάνθρακες Στην κατηγορία αυτή ανήκουν αλκάνια ή αλκένια με μικρό αριθμό ατόμων άνθρακα ή αλκοόλες και αλδεΰδες που έχουν προκύψει ως προϊόντα μεταβολισμού ή αποικοδόμησης των φωσφολιπιδίων και των λιπαρών οξεών. Τέτοιες ενώσεις είναι η trans-βουτ-2-έν και το cis -βουτ-2-έν. Mόρια με τρία άτομα άνθρακα συνδέονται μόνο σε ευθεία αλυσίδα. 8

trans-βουτ-2-έν cis -βουτ-2-έν 2-μέθυλο-1,3 βουταδιένιο Τέσσερα άτομα άνθρακα και περισσότερα μπορεί να συνδέονται σε ευθεία αλυσίδα ή σε διακλάδωση. Το ισοπρένιο (2-μέθυλο-1,3 βουταδιένιο) είναι ένα τέτοιο μόριο. Τερπενοειδή Τα τερπένια (ή ισοπρενοειδή) αποτελούν μια από τις μεγαλύτερες χημικές κατηγορίες φυσικών προϊόντων. Η σύνθεσή τους είναι αποτέλεσμα αποκλειστικά φυσικών ενζυματικών αντιδράσεων. Η δομή τους προκύπτει από τη συνένωση κεφαλής ουράς μονάδων ισοπρενίου (2-μέθυλο-1,3-βουταδιένιο). Ο άνθρακας 1, ονομάζεται κεφαλή της ισοπρενικής μονάδας, ενώ ο άνθρακας 4 θεωρείται η ουρά της. Περισσότερα από 30.000 τερπενοειδή έχουν απομονωθεί από φυτά, μικροοργανισμούς και ζώα. Τα τερπένια ταξινομούνται ανάλογα με τον αριθμό των ισοπρενικών μονάδων που περιέχουν. Έτσι, τα μονοτερπένια είναι ενώσεις με 10 άτομα άνθρακα και βιοσυντίθενται από δύο μονάδες ισοπρενίου, τα σεσκιτερπένια έχουν 15 άτομα άνθρακα και προέρχονται από τρία μόρια ισοπρενίου κ.λπ. Τα μονο- και τα σεσκιτερπένια απαντούν κυρίως στα φυτά, ενώ τα υψηλότερης τάξης τερπένια απαντούν τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα και πολλά παρουσιάζουν αξιόλογη βιολογική δραστηριότητα. Παρακάτω αναλύεται η κάθε κατηγορία τερπενίων. Moνοτερπένια Τα μονοτερπένια, όπως και προηγούμενα αναφέρθηκε συντίθενται από δύο μόρια ισοπρενίου. Μπορεί να είναι άκυκλα όπως τα β-μυρκένιο, (Ε)-β-οκιμένιο, (Ζ)- β-οκιμένιο και το άλλο-οκιμένιο, ή κυκλικά όπως τα π-μενθάνιο και p-κυμένιο. Τα κυκλικά μονοτερπένια μπορεί να είναι μονοκυκλικά όπως τα π-μενθάνιο και p- κυμένιο, δικυκλικά όπως το δ-3- καρένιο και τρικυκλικά όπως το τρικυκλένιο. 9

Μονοτερπένια που η δομή τους περιέχει βενζολικό δακτύλιο όπως το p- κυμένιο, η καρβακρόλη, η θυμόλη και η φαινυλαιθυλική αλκοόλη συναντώνται συχνά ως συστατικά αιθερίων ελαίων αρωματικών όπως τη ρίγανη (Origanum sp.), το θυμάρι (Thymus sp.), το θρούμπι (Satureja sp.) κ.ά.. Στην κατηγορία των μονοτερπενίων ανήκουν και τα φαινυλοπροπανοειδή τα οποία προκύπτουν από διαφορετικό βιοσυνθετικό κύκλο. Άκυκλα μονοτερπένια Η ομάδα αυτή των μονοτερπενίων έχει πολύ λίγα μέλη και περιέχει τα τριένια, το μυρκένιο και τα οκιμένια καθώς και τις αλκοόλες γερανιόλη, νερόλη, κιτρονελλόλη λιναλοόλη κλπ. Η κιτράλη είναι το μίγμα της γερανιάλης και της νεράλης. Η κιτρονελλάλη είναι επίσης μία άκυκλη αλδεΰδη που ανήκει στην ομάδα αυτή των μονοτερπενίων. 10

Κυκλικά μονοτερπένια Ανάλογα με το αριθμό των δακτυλίων τα κυκλικά μονοτερπένια διακρίνονται σε : 1. Μονοκυκλικά μονοτερπένια 2. Δικυκλικά μονοτερπένια 3. Τρικυκλικά μονοτερπένια Μονοκυκλικά μονοτερπένια Τα μονοτερπένια της δομής του π-μενθανίου που διαθέτουν δηλαδή σκελετό 1- μεθυλ-4-ισοπρόπυλ-κυκλοεξανίου, αποτελούν τη μεγαλύτερη ομάδα μονοτερπενίων. Στα μονοκυκλικά μονοτεπρένια ανήκουν και αυτά με δομή π- μενθαδιενίου όπως τα: λιμονένιο, α- τερπινένιο, β-τερπινένιο, γ-τερπινένιο, τερπινολένιο, α-φελλανδρένιο και β-φελλανδρένιο. Μονοτερπένια όπως το p-κυμένιο και τα υδροξυλιωμένα παράγωγά του θυμόλη και το ισομερές αυτής καρβακρόλη πάντα βρίσκονται μαζί με τα α- τερπινένιο, γ-τερπινένιο και την τερπινέν-4-όλη. Επίσης συστατικά όπως τα p-κυμέν- 8-όλη και η κουμινιλική αλκοόλη επίσης προκύπτουν από το p-κυμένιο. Στην κατηγορία των μονοκυκλικών μονοτερπενίων ανήκουν και οι μονοτερπενικές 11

αλκοόλες: α-τερπινεόλη, μενθόλη, ισοπουλεγόλη και cis- εξαϋδροκουμινυλική αλκοόλη. Οι μονοτερπενικές κετόνες που ανήκουν στην ομάδα αυτή είναι οι: καρβόνη, διιδροκαρβόνη,ισομενθόνη, πιπεριτόνη, πουλεγόνη (ή πιπεριτενόνη) και ισοπουλεγόνη. 12

Δικυκλικά μονοτερπένια Οι κυκλικοί αιθέρες 1,8 κινεόλη, η 1,4 κινεόλη μαζί με την ασκαριδόλη είναι δικυκλικά οξυγονωμένα μονοτερπένια. Στην ομάδα αυτή ανήκουν επίσης τα μονοτερπένια της δομής του πινανίου (α-πινένιο και β-πινένιο ) καθώς και η βορνεόλη, ο οξικός εστέρας του ισοβορνυλίου, το καμφένιο, η καμφορά και η φενχόνη. Επίσης μονοτερπένια της δομής του θουγιανίου (που έχουν στη δομή τους ένα δακτύλιο κυκλοπροπανίου [3,1,0]) α-θουγένιο, σαβινένιο, το cis ισομερές του ένυδρου σαβινενίου, η σαβινόλη, ο οξικός εστέρας του σαβινυλίου, α-θουγιόνη, β- θουγιόνη και η ισοθουγιανόλη, ανήκουν στην ομάδα αυτή. Τέλος στα δικυκλικά μονοτερπένια κατατάσσονται τα μονοτερπένια της δομής καρενίου (που έχουν στη δομή τους ένα δακτύλιο κυκλοπροπανίου [4,1,0]) με κύριο εκπρόσωπο το δ-3-καρένιο. Τρικυκλικά μονοτερπένια Κύριος εκπρόσωπος των τρικυκλικών μονοτερπενίων είναι το τρικυκλένιο. Σεσκιτερπένια Τα σεσκιτερπένια είναι ακόρεστα συστατικά τα οποία σχηματίζονται με την προσθήκη ενός ισοπρενίου στο μόριο των μονοτερπενίων και έχουν το μοριακό τύπο C15H24. Η δομή τους μπορεί να είναι ευθεία, διακλαδισμένη ή κυκλική. Τα κυκλικά σεσκιτερπένια διακρίνονται σε μονοκυκλικά, δικυκλικά και τρικυκλικά. Άκυκλα σεσκιτερπένια Εκπρόσωποι αυτής της ομάδας είναι το β-φαρνεσένιο που είναι συστατικό του λυκίσκου, το α-φαρνεσένιο που είναι το δομικό ισομερές του (structural isomer) και η φαρνεσόλη η οποία απαντάται κυρίως στα αιθέριο έλαιο ανθέων όπως του τριαντάφυλλου και του κυκλάμινου. 13

Ακόμα συχνά απαντώμενο άκυκλο σεσκιτερπένιο είναι η νερολιδόλη, ισομερές της φαρνεσόλης που στη φύση βρίσκεται συνήθως με την Ε ισομερή μορφή παρά με τη Ζ. Μονοκυκλικά σεσκιτερπένια Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα σεσκιτερπένια τύπου μπισαμπολενίου καθώς και τα οξυγονωμένα παράγωγά του α-μπισαμπολόλη και β-μπισαμπολόλη τα οποία αποτελούν κύρια συστατικά του αιθερίου ελαίου του χαμομηλιού. 14

Ένας άλλος εκπρόσωπος της ομάδας των μονοκυκλικών σεσκιτερπενίων είναι το ζινγκιμπερένιο που αποτελεί κύριο συστατικό του αιθερίου ελαίου της αρμπαρόριζας. Δικυκλικά Σεσκιτερπένια Κύριος εκπρόσωπος της ομάδας των δικυκλικών σεσκιτερπενίων είναι το καδινένιο το οποίο απαντάται με τρεις ισομερείς μορφές α-καδινένιο, γ-καδινένιο και δ-καδινένιο. Τα συστατικά αυτά βρίσκονται στο αιθέριο έλαιο του σχίνου και είναι γνωστά ως σεσκιτερπένια τύπου ναφθαλινίου. Τα α-, β-, γ- και δ-σελινένια ανήκουν στην ομάδα των δικυκλικών σεσκιτερπενίων και είναι συστατικά του αιθερίου ελαίου του σέλινου. 15

Τέλος γνωστή ομάδα ενώσεων που ανήκει στην κατηγορία αυτή είναι τα αζουλένια τα οποία ευθύνονται για το μπλέ χρώμα των αιθερίων ελαίων των οποίων αποτελούν συστατικά. Κύριος εκπρόσωπος της ομάδας αυτής είναι το χαμαζουλένιο. Διάφορα άλλα σεσκιτερπένια (miscellaneous) Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα παράγωγα του καρυοφυλενίου, το β- καρυοφυλλένιο (ή trans-καρυοφυλλένιο) και το χουμουλένιο. 16

Διτερπένια Συνένωση κεφαλής ουράς τεσσάρων μονάδων ισοπρενίου οδηγεί στην δημιουργία των διτερπενίων (C20H32). Για την παραλαβή τους με τη μέθοδο της απόσταξης απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος (όπως και για τα σεσκιτερπένια), καθώς είναι βαρύτερα από τα μονοτερπένια. Τυπικοί εκπρόσωποι της ομάδας αυτής είναι η φυτόλη, μία άκυκλη διτερπενική αλκοόλη, η οποία απαντάται σε δύο ισομερής μορφές την trans- φυτόλη και τη cis φυτόλη και η μανουλοόλη μια δικυκλική διτερπενική αλκοόλη. Φαινυλοπροπανοειδή Οι ενώσεις που ανήκουν στην ομάδας των φαινυλοπροπανοειδών αποτελούν μια ξεχωριστή κατηγορία συστατικών των αιθερίων ελαίων. Περιέχουν στο μόριό τους ένα βενζολικό δακτύλιο. Κύριοι εκπρόσωποι της κατηγορίας αυτής είναι η ανηθόλη, η μέθυλο-χαβικόλη (ή εστραγόλη), η ευγενόλη, η κινναμωμική αλδεΰδη και η βανιλλίνη (Baser and Demirci, 2007). 17

Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή και τη σύσταση των αιθερίων ελαίων στα φυτά. Γενικά Τα αιθέρια έλαια μαζί με τα αλκαλοειδή και τα φαινολικά συστατικά είναι σημαντικά συστατικά του δευτερογενούς μεταβολισμού του φυτού. Η αξία τους κρίνεται τόσο από τη μέχρι σήμερα γνωστή χρήση τους από τη βιομηχανία φαρμάκων, τροφίμων και αρωμάτων, αλλά και από τις αντιμικροβιακές και αντιοξειδωτικές ιδιότητές τους που ενισχύουν τη χρήση των αιθερίων ελαίων στα τρόφιμα. Καθίσταται έτσι τις περισσότερες φορές απαραίτητο να είναι γνωστή η κατάλληλη εποχή συλλογής, ώστε να επιτυγχάνεται η επιθυμητή σύσταση και απόδοση σε αιθέριο έλαιο. Για να γίνει αυτό εφικτό, θα πρέπει να είναι γνωστοί οι παράγοντες που καθορίζουν τη χημική σύσταση καθώς και την απόδοση του αιθερίου ελαίου στα φυτά.στη συνέχεια αναλύονται κάποιοι από αυτούς τους παράγοντες (Figueiredo et al. 2008). Μεταβολές στη φυσιολογία του φυτού Οι μεταβολές στη φυσιολογία του φυτού αφορούν: Το στάδιο ανάπτυξης των οργάνων (φύλλα, άνθη, καρποί) Το μέρος του φυτού (φύλλα, άνθη κ.λπ.) που αναλύεται Το εκκριτικό όργανο που παράγει τα αιθέρια έλαια Την εποχική διακύμανση Τις μηχανικές και χημικές βλάβες Το στάδιο ανάπτυξης των οργάνων Το στάδιο ανάπτυξης των οργάνων του φυτού (φύλλα, άνθη, καρποί) είναι καθοριστικό για τη σύσταση του αιθερίου ελαίου του φυτού. Στις περισσότερες περιπτώσεις η απόδοση σε αιθέριο έλαιο είναι αυξημένη την περίοδο της ανθοφορίας. Ταυτόχρονα, η αναλογία κάποιων συστατικών αυξάνεται από 10%, που μπορεί να βρισκόταν στα αρχικά στάδια, σε 50-70% στο στάδιο της πλήρους άνθησης. Σύμφωνα με τους Mάñez et al. (1991), οι αλλαγές που παρατηρούνται στη σύσταση των πτητικών συστατικών κατά την ωρίμανση των οργάνων οφείλονται σε αντιδράσεις κυκλοποίησης και αφυδάτωσης των συστατικών. 18

Το μέρος του φυτού που αναλύεται Στις περισσότερες περιπτώσεις η σύσταση του αιθερίου ελαίου εξαρτάται από το μέρος του φυτού που αναλύεται: άνθη, πράσινα μέρη (φύλλα, βλαστοί), φλοιοί, oλόκληροι καρποί, περικάρπιο ή μόνο σπόροι, ρίζες κ.α. Η συγκέντρωση των τερπενοειδών είναι γενικά μεγαλύτερη στα αναπαραγωγικά όργανα, συνήθως, στην περίοδο πριν και τα διάρκεια της άνθησης. Επίσης, εξαιτίας του προστατευτικού ρόλου που παρέχουν στο φυτό έναντι φυσικών εχθρών, η συγκέντρωσή τους είναι αυξημένη στα νεαρά όργανα παρά στα ώριμα. Το εκκριτικό όργανο που παράγει τα αιθέρια έλαια Οι διαφορές στη σύσταση του αιθερίου ελαίου στα διάφορα μέρη του φυτού μπορεί να εξηγηθεί εν μέρει και από την ετερογενή κατανομή των εκκριτικών οργάνων (τριχίδια,πόροι) στο φυτό. Συχνά από τα όργανα αυτά δεν εκκρίνονται τα ίδια συστατικά, ενώ μπορεί και ο μηχανισμός έκκρισης να είναι διαφορετικός ή ακόμα και να μην αναπτύσσονται ταυτόχρονα σε όλα τα μέρη του φυτού. Το είδος και η θέση των οργάνων αυτών είναι χαρακτηριστικά για κάθε οικογένεια. Εποχική διακύμανση Σε πολλά είδη η σύσταση του αιθερίου ελαίου τους μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του έτους, γεγονός που καθορίζει και την εποχή συλλογής του φυτού. Συχνά οι μεταβολές στη σύσταση όσο και στην απόδοση σε αιθέριο έλαιο συνδέονται με τις καιρικές συνθήκες που επικρατούν τους διάφορους μήνες του έτους (διάρκεια ηλιοφάνειας,θερμοκρασία, υγρασία) ή ακόμη και με επιμολύνσεις από παθογόνους μικροοργανισμούς (ιδιαίτερα κατά τους μήνες με υψηλή βροχόπτωση). Σε κάθε περίπτωση η εποχή συλλογής επιλέγεται βάσει του επιθυμητού συνδυασμού σύστασης και απόδοσης σε αιθέριο έλαιο. Μηχανικές και χημικές βλάβες Η συγκέντρωση των δευτερογενών μεταβολιτών στο φυτό επηρεάζεται από πληγές ή προσβολές που μπορεί να προκληθούν από αρπακτικά πτηνά ή ακόμη και από την εφαρμογή ζιζανιοκτόνων. Στις περιπτώσεις αυτές νέα συστατικά μπορεί να παραχθούν ή ακόμη μπορεί να παρατηρείται αύξηση στη συγκέντρωση ή/και αλλαγή στις αναλογίες των ήδη υπαρχόντων συστατικών. Η αντίδραση ενός υγειούς φυτού σε οποιοδήποτε είδος μηχανικής ή χημικής βλάβης επιπλέον εξαρτάται και από το στάδιο ανάπτυξης του φυτού, τη διαθεσιμότητα του νερού, την ηλιοφάνεια κ.α. 19

Περιβαλλοντικοί παράγοντες Το κλίμα Η παραγωγή των αιθερίων ελαίων εξαρτάται άμεσα από τις κλιματικές συνθήκες που επικρατούν στο περιβάλλον ανάπτυξης του φυτού. Το κλίμα είναι ίσως ο μοναδικός παράγοντας που διαφεύγει του ανθρώπινου ελέγχου, γι αυτό και θεωρείται καθοριστικός στην ποιότητα των αιθερίων ελαίων. Έτσι, εξαιτίας των άνυδρων και θερμών καλοκαιρινών μηνών των τελευταίων ετών παρατηρήθηκε μείωση στην απόδοση σε αιθέριο έλαιο του δενδρολίβανου (στην Τυνησία) από 60-70 tn στους 20 tn για τα έτη 2002 και 2003 αντίστοιχα (Ouahada, 2004). Oι Turtola et al (2003) έδειξαν ότι υπό συνθήκες ξηρασίας η συγκέντρωση των τερπενίων αυξάνεται, ενώ μειώνεται η ανάπτυξη στα φυτά Pinus sylvestris και Picea abies. Στα είδη Coriandrum sativum και Thymus vulgaris η απόδοση σε αιθέριο έλαιο αυξάνει με την αύξηση της άρδευσης. Σε συνθήκες ξηρασίας μειώνεται η φωτοσυνθετική δραστηριότητα των φυτών και μεταβάλλεται η ικανότητα πρόσληψης θρεπτικών συστατικών. Κάτω από τέτοιες συνθήκες στρες, τα φυτά είναι περισσότερο επιρρεπή σε παθογόνους οργανισμούς και φυτοφάγα ζώα. Γεωγραφική θέση Από πολλές βιβλιογραφικές αναφορές επιβεβαιώνεται ότι συχνά τόσο η απόδοση όσο και η σύσταση του αιθερίου ελαίου για το ίδιο είδος φυτού εξαρτάται από τη γεωγραφική θέση της καλλιέργειας. Έτσι, στη βιβλιογραφία παρατηρείται μία αξιοσημείωτη ποικιλότητα στην περιεκτικότητα των συστατικών αιθερίου ελαίου σε κάποια είδη φυτών (π.χ.t. vulgaris) που υποδηλώνει την ύπαρξη χημειοτύπων. Η ύπαρξη χημειοτύπων είναι το αποτέλεσμα διαφορών στις περιβαλλοντικές συνθήκες, στις συνθήκες καλλιέργειας (γεωγραφικό ύψος, ηλιοφάνεια, τύπος εφάδους), οι οποίες καταλήγουν και σε γενετικές διαφοροποιήσεις των ειδών. Γενετικοί παράγοντες Η παραγωγή και η χημική σύσταση των αιθερίων ελαίων από τα φυτά είναι γενετικά καθορισμένη. Ωστόσο, μικρές διαφορές στο γονότυπο ατόμων του ίδιου είδους επηρεάζουν σημαντικά τη χημική σύσταση των δευτερογενών μεταβολιτών (δημιουργία χημειοτύπων), χωρίς να μεταβάλλουν την μορφολογία του (http://encyclopedia.thefreedictionary.com/chemotype; Νemeth 2005). 20

Ο Ρόλος Των Αιθερίων Ελαίων Ο ρολος τους Ο ακριβης ρόλος των αιθερίων ελαίων δεν έχει γίνει ακόμη γνωστός, υπαρχουν όμως πολλες υποθεσεις καποιες από αυτές είναι οι παρακατω: Προστασία του φυτού: Μίγματα τερπενοειδών (όπως η λιναλοόλη και τολιμονένιο) ή άλλων ουσιών συσσωρεύονται συνήθως σε κύτταρα με υψηλή εξειδίκευση όπως αδενώδεις τρίχες ή αδένες, με τη μορφή αιθερίων ελαίων. Οι δομές αυτές, είτε έχουν καθαρά αμυντικούς ρόλους, αφού τα προϊόντα τους παρουσιάζουν τοξική ή απωθητική δράση έναντι παθογόνων και φυτοφάγων (Taiz and Zeiger 1998 ; Jacobson 1982), είτε συμβάλλουν στην προσέλκυση των επικονιαστών ή των φυτοφάγων (Seigler 1998 ; Pichersky and Gershenzon 2002). Ως φερομόνες διαφόρων εντόμων : Ορισμένα μονοτερπένια, συστατικά αιθερίων ελαίων δρουν ως φερομόνες εντόμων όπως η γερανιόλη, το μυρκένιο, το λιμονένιο και το α και β πινένιο (Pichersky and Gershenzon 2000). Έναρξη αμυντικών μηχανισμών φυτού: Υπάρχουν ενδείξεις ότι ορισμένα πτητικά συστατικά, μεταξύ αυτών και τερπένια, διαδραματίζουν ρόλο σημάτων συναγερμού, αφού ελευθερώνονται από τραυματισμένους φυτικούς ιστούς και επάγουν αμυντικούς μηχανισμούς σε γειτονικά, μη τραυματισμένα φυτά (Pichersky and Gershenzon 2000). μειώνουν την απώλεια του νερού με την διαπνοή. προσελκύουν τα έντομα, που μαζεύουν τη γύρη και βοηθούν έτσι στην αναπαραγωγή και επικονίαση. έχουν αντισηπτικές ιδιότητες και ενεργούν κατά των βακτηρίων, των μυκήτων και των ζυμών. για να τα βοηθήσουν να επηρεάσουν άλλα φυτά που αναπτύσσονται στην ίδια περιοχή (αλληλοπάθεια), ως αποθήκες ενέργειας επούλωση πληγών. Τέλος τα αιθέρια έλαια λόγω των διάφορων συστατικών που διαθέτουν έχουν 21

αντιοξειδωτικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες (Azaz et al., 2005; Panizzi et al., 1993;Yadegarinia et al., 2006; Chorianopoulos et al., 2006). Προετοιμασία δείγματος πτητικών συστατικών αιθερίων ελαίων Γενικά Τα αιθέρια έλαια είναι υγρά, και δεν αφήνουν κηλίδα σε διηθητικό χαρτί σε αντίθεση με τα λιπαρά έλαια. Είναι άχρωμα έως υποκίτρινα με ελάχιστες εξαιρέσεις (γαρυφαλλέλαιο,αιθέριο έλαιο χαμομηλιού). Δεν διαλύονται παρά ελάχιστα στο νερό, ενώ είναι διαλυτά σε αιθέρα, αιθανόλη και στους περισσότερους οργανικούς διαλύτες. Κατά την παραμονή τους επί πολύ χρόνο μετά την παραλαβή τους σκουραίνουν, ρητινοποιούνται και παρουσιάζουν αλλοιώσεις στην οσμή τους. Αιτία αυτών αποτελούν οι αντιδράσεις αυτοοξείδωσεις, πολυμερισμού και υδρόλυσης των εστέρων. Η υγρασία, η θερμοκρασία και το φως επηρεάζουν τα αιθέρια έλαια, γι αυτό πρέπει να φυλάσσονται σε μικρά και καλά κλεισμένα δοχεία γυάλινα ή μεταλλικά από ανοξείδωτο χάλυβα και σε θερμοκρασία 0 0C (Γαβαλάς 2004). Οι κλασικές μέθοδοι παραλαβής των αιθερίων ελαίων είναι η απόσταξη, η εκχύλιση (κυρίως για άνθη ή άλλα φυτικά υλικά ευπαθή στην απόσταξη) και η μηχανική έκθλιψη (Σουλελές 2000; Bicchi 2000). Διεθνώς ως «αιθέριο έλαιο» ορίζεται το προϊόν παραλαβής με απόσταξη με ατμό (steam distillation, SD), υδροαπόσταξη (hydrodistillation, HD), ή έκθλιψη (expression) του φυτού ή μέρους αυτού (Bicchi 2000). Παραλαβή αιθερίων ελαίων Η παραλαβή των αιθέριων ελαίων μπορεί να γίνει με διάφορες μεθόδους (απόσταξη,εκχύλιση, σύνθλιψη, κλπ.), ανάλογα με το είδος και το τμήμα του φυτικού υλικού και την περιεκτικότητα του σε αιθέρια έλαια. Ακόμη, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η τιμή του αιθέριου ελαίου, η χημική σύνθεση των συστατικών του και άλλοι παράγοντες. Η απόσταξη είναι η πιο διαδομένη μέθοδος που χρησιμοποιείται για την παραλαβή των αιθέριων ελαίων. Πάραυτα υπάρχουν διάφορα είδη εξαγωγής προκειμένου να απομονωθούν τα αιθέρια έλαια από το λουλούδι, το φλοιό, τους σπόρους, τα φύλλα,τις ρίζες ή της ρητίνες εν προκειμένω, των φυτών: 22

Απορρόφηση από καθαρό λίπος: Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για τη λήψη αιθέριων ελαίων τα οποία περιέχονται σε ευαίσθητους ιστούς όπως είναι τα πέταλα των ανθέων. Όταν η πρώτη ύλη είναι λουλούδια που παράγουν και διασκορπίζουν στο περιβάλλον το αιθέριο έλαιο και μετά τη συλλογή τους, τότε μπορεί να γίνει εκχύλιση με ψυχρό λίπος για την παραλαβή του αιθέριου ελαίου. Πρόκειται για βελτίωση της μεθόδου παρασκευής των αρωματικών αλοιφών που είχε εφαρμοστεί στην αρχαιότητα. Κατά τη μέθοδο αυτή νωπά άνθη (ολόκληρα ή κατατμημένα) έρχονται σε επαφή με καθαρό λίπος το οποίο είναι επιστρωμένο πάνω σε πλάκες ως λεπτή στοιβάδα. Το αιθέριο έλαιο απορροφάται από το λίπος και εν συνεχεία εκχυλίζεται. Τα άνθη αντικαθίστανται ανά τακτά χρονικά διαστήματα με νέα. Η μέθοδος είναι γνωστή ως εξανθοσμία (Εnfleurage). Η απόσταξη με υδρατμούς (υδροαπόσταξη): Κατά τη μέθοδο αυτή το φυτικό υλικό αναμιγνύεται με νερό, και μέσα από τη μάζα του διαβιβάζεταιατμός παραγόμενος από εξωτερική πηγή. Κατά την διέλευση του μέσα από το φυτικό υλικό, ο ατμός συμπαρασύρει το αιθέριο έλαιο και διέρχεται μέσωεφαρμοσμένου ψυκτήρα που καταλήγει σε μια φιάλη υποδοχής του αποστάγματος όπου συνυπάρχουν το αιθέριο έλαιο και το νερό. Υπάρχουν παραλλαγές του συστήματος και μια συνηθισμένη από αυτές είναι η συσκευή Clevenger. Το αιθέριο έλαιο επιπλέει στο νερό και διαχωρίζεται με μηχανική αναρρόφηση. Η παραλαβή των αιθέριων ελαίων με απόσταξη διαρκεί 1-3 ώρες, ανάλογα με το είδος και την ποσότητα του αιθέριου ελαίου. Με τη μέθοδο αυτή απομονώνονται πολλά πτητικά αιθέρια έλαια χωρίς τον κίνδυνο αποσυνθέσεως τους, αφού αποστάζουν σε θερμοκρασίες κάτω των 100 C (Σ.Ζ νερού). Η απόσταξη γίνεται συνήθως σε ατμοσφαιρική πίεση και σε ειδικές περιπτώσεις σε ελαττωμένη ή σε υψηλή πίεση. Εκχύλιση με συγκεκριμένο διαλύτη: Στη μέθοδο αυτή η απομάκρυνση του διαλύτη πρέπει να διεξάγεται σε όσον το δυνατό χαμηλότερη θερμοκρασία ώστε να μην υπάρχει απώλεια πτητικών συστατικών του αιθέριου ελαίου. Η εκχύλιση και ιδιαίτερα η εκχύλιση με πτητικούς διαλύτες, είναι η μέθοδος που προτιμάται όταν η πρώτη ύλη είναι λουλούδια με αιθέριο έλαιο μεγάλης αξίας (π.χ. γιασεμί). Αυτό συμβαίνει γιατί με αυτό το είδος εκχύλισης απομονώνεται όλο το αιθέριο έλαιο, το οποίο αντιπροσωπεύει το πραγματικό άρωμα του φυτού, από το οποίο προέρχεται (αντίθετα, με την απόσταξη λαμβάνονται μόνο τα πτητικά συστατικά του αιθέριου ελαίου). Η νέα και ήπια τεχνολογία εκχύλισης βοτανικών πρώτων υλών που 23

χρησιμοποιεί ως διαλύτη το διοξείδιο του άνθρακα (CO2). Το διοξείδιο του άνθρακα είναι ένα φυσικό αέριο, και είναι αναγνωρισμένος ως ασφαλής (GRAS) εγκεκριμένος διαλύτης για λιπόφιλα μόρια. Το ψυχρό υπερκρίσιμο υγρό διοξείδιο του άνθρακα δίνει εκχυλίσματα τα οποία περιέχουν ως επί το πλείστον αιθέρια έλαια και λιπόφιλα βοτανικά συστατικά που διαλύει τοδιοξείδιο του άνθρακα. Η τελική απομόνωση των συστατικών περιέχει υψηλή από τα αιθέρια συστατικά και καθόλου υπολείμματα διαλύτη. Επιπλέον τα εκχυλίσματα δεν περιέχουν μικροβιολογικούς ρύπους. Η διαδικασία εκχύλισης είναι πιο ήπια σε σύγκριση με αυτήν της απόσταξης με ατμό, λόγω των χαμηλότερων θερμοκρασιών και της αδρανούς CO2 ατμόσφαιρας. Έτσι δεν έχουμε ισομερισμό, οξειδώσεις και υδρόλυση. Το αιθέριο έλαιο που κερδίζουμε θεωρείται ανώτερο σε ποιότητα σε σύγκριση με αυτό που παίρνουμε μέσω της απόσταξης με ατμό, σε φρεσκάδα και με τυπικό και αυθεντικό άρωμα που είναι πολύ κοντά στην φυτική πρώτη ύλη. Μηχανική συμπίεση εν ψυχρώ με εφαρμογή υψηλής πιέσεως: Το εκ πιέσεως λαμβανόμενο υγρό είναι γαλάκτωμα ελαίου σε νερό και το αιθέριο έλαιο παραλαμβάνεται με φυγοκέντρηση. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται κυρίως για την παραλαβή ελαίων των καρπών του γένους Citrus τα οποία είναι ιδιαιτέρως ευπαθή σε υδρόλυση και οξείδωση. Η χρησιμοποίηση μηχανικών μέσων (σύνθλιψη, έκθλιψη, κλπ.) γίνεται κατά την παραλαβή αιθέριων ελαίων από ξηρούς καρπούς ή από το φλοιό των εσπεριδοειδών. Για το σκοπό αυτό υπάρχουν ειδικά μηχανήματα ή πιεστήρια που μοιάζουν με τα ελαιοτριβεία. Απόσταξη επιταχυνόμενη με υπέρυθρη ακτινοβολία (MASD)17. Η MASD (Microwave Accelerated Steam Distillation) αποτελεί μια από τις πλέον σύγχρονες τεχνικές εξαγωγής αιθέριου ελαίου. Αποτελεί μια επέκταση της τεχνικής της υδροαπόσταξης όπου η θέρμανση που παρέχεται είναι από ένα πηγή υπέρυθρης ακτινοβολίας. Η οργανολογία είναι ακριβώς η ίδια απλώς την θέση του θερμαντικού σώματος είναι ο φούρνος IR. 24

Χρησεις αιθερίων ελαίων: Τα αιθέρια έλαια χρησιμοποιούνταν κυρίως στην αρωματοποιία αλλά και στην ιατρική. Ήταν ήδη διαδεδομένη η χρήση τους για την αντιμετώπιση μιας μεγάλης ποικιλίας σωματικών και ψυχικών δυσαρμονιών, τόσο από τους βοτανολόγους όσο και από τους γιατρούς, που διατηρήθηκε μέχρι τα τέλη του 19ου αιώνα. Συνήθως χρησιμοποιούνταν αρωματικά φυτά για θεραπευτικούς σκοπούς και τα πιο διαδεδομένα ήταν το χαμομήλι, η κανέλλα, το θυμάρι, το δενδρολίβανο, η δάφνη, ο μάραθος κ.α. Μέχρι το 1940 ο κύριος ρόλος των αιθερίων ελαίων ήταν στο να αρωματίζουν τα σύνθετα (χημικά φάρμακα), τα οποία είχαν αντικαταστήσει τα παραδοσιακά βότανα.η μελέτη των αιθερίων ελαίων συνεχίζεται έως σήμερα, με αποτέλεσμα να έχουν μελετηθεί τα περισσότερα από αυτά. Σε αυτό έχει βοηθήσει η εφαρμογή νέων, βελτιωμένων μεθόδων ανάλυσης. Οι κυριότερες από αυτές είναι η αέρια χρωμτογραφία (GC), η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), η φασματογραφία μαζών (MS). ΤΡΟΠΟΙ ΧΡΗΣΗΣ Τρεις είναι οι κυριότεροι τρόποι χρήσης των αιθέριων ελαίων: 1. Συσκευές καύσης: Είναι ο πιο εύκολος και πιο φθηνός τρόπος χρήσης, παράλληλα όμως είναι πολύ αποτελεσματικός αφού βιώνουμε το αιθέριο έλαιο στην αέρια κατάστασή του (τη λιγότερα στερεά μορφή ύλης). Επίσης έχει το πλεονέκτημα ότι μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε οποιοδήποτε αιθέριο έλαιο (ακόμα και αυτά που δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο δέρμα). Τέλος είναι ο μοναδικός τρόπος με τον οποίο μπορούμε να εξαγνίσουμε, να καθαρίσουμε ή απλά να αρωματίσουμε έναν χώρο. Απαιτούμενη ποσότητα: μέχρι 3 σταγόνες για ένα δωμάτιο 3x3. 2. Τελετουργικά μπάνια: Το τελετουργικό μπάνιο είναι ένας τρόπος καθαρισμού και εξαγνισμού από τις ενέργειες της μέρας, ενέργειες με τις οποίες ήλθαμε σε επαφή κατά τη διάρκεια των καθημερινών ασχολιών μας. Ένα τέτοιο μπάνιο θα μας αναζωογονήσει και θα μας απαλλάξει από τα δυσάρεστα ενεργειακά βάρη. Είναι μία μέθοδος εύκολη στη χρήση της. Το μόνο που χρειάζεται είναι να επιλέξουμε το κατάλληλο αιθέριο έλαιο για την περίπτωσή μας. Στο μπάνιο μπορούμε να μείνουμε 15-20 λεπτά. 25