Για διαγνωστική χρήση In Vitro. ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ. ΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΒΟΛΩΝ (Ετικέτες προϊόντων και συμπληρωματικά έγγραφα)

Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford CT USA 060 Τηλ.: +1 (0) 8-9500 ή (888) 9-055 (Μόνο για τις Η.Π.Α. και Καναδά), Φαξ: +1 (0) 8-9599 WWW.IMMUCOR.COM Εγχειρίδια προϊόντος και μεταφράσεις στη διεύθυνση: www.immucor.com Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ο Σ LIFECODES ID Τάξης Ι: Ένας Προσδιορισμός Διαλογής Luminex για την Ποιοτική Ανίχνευση Αντισωμάτων Αντιδραστικών Ομάδων IgG σε Μόρια HLA Τάξης I. LIFECODES IDv Τάξης ΙΙ: Ένας Προσδιορισμός Διαλογής Luminex για την Ποιοτική Ανίχνευση Αντισωμάτων Αντιδραστικών Ομάδων IgG σε Μόρια HLA Τάξης ΙI. Για διαγνωστική χρήση In Vitro. ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Ορισμός συμβόλων... Προοριζόμενη χρήση... Σύνοψη και περιγραφή... Αρχές της διαδικασίας... Αντιδραστήρια... A. Ταυτοποίηση... Β. Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις... Γ. Οδηγίες φύλαξης... Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση... Ε. Ενδείξεις αστάθειας... Απαιτούμενα όργανα... Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία... 1 Διαδικασία... Α. Παρεχόμενα υλικά... B. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται... Οδηγίες χρήσης... Αποτελέσματα... Έλεγχος ποιότητας... Περιορισμοί της διαδικασίας... Αντιμετώπιση προβλημάτων... Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης... Βιβλιογραφία... 4 5 5 5 6 6 6 ΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΒΟΛΩΝ (Ετικέτες προϊόντων και συμπληρωματικά έγγραφα) Αριθμός Παρτίδας Αριθμός καταλόγου Ημερομηνία λήξης Εύρος θερμοκρασιών (φύλαξη) Αραίωση πριν από τη χρήση DIL Φωτοευαίσθητο (Να κρατηθεί μακριά από το φως) Επαρκεί για N δοκιμές Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Όνομα ασθενούς NAME Αριθμός ταυτοποίησης ID# Ημερομηνία DATE Τεχνικός TECH Σφαιρίδιο BEAD Εθνικότητα ETHN Δωρητής DONOR Ημερομηνία αιμορραγίας BDT Συντελεστής ρύθμισης υποβάθρου BAF Διάμεση Ένταση Φθορισμού MFI Αντισώματα αντιδραστικής ομάδας PRA Ερμηνεία INTRP Σφαιρίδιο αρνητικού μάρτυρα CON Σφαιρίδιο θετικού μάρτυρα (Ανοσοσφαιρίνη G) IgG Αντιγόνο AG Δείγμα SAMPLE Τάξη I CLI Τάξη II CLII Γραμμή ROW Στήλη COL Αριθμός σφαιριδίων με αντιγόνο Αναμενόμενες σειρές EXPECTED RANGES Κατασκευαστής Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Προειδοποίηση Σελίδα 1 από 6 LC807IVDEL.15 (07/16)

ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Τα Κιτ LIFECODES ID Τάξης I και IDv Τάξης II είναι ανοσοπροσδιορισμοί σφαιριδίων που χρησιμοποιούνται για την ποιοτική ανίχνευση αντισωμάτων IgG HLA Αντιδραστικής Ομάδας (PRA). ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Τα αντιγόνα ανθρώπινων λευκοκυττάρων (HLA) είναι ένα σύστημα γλυκοπρωτεϊνών που έχουν λειτουργικό ρόλο στην παρουσίαση των πεπτιδίων στο ανοσιακό σύστημα. 1, Ωστόσο, σε ένα ιδιαίτερα πολυμορφικό σύστημα, τα μόρια HLA μπορεί να γίνουν στόχοι των αποκρίσεων των αντισωμάτων σε άτομα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, μετάγγισης προϊόντων αίματος ή απόρριψης μεταμόσχευσης οργάνων. Γενικά, η αλλοανοσοποίηση οδηγεί στην παραγωγή αντισωμάτων HLA στο % περίπου των ατόμων που έχουν εκτεθεί. Η παρουσία ή απουσία αυτών των ειδικών των HLA αντισωμάτων παίζει ρόλο στον προσδιορισμό της επιβίωσης των αλλομοσχευμάτων των μεταμοσχεύσεων. 4 Τα Σφαιρίδια LIFECODES ID Τάξης I προορίζονται να ανιχνεύουν αντισώματα IgG για τις γλυκοπρωτεΐνες HLA Τάξης I. Το LIFECODES ID Τάξης Ι αποτελείται από διαφορετικά Σφαιρίδια Luminex συζευγμένα με γλυκοπρωτεΐνες κεκαθαρμένης συγγένειας HLA Τάξης Ι από διαφορετικά άτομα. Τα Σφαιρίδια LIFECODES IDv Τάξης IΙ προορίζονται να ανιχνεύουν αντισώματα IgG για τις γλυκοπρωτεΐνες HLA Τάξης IΙ. Το LIFECODES IDv Τάξης ΙΙ αποτελείται από διαφορετικά Σφαιρίδια Luminex συζευγμένα με γλυκοπρωτεΐνες κεκαθαρμένης συγγένειας HLA Τάξης ΙΙ από διαφορετικά άτομα. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Ένα κλάσμα των σφαιριδίων επιτρέπεται να επωαστεί μαζί με ένα μικρό όγκο δείγματος ορού δοκιμής. Τα ευαισθητοποιημένα σφαιρίδια στη συνέχεια θα εκπλυθούν για να απομακρυνθεί το μη συνδεδεμένο αντίσωμα. Κατόπιν προστίθεται αντι-ανθρώπινο αντίσωμα IgG συζευγμένο με φυκοερυθρίνη. Μετά από μια ακόμη επώαση, το δείγμα της δοκιμής αραιώνεται και αναλύεται στο όργανο Luminex. Η ένταση του σήματος από κάθε σφαιρίδιο συγκρίνεται με την ένταση του σήματος ενός σφαιριδίου αρνητικού μάρτυρα που περιλαμβάνεται στο παρασκεύασμα σφαιριδίων για να εξακριβωθεί αν το σφαιρίδιο είναι θετικό ή αρνητικό για το συνδεδεμένο αλλοαντίσωμα. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ A. Ταυτοποίηση 6800: LM1 Το LIFECODES ID Τάξης I αποτελείται από πέντε (5) συστατικά στοιχεία σε επαρκείς ποσότητες για 4 δοκιμές. 1. LM1B Σφαιρίδια HLA I (10 µl): Ένα μείγμα σφαιριδίων συζευγμένων με γλυκοπρωτεΐνες HLA Τάξης I από διαφορετικό άτομο μαζί με τέσσερα (4) σφαιρίδια-μάρτυρες. Το ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης είναι ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιέχει NaCl, Tween-0, ProClin 00 και λευκωματίνη βόειου. ΦΩΤΟΕΥΑΙΣΘΗΤΟ. Διατηρήστε τη συνήθη έκθεση στο φως σε τρεις ώρες ή λιγότερο. Να φυλάσσεται στους έως 8 C σε σκοτεινό μέρος.. LMCJ Συμπύκνωμα συζεύγματος (170 µl): Αντι-ανθρώπινη IgG αίγας συζευγμένη με φυκοερυθρίνη σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης που περιέχει NaCl, Tween-0, αζίδιο νατρίου και λευκωματίνη βόειου ορού. DIL ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΑΡΑΙΩΘΕΙ ΣΕ ΑΝΑΛΟΓΙΑ 1:10 σε Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης πριν από τη χρήση. ΦΩΤΟΕΥΑΙΣΘΗΤΟ. Κρατήστε τα μακριά από το άμεσο φως για παρατεταμένες χρονικές περιόδους. Να φυλάσσεται στους έως 8 C σε σκοτεινό μέρος.. LMWB Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (0 ml): Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιέχει NaCl, Tween-0, αζίδιο νατρίου και λευκωματίνη βόειου ορού. Να φυλάσσεται στους έως 8 C και να αποκτά θερμοκρασία δωματίου (0 έως 4 o C) πριν από τη χρήση. 4. LMPC Ορός θετικού μάρτυρα (80 µl): Αυτό το ορός ή μίγμα ορών λαμβάνεται από άτομα που αποδεικνύεται ότι είναι στα αντιγόνα HLA (>85% PRA). Να φυλάσσεται στους έως 8 C. 5. LMNC Ορός αρνητικού μάρτυρα (80 µl): Αυτό το ορός ή μίγμα ορών λαμβάνεται από το άτομο που είναι γνωστό για να μην έχει κανένα αντίσωμα στα αντιγόνα HLA (<10% PRA). Να φυλάσσεται στους έως 8 C. 68: LMQ Το LIFECODES IDv Τάξης ΙΙ αποτελείται από πέντε (5) συστατικά στοιχεία σε επαρκείς ποσότητες για 4 δοκιμές. 1. LMB Σφαιρίδια HLA II (10 µl): Ένα μείγμα σφαιριδίων συζευγμένων με γλυκοπρωτεΐνες HLA Τάξης ΙI από διαφορετικό άτομο μαζί με τέσσερα (4) σφαιρίδια-μάρτυρες. Το ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης είναι ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιέχει NaCl, Tween-0, αζίδιο νατρίου και λευκωματίνη βόειου ορού. ΦΩΤΟΕΥΑΙΣΘΗΤΟ. Διατηρήστε τη συνήθη έκθεση στο φως σε τρεις ώρες ή λιγότερο. Να φυλάσσεται στους έως 8 C σε σκοτεινό μέρος.. LMCJ Συμπύκνωμα συζεύγματος (170 µl): Αντι-ανθρώπινη IgG αίγας συζευγμένη με φυκοερυθρίνη σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης που περιέχει NaCl, Tween-0, αζίδιο νατρίου και λευκωματίνη βόειου ορού. DIL ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΑΡΑΙΩΘΕΙ ΣΕ ΑΝΑΛΟΓΙΑ 1 προς10 σε Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης πριν από τη χρήση. ΦΩΤΟΕΥΑΙΣΘΗΤΟ. Κρατήστε τα μακριά από το άμεσο φως για παρατεταμένες χρονικές περιόδους. Να φυλάσσεται στους έως 8 C σε σκοτεινό μέρος.. LMWB Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (0 ml): Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιέχει NaCl, Tween-0, αζίδιο νατρίου και λευκωματίνη βόειου ορού. Να φυλάσσεται στους έως 8 C και να αποκτά θερμοκρασία δωματίου (0 έως 4 o C) πριν από τη χρήση. 4. LMPC Ορός θετικού μάρτυρα (80 µl): Αυτός ο ορός ή μίγμα ορών λαμβάνεται από άτομο(α) που αποδεικνύεται ότι είναι αλλοανοσοποιητικά στα αντιγόνα HLA (>85% PRA). Να φυλάσσεται στους έως 8 C. 5. LMNC Ορός αρνητικού μάρτυρα (80 µl): Αυτός ο ορός ή μίγμα ορών λαμβάνεται από άτομο(α) που είναι γνωστό ότι δεν διαθέτουν κανένα αντίσωμα στα αντιγόνα HLA (<10% PRA). Να φυλάσσεται στους έως 8 C. B. Προειδοποιήσεις ή Προφυλάξεις 1. Για διαγνωστική χρήση In Vitro. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του παρόντος κιτ δοκιμάστηκε και βρέθηκε αρνητικό για αντισώματα στους ιούς HIV, HCV και HBsAg με μεθόδους εγκεκριμένες από την υπηρεσία FDA. Ωστόσο, καμία μέθοδος δοκιμής δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση ως προς την απουσία μολυσματικών παραγόντων. Επομένως, να εφαρμόζετε τις Γενικές Προφυλάξεις όταν εργάζεστε με αυτά τα υλικά.. Η αντικατάσταση συστατικών στοιχείων με στοιχεία που δεν παρέχονται με το παρόν σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα. 4. Τα αντιδραστήρια περιέχουν 0,1% αζίδιο νατρίου ως συντηρητικό, το οποίο μπορεί να αντιδράσει με τις σωληνώσεις από μόλυβδο ή χαλκό και να σχηματίσει εκρηκτικά μεταλλικά αζίδια. Να χρησιμοποιείτε άφθονες ποσότητες νερού όταν απορρίπτετε αυτά τα υλικά στο νεροχύτη. Σελίδα από 6 LC807IVDEL.15 (07/16)

5. Η βακτηριακή μόλυνση των δειγμάτων ή η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων ή άλλων συσσωματωμάτων ανοσοσφαιρίνης μπορεί να προκαλέσει αυξημένη μη ειδική σύνδεση και λανθασμένα αποτελέσματα. 6. Το παρόν προϊόν ανιχνεύει αντισώματα IgG που μπορεί να είναι ή να μην είναι λεμφοκυτταροτοξικά. 7. Το παρόν προϊόν δεν αναμένεται να ανιχνεύει αντισώματα ανοσοσφαιρίνης τάξης IgA ή IgM. 8. Τα αποτελέσματα που έχουν αρκετά θετικά σφαιρίδια DQ, τα οποία δεν μοιράζονται δοκιμαστικούς τύπους DQ, ενδέχεται να δηλώνουν την παρουσία ενός ειδικού αντισώματος άλφα DQ. Εξετάστε περαιτέρω αυτά τα δεδομένα. 9. Τα ειδικά αντισώματα DQ, τα οποία έχουν θετικά αποτελέσματα στα ομοζυγωτικά συζευγμένα σφαιρίδια του δότη DQ που δεν υποστηρίζονται από κάποιο θετικό αποτέλεσμα στον αντίστοιχο ετεροζυγωτικό δότη DQ, ενδέχεται να δηλώσουν ένα ελαφρώς αντιδραστικό αντίσωμα. Εξετάστε περισσότερο αυτά τα δεδομένα. 10. Ο προσδιορισμός του ποσοστού % PRA δεν είναι η μοναδική βάση για μια κλινική απόφαση που επηρεάζει τη θεραπεία ενός ασθενή. Συνήθως πραγματοποιείται μια τελική διασταύρωση πριν τη μεταμόσχευση 11. Τα προϊόντα αυτά προορίζονται για χρήση με το όργανο Luminex σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1. Απορρίψτε όλα τα υλικά μετά τη χρήση, σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς. 1. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά Φύλλα δεδομένων ασφαλείας υλικού. Γ. Οδηγίες φύλαξης 1. Ανατρέξτε στις ετικέτες του προϊόντος για οδηγίες φύλαξης.. Τα σφαιρίδια και τα συζεύγματα είναι ΦΩΤΟΕΥΑΙΣΘΗΤΑ. Διατηρείτε τη συνήθη έκθεση στο φως έως τρεις ώρες ή λιγότερο. Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση 1. Βλ. «Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία».. Το συμπυκνωμένο σύζευγμα πρέπει να αραιωθεί σε αναλογία 1:10 σε Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης πριν από τη χρήση. Ε. Ενδείξεις αστάθειας 1. Μη χρησιμοποιείτε συστατικά ή μάρτυρες που παρουσιάζουν θολότητα ή έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης τους.. Απορρίψτε όλους τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες που δεν χρησιμοποιήθηκαν, καθώς και το σύζευγμα μετά τη χρήση. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΟΡΓΑΝΑ Όργανο Luminex και Βάση XY (Lifecodes Αριθμός Καταλόγου 88800, 8880) ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Το αίμα πρέπει να συλλέγεται χωρίς αντιπηκτικό με ασηπτική τεχνική και να ελέγχεται όσο είναι ακόμη φρέσκο ώστε να ελαχιστοποιείται η πιθανότητα εμφάνισης ψευδώς θετικών ή ψευδώς αρνητικών αντιδράσεων λόγω ακατάλληλης αποθήκευσης ή μόλυνσης του δείγματος. Ο ορός πρέπει να αποθηκεύεται σε θερμοκρασία από έως 8 C για 48 ώρες το πολύ. Εάν ο ορός πρέπει να αποθηκευθεί για περισσότερο από 48 ώρες, πρέπει να καταψύχεται στους ή κάτω από 0 C ή -80 C έως χρόνια. Μεμονωμένα εργαστήρια θα πρέπει να καθορίσουν και να επικυρώσουν μεθόδους για την αποθήκευση ορών για περισσότερο από χρόνια. Ο ορός πρέπει να διαχωρίζεται από τα ερυθροκύτταρα όταν αποθηκεύεται ή μεταφέρεται. Αποφύγετε την επανειλημμένη ψύξη και απόψυξη των δειγμάτων ορού. Μην χρησιμοποιείτε μικροβιολογικά μολυσμένους, αιμολυμένους, λιπαιμικούς ή απενεργοποιημένους με θερμότητα ορούς δεδομένου ότι τα δείγματα αυτά ενδέχεται να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. Πριν από τον προσδιορισμό, όλα τα δείγματα πρέπει να αναμειχθούν με δονητικό αναδευτήρα και να φυγοκεντρηθούν για σύντομο χρονικό διάστημα (0 δευτερόλεπτα στα 10.000xg) για να ιζηματοποιηθούν τα σωματίδια που ενδέχεται να υπάρχουν. Σε εργαστηριακή δοκιμή, αξιολογήθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια και δεν υπήρξε παρεμβολή με το LIFECODES LifeScreen Deluxe: Remicade (Centocor), Rituxin (Genentech), Zenapax (Roche), Campath (Genzyme), και Gammaguard (Baxter). Αντίθετα, το Thymoglobulin (Genzyme) φάνηκε να προκαλεί ψευδή θετικά αποτελέσματα. Τα δείγματα που περιέχουν Thymoglobulin ενδέχεται να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ A. Παρεχόμενα υλικά (Βλ. Την ενότητα ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ για πιο συγκεκριμένες πληροφορίες) Σφαιρίδια HLA Συμπύκνωμα συζεύγματος Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Ορός θετικού μάρτυρα Ορός αρνητικού μάρτυρα Φύλλο καταγραφής Φύλλο μορφής πλάκας B. Υλικά, αντιδραστήρια και εξοπλισμός που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται (αυτά που αναφέρονται ή ισοδύναμα) Προσαρμοζόμενες πιπέτες 5 µl 50 µl με κατάλληλες απολήξεις Πολυκάναλη πιπέτα 50 µl με κατάλληλες απολήξεις και δοχείο ρυθμιστικού διαλύματος Σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml για αραιώσεις συζευγμάτων Σωληνάρια δοκιμών για δείγματα ασθενών και μαρτύρων Χρονόμετρο Πένα επισήμανσης Περιστροφική συσκευή ή δονητικός αναδευτήρας με προσαρμογέα πλάκας Υγρό Ελύτρου Luminex (1x ή 0x Lifecodes Αρ. Κατ. 68005 ή 6805) Σφαιρίδια Βαθμονόμησης Luminex (CAL 1, CAL, CON 1, CON, Lifecodes Αρ. Κατ. 68006, 68007, 68008, 68009) Απεσταγμένο νερό Μικροπορώδεις πλάκες πολλαπλού φιλτραρίσματος (Αρ. Κατ. MSBVN110, Lifecodes Ct # 8886) Αυτοκόλλητα πλαστικά καλύμματα Πολλαπλός συλλέκτης κενού (Millipore Αρ. Κατ. MAVM 0960R Qiagen Cat#19504, Lifecodes Cat# 88815) Σελίδα από 6 LC807IVDEL.15 (07/16)

ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ: ΠΡΕΠΕΙ να δοθεί προσοχή ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση του Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης και του αντιδραστηρίου αντιανθρώπινης IgG. Η ακούσια μόλυνση αυτών των αντιδραστηρίων με ανθρώπινο ορό θα προκαλέσει την εξουδετέρωση της αντιανθρώπινης IgG και την επακόλουθη αποτυχία της δοκιμής. Πρέπει να δοθεί προσοχή ώστε να ελέγχεται η ισχύς του κενού. Η ισχυρή πίεση κενού μπορεί να κάνει τα σφαιρίδια να κολλήσουν στη μεμβράνη με αποτέλεσμα να αποτύχει η μέτρηση των σφαιριδίων. Πρέπει να δοθεί προσοχή κατά το πιπετάρισμα στην πλάκα φίλτρου, ώστε να μην κολλήσουν τα σφαιρίδια στις πλευρές των φρεατίων της μικροπλάκας. Τα σφαιρίδια πρέπει να μεταφέρονται με πιπέτα μέσα στο διάλυμα που ήδη βρίσκεται στο φρεάτιο, ενώ πρέπει να προσέχετε να μην ακουμπήσετε τη μεμβράνη με την απόληξη. Η επαφή της μεμβράνης με την απόληξη της πιπέτας μπορεί να προκαλέσει διάτρηση της μεμβράνης και επακόλουθη αποτυχία του προσδιορισμού. Πρέπει να δοθεί προσοχή ώστε να διασφαλιστεί, κατά τα βήματα επώασης, ότι τα σφαιρίδια δεν θα κάνουν το υγρό να χυθεί και δεν θα κολλήσουν στις πλευρές των φρεατίων. Όταν ο προσδιορισμός εκτελείται για πρώτη φορά, αναλύστε μερικούς θετικούς ή/και αρνητικούς μάρτυρες για να καθορίσετε τη βέλτιστη ταχύτητα της περιστροφικής πλατφόρμας ή του δονητικού αναδευτήρα. Η ταχύτητα των 00 περιστροφών ανά λεπτό περίπου έχει αποδειχτεί αποτελεσματική σε ορισμένα όργανα. Η παρουσία σημαντικών επιπέδων μη συνδεδεμένου αντισώματος κατά την ολοκλήρωση του σταδίου έκπλυσης, λόγω περισσεύματος ορού ή ανεπαρκούς έκπλυσης, μπορεί να μειώσει την ικανότητα του προσδιορισμού να ανιχνεύει IgG που έχει συνδεθεί με ευαισθητοποιημένα σφαιρίδια και να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα. Ένα δείγμα θετικών και αρνητικών ορών μάρτυρα πρέπει να περιλαμβάνεται σε κάθε δοκιμή για να διαπιστώνονται τα τεχνικά σφάλματα και οι αστοχίες των βαθμονομητών που ενδεχομένως έχουν παρουσιαστεί. 1. Αφήστε τα άλλα συστατικά στους έως 8 C σε σκοτεινό μέρος μέχρι να τα χρειαστείτε, αφήστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου (0 έως 4 C) πριν από τη χρήση. Κατά τη διάρκεια αυτού του χρονικού διαστήματος, χρησιμοποιήστε το Φύλλο Μορφής Πλάκας για να εκχωρήσετε μια θέση στην πλάκα για καθέναν από τους ορούς και τους μάρτυρες που πρόκειται να αναλυθούν. Οι οροί μάρτυρα που παρέχονται με το κιτ χρησιμοποιούνται στην απεικόνιση ενός ευρέως αντιδραστικού θετικού αλλοορού και ενός αρνητικού ορού.. Καλύψτε τα μη εκχωρημένα φρεάτια της Πλάκας Φίλτρου με αυτοκόλλητο πλαστικό κάλυμμα. Κατόπιν προϋγράνετε τα φρεάτια που θα χρησιμοποιηθούν με 100-00 µl απεσταγμένου νερού. Μετά από -5 λεπτά, αφαιρέστε νερό με απαλή αναρρόφηση της πλάκας μέσω του συλλέκτη κενού. (Βλ. τις συστάσεις του κατασκευαστή για την κατάλληλη χρήση.). Ετοιμάστε γρήγορα τα Σφαιρίδια HLA (0 δευτερόλεπτα) με φυγοκέντρηση του φιαλιδίου στα 600 800 x g για να απομακρυνθούν τα σφαιρίδια ή το υγρό από το καπάκι ή τα τοιχώματα του φιαλιδίου. Αναμείξτε επιμελώς με δονητικό αναδευτήρα (~1 λεπτό) για να επαναιωρηθούν ομοιόμορφα τα σφαιρίδια. 4. Προσθέστε 40 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε κάθε φρεάτιο δοκιμής της Πλάκας Φίλτρου, κατόπιν προσθέστε 1,5 µl ορού ασθενή ή ορού μάρτυρα και αναμείξτε. 5. Προσθέστε 5 µl Σφαιριδίων HLA σε καθένα από τα εκχωρημένα φρεάτια. Κατά τη διανομή των σφαιριδίων, να αναμειγνύετε με δονητικό αναδευτήρα τα Σφαιρίδια HLA ανά λεπτά για να διατηρούνται σε κατάσταση επαναιώρησης. ΠΡΟΣΟΧΗ: Είναι σημαντικό να διατηρείτε τα σφαιρίδια σε κατάσταση επαναιώρησης για να διασφαλίζετε ότι μοιράζονται αρκετά σφαιρίδια στα φρεάτια και να διασφαλίζετε χαμηλούς χρόνους καταμέτρησης. Αν δεν αναμειγνύονται κατά διαστήματα τα σφαιρίδια σε δονητικό αναδευτήρα, τα σφαιρίδια θα εγκατασταθούν κοντά στον πυθμένα του σωληναρίου. Αυτό θα έχει ως αποτέλεσμα την τοποθέτηση διαφορετικών ποσοτήτων σφαιριδίων στα φρεάτια, γεγονός το οποίο ενδέχεται να έχει αρνητική επίδραση στους χρόνους εκτέλεσης και στην ανάλυση των αποτελεσμάτων. 6. Καλύψτε την πλάκα με αυτοκόλλητο πλαστικό κάλυμμα και περιτυλίξτε την ή συσκευάστε την σε κουτί για να προστατεύεται από το φως. Επωάστε για 0 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (0 έως 4 C) σε σκοτεινό μέρος, σε περιστροφική πλατφόρμα (00 περιστροφές ανά λεπτό). Επανατοποθετήστε τα αχρησιμοποίητα τμήματα των ορών μάρτυρα και των σφαιριδίων για φύλαξη σε σκοτεινό μέρος, στους έως 8 C, για μελλοντική χρήση. 7. Αραιώστε το σύζευγμα με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και φυλάξτε το σε σκοτεινό μέρος (5 µl συζεύγματος με 45 µl ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης ανά δείγμα). Για να αντισταθμίσετε τις απώλειες του πιπεταρίσματος, μπορείτε να ετοιμάσετε ένα (1) πρόσθετο μέρος αραιωμένου συζεύγματος. Καλύψτε το με φύλλο ή/και φυλάξτε το σε σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου, μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Επανατοποθετήστε το αχρησιμοποίητο τμήμα του Συμπυκνωμένου Συζεύγματος για φύλαξη σε σκοτεινό μέρος, στους έως 8 C, για μελλοντική χρήση. 8. Μετά από επώαση 0 λεπτών, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο πλαστικό κάλυμμα και προσθέστε 100 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε κάθε φρεάτιο. Αναμείξτε χτυπώντας την πλευρά της πλάκας και αναρροφήστε απαλά. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η χρήση υπερβολικής ισχύος κενού θα κάνει τα σφαιρίδια να προσκολληθούν στη μεμβράνη και ενδέχεται να προκαλέσουν αστοχία του δείγματος. Εφαρμόστε την ελάχιστη πίεση κενού που απαιτείται για την αναρρόφηση των δειγμάτων. 9. Προσθέστε 50 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε κάθε φρεάτιο, αναρροφήστε και επαναλάβετε δύο ακόμη φορές ώστε να εκτελεστούν συνολικά τρεις πλύσεις. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η ανεπαρκής πλύση μπορεί να μειώσει την ικανότητα του συζεύγματος να ανιχνεύει IgG που έχει συνδεθεί με ευαισθητοποιημένα σφαιρίδια και να προκαλέσει λανθασμένα αρνητικά αποτελέσματα. 10. Προσθέστε 50 µl αραιωμένου συζεύγματος σε κάθε φρεάτιο. Καλύψτε την πλάκα με ένα φύλλο ή συσκευάστε την σε ένα κουτί για να προστατεύεται από το φως. Τοποθετήστε την πλάκα σε περιστροφική πλατφόρμα (ρυθμισμένη στις 00 περιστροφές ανά λεπτό) ή να αναμειγνύετε απαλά με δονητικό αναδευτήρα ανά 5-10 λεπτά. Επωάστε για 0 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (0 έως 4 C). 11. Χρησιμοποιώντας μια καθαρή απόληξη πιπέτας, προσθέστε 10-150 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης σε κάθε φρεάτιο και αναμείξτε για να επαναιωρηθούν τα σφαιρίδια. 1. Συλλέξτε δεδομένα με το όργανο Luminex εφαρμόζοντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Καθυστερήσεις μεγαλύτερες από ώρες μπορεί να αυξήσουν την πιθανότητα εμφάνισης ψευδώς θετικών ή ψευδώς αρνητικών αντιδράσεων. Επανατοποθετήστε το αχρησιμοποίητο τμήμα του Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης για φύλαξη στους έως 8 C, για μελλοντική χρήση. Σελίδα 4 από 6 LC807IVDEL.15 (07/16)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Για να εξακριβώσετε αν ένα σφαιρίδιο είναι θετικό, διαιρέστε τη διάμεση τιμή MFI του μεμονωμένου σφαιριδίου με τη διάμεση τιμή MFI του Σφαιριδίου Θετικού Μάρτυρα (CON1, CON, CON). Από τα πηλίκα, αφαιρέστε το Συντελεστή Ρύθμισης Υποβάθρου (BAF) για τον κατάλληλο συνδυασμό σφαιριδίου/con. Ο συντελεστής BAF είναι μια προκαθορισμένη σχέση MFI για κάθε συνδυασμό σφαιριδίου/con με τον οποίο αντισταθμίζεται ο θόρυβος του υπόβαθρου που οφείλεται στις διακυμάνσεις των σφαιριδίων και μπορεί να βρεθεί στο ειδικό για την παρτίδα Φύλλο Καταγραφής που συνοδεύει το κιτ. Παράδειγμα: MFI μεμονωμένου σφαιριδίου - (BAF) = Προσαρμοσμένη σχέση 1 Σφαιρίδιο Αρνητικού Μάρτυρα 1 (CON1) MFI MFI μεμονωμένου σφαιριδίου - (BAF) = Προσαρμοσμένη σχέση Σφαιρίδιο Αρνητικού Μάρτυρα (CON) MFI MFI μεμονωμένου σφαιριδίου - (BAF) = Προσαρμοσμένη σχέση Σφαιρίδιο Αρνητικού Μάρτυρα (CON) MFI Τα κιτ ID Τάξης I & κιτ IDv Τάξης IΙ χρησιμοποιούν επίσης έναν τέταρτο υπολογισμό αρνητικού μάρτυρα, το «CalcCON», το οποίο βασίζεται στην απόδοση των μη αντιδρώντων σφαιριδίων τα οποία περιέχουν αντιγόνο. Το CalcCON προσδιορίζεται ως εξής: CalcCON = χαμηλότερη τιμή MFI σφαιριδίων αντιγόνου + 0. Επομένως, ο τέταρτος υπολογισμός είναι: MFI μεμονωμένου σφαιριδίου - (BAF) = Προσαρμοσμένη σχέση 4 CalcCON Θετική τιμή σε δύο ή περισσότερους από τους τέσσερις υπολογισμούς υποδεικνύει θετική αντίδραση σφαιριδίου. Αρνητική τιμή σε τρεις ή περισσότερους από τους τέσσερις υπολογισμούς υποδεικνύει αρνητική αντίδραση σφαιριδίου. Το ποσοστό PRA (Αντισώματα Αντιδραστικής Ομάδας) για τα κιτ ID υπολογίζεται ως εξής: ID Τάξης Ι IDv Τάξη IΙ % PRA = Αριθμός θετικών αντιδράσεων σφαιριδίων X 100 Αριθμός σφαιριδίων στον προσδιορισμό (δεν περιλαμβάνονται τα σφαιρίδια μάρτυρα) %PRA = (Αριθμός θετικών αντιδράσεων σφαιριδίων εμπλουτισμένων με DR) + (Αριθμός αρνητικών αντιδράσεων σφαιριδίων εμπλουτισμένων με DR που επίσης περιέχουν ένα αντιγόνο DQ, το οποίο είναι θετικό) X 100 Συνολικός αριθμός σφαιριδίων εμπλουτισμένων με DR ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Ο έλεγχος ποιότητας των κιτ ID Τάξης Ι και κιτ IDv Τάξης ΙI είναι ενσωματωμένος στο σύστημα δοκιμών με τη συμπερίληψη Θετικών και Αρνητικών Ορών Μάρτυρα. Αυτοί οι μάρτυρες πρέπει να περιλαμβάνονται σε κάθε δοκιμή για να διαπιστώνονται τα τεχνικά σφάλματα και οι αστοχίες των βαθμονομητών που ενδεχομένως έχουν παρουσιαστεί. Για τα κιτ ID, οι Οροί Θετικού Μάρτυρα θα αντιδράσουν με τα περισσότερα ή με όλα τα συζευγμένα σφαιρίδια HLA (>85%) με τα συζευγμένα σφαιρίδια HLA μέγιστης απόδοσης να παράγουν ελάχιστη διάμεση ένταση φθορισμού 10.000. Οι Οροί Αρνητικού Μάρτυρα θα είναι αρνητικοί (<10%). Τα σετ σφαιριδίων περιλαμβάνουν τέσσερα σφαιρίδια μάρτυρα για την παρακολούθηση της απόδοσης καθενός δείγματος. Το Σφαιρίδιο Θετικού Μάρτυρα είναι επιστρωμένο με ανθρώπινη IgG και πρέπει να εμφανίσει τιμές MFI > 10.000 με τους ορούς μάρτυρα. Αν παίρνετε τιμές χαμηλότερες από 10.000 MFI με τους ορούς μάρτυρα, ο προσδιορισμός σας μπορεί να έχει εκπλυθεί ανεπαρκώς ή το σύζευγμα μπορεί να είναι ακατάλληλο. Τα δείγματα των ασθενών εμφανίζουν μεγάλο εύρος αντιδραστικότητας με το Σφαιρίδιο Θετικού Μάρτυρα, αλλά θα πρέπει να παράγουν σήμα > 500 MFI. Παρόμοια, τα Σφαιρίδια Αρνητικού Μάρτυρα πρέπει να εμφανίζουν χαμηλές τιμές MFI. Ανατρέξτε στο φύλλο καταγραφής των αντίστοιχων παρτίδων για τα αναμενόμενα εύρη τιμών των αρνητικών σφαιριδίων μάρτυρα. Τα δεδομένα εκτός του εύρους τιμών πρέπει να εξεταστούν με προσοχή. Σε περίπτωση απουσίας ορών, ο θετικός μάρτυρας θα δώσει ισχυρό σήμα ενώ τα υπόλοιπα σφαιρίδια θα δώσουν κατά μέσον όρο 50 MFI ή λιγότερο. Όταν ένα δείγμα παράγει αυτές τις πολύ χαμηλές τιμές, τότε το δείγμα μπορεί να έχει παραλειφθεί κατά λάθος. Τα δείγματα αυτά πρέπει να επαναλαμβάνονται. Η δοκιμασία πρέπει να εκτελεστεί όπως συνιστάται στο εσωτερικό της συσκευασίας καθώς επίσης όπως εκτελείται με κάθε άλλη διαδικασία ποιοτικού ελέγχου που συμφωνεί με τις τοπικές απαιτήσεις και τις απαιτήσεις της πολιτείας, της ομοσπονδίας ή / και των υπηρεσιών διαπίστευσης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Μπορεί να προκύψουν λανθασμένα αποτελέσματα λόγω βακτηριακής μόλυνσης των υλικών ελέγχου, ακατάλληλων χρόνων επώασης, ακατάλληλης πλύσης ή έκχυσης των σφαιριδίων, έκθεσης του συζεύγματος στο φως ή παράλειψης αντιδραστηρίων ή βημάτων της δοκιμής. Η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων ή άλλων συσσωματωμάτων ανοσοσφαιρίνης στον ορό ασθενή μπορεί να προκαλέσει αυξημένη μη ειδική σύνδεση και λανθασμένα αποτελέσματα προσδιορισμού. Για τα κιτ ID, τα αντισώματα που ανιχνεύονται είναι αυτά που αντιδρούν μέσα στον πληθυσμό των διαθέσιμων αντιγόνων που αναφέρονται στο Φύλλο Καταγραφής. Ορισμένα χαμηλού βαθμού συγγένειας, ορισμένα χαμηλής τιτλοδότησης, IgA, IgM και αντισώματα έναντι σπανίων αλληλομόρφων δεν θα ανιχνευθούν με τους προσδιορισμούς LIFECODES ID. Τα σφαιρίδια φαινοτύπου της Τάξης II που δηλώνουν την παρουσία αντιγόνων DR και/ή DQ είναι εμπλουτισμένα για DR, επομένως, αυτά τα σφαιρίδια ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξημένη ευαισθησία σε αντισώματα DR. Αντίθετα, τα ειδικά σφαιρίδια DQ της Τάξης ΙΙ είναι εμπλουτισμένα για DQ και παρουσιάζουν αυξημένη ευαισθησία σε αντισώματα DQ. Τα πειράματα που έχουν διεξαχθεί έως σήμερα δεν κατάφεραν να ανιχνεύσουν την παρουσία DR στα εμπλουτισμένα σφαιρίδια DQ, βελτιώνοντας την ειδικότητα για τα αντισώματα DQ. Η Σελίδα 5 από 6 LC807IVDEL.15 (07/16)

πυκνότητα αντιγόνου για DR και DQ στα δύο σχέδια σφαιριδίων (εμπλουτισμένα DR και εμπλουτισμένα DQ) μπορούν να εξηγήσουν τα μοτίβα αντιδραστικότητας των σφαιριδίων κατά την ανάλυση του ορού. Η προσθήκη των σφαιριδίων DQ της Τάξης ΙΙ στον προσδιορισμό της Τάξης II IDv θα βοηθήσει στον προσδιορισμό της παρουσίας των αντισωμάτων DQ στους ορούς υψηλών PRA. Λόγω της σύνθετης φύσης της εξακρίβωσης HLA, η ερμηνεία των δεδομένων πρέπει να εκτελείται από εξειδικευμένο προσωπικό. Η εξακρίβωση της ειδικότητας των αντισωμάτων με χρήση των κιτ LIFECODES ID πρέπει να λαμβάνει υπόψη τα αποτελέσματα όλων των σφαιριδίων, συμπεριλαμβανομένων αυτών που ενδέχεται να βρίσκονται στην τιμή αναφοράς ή στην περιοχή της. Η γνώση του ιστορικού του ασθενούς καθώς και η κατανόηση των ομάδων με διασταυρούμενες αντιδράσεις μπορεί να αποδειχθούν χρήσιμες στην αντιστοίχιση ειδικότητας σε συγκεκριμένο ορό. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΠΙΘΑΝΗ ΑΙΤΙΑ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ Χαμηλός αριθμός σφαιριδίων Υπέρβαση κατωφλίου μάρτυρα Αστοχία κατωφλίου θετικού μάρτυρα Το Μείγμα Ιχνηλατών δεν έχει εναιωρηθεί καλά Αστοχίες οργάνου - εκτός βαθμονόμησης Αστοχίες οργάνου - η ροή του δείγματος είναι φραγμένη Φωτολεύκανση σφαιριδίων Πίεση κενού υπερβολικά ισχυρή/σφαιρίδια προσκολλημένα στη μεμβράνη Ανεπαρκής πλύση Ανεπαρκής ποιότητα δείγματος Φωτολεύκανση συζεύγματος Ανεπαρκής πλύση Χρησιμοποιήστε το δονητικό αναδευτήρα για να επαναιωρηθεί πλήρως Βλ. εγχειρίδιο οργάνου Βλ. εγχειρίδιο οργάνου Χρησιμοποιήστε νέο κιτ Μειώστε την ισχύ του κενού Επαναλάβετε και παρακολουθήστε τις πλύσεις Νέα συλλογή Χρησιμοποιήστε νέο κιτ Επαναλάβετε και παρακολουθήστε τις πλύσεις ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Όταν τα κιτ LIFECODES ID χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται, τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν την παρουσία ή απουσία αντισωμάτων HLA IgG. Χρησιμοποιώντας τιμή αναφοράς PRA 10%, το κιτ ID Τάξης Ι παρουσίασε 97,1% συν-θετικότητα (90,- 99,%), 86,4% συν-αρνητικότητα (75,5-9,0%) και 9,% συμφωνία (86,-95,7%) για 19 δείγματα που αξιολογήθηκαν όταν συγκρίθηκαν με αποτελέσματα που λήφθηκαν με χρήση μεθόδων κυτταρομετρίας ροής (95% όρια εμπιστοσύνης). Το κιτ της Τάξης II IDv έδειξε 99,7% συνθετικότητα (98,-99,9%), 7,% συν-αρνητικότητα (66,6-77,1%) και 87,% συμφωνία (84,-89,6%) για 600 δείγματα που αξιολογήθηκαν κατά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με χρήση μεθόδων LIFECODES Class II ID. Οι αξίες για τη συν-αρνητικότητα και τη συμφωνία αντικατοπτρίζουν τη βελτιωμένη ανίχνευση των αντισωμάτων αντιδραστικών σε DC με το Class II IDv. Το κιτ της Τάξης IDv έδειξε 100% συμφωνία σε αναφερόμενα αποτελέσματα για επτά δείγματα που εξετάστηκαν από έξι χειριστές σε τρία κέντρα εξέτασης και 100% συμφωνία σε αναφερόμενα αποτελέσματα για επτά δείγματα που εξετάστηκαν με τρεις διαφορετικές παρτίδες από ένα μόνο χειριστή. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Klein, J, Sato, A. The HLA System. New England Journal of Medicine 000; 4:70 και 4:78.. Parham, P. The Immune System. Garland Publishing, Νέας Υόρκης και του Λονδίνο. 000; 55.. Rodey, GE. HLA Beyond Tears ( η Έκδοση). DeNovo, Inc. Durango, Colorado ΗΠΑ. 000; 16. 4. McKenna, RM; Takemoto, SK; Terasaki, PI. Anti-HLA Antibodies after Solid Organ Transplantation. Transplantation 000; 69:19. ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗΣ ΚΑΙ ΕΞΟΥΣΙΟΔΟΤΗΜΕΝΟΣ ΑΝΤΙΠΡΟΣΩΠΟΣ Κατασκευάστηκε: Για την Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 0690 Η.Π.Α.,. Τηλ.: +1.0.8.9500, 888-9-055 (Μόνο για τις Η.Π.Α. και τον Καναδά); Φαξ: +1-0-8-9599 Εξουσιοδοτημένος Αντιπρόσωπος: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opel-Strasse 6A Rodermark 6, Germany Phone: (+49) 6074-84 0-0, Fax: (+49) 6074-84 0-99 Τεχνικό Σέρβις στην Ευρώπη: +/ 85 47 91 Εκδόθηκε: Αναθ 15, 016-07- Σελίδα 6 από 6 LC807IVDEL.15 (07/16)