CD34Count Kit Κωδικός Αρ. K2370 2η έκδοση Για την ταυτοποίηση και απαρίθµηση των κυττάρων CD34+ σε δείγµατα ανθρώπινου κινητοποιηµένου αίµατος και σε δείγµατα από τα οποία έχουν αφαιρεθεί τα λευκά αιµοσφαίρια. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 50 εξετάσεις εις διπλούν. (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.1/15
Περιεχόµενα Σελίδα Προοριζόµενη χρήση... 3 Περίληψη και επεξήγηση... 3 Αρχή της διαδικασίας... 3 Αντιδραστήρια... 4 Υλικά που παρέχονται... 4 Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται... 5 Προετοιµασία αντιδραστηρίων... 5 Προφυλάξεις... 5 Αποθήκευση... 6 Συλλογή και προετοιµασία του δείγµατος... 7 ιαδικασία χρώσης... 7 Χρώση των κυττάρων και προσθήκη των σφαιριδίων µαρτύρων µέτρησης... 7 Οδηγία, τεχνική προκαταρκτικής µεταφοράς και «wet tip» («βρεγµένου άκρου»)... 8 Ποιοτικός έλεγχος... 8 είγµα µάρτυρα... 8 Ο χρόνος ως ποιοτικός έλεγχος... 8 Εξετάσεις εις διπλούν... 8 Λήψη δεδοµένων... 9 Προετοιµασία λήψης δεδοµένων για το CD34Count Kit... 9 Ανάλυση δεδοµένων... 12 Αποτελέσµατα... 12 Ανάθεση τιµής... 13 Περιορισµοί... 13 Επίλυση προβληµάτων... 14 Όργανο... 14 Βιβλιογραφία... 15 (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.2/15
Προοριζόµενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση σε κυτταροµετρία ροής. Το CD34Count Kit προορίζεται ως µια in vitro διαγνωστική εξέταση για την ταυτοποίηση και απαρίθµηση των θετικών για CD34 (CD34+) αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων σε κινητοποιηµένα δείγµατα ανθρώπινου περιφερικού αίµατος καθώς και σε δείγµατα αίµατος από τα οποία έχουν αφαιρεθεί τα λευκά αιµοσφαίρια. Περίληψη και επεξήγηση Με τη χρήση κυτταροτοξικών φαρµάκων, κυτοκινών ή συνδυασµό των δύο µπορούµε να κινητοποιήσουµε τα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα (haematopoietic progenitor cells HPC) από το µυελό των οστών HPCπρος το περιφερικό αίµα (ΠΑ). Η κινητοποίηση αυτή επιτρέπει µε αφαίρεση τη συλλογή επαρκών ποσοτήτων HPC για τις διαδικασίες µεταµόσχευσης (1, 2). Η χρήση αρχέγονων κυττάρων του ΠΑ (progenitor blood stem cells PBSC) σε µεταµοσχεύσεις έχει αυξηθεί ραγδαία την τελευταία δεκαετία, ενώ σήµερα προτιµάται ως πηγή των HPC στο µυελό των οστών (ΜΟ) στην αυτόλογη µεταµόσχευση ΠΑ. Κατά παράδοση, ως µέσο πρόγνωσης του δυναµικού της µεταµόσχευσης έχει χρησιµοποιηθεί ο απόλυτος αριθµός των µονοπύρηνων κυττάρων σε συγκοµιδές ΜΟ ως προς το σωµατικό βάρος του λήπτη. Ωστόσο, η προσέγγιση αυτή είναι ανεπαρκής στις συγκοµιδές κινητοποιηµένων PBSC εξαιτίας της ασταθούς περιεκτικότητάς τους σε HPC. Από τα τέλη της δεκαετίας του 1980 είχε καθιερωθεί η άποψη ότι σχεδόν όλη η ενεργότητα των κυττάρων σχηµατισµού αποικιών (cell forming cells CFC) καθώς και το δυναµικό της µεταµόσχευσης µυελού ή δειγµάτων περιφερικού αίµατος περιέχονταν στο µικρό εκείνο πληθυσµό των κυττάρων που έφεραν το αντιγόνο CD34 (3). Το CD34 είναι ένα αντιγόνο της κυτταρικής επιφάνειας, η παρουσία του οποίου στα αιµοποιητικά κύτταρα, περιορίζεται στα πρώιµα προγονικά κύτταρα όλων των σειρών (1, 2). Εποµένως, τα CD34+ HPC µπορούν να αποκαταστήσουν την αιµοποιητική διαδικασία από πολλαπλές γενεαλογίες κυττάρων σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αφαίρεση µυελού. Ο αριθµός των CD34+ κυττάρων, που προσδιορίζεται µε κυτταροµετρία ροής, ανά χιλιόγραµµο σωµατικού βάρους του λήπτη έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας χρήσιµος δείκτης των δυνατοτήτων που διαθέτουν τα µοσχεύµατα αρχέγονων κυττάρων του περιφερικού αίµατος (PBSC) για αποκατάσταση της αιµοποίησης (1, 2). Οι Sutherland et al. (5) ανέπτυξαν µια σειρά κλινικών οδηγιών για το «International Society for Hematotherapy and Graft Engineering» (ISHAGE) ( ιεθνή εταιρεία αιµατοθεραπείας και µηχανικής µοσχευµάτων) για την απλή και τυποποιηµένη απαρίθµηση των CD34+. Οι οδηγίες αυτές έχουν υιοθετηθεί στο CD34Count Kit που περιέχει τα Anti-CD45/FITC και Anti-CD34/RPE και ως εκ τούτου επιτρέπει την ταυτοποίηση των λευκοκυττάρων (CD45+) και την εξακρίβωση των «αληθών» CD34+ κυττάρων αφού αυτά φθορίζουν αµυδρά στο φθορισµό της CD45, ενώ έχουν χαµηλή παράπλευρη σκέδαση (CD45 dim, SSC low ).Η προσθήκη των σφαιριδίων µέτρησης CytoCount στο κυτταρικό εναιώρηµα δίνει τη συγκέντρωση των CD34+ κυττάρων ανά µονάδα του αρχικού όγκου του δείγµατος (δηλαδή, τον απόλυτο αριθµό των CD34+ κυττάρων) µε µια και µόνο αξιολόγηση κυτταροµετρίας ροής (τεχνική µονής πλατφόρµας) (1-3). Η τεχνική της µονής πλατφόρµας έχει λιγότερες πηγές διακύµανσης σε σύγκριση µε την προηγούµενη και πιο συχνά χρησιµοποιούµενη τεχνική της διπλής πλατφόρµας, ενώ µελέτες από διαφορετικά κέντρα έδειξαν ότι παρέχει καλύτερο συντελεστή διακύµανσης (CV) και ότι ο κίνδυνος δηµιουργίας αποκλίσεων είναι χαµηλότερος (4). Η προαιρετική προσθήκη της χρωστικής του DNA, 7-αµινοακτινοµυκίνη D (7-AAD), η οποία επίσης περιλαµβάνεται στο κιτ, επιτρέπει τον αποκλεισµό των νεκρών κυττάρων από την ανάλυση (1, 2). Η 7-AAD µπορεί να διαχυθεί και να χρωµατίσει µόνο τα νεκρά κύτταρα επειδή η κυτταρική µεµβράνη των νεκρών κυττάρων είναι κατεστραµµένη. Αρχή της διαδικασίας Το CD34Count Kit έχει σχεδιαστεί ώστε να παρέχει µια βέλτιστη µέθοδο απαρίθµησης των κυττάρων CD34+, τηρώντας τις οδηγίες του ISHAGE για τη µονή πλατφόρµα (1, 2, 5). Η εξέταση πραγµατοποιείται εις διπλούν καθώς το δείγµα χρωµατίζεται µε ένα αντιδραστήριο διπλού χρώµατος που αποτελείται από τις Anti-Human CD45/FITC και Anti-Human CD34/RPE. (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.3/15
Μετά τη χρώση του δείγµατος, τα ερυθρά αιµοσφαίρια λύονται µε ένα λυτικό παράγοντα που έχει ως βάση το χλωριούχο αµµώνιο και κατόπιν στο δείγµα προστίθεται (προαιρετικά) 7-AAD για τη µέτρηση της βιωσιµότητας. Ως εσωτερικό µέσο αναφοράς του πληθυσµού χρησιµοποιούνται φθορίζοντα σφαιρίδια-µάρτυρες µέτρησης (CytoCount ), τα οποία προσθέτουµε στο δείγµα. Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, η απόλυτη συγκέντρωση των CD34+ στο δείγµα κυττάρων διαιρώντας τον αριθµό των CD34 µε τον αριθµό των φθοριζόντων σφαιριδίων και µετά πολλαπλασιάζοντας επί τη συγκέντρωση των σφαιριδίων στο CytoCount. Οι οδηγίες της ISHAGE για τον προσδιορισµό των πραγµατικών προγονικών κυττάρων µε δυναµικό αναγέννησης έχουν ως αρχή τη χρησιµοποίηση της στρατηγικής της διαδοχικής πύλης κατά Bool. Τούτο επιτυγχάνεται αντιχρωµατίζοντας µε το Anti-CD45/FITC και µετρώντας τα CD34+ κύτταρα κει εποµένως αποκλείοντας από την ανάλυση τα υπολείµµατα και τα µη ειδικά περιστατικά χρώσης (1, 2). Σηµαντικό είναι ότι η προσέγγιση αυτή επιτρέπει και τη διάκριση των HPC που εκφράζουν σχετικά χαµηλά επίπεδα CD45 στην επιφάνειά τους από τα λεµφοκύτταρα και τα µονοκύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα. Όπως τα λεµφοκύτταρα, έτσι τα µονοκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα σχηµατίζουν διακριτά σµήνη σε γραφήµατα δύο µεταβλητών της CD45 συναρτήσει της πλευρικής σκέδασης (SSC). Το ίδιο συµβαίνει και µε τα CD34+ µη κακοήθη αρχέγονα και προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα (1, 2). Η προσθήκη γνωστής συγκέντρωσης σφαιριδίων αναφοράς καθιστά εφικτό τον υπολογισµό της απόλυτης συγκέντρωσης των CD34+ κυττάρων στο αρχικό δείγµα, δηλαδή τον προσδιορισµό του αριθµού των CD34+ κυττάρων ανά µl δείγµατος. Ο αποκλεισµός των νεκρών κυττάρων από την απαρίθµηση των CD34+ κυττάρων είναι προαιρετικός και µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση της παρεµβόλιµης χρωστικής του DNA 7-AAD, η οποία επιτρέπει τη διάκριση µεταξύ ζωντανών και νεκρών κυττάρων. Η 7-AAD διεγείρεται στα 488 nm και το µέγιστο της εκποµπής της βρίσκεται στα 660 nm. Η προσθήκη της 7-AAD προτείνεται ιδιαιτέρως όταν αναλύονται δείγµατα που αποθηκεύτηκαν για περισσότερες από τέσσερις ώρες και από τα οποία έχουν αφαιρεθεί τα λευκά αιµοσφαίρια ή δείγµατα από τα οποία έχουν αφαιρεθεί τα λευκά αιµοσφαίρια µετά από ξεπάγωµα. Αντιδραστήρια Υλικά που παρέχονται Φιαλίδιο 1 Φιαλίδιο 2 Monoclonal Mouse Anti-Human CD45/FITC, Clone T29/33 + Monoclonal Mouse Anti-Human CD34/RPE, Clone BIRMA-K3 1 ml, έτοιµο προς χρήση EasyLyse 2 x 5 ml, πυκνό 20 x Παράγοντας λύσης ερυθροκυττάρων µε βάση το χλωριούχο αµµώνιο Φιαλίδιο 3 Φιαλίδιο 4 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 1 ml (0,01% w/v), έτοιµο προς χρήση Για χρώση βιωσιµότητας CytoCount 17 ml, έτοιµο προς χρήση µετά από επαναιώρηση Σφαιρίδια µάρτυρες µέτρησης (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.4/15
Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται 1. Σωλήνες πολυστυρενίου 12 x 75 mm. 2. Βαθµονοµηµένη πιπέττα για όγκους 10 µl και 100 µl. 3. Συσκευή µίξης αίµατος (blood mixer) ή περιστροφική συσκευή µίξης για την επαναιώρηση των σφαιριδίων CytoCount. 4. Απιονισµένο ή απεσταγµένο νερό. 5. Συσκευή vortex. 6. ιανεµητής ποσοτήτων ή διάταξη πιπεττών (2 ml) για τη µεταφορά 2 ml EasyLyse. 7. PBS για την αραίωση των δειγµάτων, αν αυτή είναι απαραίτητη. 8. Sheat Fluid. 9. είγµατα µάρτυρες CD34+. Προετοιµασία αντιδραστηρίων 1. Αραιώστε την απαιτούµενη ποσότητα του EasyLyse του φιαλιδίου 2, προσθέτοντας 1 όγκο EasyLyse σε 19 όγκους απιονισµένου νερού, σε θερµοκρασία δωµατίου. Εναλλακτικά, µπορείτε να αναµίξετε το περιεχόµενο µιας φιάλης (5 ml) EasyLyse σε 95 ml απιονισµένου νερού σε θερµοκρασία δωµατίου. Το νερό της βρύσης δεν είναι συµβατό µε τον παράγοντα λύσης. 2. Αφαιρέστε το φιαλίδιο 4, CytoCount, από τους 2 8 C που βρίσκεται αποθηκευµένο. Βεβαιωθείτε ότι το πώµα έχει κλείσει καλά ώστε να αποφύγετε διαρροή του υγρού και ανακατέψτε καλά για να βεβαιωθείτε για την πλήρη επαναιώρηση των σφαιριδίων. Αποφύγετε την ανάµιξη µε συσκευή vortex επειδή υπάρχει πιθανότητα εισροής φυσαλίδων αέρος που µπορούν να µειώσουν τον πραγµατικό όγκο των σφαιριδίων που µεταφέρονται µε τη πιπέττα. Συνιστάται να τοποθετήσετε τα σφαιρίδια σε µια περιστροφική συσκευή µίξης επί 5 60 λεπτά ώστε να βεβαιωθείτε ότι τα σφαιρίδια παραµένουν σε εναιώρηµα µέχρις για όσο απαιτείται. Πριν από τη χρήση, αφήστε το αντιδραστήριο CytoCount να ισορροπήσει σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το φιαλίδιο 1, Anti-Human CD45/FITC + Anti-Human CD34/RPE, περιέχει υλικό ζωικής προέλευσης. Όπως ισχύει για κάθε προϊόν βιολογικής προέλευσης, πρέπει να εφαρµόζονται οι πρέπουσες διαδικασίες χειρισµού. 3. Μην καταψύχετε κανένα από τα αντιδραστήρια ή µην εκθέτετε τα αντιδραστήρια στο ηλιακό φως. 4. Το φιαλίδιο 3, 7-AAD, είναι µια χρωστική που δεσµεύεται από τα νουκλεϊκά οξέα. Η συγκέντρωση της χρωστικής στο διάλυµα είναι 0,01% και γι' αυτό το διάλυµα δεν απαιτεί σήµανση επικινδυνότητας. Οι τοξικολογικές ιδιότητες της χρωστικής αυτής δεν έχουν ακόµα ερευνηθεί. 5. Η συγκέντρωση των σφαιριδίων στο φιαλίδιο 4, CytoCount, διαφέρει από παρτίδα σε παρτίδα. Η συγκέντρωση των σφαιριδίων (C) και η τυπική απόκλιση (S) δηλώνονται στο φιαλίδιο ως αριθµός σφαιριδίων ανά µl. 6. Τα φιαλίδια 1, 2, 3 και 4 περιέχουν νατραζίδιο (NaN 3 ), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό και να σχηµατίσει ιδιαίτερα εκρηκτικές συσσωρεύσεις αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύντε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις. (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.5/15
7. Βεβαιωθείτε ότι το φιαλίδιο 4, CytoCount, φυλάσσεται καλά πωµατισµένο, σε όρθια θέση για την αποφυγή διαρροής του υγρού. Τα σφαιρίδια CytoCount πρέπει πριν από κάθε χρήση να επαναιωρούνται καλά. Η έντονη ανάµιξη των σφαιριδίων CytoCount στη συσκευή vortex µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα την εισροή φυσαλίδων αέρος στο υγρό που µπορεί να µειώσει τον αναµενόµενο όγκο των σφαιριδίων CytoCount που µεταφέρονται µε την πιπέττα. Συνιστάται η ήπια περιστροφή (π.χ. σε µια περιστροφικήπεριστροφική συσκευή ανάµιξης ή σε συσκευή περιστροφής σωλήνων αίµατος). 8. Ιδιαίτερη φροντίδα απαιτείται ώστε πριν από την επαναιώρηση να µη χαθεί κάποιο από τα εναιωρήµατα CytoCount, διαφορετικά η µέτρηση των σφαιριδίων ακυρώνεται. Αν κατά την παραλαβή του προϊόντος υπάρξει οποιαδήποτε διαρροή από το φιαλίδιο 4, CytoCount, µην χρησιµοποιήσετε τα σφαιρίδια. Επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία της Dako για την αντικατάσταση του φιαλιδίου 4. 9. Είναι σηµαντικό να χρησιµοποιείτε την ίδια πάντα βαθµονοµηµένη πιπέττα αλλά και την τεχνική της προκαταρκτικής µεταφοράς και του «wet tip» (πριν την αναρρόφηση, εµβαπτίζετε το ακροφύσιο στο υγρό και αναρροφήστε δύο - τρεις φορές προτού αναρροφήσετε την τελική µεταφερόµενη ποσότητα) τόσο για το δείγµα όσο και για τα σφαιρίδια CytoCount. Είναι σηµαντικό οι µεταφερόµενοι όγκοι των σφαιριδίων CytoCount και του δείγµατος να είναι ακριβείς. Οι όγκοι του αντιδραστηρίου του αντισώµατος και του παράγοντα λύσης δεν είναι ουσιώδεις στον προσδιορισµό του απόλυτου αριθµού των CD34+ κυττάρων. Αυτό που είναι σηµαντικό είναι η αναλογία µεταξύ του όγκου του δείγµατος και του όγκου των σφαιριδίων. 10. Συνιστάται να θέσετε την τιµή ουδού στο FL1 (515-545 nm), καθώς αυτό ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο απώλειας περιστατικών CytoCount κατά τη διάρκεια της λήψης. Ιδιαίτερη φροντίδα πρέπει να δοθεί ώστε να µην αποκλειστούν CD34+ περιστατικά έχοντας ορίσει πολύ υψηλό ουδό FL1. Ανατρέξτε στην επίλυση προβληµάτων. 11. Η εξέταση δεν έδειξε να υπάρχει επιµειξία µεταξύ δειγµάτων. Παρόλα αυτά συνιστάται η κάθε συσκευή κυτταροµετρίας ροής να επικυρώνεται για φαινόµενα επιµειξίας µεταξύ των δειγµάτων. Για την αποφυγή οποιασδήποτε επιµειξίας από ένα δείγµα υψηλής συγκέντρωσης CD34+ κυττάρων προς ένα δείγµα µε χαµηλή συγκέντρωση, µπορείτε µεταξύ των δειγµάτων να αφήνετε να τρέχει µέσα από το κυτταρόµετρο ροής διάλυµα PBS. 12. Όταν χρησιµοποιείτε την 7-AAD ως σήµανση για τα νεκρά κύτταρα είναι σηµαντικό να έχετε τις βέλτιστες ρυθµίσεις αντιστάθµισης, επειδή το σήµα από το κανάλι RPE επικαλύπτεται µε το κανάλι 7-AAD. Στη χειρότερη περίπτωση, τα θετικά περιστατικά CD34 θα αποκλειστούν αν βρεθούν εντός της πύλης αποκλεισµού νεκρών κυττάρων στο κανάλι 7-AAD αντί στο κανάλι πλευρικής σκέδασης. 13. Η 7-AAD διεγείρεται στα 488 nm και το µέγιστο της εκποµπής της βρίσκεται στα 660 nm (FL3 ή FL4, ανάλογα µε το όργανο). Συνεπώς, η χρωστική δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί µαζί µε άλλα φθοριοχρώµατα σε συστήµατα µονού laser που εκπέµπουν σε µήκη κύµατος >600 nm, όπως το PerCP ή το RPE-Cy5. 14. Έχει αναφερθεί η συσσωµάτωση σφαιριδίων µαρτύρων µέτρησης (4). Τα σφαιρίδια CytoCount παρουσιάζουν έναν ιδιαίτερα χαµηλό αριθµό πολλαπλασίων (κάτω του 3%) καθιστώντας απλούστερο το όριο πύλης των σφαιριδίων. Αν παρατηρηθεί µεγαλύτερος αριθµός πολλαπλασίων του CytoCount και υπάρχει υποψία προβλήµατος για το προϊόν, επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία της Dako. Αποθήκευση Αποθηκεύστε το κιτ σε σκοτεινό µέρος, στους 2 8 C. Μην το χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο κιτ. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που προδιαγράφονται, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη. Το EasyLyse, φιαλίδιο 2, παραµένει σταθερό για 6 µήνες µετά το άνοιγµα του φιαλιδίου. Ο παράγοντας λύσης µετά την αραίωση παραµένει σταθερός επί 20 ηµέρες στους 2 24 C. Αποθηκεύετε όλα τα αντιδραστήρια σε όρθια θέση. (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.6/15
Συλλογή και προετοιµασία του δείγµατος Συλλέξτε ασηπτικά περιφερικό αίµα µε φλεβοκέντηση, µέσα σε έναν αποστειρωµένο σωλήνα K 3 EDTA συλλογής αίµατος. Κάθε εξέταση απαιτεί 200 µl δείγµατος (100 µl ανά σωλήνα). Για τη συλλογή του δείγµατος, ακολουθήστε τις οδηγίες του κατασκευαστή του σωλήνα συλλογής. Συλλέξτε δείγµατα λευκαφαίρεσης σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή του οργάνου λευκαφαίρεσης. Αποθηκεύστε το αντιθροµβωµένο αίµα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 έως 25 C) έως ότου αυτό είναι έτοιµο για χρώση. Τα δείγµατα περιφερικού αίµατος πρέπει να χρωµατίζονται εντός 24 ωρών από τη συλλογή τους. Συνιστάται να χρωµατίζετε τα δείγµατα από τα οποία έχουν αφαιρεθεί τα λευκά αιµοσφαίρια τη στιγµή που πραγµατοποιείται η αφαίρεση των λευκοκυττάρων. Σε όλα τα δείγµατα που πρόκειται να αξιολογηθούν, µετρήστε τα λευκά αιµοσφαίρια (WBC). Αν η µέτρηση WBC είναι µεγαλύτερη από 10 7 WBC/mL, αραιώστε το δείγµατα µε PBS έως 10 7 WBC/mL περίπου. Καταγράψτε το συντελεστή αραίωσης για τον υπολογισµό του τελικού απόλυτου αριθµού των CD34+ κυττάρων στο αρχικό δείγµα. Μην χρησιµοποιείτε κύτταρα που προηγουµένως έχουν µονιµοποιηθεί. ιαδικασία χρώσης Χρώση των κυττάρων και προσθήκη των σφαιριδίων µαρτύρων µέτρησης. 1. Αραιώστε το αρχικό δείγµα µε PBS έως περίπου 10 7 λευκοκύτταρα ανά ml. Καταγράψτε τον ακριβή συντελεστή αραίωσης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, αραίωση απαιτείται µόνο στα δείγµατα από τα οποία έχουν αφαιρεθεί τα λευκά αιµοσφαίρια. 2. Κάθε δείγµα πρέπει να εξετάζεται εις διπλούν. Γι' αυτό απαιτούνται δύο σηµειωµένοι δοκιµαστικοί σωλήνες για κάθε δείγµα. 3. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα, µεταφέρετε 100 µl του δείγµατος. Χρησιµοποιήστε την αντίστροφη χορήγηση (βλ. οδηγίες παρακάτω, τεχνική προκαταρκτικής µεταφοράς µε «wet tip» («βρεγµένο άκρο»). 4. Σε κάθε σωλήνα προσθέστε 10 µl του φιαλιδίου 1, (Anti-Human CD45/FITC + Anti-Human CD34/RPE) και αναµίξτε τα σε συσκευή vortex. Επωάστε τους σωλήνες επί 30 λεπτά στους 2 8 C ή επί 15 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 5. Προσθέστε 2 ml του αραιωµένου παράγοντα λύσης (φιαλίδιο 2, EasyLyse αραιωµένο 20 x φορές). Αναµίξτε το δείγµα σε συσκευή vortex αµέσως µετά την προσθήκη του παράγοντα λύσης. 6. Επωάστε σε σκοτεινό µέρος επί 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. 7. Αν το ζητούµενο είναι η χρώση της βιωσιµότητας, προσθέστε σε κάθε δείγµα 10 µl της φιάλης 3 (7-AAD) και αναµίξτε. ιαφορετικά προχωρήστε στο βήµα 8. Πριν από τη δειγµατοληψία, επωάστε επί τουλάχιστον 5 λεπτά µε το 7-AAD. 8. Επαναιωρήστε το φιαλίδιο 4 (CytoCount ) σε µια περιστροφική συσκευή ανάµιξης, όπως περιγράφεται στην «Προετοιµασία αντιδραστηρίου». Προσθέστε 100 µl στο χρωµατισµένο δείγµα µε τα λυµένα κύτταρα. Η µεταφορά τόσο του δείγµατος όσο και των σφαιριδίων CytoCount πρέπει να πραγµατοποιείται µε την ίδια βαθµονοµηµένη πιπέττα και χρησιµοποιώντας την τεχνική της προκαταρκτικής µεταφοράς και του «wet tip» («βρεγµένου άκρου») (4) (βλ. οδηγίες παρακάτω, τεχνική προκαταρκτικής µεταφοράς και «wet tip»). 9. Πριν από τη δειγµατοληψία, ανακατέψτε τα σφαιρίδια και το δείγµα ήπια επί 3 δευτερόλεπτα χρησιµοποιώντας τη συσκευή vortex ώστε να εξασφαλίσετε την οµοιόµορφη κατανοµή των σφαιριδίων CytoCount σε όλο το δείγµα. 10. Η δειγµατοληψία πρέπει να γίνεται εντός 45 λεπτών µετά την προσθήκη του παράγοντα λύσης (βήµα 5). 11. Λάβετε τουλάχιστον 60.000 περιστατικά λευκών αιµοσφαιρίων (WBC), 1000 σφαιρίδια CytoCount και τουλάχιστον 100 CD34+ κύτταρα (4). Για το CD34Count Kit, ανατρέξτε στην «Προετοιµασία λήψης». (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.7/15
Οδηγία, τεχνική προκαταρκτικής µεταφοράς και «wet tip» («βρεγµένου άκρου») Για τη µεταφορά του δείγµατος και των σφαιριδίων πρέπει να χρησιµοποιείτε την ίδια πιπέττα. Για κάθε αντιδραστήριο χρησιµοποιείτε καινούριο άκρο. Η υιοθέτηση της ίδιας τεχνικής για µεταφορά τόσο του δείγµατος όσο και των σφαιριδίων διασφαλίζει συνεπέστερα αποτελέσµατα. είγµα 1. Πιέστε το έµβολο έως το δεύτερο στοπ, βάλτε την άκρη της πιπέττας µέσα στο υγρό και αναρροφήστε το δείγµα. Κατόπιν πιέστε το έµβολο έως το πρώτο στοπ, απελευθερώνοντας το δείγµα. Στο άκρο τώρα της πιπέττας παραµένει µια ποσότητα του υγρού. 2. Επαναλάβετε το βήµα αυτό δύο φορές, κρατώντας το άκρο της πιπέττας µέσα στο δείγµα. 3. Τώρα το άκρο της πιπέττας είναι έτοιµο προς χρήση. Πιέστε το έµβολο έως το δεύτερο στοπ, βάλτε το άκρο της πιπέττας µέσα στο υγρό και αναρροφήστε το δείγµα. Τραβήξτε προσεκτικά το άκρο της πιπέττας από το δείγµα και σκουπίστε το απαλά µε χαρτοπετσέτα για να αποµακρύνετε κάθε περίσσεια υγρού, προσέχοντας να µην ακουµπήσετε το στόµιο του άκρου και αφαιρέσετε κατά λάθος το δείγµα από το εσωτερικό του. 4. Προσπαθήστε να κρατάτε την πιπέττα όσο γίνεται πιο κατακόρυφα. Ελέγξτε για την παρουσία φυσαλίδων αέρος στο άκρο. Αν υπάρχουν φυσαλίδες αέρα, µεταφέρετε το υγρό πάλι πίσω στο δείγµα και επαναλάβετε τη δειγµατοληψία. 5. Μεταφέρετε το δείγµα έως το πρώτο στοπ του εµβόλου. Στο άκρο της πιπέττας πρέπει να παρατηρήσετε υπόλειµµα του υγρού που µεταφέρατε. Μην ακουµπάτε τα τοιχώµατα του δοκιµαστικού σωλήνα όταν αφαιρείτε το άκρο. Σφαιρίδια 6. Προετοιµάστε την πιπέτα µε το εναιώρηµα σφαιριδίων CytoCount στο φιαλίδιο 4 όπως περιγράφηκε παραπάνω για το δείγµα (βήµατα 1 3). 7. Για τη µεταφορά του εναιωρήµατος των σφαιριδίων, ακουµπήστε το άκρο της πιπέττας στο τοίχωµα του σωλήνα που βρίσκεται κοντά στην επιφάνεια του δείγµατος. Μια ελαφρά κλίση στο σωλήνα και στην πιπέττα βοηθά στο βήµα αυτό. Μεταφέρετε το δείγµα έως το πρώτο στοπ του εµβόλου. Μετά τη µεταφορά πρέπει να παρατηρήσετε στο άκρο της πιπέττας υπόλειµµα του υγρού. 8. Για την περαιτέρω µεταφορά σφαιριδίων τοποθετήστε το άκρο στο φιαλίδιο του CytoCount και αναρροφήστε µεγαλύτερη ποσότητα εναιωρήµατος χωρίς όµως να µεταφέρετε και το υπόλειµµα του υγρού από την πρώτη µεταφορά. 9. Αν το άκρο δεν ήρθε σε επαφή µε το δείγµα, το υπόλειµµα του υγρού στο άκρο πρέπει να χορηγείται στο φιαλίδιο CytoCount. Αν επιλέξετε να απορρίψετε το υπόλειµµα του υγρού, ενδέχεται το αντιδραστήριο να µην επαρκεί για 50 εξετάσεις εις διπλούν. Ποιοτικός έλεγχος είγµα µάρτυρα Για να ελέγξετε αν η προετοιµασία της απαρίθµησης των CD34+ κυττάρων είναι η κατάλληλη, πρέπει να συµπεριλαµβάνετε και ένα δείγµα θετικού µάρτυρα για έλεγχο ποιότητας. Συνιστάται ανεπιφύλακτα η συµµετοχή ενός εξωτερικού σχήµατος αποτίµησης της ποιότητας. Ο χρόνος ως ποιοτικός έλεγχος Σε προσδιορισµούς µονής πλατφόρµας µπορείτε να χρησιµοποιείτε ως εσωτερικό έλεγχο ποιότητας το χρόνο, καθώς µελέτες έχουν διαπιστώσει ότι ο αριθµός των σφαιριδίων που απαιτείται σε µια συγκεκριµένη χρονική περίοδο είναι εξαιρετικά σταθερός για τα περισσότερα κυτταρόµετρα ροής. Για κάθε καινούρια παρτίδα σφαιριδίων, ο χρήστης µπορεί για δεδοµένο χρόνο να εξάγει µια µέση τιµή µέτρησης σφαιριδίων µε εύρος ± 2 SD. Οποιοδήποτε δείγµα µε καταµέτρηση σφαιριδίων εκτός του εύρους αυτού αποτελεί ένδειξη πιθανού σφάλµατος κατά τη µεταφορά και γι' αυτό το δείγµα πρέπει να χρωµατίζεται εκ νέου (6). Εξετάσεις εις διπλούν Κάθε δείγµα πρέπει να εξετάζεται εις διπλούν. Η διαφορά των τιµών που λαµβάνετε από τις εξετάσεις εις διπλούν δεν πρέπει να ξεπερνά το 15%. Σε διαφορετική περίπτωση, το δείγµα πρέπει (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.8/15
να εξετάζεται εκ νέου. Η διαφορά µεταξύ των διπλών τιµών (X και Y) υπολογίζεται όπως παρακάτω: Λήψη δεδοµένων Ακολουθήστε τις συστάσεις του κατασκευαστή για την προετοιµασία του κυτταρόµετρου για λήψη τριών χρωµάτων. Στην προετοιµασία περιλαµβάνεται η ρύθµιση ή ο έλεγχος των τάσεων της λυχνίας του φωτοπολλαπλασιαστή (PMT) και η ευαισθησία του οργάνου, όπως επίσης η αντιστάθµιση, όταν χρησιµοποιείται αντιστάθµιση µε µηχανικά µέσα. Οι Sutherland et al. (1) and Gratama et al. (2) έχουν περιγράψει την προετοιµασία λήψης στα κυτταρόµετρα ροής FACSCalibur (Beckton Dickinson) και Coulter XL (Beckman Coulter). Προετοιµασία λήψης δεδοµένων για το CD34Count Kit Τα δεδοµένα µπορούν να ληφθούν είτε µε µηχανική αντιστάθµιση ενόσω διαρκεί η λήψη, είτε να ληφθούν χωρίς αντιστάθµιση,η οποία εφαρµόζεται κατόπιν κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των δεδοµένων. Σχετικά µε την προετοιµασία της αντιστάθµισης ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσεως του κυτταρόµετρου ροής. Το παρακάτω πρωτόκολλο είναι σχεδιασµένο τόσο για λήψη όσο και για ανάλυση αποτελεσµάτων. 1. ηµιουργήστε τις παρακάτω δισδιάστατες απεικονίσεις δεδοµένων (στικτά διαγράµµατα) και ρυθµίστε τις περιοχές σύµφωνα µε τις εικόνες: ιάγραµµα A: CD45 FITC συναρτήσει SSC-H (περιοχή 1 και περιοχή 5) ιάγραµµα Β: CD34 RPESSC-H (περιοχή 2) ιάγραµµα C: CD45 FITC συναρτήσει SSC-H (περιοχή 3) ιάγραµµα D: FSC-H συναρτήσει SSC-H (περιοχή 4) ιάγραµµα Ε: 7-AAD συναρτήσει SSC-H (περιοχή 8) ιάγραµµα F: CD45 FITC συναρτήσει CD34 RPE (περιοχή 6 και περιοχή 9) ιάγραµµα G: Χρόνος συναρτήσει FSC-H µε όριο πύλης στα περιστατικά CytoCount (περιοχή 7) ιάγραµµα Η: FSC-H συναρτήσει SSC-H 2. ηµιουργήστε την παρακάτω λογική πύλη (το χρώµα είναι προαιρετικό): Το G7 ονοµάστηκε «Stem Cells» και προστέθηκε στο κατασκευαστή λογικής πύλης για το χρωµατισµό των θετικών περιστατικών CD34+. Ο χρωµατισµός του ορίου πύλης είναι πολύ χρήσιµος στη διάρκεια προετοιµασίας λήψης και ανάλυσης αποτελεσµάτων. 3. Εφαρµόστε τις πύλες στα διαγράµµατα όπως παρακάτω ιάγραµµα A: G1 ιάγραµµα Β: G2: ιάγραµµα C: G3: ιάγραµµα D: G4 ιάγραµµα Ε: Χωρίς πύλη (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.9/15
ιάγραµµα F: Χωρίς πύλη ιάγραµµα G: G6 ιάγραµµα Η: Χωρίς πύλη 4. Ορίστε την τιµή ουδού στο FL-1 έτσι ώστε να αποκλείει όλα τα αρνητικά περιστατικά CD45. Συνιστάται να θέσετε την τιµή ουδού στο FL1, καθώς αυτό ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο αποκλεισµού των σφαιριδίων CytoCount. Η ρύθµιση του ουδού στην παράµετρο FSC είναι εφικτή, αλλά απαιτείται προσοχή ώστε να µην αποκλειστεί κανένα περιστατικό σφαιριδίου. Ανατρέξτε στην «Επίλυση προβληµάτων» 5. Φορτώστε το πρώτο δείγµα και παρατηρώντας το ιάγραµµα H ρυθµίστε την αύξηση PMT για το FSC και το SSC εξασφαλίζοντας ότι όλος ο πληθυσµός βρίσκεται υπό κλίµακα. Αν ο ουδός ρυθµιστεί στην παράµετρο FSC, βεβαιωθείτε ότι τα περιστατικά CytoCount βρίσκονται πάνω από την τιµή ουδού. 6. Ρυθµίστε το PMT για το CD45/FITC. Ο πληθυσµός των λεµφοκυττάρων πρέπει να πέσει εντός της τρίτης δεκάδας ( ιάγραµµα A). Βεβαιωθείτε ότι δεν εξαιρείται κανένα CD45+ κύτταρο µε αµυδρό φθορισµό. Αν υπάρχει αµφιβολία, µπορείτε είτε να χαµηλώσετε τον ουδό FL1, είτε να ανεβάσετε την αύξηση PMT για το FL1. Αν αλλάξουν οι ρυθµίσεις PMT, ίσως είναι απαραίτητο να προσαρµόσετε και τις ρυθµίσεις αντιστάθµισης. Plot A Plot B Plot C 7. Ρυθµίστε το PMT για το CD34/RPE. Η πλειοψηφία των αρνητικών περιστατικών πρέπει να βρίσκεται µεταξύ της πρώτης και της δεύτερης δεκάδας ( ιάγραµµα Β). 8. Ρυθµίστε το PMT για το 7-AAD. Η πλειοψηφία των αρνητικών περιστατικών πρέπει να βρίσκεται εντός της πρώτης δεκάδας ( ιάγραµµα Ε). (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.10/15
9. Εφαρµόστε την περιοχή 6 από το διάγραµµα F στο διάγραµµα G. Αν ο ουδός ρυθµιστεί στην παράµετρο FSC, χρησιµοποιήστε το διάγραµµα G για να βεβαιωθείτε ότι δεν έχει αποκλειστεί κανένα περιστατικό CytoCount εξαιτίας της ρύθµισης του ουδού (ανατρέξτε στην «Επίλυση προβληµάτων»). Plot D Plot E Plot F 10. Συνιστάται η εφαρµογή µιας πύλης αποκλεισµού στο διάγραµµα H. Αυτή η πύλη αποκλεισµού πρέπει να περιλαµβάνει περιστατικά SSC-low και FSC-low (περιοχή 9). Στη διάρκεια λήψης των αποτελεσµάτων, τα περιστατικά που πέφτουν εντός της πύλης αυτής πρέπει να απορρίπτονται. Αυτό επιτυγχάνεται µε την εφαρµογή στα περιστατικά αυτά ενός φίλτρου πύλης (πύλη αποκλεισµού) ή µε την απόρριψη περιστατικών στην περιοχή 9 του παραθύρου λήψης αποτελεσµάτων. Όταν ως ουδός χρησιµοποιείται η παράµετρος FSC, η πύλη αυτή αποκλεισµού δεν είναι κατάλληλη. 11. Στη διάρκεια της λήψης των αποτελεσµάτων, βεβαιωθείτε ότι ο χρόνος αποθηκεύεται ως µια παράµετρος. Plot G Plot H Τώρα το όργανο είναι έτοιµο για τη λήψη των αποτελεσµάτων. 12. Λάβετε τουλάχιστον 60.000 περιστατικά WBC, 1000 περιστατικά CytoCount και 100 περιστατικά CD34+. Μόνον για έναν από τους αριθµούς αυτούς µπορείτε να ορίσετε κάποιο κριτήριο διακοπής. Για τα χαµηλά δείγµατα CD34+, το κριτήριο διακοπής είναι τα 100 περιστατικά CD34+, ενώ το κριτήριο διακοπής για τα υψηλά δείγµατα CD34+ είναι τα 60.000 (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.11/15
περιστατικά WBC. Συνιστάται να λάβετε όσο περισσότερα περιστατικά µπορείτε, αφού αυτό παρέχει τον πιο ακριβή αριθµό των CD34+ κυττάρων. Ανάλυση δεδοµένων Χρησιµοποιήστε το ίδιο πρωτόκολλο ανάλυσης µε αυτό της λήψης των αποτελεσµάτων. 1. Εφαρµόστε τη ρύθµιση αντιστάθµισης ακολουθώντας τις οδηγίες του λογισµικού για τη λήψη δεδοµένων χωρίς µηχανική αντιστάθµιση. Σηµειώστε ότι η αντιστάθµιση για την επικάλυψη ανάµεσα στα κανάλια RPE και 7-AAD είναι κρίσιµη (ανατρέξτε στις «Προφυλάξεις»). 2. Εµφανίζονται στατιστικά στοιχεία για την περιοχή 4 (αρχέγονα κύτταρα) που δείχνουν τα προγονικά κύτταρα CD34+ και την περιοχή 7 (σφαιρίδια) που δείχνουν την καταµέτρηση των σφαιριδίων. Εµφανίζονται στατιστικά στοιχεία επίσης για την περιοχή 1 (G2), όταν απαιτείται ο αριθµός για τα λαµβανόµενα CD45 θετικά κύτταρα. 3. Εισάγετε το αρχείο των λαµβανοµένων δεδοµένων (αρχείο FCS) και τοποθετήστε τις περιοχές. 4. Στο διάγραµµα D εφαρµόστε το G5 και τοποθετήστε την περιοχή 4 ώστε να συµπεριλάβει µόνο τα µικρότερα λεµφοκύτταρα (εικόνα 1(α)). 5. Τώρα εφαρµόστε το G4 στο διάγραµµα D και κρατήστε την περιοχή 4 στην ίδια θέση (εικόνα 1(β)). a b Εικόνα 1. (α): Η περιοχή 4 είναι τοποθετηµένη ώστε να συµπεριλαµβάνει περιστατικά µεγαλύτερα από τα µικρότερα λεµφοκύτταρα, όπως επίσης περιστατικά χαµηλά στην πλευρική σκέδαση. (β): µετά τη ρύθµιση της περιοχής 4 στα ζωντανά λεµφοκύτταρα, το διάγραµµα έχει όριο πύλης στο G4 ώστε να εµφανίζει τα γεγονότα εκείνα που πληρούν τις απαιτήσεις που περιγράφονται στη στρατηγική δηµιουργίας ορίου πύλης ISHAGE. Αποτελέσµατα Υπολογισµός του απόλυτου αριθµού των CD34+ κυττάρων ανά µl, στο αρχικό δείγµα: Χρησιµοποιήστε την ακόλουθη εξίσωση για να υπολογίσετε τον απόλυτο αριθµό των CD34+ κυττάρων: CD34+ κύτταρα/µl = καταµετρηµένος αριθµός CD34+ κυττάρων (Π4) x συγκέντρωση του CytoCount * x συντελεστής αραίωσης καταµετρηµένος αριθµός σφαιριδίων (Π7) *Η τιµή αυτή (C) βρίσκεται στην ετικέτα του φιαλιδίου 4: C= αριθµός σφαιριδίων/µl. Στο παράδειγµα που παρουσιάζεται (διαγράµµατα A έως H), ο υπολογισµός του απόλυτου αριθµού των CD34+ κυττάρων γίνεται όπως παρακάτω: 216 x 1006 x 1 = 66 CD34+ κύτταρα/µl 3276 (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.12/15
Το τελικό αποτέλεσµα είναι ο µέσος όρος των εξετάσεων εις διπλούν. Η Dako συνιστά η διαφορά µεταξύ αυτών των δύο τιµών να µην υπερβαίνει το 15%, σε αντίθετη περίπτωση το δείγµα πρέπει να αναλύεται και πάλι (ανατρέξτε στον «Ποιοτικό έλεγχο»). Ανάθεση τιµής Η συγκέντρωση των σφαιριδίων (C) και η αντίστοιχη τυπική απόκλιση (S) αναφέρονται στην ετικέτα του φιαλιδίου 4 ως αριθµός/µl. Ο αριθµός αυτός λαµβάνεται µε τη χρήση του µετρητή σωµατιδίων Z1 Coulter. Η τυπική απόκλιση της συγκέντρωσης των σφαιριδίων ελάχιστα συνεισφέρει στη συνδυασµένη αβεβαιότητα του αποτελέσµατος της ανάλυσης. Περιορισµοί 1. Λόγω της ποικιλοµορφίας των βιολογικών δειγµάτων, ορισµένα δείγµατα µπορεί να µην αναλύονται σωστά. Είναι απαραίτητο, τα στικτά διαγράµµατα να επιθεωρούνται από κάποιον µε εµπειρία στην κυτταροµετρία ροής. Ένα εσφαλµένο υψηλό αποτέλεσµα µπορεί να οδηγήσει σε έγχυµα το οποίο να περιέχει δόση CD34+ κυττάρων µε ουδό µικρότερο από τον προτεινόµενο. 2. Τα αποτελέσµατα του CD34Count Kit πρέπει να ερµηνεύονται σε συνδυασµό και µε άλλες πληροφορίες που προέρχονται από κλινικές αξιολογήσεις και πρόσθετες διαγνωστικές διαδικασίες. 3. Φυλάσσετε τα δείγµατα αίµατος σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 o C). 4. Μην χρησιµοποιείτε αποθηκευµένα δείγµατα ασθενών στα οποία έχει προηγηθεί µονιµοποίηση. 5. Ο αριθµός των WBC δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10 7 WBC/mL και ο αριθµός των CD34 στο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 2000 κύτταρα/µl. (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.13/15
Επίλυση προβληµάτων Πρόβληµα Ορισµένα περιστατικά σφαιριδίων χάθηκαν επειδή η τιµή ουδού της παραµέτρου FSC-H είχε ρυθµιστεί πολύ ψηλά. Επίλυση Εκτελέστε ξανά την ανάλυση του δείγµατος µε χαµηλότερο ουδό FSC-H. Ωστόσο, συνιστάται να ορίσετε τον ουδό στην παράµετρο FL1. Λάθος: Στην παράµετρο FSC-H δεν παρατηρείται κανένα περιστατικό κάτω από τον κύριο πληθυσµό σφαιριδίων. Κατά τη λήψη των αποτελεσµάτων, ορισµένα σφαιρίδια CytoCount αποκλείονται. Εξαιρείται µέρος του πληθυσµού των CD34+ επειδή ο ουδός FL1 έχει ρυθµιστεί πολύ υψηλά. Σωστό: Μπορεί να παρατηρηθούν περιστατικά µικρότερα από τον κύριο πληθυσµό των σφαιριδίων. Τα σφαιρίδια CytoCount δεν έχουν αποκλειστεί. Εκτελέστε ξανά την ανάλυση του δείγµατος µε χαµηλότερο ουδό FL1. Το δείγµα ποιοτικού ελέγχου βρίσκεται εκτός του εύρους. Είναι δύσκολος ο ορισµός των περιοχών. Ελέγξτε το κυτταρόµετρο ροής και την προετοιµασία λήψης αποτελεσµάτων και εκτελέστε πάλι το δείγµα ποιοτικού ελέγχου. Αν το δείγµα-µάρτυρας συνεχίζει να βρίσκεται εκτός εύρους, επικοινωνήστε µε το τοπικό τµήµα υποστήριξης του οργάνου. Μεγεθύνετε τα στικτά διαγράµµατα και τοποθετήστε ξανά την περιοχή. Όργανο Το CD34Count Kit προορίζεται για χρήση σε κυτταρόµετρο ροής. Το κυτταρόµετρο ροής πρέπει να διαθέτει µε τον κατάλληλο εξοπλισµό και λογισµικό καθώς και laser µήκους κύµατος 488 nm. Το κυτταρόµετρο ροής πρέπει να έχει δυνατότητα εντοπισµού του φθορισµού στα παρακάτω µήκη κύµατος: 515 545 nm (FL1), 562-607 nm (FL2) και >650 nm (FL3 ή FL4, ανάλογα µε το όργανο). Επίσης πρέπει να είναι ανιχνεύσιµη η σκέδαση φωτός (εµπρός και πλευρική σκέδαση). Το όργανο πρέπει να έχει δυνατότητα ουδού είτε στο FL1 είτε στην παράµετρο πρόσθιας σκέδασης. (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.14/15
Ακολουθήστε την προετοιµασία ποιοτικού ελέγχου που συνιστά ο κατασκευαστής του οργάνου. Η προετοιµασία περιλαµβάνει τη ρύθµιση ή τον έλεγχο των τάσεων PMT, τη αντιστάθµιση φθορισµού και την ευαισθησία του οργάνου. Βιβλιογραφία 1. Sutherland DR, Keeney M, Gratama JW. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Current Protocols in Cytometry. New York: John Wiley & Sons; 2003. p. 6.4.1-23. 2. Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; 1999. p. 6.4.1-22. 3. Keeney M, Gratama JW, Sutherland DR. Critical role of flow cytometry in evaluating peripheral blood hematopoietic stem cell grafts. Cytometry 2004;58A:72-5. 4. Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry 2000;42:327-46. 5. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother 1996;5:213-26. 6. Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: time can tell all. Cytometry 2003;52B:37-40. Επεξήγηση των συµβόλων Αριθµός καταλόγου Περιορισµοί θερµοκρασίας Κωδικός παρτίδας Ιατρική συσκευή in vitro διαγνωστικών εξετάσεων Συµβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης Φυλάξτε το µακριά από το ηλιακό φως (συµβουλευθείτε το εδάφιο αποθήκευσης) Περιέχει αρκετό για <n> τεστ Ηµεροµηνία λήξης Κατασκευαστής Προϊόν της: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark/ Danemark/ Dänemark Τηλ. +45 44 85 95 00 Φαξ +45 44 85 95 95 www.dako.com (111445-003) K2370/GR/JLA/2010.10.15 σελ.15/15