ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΠΡΩΤΟΤΥΠΩΝ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΑΓΩΓΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΗ ΚΑΤΑΠΟΛΕΜΗΣΗ ΤΩΝ ΕΞΩΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΩΝ ΟΠΩΣ ΑΥΤΕΣ ΕΜΦΑΝΙΖΟΝΤΑΙ ΣΤΙΣ ΕΝΤΑΤΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΕΙΔΩΝ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΟΛΥΓΑΣ Ν. ΜΑΡΚΟΣ Τ. Ιχθυολόγος, MSc ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ιχθυοπαθολογίας, Ιχθυολογίας & Υδατοκαλλιεργειών του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Καρδίτσα 2014 1

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τέσσερις θεματικές ενότητες. Στη πρώτη ενότητα μελετήθηκε ο βαθμός παρασίτωσης, η εποχικότητα και η παθολογία των εξωπαρασιτώσεων στα εκτρεφόμενα είδη. Παράλληλα διερευνήθηκε το ποιοτικό και ποσοτικό παρασιτικό προφίλ των άγριων πληθυσμών με σκοπό να τεκμηριωθεί εάν αυτοί ευθύνονται για τις παρασιτώσεις των εκτρεφόμενων και ποιά η ειδοειδική σχέση μεταξύ παρασίτων και ψαριών. Από τα αποτελέσματα προέκυψαν σημαντικά συμπεράσματα ειδοειδικής ηθολογίας μεταξύ των παρασίτων και των ξενιστών τους. Δηλαδή συγκεκριμένα είδη παρασίτων εμφανίζονται σε συγκεκριμένα είδη ψαριών, με παρουσία επίμονη τόσο στους εκτρεφόμενους όσο και στους άγριους πληθυσμούς, αυτό φαίνεται να ισχύει περισσότερο στα μονογενή, διγενή και κωπήποδα παράσιτα και όχι στα κεστώδη που εμφανίζουν μικρή ειδικότητα ξενιστών. Στη δεύτερη θεματική ενότητα διερευνήθηκε η τοξική δράση δύο αντιπαρασιτικών ουσιών, της νικλοσαμίδης που είναι ένα ταινιοκτόνο- μαλακιοκτόνο και της εμαμεκτίνης που έχει κωπηποδοκτόνες ιδιότητες. Μέσα από διάφορα δοσολογικά σχήματα per os χορήγησης διαπιστώθηκε πως η νικλοσαμίδη είναι ασφαλής σε υψηλή-βραχυχρόνια χορήγηση (60ppm/kg x 3d) όπως επίσης και σε χαμηλή-μακροχρόνια (20ppm/kg x 10d). Παρόλα αυτά, σε ημερήσια χορήγηση πάνω από 100ppm/kg βιομάζας η νικλοσαμίδη φάνηκε να είναι ελαφρά τοξική για τα ψάρια καθώς παρουσίασαν αλλαγή στο χρωματισμό, απάθεια, ληθαργικότητα, ανωμαλία πλεύσης και ασκίτη. Ιστοπαθολογικά ευρήματα υπέδειξαν νεφροτοξικότητα και ατροφία του εντερικού βλεννογόνου. Δοσολογικά σχήματα που ξεπερνούν τα 100ppm/ ημέρα είναι θανατηφόρα για τα ψάρια με τον επερχόμενο χρόνο θανάτου να είναι αντιστρόφως ανάλογος της δόσης εφαρμογής. Σε μεγάλες δόσεις ο θάνατος είναι βίαιος πιθανότατα εξαιτίας καρδιακής ανακοπής και για το λόγο αυτό τα ιστοπαθολογικά ευρήματα είναι ασαφή. Για να μειωθεί ο κίνδυνος τοξίκωσης από υπερδοσία εξαιτίας υπερβολικής κατανάλωσης φαρμακούχας τροφής από τα ψάρια, θα πρέπει σε επίπεδο εκτροφής η ουσία να εφαρμόζεται σε όλη τη ποσότητα του πρωινού γεύματος και όχι σε μέρος αυτού. Η εμαμεκτίνη ως καλά μελετημένο και αδειοδοτημένο φάρμακο στη Νορβηγία ενάντια στα θαλάσσια κωπήποδα παράσιτα 2

του σολομού δεν υπέδειξε τοξική δράση στα ψάρια ακόμα και σε δόσεις 100πλάσιες της προτεινόμενης. Στη τρίτη θεματική ενότητα έγινε έλεγχος της αντιπαρασιτικής δράσης της εμαμεκτίνης και της νικλοσαμίδης μετά από χορήγηση σε ιχθύες φυσικά μολυσμένους με παράσιτα. Η αντιπαρασιτική δράση ελέγχθηκε τόσο εργαστηριακά όσο και στο πεδίο. Εργαστηριακά διαπιστώθηκε πως η νικλοσαμίδη δρα ενάντια στα μονογενή παράσιτα και δη σε γένη όπως Lamellodiscus echeneis (Furnestinia), Diplectanum και Sparicotyle που είναι γνωστοί παρασιτικοί αιτιολογικοί παράγοντες στις ιχθυοεκτροφές της Μεσογείου, ενώ η εμαμεκτίνη δρα ενάντια στα κωπήποδα και δη στα γένη Caligus και Lernanthropus. Η δράση και των δύο φαρμάκων ελέγχθηκε σε πραγματικές συνθήκες εκτροφής με την εμαμεκτίνη να είναι δραστική στο σύνηθες δοσολογικό σχήμα (0,1μg/kg/d x 10d), μειώνοντας το συνολικό παρασιτικό φορτίο ανά ψάρι έως και 68% την 30 ημέρα. Η νικλοσαμίδη αν και εργαστηριακά κατάφερε πρακτικά να μηδενίσει το παρασιτικό φορτίο των ψαριών εντούτοις τα αποτελέσματα στο πεδίο ήταν λιγότερο εντυπωσιακά αλλά εξίσου σημαντικά καθώς το συνολικό παρασιτικό φορτίο ανά βράγχιο μειώθηκε σε ποσοστό 88,5% τη 17 η ημέρα στο δοσολογικό σχήμα των 60ppm/kg/d x 5 d. Το πραγματικό πλεονέκτημα των δύο αυτών αντιπαρασιτικών ουσιών δεν είναι η αντιπαρασιτική τους δράση αυτή καθαυτή, αλλά το γεγονός πως παραμένουν δραστικά ακόμη και με per os χορήγηση η οποία πλεονεκτεί των λοιπών τρόπων εφαρμογής (λουτρά). Στη τέταρτη θεματική ενότητα έγινε έλεγχος των φαρμακοκινητικών παραμέτρων της νικλοσαμίδης. Ο χρόνος ημίσειας ζωής (t 1/2 ) στο δέρμα υπολογίστηκε στις 150h, οπότε πρακτικά ο χρόνος αναμονής ανέρχεται στις 787 βαθμοημέρες (χρειάζεται να παρέλθει 6 φορές ο χρόνος αναμονής της ουσίας για να είναι μη ανιχνεύσιμη στους ιστούς). Εκτός των παραπάνω υπολογίστηκαν και λοιπές φαρμακοκινητικές παράμετροι όπως κάθαρση πλάσματος (CL pl )(0,84 L/h/Kg), μέγιστες συγκεντρώσεις ιστών (C max, σταθερά ρυθμού αποβολής (K el =0,0138) καθώς επίσης και o μέσος χρόνος αναμονής (MRT pl = 44 h). Έλεγχος των φαρμακοκινητικών παραμέτρων της εμαμεκτίνης δεν έγινε στη παρούσα θεματική ενότητα καθώς έχει εκτενώς διερευνηθεί από πρόσφατες εργασίες. 3

Ανακοινώσεις και Δημοσιεύσεις σχετιζόμενες με την παρούσα διατριβή Kolygas M.N., Gourzioti E., Vatsos I.N., Athanasopoulou F. (2012). Identification of Tenacibaculum maritimum strains from marine farmed fish in Greece. Journal of Veterinary Record 170(24): 623-625. Μ.Ν. Κολύγας, Ε. Γουρζιώτη, Φ. Aθανασοπούλου. Πρώτη εµφάνιση μυκητίασης σε εκτρεφόμενα θαλασσινά ψάρια του είδους Pagrus pagrus (Linnaeus, 1758) (Φαγκρί) από Exophiala sp. στην Ελλάδα. 10-13 Οκτωβρίου 2013. 15 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων, Θεσσαλονίκη. Βιβλίο πρακτικών, σελ. 379-382. 4

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Φ. Αθανασοπούλου, Καθηγήτρια, Επιβλέπουσα Εργαστήριο Ιχθυοπαθολογίας, Ιχθυολογίας & Υδατοκαλλιεργειών, Τμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Ι. Πάσχος, Ομότιμος Καθηγητής, Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Τμήμα Ιχθυοκομίας & Αλιείας, Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Ηπείρου Ι. Παππάς, Αναπληρωτής Καθηγητής, Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Εργαστήριο Φαρμακολογίας και Τοξικολογίας, Τμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Φ. Αθανασοπούλου, Καθηγήτρια, Τμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Ι. Πάσχος, Ομότιμος Καθηγητής, Τμήμα Ιχθυοκομίας & Αλιείας, ΤΕΙ Ηπείρου Ι. Παππάς, Αναπληρωτής Καθηγητής. Τμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Α. Γκόβαρης, Καθηγητής, Τμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Ι. Λεονάρδος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών Η. Παπαδόπουλος, Καθηγητής, Τμήμα Κτηνιατρικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Μ. Λευκαδίτης, Λέκτορας, Τμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας 5

UNIVERSITY OF THESSALY SCHOOL OF HEALTH SCIENCES FACULTY OF VETERINARY MEDICINE IMPLEMENTATION OF INNOVATORY AND EFFICACIOUS TREATMENTS AGAINST ECTOPARASITES OF INTENSIVE CULTURED MEDITERRANEAN FISH KOLYGAS N. MARKOS T. Ichthylogist, MSc A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY Work carried out at the Laboratory of Fish Diseases and Aquaculture of the Faculty of Veterinary Medicine of the University of Thessaly Karditsa. Greece 2014 6

ABSTRACT Current thesis is divided into 4 thematic Chapters. The 1 st Chapter is dealing with the parasitic relatedness between cultured and wild fish populations and the role of the former as passive parasitic transmitters to the latter. In order to investigate the above hypotheses, a thorough research upon the quantitative- qualitative parasitic profile was conducted taking into account several parameters such as season, clinical manifestations and histopathological findings. The results indicated strong behavioral patterns between parasites and fish species. That is, most of the monogenean and trematoda parasites infect specific fish species, showing high host specificity, but cestodes presented low host specificity infecting a wide range of marine teleosts. In the 2 nd Chapter two antiparasitic substances niclosamide and emamectin - were concluded in fish toxicity tests through several per os administrational regimens. As far as niclosamide is concerned 60ppm/kg/d for 3days and 20ppm/kg/d for 10 days regimens were sublethal and safe demonstrating normal kidney and liver histological findings. Daily doses of 100ppm indicated slightly toxic manifestations suc as pigmentation abnormalities, lethargy, apathy, and askitis. Histopathological findings focused mainly on the atrophy of the intestinal mucosa and glomeruli disorganization. Regimes that exceed daily intake of 100ppm niclosamide, are highly toxic. Toxicity immediates rapidly due to cardiac arrest and in most of the cases no histopathological signs were visible. In order to reduce overdose minifestations, niclosamide should applied in the whole quantity of the first meal in cultured fish, and not on a part of it. Emamectin, as a well studied and registered antiparasitic drug in Norway, did not indicate any kind of toxicity, whatsoever. In The 3 rd Chapter optimum sublethal and subtoxic regimens of the previous (2 nd ) Chapter, were challenged against naturally infected fish with ectoparasites, on laboratory conditions. The final curative doses tested in field trials. Niclosamide regimen of 60ppm/kg biomass/d for 5 days is effective against Sparicotyle, Diplectanum and Lamellodiscus, capable of decreasing the total parasitic load up to 88,5% (17 th day). Emamectin regimen of 0,1μg/kg/d for 10 days is effective against Caligus and Lernanthropus genera, by reducing the total parasitic load per fish up to 68% (30 th day). As a conclusion, both compounds have an advantage over current 7

antiparasitic applications through immersion, for they can be effect via per os administration. In the 4 th Chapter, pharmacokinetics and bioavailability of niclosamide studied after single administration of niclosamide, via injection and per os, respectively.the distribution of the substance in target- tissues was also calculated through time. Halftime period in skin (t1/2 (skin) ) was approximately 150h in 21 0 C, which can be generally expressed as 787 degree-days (6 period half-time periods need to reduce niclosamide concentrations below minimum tracing levels. Other pharmacokinetic parameters in plasma were: AUC plasma (2863 h*ng/l), Vd plasma (60,8 L/kg), CL plasma (0,84 L/h/kg), K el (plasma) (0.013 L/h) and MRT plasma (44 h). Pharmacokinetic parameters of emamectin did not calculated for it has been extensively studied in previous studies. 8

Announcements and Publications associated with the present thesis Kolygas M.N., Gourzioti E., Vatsos I.N., Athanasopoulou F. (2012). Identification of Tenacibaculum maritimium strains from marine farmed fish in Greece. Journal of Veterinary Record 170(24): 623-625. M.N. Kolygas, E. Gourzioti, F. Athanasopoulou (2013). First incident of mycosis in marine cultured red porgy (Pagrus pagrus Linnaeus, 1758) caused by Exophiala sp. in Greece. Publication in 15th Pan-Hellenic Conference of Ichthyologists, University of Thessaloniki, 10-13 October 2013. Book of proceedings, pp. 379-382. 9

ADVISOR COMMITTEE F. Athanassopoulou, Professor, Supervisor Laboratory of Fish Diseases and Aquaculture, Faculty of Veterinary Medicine, University of Thessaly I. Paschos, Professor, Member of advisory committee Department of Aquaculture and Fisheries, Technological Educational Institute of Epirus Assosiate Professor, I. Pappas, Member of advisory committee Laboratory of Pharmacology & Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Thessaly EXAMINATION BOARD Professor F. Athanassopoulou, Faculty of Veterinary Medicine, University of Thessaly Professor I. Paschos, Technological Educational Institute of Epirus Assosiate Professor, I. Pappas, Faculty of Veterinary Medicine, University of Thessaly Professor, A. Govaris, Faculty of Veterinary Medicine, University of Thessaly Professor, Ι. Leonardos, Department of Biological applications and Technology, University of Ioannina Professor, E. Papadopoulos, School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki Μ. Leukaditis, Lecturer, Faculty of Veterinary Medicine, University of Thessaly 10

Πίνακας περιεχομένων ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 2 Ανακοινώσεις και Δημοσιεύσεις σχετιζόμενες με την παρούσα διατριβή... 4 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ... 5 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ... 5 ABSTRACT... 7 EXAMINATION BOARD... 10 Ευχαριστίες... 15 Αναλυτική περιγραφή αντικειμένου της έρευνας... 17 1 η Ενότητα: Μελέτη του βαθμού παρασίτωσης, της εποχικότητας και της παθολογίας των εξωπαρασιτώσεων... 17 2 η Ενότητα: Τοξικότητα Εμαμεκτίνης, Νικλοσαμίδης... 18 3 η Ενότητα: Αποτελεσματικότητα πειραματικές δοκιμές... 19 4 η Ενότητα: Φαρμακοκινητική, t αποδρομής... 19 Καινοτομικότητα της έρευνας... 20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 22 Εξωπαρασιτώσεις στις Ελληνικές υδατοεκτροφές... 23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο... 27 1.1 Υλικά και Μέθοδοι 1 ης Ενότητας... 27 1.1.1 Περιοχές δειγματοληψιών εκτρεφόμενων πληθυσμών... 27 1.1.2 Περιοχές δειγματοληψιών άγριων πληθυσμών και επιλογή ειδών... 28 1.1.3 Παρασιτολογικές εξετάσεις... 29 1.1.4 Χρωματισμός παρασίτων... 32 1.2 Αποτελέσματα 1 ης Ενότητας... 37 1.2.1 Είδη και αριθμός εξετασθέντων ιχθύων... 37 1.2.2 Σύνολο παρασίτων που εντοπίστηκαν... 39 1.2.3 Περιγραφή παρασίτων... 43 1.2.3.1 Μονογενή... 44 11

1.2.3.2 Διγενή Τρηματώδη... 93 1.2.3.3 Κωπήποδα... 121 1.2.3.4 Ισόποδα... 148 1.2.3.5 Βδέλλες (Annelida)... 155 1.2.3.6 Κεστώδη... 159 1.2.4 Παθολογία εξωπαρασιτώσεων... 163 1.3 Συζήτηση 1 ης ενότητας... 167 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο... 170 Τοξικότητα Εμαμεκτίνης, Νικλοσαμίδης... 170 2.1 Εισαγωγή 2 ης ενότητας... 170 2.1.1 Νικλοσαμίδη... 170 2.1.1.1 Γενικά χαρακτηριστικά... 170 2.1.1.2 Χημική σταθερότητα... 171 2.1.1.3 Κτηνιατρική Χρήση... 172 2.1.1.4 Αντιπαρασιτική δράση στους ιχθύες... 172 2.1.1.5 Παρεντερική χορήγηση... 173 2.1.1.6 Γαστρεντερική χορήγηση... 174 2.1.2 Εμαμεκτίνη... 175 2.1.2.1 Γενικά χαρακτηριστικά... 175 2.2 Υλικά και Μέθοδοι 2 ης ενότητας... 176 2.3 Αποτελέσματα 2ης Ενότητας... 180 2.4 Συζήτηση 2ης Ενότητας... 193 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο... 196 Αποτελεσματικότητα πειραματικές δοκιμές... 196 3.1 Υλικά και Μέθοδοι 3 ης Ενότητας... 196 3.2 Αποτελέσματα 3ης Ενότητας... 197 3.2.1 Παρασιτικό φορτίο μαρτύρων (ενυδρεία)... 197 3.2.2 Νικλοσαμίδη -Αποτελέσματα πειραματικών χορηγήσεων (ενυδρεία)... 199 12

3.2.3 Εμαμεκτίνη -Αποτελέσματα πειραματικών χορηγήσεων (ενυδρεία)... 202 3.2.4 Παρασιτικό φορτίο μαρτύρων (πεδίο)... 203 3.2.5 Νικλοσαμίδη -Αποτελέσματα πειραματικών χορηγήσεων (πεδίο)... 207 3.2.6 Εμαμεκτίνη -Αποτελέσματα πειραματικών χορηγήσεων (Πεδίο)... 216 3.3 Συζήτηση 3ης Ενότητας... 221 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο... 224 4.1 Υλικά και Μέθοδοι 4 ης Ενότητας... 224 4.1.1 Υπολογισμός φαρμακοκινητικής Νικλοσαμίδης... 224 4.1.2 Εξαγωγή Νικλοσαμίδης από τους ιστούς... 224 4.1.2.1 Προετοιμασία Δείγματος... 224 4.1.2.2 Προετοιμασία φυσιγγίων C18... 225 4.1.2.3 Φόρτωση Δειγμάτων στα φυσίγγια - έκλουση... 226 4.1.2.4 Ανάλυση υγρού έκλουσης - Ποσοτικοποίηση... 226 4.2 Αποτελέσματα 4 ης Ενότητας... 227 4.3 Συζήτηση 4 ης Ενότητας... 230 Τελικά Συμπεράσματα... 235 Νικλοσαμίδη, Μελλοντική χρήση: ευκαιρία ή ουτοπία;... 236 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 237 13

Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Ιχθυολογίας Ιχθυοπαθολογίας σε συνεργασία με το εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Πηγή χρηματοδότησης είναι το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ) - Ευρωπαϊκή Ένωση και Εθνικοί Πόροι. H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. 14

Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την κ. Φωτεινή Αθανασοπούλου, Καθηγήτρια του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, η οποία μου έδωσε τη δυνατότητα να εκπονήσω αυτή τη διατριβή και την επέβλεψε, υποστηρίζοντας και καθοδηγώντας με καθ όλη τη διάρκειά της. Η εμπιστοσύνη της προς εμένα πάντοτε λειτουργούσε ως ώθηση για να συνεχίσω και να προσπαθήσω περισσότερο. Ευχαριστώ, τον Κ. Πάσχο Ιωάννη, Καθηγητή του Τμήματος Ιχθυοκομίας Αλιείας του ΤΕΙ Ηπείρου για τη συμβολή, την συνεχή καθοδήγηση του ως μέλος της τριμελούς επιτροπής και τις πολύτιμες συμβουλές του. Είναι ιδιαίτερη τιμή για εμένα το γεγονός πως δέχτηκε να είναι μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Επίσης, ευχαριστώ τον Κ. Ναθαναηλίδη Κοσμά, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Ιχθυοκομίας Αλιείας του ΤΕΙ Ηπείρου, για τη βοήθειά του, την συνεχή υποστήριξή του και τις πολύτιμες συμβουλές του, που πάντοτε προσπαθώ να ακολουθώ και να μαθαίνω δίπλα του. Ευχαριστώ επίσης, τον κ. Παππά Ιωάννη, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, για την συνεχή καθοδήγηση και την βοήθεια του η οποία ήταν καταλυτική για την ολοκλήρωση των τριών τελευταίων ενοτήτων. Η πόρτα του γραφείου του πάντοτε ανοικτή, και ο ίδιος πάντοτε πρόθυμος να δώσει λύσεις στα τόσα προβλήματα που ανέκυπταν κάθε φορά, τόσο στους πειραματισμούς όσο και στις φαρμακολογικές αναλύσεις. Θερμές ευχαριστίες στην Κα Γουρζιώτη Ευγενία, διδάκτορα του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, για την βοήθειά της σε όλες τις φάσεις πραγματοποίησης της διπλωματικής εργασίας καθώς και για την ηθική συμπαράσταση της σε όλο αυτό το διάστημα συγγραφής της εργασίας. Ευχαριστίες επίσης απευθύνω: Στην κ. Μαντέ Μαρία, υπεύθυνη της μονάδας ιχθυοεκτροφής Αφοί ΔΗΜ. ΜΑΝΤΕ & ΣΙΑ Ο.Ε.", για την άριστη συνεργασία κατά την συλλογή των δειγμάτων. Στον κ. Χατζόπουλο Αχιλλέα, Ιχθυολόγο καθώς και στους υπεύθυνους της Εταιρίας Ιχθυοεκτροφών «Νηρέας» για την βοήθεια τους στην συλλογή των δειγμάτων. 15

Ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου, για την υπομονή τους, τη βοήθεια τους και τη συμπαράσταση τους. Μαζί με αυτούς ευχαριστώ και την αδερφή μου, Παναγιώτα Κολύγα για την επιμέλεια των σχηματικών απεικονίσεων των παρασίτων, την υπομονή και το πολύ χρόνο που διέθεσε για να τα ολοκληρώσει με τόσο μεγάλη πιστότητα. 16

Αναλυτική περιγραφή αντικειμένου της έρευνας Η παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τέσσερις θεματικές ενότητες, οι περιγραφές των οποίων αναλύονται παρακάτω. Οι ενότητες αυτές έγιναν με σειρά ιεράρχησης έτσι ώστε τα αποτελέσματα της πρώτης να αποτελούν φυσικής συνέχεια της επόμενης κ.ο.κ. Ωστόσο παρά τον χρονικό περιορισμό για τη περαίωση του κάθε πακέτου εργασιών ανά ενότητα, κάποιες ενότητες κρίναμε πως θα μπορούσαν να είναι περισσότερο ελαστικές χρονικά και να επικαλύπτονται. Κάτι τέτοιο έγινε με τη πρώτη και δεύτερη ενότητα, όπου οι δειγματοληψίες των άγριων πληθυσμών συνεχίστηκαν και για κάποιους παραπάνω μήνες. 1 η Ενότητα: Μελέτη του βαθμού παρασίτωσης, της εποχικότητας και της παθολογίας των εξωπαρασιτώσεων Αυτή η ενότητα εργασίας αποσκοπούσε στην μελέτη του βαθμού παρασίτωσης, της εποχικότητας και της παθολογίας των εξωπαρασιτώσεων (μονογενών, ισόποδων και κωπήποδων) σε εκτρεφόμενα είδη όπως η τσιπούρα (Sparus aurata) το μυτάκι (Diplodus puntazzo) και το λυθρίνι (Pagellus erythrinus) και σε άγρια είδη, καθόσον λίγες πληροφορίες υπάρχουν σήμερα για τα νέα εκτρεφόμενα είδη και τα άγρια ψάρια της Μεσογείου (Athanassopoulou et al., 1999; Ragias et al., 2004; 2005a,b). H μελέτη πραγματοποιήθηκε για ένα χρόνο και 3 μήνες σε άγριους καθώς επίσης και σε εκτρεφόμενους πληθυσμούς ψαριών συγκεκριμένων περιοχών και η φάση αυτή αποσκοπούσε στην μελέτη της εποχικότητας και της παθολογίας των εξωπαρασιτώσεων. Κατά το πρώτο έτος του έργου δόθηκε ιδιαίτερη σημασία στην ακριβή ταυτοποίηση των εμπλεκομένων παρασιτικών ειδών και την κατάταξή τους αναλόγως της σημασίας τους με κριτήρια τη παρουσία, την θνησιμότητα των ξενιστών και την ένταση τους, καθώς επίσης και την φύση των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που προκαλούν υπό συνθήκες εκτροφής σε κλωβούς. Η διάγνωση και ταυτοποίηση των μονογενών, ισόποδων και κωπήποδων έγινε με κλασσικές παρασιτολογικές μεθόδους (Yamaguti, 1963). Η νεκροσκοπική και παρασιτολογική εξέταση έγινε με μεθόδους που έχουν περιγράψει οι Αθανασοπούλου (1990) και Roberts (1989) για να προσδιοριστεί η ακριβής θέση των 17

παρασίτων, η έντασή τους καθώς και η ασφαλής καταμέτρηση των ατόμων των διαφόρων παρασίτων. Το ποσοστό θνητότητας για κάθε είδος ψαριού συσχετίστηκε με την περιοχή εκτροφής, τα είδη των ταυτοποιηθέντων παρασίτων και την εποχή της δειγματοληψίας σε προγράμματα στατιστικής ανάλυσης. 2 η Ενότητα: Τοξικότητα Εμαμεκτίνης, Νικλοσαμίδης Σε αυτήν την ενότητα εργασίας έγιναν διάφοροι πειραματικοί έλεγχοι ως προς τα όρια τοξικότητας της Νικλοσαμίδης και της Εμαμεκτίνης ανά είδος και μέγεθος. Η τοξικότητα της εμαμεκτίνης ερευνήθηκε παρά το γεγονός ότι είναι ένα καταχωρημένο φάρμακο στη Βόρεια Αμερική και στην Ευρώπη (με εκτενείς πληροφορίες τοξικότητας για διάφορα είδη ψαριών), καθώς κρίναμε απαραίτητη τη μελέτη της συμπεριφοράς του φαρμάκου και τη πιθανή τοξική δράση σε ευρύαλα είδη όπως η τσιπούρα και το λαβράκι. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε υγιή ψάρια ιχθυοτροφείων στις εγκαταστάσεις του εργαστηρίου Ιχθυολογίας & Ιχθυοπαθολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής του Παν/μίου Θεσσαλίας. Η τοξικότητα των φαρμάκων διερευνήθηκε με τη χορήγηση διάφορων δοσολογικών σχημάτων (οι δοσολογίες καθώς και η διάρκεια θεραπείας καθορίστηκαν βάση έτερων νόμιμων θεραπειών σε άλλα είδη ψαριών και ζώων καθώς και προηγούμενης εμπειρίας). Μετά από την θεραπεία, τα ψάρια ελέγχθηκαν για πιθανές παρενέργειες για χρονικό διάστημα 30 ημερών. Η αξιολόγηση των παρενεργειών βασίστηκε στη μέτρηση των πιθανών απωλειών καθώς και από τις μακροσκοπικές και ιστοπαθολογικές εξετάσεις στα εξεταζόμενα ψάρια σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία καθώς και η συμπεριφορά, η όρεξη και οι αλλαγές του χρωματισμού. Επιπλέον, εξετάστηκαν οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στα βασικά όργανα που συμμετέχουν στο μεταβολισμό και απομάκρυνση των φαρμάκων όπως το ήπαρ και οι νεφροί. Υιοθετήθηκαν πρότυπες χρώσεις για τους εξεταζομένους ιστούς. Τέλος, βασιζόμενοι στις πληροφορίες τοξικότητας που προέκυψαν από αυτή την ενότητα εργασίας, επιλέχθηκαν τα όρια βέλτιστων συγκεντρώσεων των φαρμάκων. 18

3 η Ενότητα: Αποτελεσματικότητα πειραματικές δοκιμές Η δραστικότητα των δύο αντιπαρασιτικών φαρμάκων (νικλοσαμίδη και εμαμεκτίνη) εξετάστηκε σε φυσικά μολυσμένα ψάρια από συγκεκριμένες ή μεικτές ομάδες παρασίτων (μονογενή, ισόποδα, κωπήποδα) στις δεξαμενές των εγκαταστάσεων του εργαστηρίου μας. Οι δοκιμές πεδίου πραγματοποιήθηκαν σε ειδικά διαμορφωμένους ιχθυοκλωβούς ιδιωτικής εταιρείας. Τα φάρμακα ενσωματώθηκαν στην τροφή, σε δόσεις που προέκυψαν από τη δεύτερη ενότητα. Τα ψάρια εισάγονταν στις πειραματικές εγκαταστάσεις 30 ημέρες πριν την έναρξη των πειραμάτων για βέβαιο εγκλιματισμό. Πριν την έναρξη χορήγησης των δοσολογικών σχημάτων, μέρος του πληθυσμού (ο ακριβής αριθμός αναφέρεται στα υλικά-μεθοδολογία) θανατώθηκε για να προσδιοριστεί ποιοτικά και ποσοτικά το προφίλ του παρασιτικού φορτίου. Ο προσδιορισμός των μονογενών, ισόποδων και κωπήποδων παρασίτων έγινε σύμφωνα με τους Lom & Dykova (1991) και Roberts (1989). Η δραστικότητα κάθε φαρμάκου καθορίστηκε με τη μέτρηση των θνησιμοτήτων και του συνολικού παρασιτικού φορτίου των ψαριών στα οποία χορηγήθηκε η θεραπευτική δόση, μετά από σύγκριση με τα ψάρια μάρτυρες. Η διάρκεια αυτών των πειραμάτων ήταν 6 μήνες. Τα πιο αποτελεσματικά δοσολογικά σχήματα αυτής της ενότητας επιλέχθηκαν για περαιτέρω διερεύνηση, στην ακόλουθη, ενότητα εργασίας. 4 η Ενότητα: Φαρμακοκινητική, t αποδρομής Στη 4 η θεματική ενότητα πραγματοποιήθηκε μία εκτενής διερεύνηση της κατανομής της νικλοσαμίδης στους ιστούς των ψαριών. Η φαρμακοκινητική της νικλοσαμίδης υπολογίστηκε από τα δεδομένα που λήφθηκαν μετά από ενδομυϊκή έγχυση 6mg/kg βιομάζας στη βάση του ραχιαίου πτερυγίου σε λαβράκια (μέσου βάρους 120g.). Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν μετά από ½, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 32, 48 και 216 ώρες μετά τη χορήγηση Οι αναλύσεις των αντιπαρασιτικών φαρμάκων που έγιναν στο πλάσμα του αίματος και τους ιστούς αποτέλεσε τροποποιημένη μέθοδο που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας. 19

Για ημι-λογαριθμική εξέταση τα δεδομένα τοποθετήθηκαν σε ειδικό πρόγραμμα (curve EXPERT 1997, D. Hyams). Το μοντέλο στο οποίο τα δεδομένα έδωσαν την καλύτερη προσέγγιση (least square fitting) είναι αυτό που τελικώς επιλεγόταν κάθε φορά για την εύρεση των φαρμακοκινητικών παραμέτρων (Ritschel & Banersbee, 1986). Καινοτομικότητα της έρευνας Από όσο γνωρίζουμε δεν πραγματοποιείται παρόμοιο έργο στην Ελλάδα ή σε διεθνές επίπεδο. Προηγούμενες έρευνες έδειξαν ότι η ιβερμεκτίνη έχει πολύ καλά αποτελέσματα στη θεραπεία των εξωπαρασιτώσεων τόσο των μονογενών όσο και των Αρθροπόδων. Όμως η ιβερμεκτίνη έχει μικρό περιθώριο ασφάλειας και παραμένει πολύ στους ιστούς και το περιβάλλον. (Athanassopoulou et al. 2001b; Athanassopoulou et al., 2002). Έτσι σήμερα διεθνώς χρησιμοποιούνται νέα παράγωγά της (όπως η εμαμεκτίνη) που όμως δεν έχουν δοκιμαστεί ακόμη στην Μεσόγειο (Lees et al., 2008). Για τα Αρθρόποδα έχει δοκιμαστεί και η δελταμεθρίνη με καλά αποτελέσματα όμως, η θεραπεία γίνεται με μπάνιο που δεν είναι εύχρηστη (Athanassopoulou et al., 2001a; 2004c). Τα καλύτερα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν σε δόση 10g/L όπου η συχνότητα μειώθηκε από 100% σε 0% σε διάστημα 24 ωρών σε μικρά και μεγάλα ψάρια (λαβράκι). Εξ άλλου το φάρμακο δεν έχει ερευνηθεί σε Sparidae και δεν είναι ακόμη εγκεκριμένο για τα μεσογειακά είδη λόγω έλλειψης μελέτης περιβαλλοντικών επιπτώσεων που είναι πολύ δαπανηρή και ασύμφορη. Επίσης, φαρμακούχα σύμπηκτα που περιείχαν 3mg/Kg ΣΒ diflubenzuron αντιμετώπισαν πλήρως τα προ ενήλικα και τα ενήλικα στάδια των ισόποδων για μια περίοδο 14 ημερών και δεν παρατηρήθηκαν παρενέργειες σε λαβράκια υπό θεραπεία κατά τη διάρκεια των πειραμάτων και δεν παρατηρήθηκε επαναμόλυνση για 15 ημέρες μετά το τέλος της θεραπείας Athanassopoulou et al., 2004c). Και το φάρμακο αυτό δεν έχει ερευνηθεί σε Sparidae και δεν είναι ακόμη εγκεκριμένο για τα μεσογειακά είδη Αναμένεται ότι τελικά μέσω της έρευνας αυτής θα κατοχυρωθεί μία αποτελεσματική αντιπαρασιτική ουσία για τη κάθε ομάδα παρασίτων (μονογενή, ισόποδα, κωπήποδα). Αυτό θα προσδώσει τη δυνατότητα σχεδιασμού 20

πρωτοποριακών και δραστικών θεραπειών, που θα μειώσουν σημαντικά τις θνησιμότητες και συνεπώς το κόστος του τελικού προϊόντος Το όφελος θα είναι πολλαπλό, διότι θα δοθεί η δυνατότητα εκτροφής των καινούργιων ειδών σε ανταγωνιστικό επίπεδο. Οι θεραπείες αυτές θα καλύψουν το μεγάλο κενό γνώσης που υπάρχει σήμερα σχετικά με τις αντιπαρασιτικές θεραπείες σε εξωπαράσιτα γενικότερα αλλά και τις θεραπείες των εκτρεφόμενων μεσογειακών ειδών ειδικότερα. Ελπίζουμε ότι αυτές θα είναι ευκολότερες, οικονομικότερες, πιο φιλικές προς το περιβάλλον και ασφαλείς για τον καταναλωτή. Έτσι, η παρούσα μελέτη θα μας δώσει τη δυνατότητα να δημιουργήσουμε νέα συστήματα μελέτης της παρασίτωσης των μεσογειακών ειδών ιχθύων τα οποία μπορεί να λειτουργήσουν ως πρότυπα σημαντικής καινοτομίας στον Ευρωπαϊκό χώρο αλλά και διεθνώς. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής μπορούν κάλλιστα να βρουν εφαρμογή στη εμπορική ιχθυοεκτροφική παραγωγή της χώρας μας κατά τη θεραπεία διαφόρων νοσημάτων των ψαριών και στις βιομηχανίες παραγωγής και εισαγωγής φαρμακευτικών σκευασμάτων. 21

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Ελλάδα ως χώρα με μεγάλη αλιευτική ιστορία ανασυστάθηκε στο πρώτο τρίτο του περασμένου αιώνα και απέκτησε ένα περισσότερο βιομηχανικό χαρακτήρα ανταποκρινόμενη στις καταναλωτικές απαιτήσεις (Moutopoulos & Stergiou, 2012). Στις αρχές της δεκαετίας του 80 αρκετοί αλιευτικοί συνεταιρισμοί παράλληλα με την αλιευτική τους δραστηριότητα ξεκίνησαν την πολυεκτροφή ειδών σε κλωβούς βελτιώνοντας το εισόδημα τους καθώς μπορούσαν να εμπορευθούν μεγάλα ψάρια σε καλύτερες τιμές μιας και πωλούνταν πλέον κατά απαίτηση του καταναλωτή και όχι από προσφορά των ιδίων. Τα ψάρια της πολυεκτροφής προέρχονταν από αλιευμένους πληθυσμούς και η εκτροφή τους ήταν πολυειδική. Έτσι ο κανιβαλισμός ήταν έντονος με μεγάλες θνησιμότητες, και με την εκτροφή να κρίνεται σαφώς προβληματική, χωρίς ζωοτεχνική μέριμνα. Στα μέσα της δεκαετίας του 80 ο Ελληνικός υδατοεκτροφικός κλάδος προσπάθησε να μιμηθεί τις επιτυχημένες απόπειρες εκτροφής μπακαλιάρου και σολομού των Βόρειων χωρών, προσαρμοσμένη στις περιβαλλοντικές απαιτήσεις της Μεσογείου, επιλέγοντας τοπικά εμπορικά είδη, όπως τσιπούρα και λαβράκι. Από αρκετούς Ιχθυολόγους εκείνη η εποχή θεωρείται πως έθεσε τα θεμέλια της έρευνας και καινοτομίας και της εκτόξευσης της δυναμικής των ελληνικών υδατοεκτροφών. Ο λόγος απλός, τα ψάρια προμηθεύονταν σε τιμές ισάξιες με εκείνες των αλιευμένων άγριων πληθυσμών στους χονδρέμπορους των ιχθυοσκάλων της χώρας. Με αυτό το τρόπο οι εταιρίες απέκτησαν γρήγορα οικονομική αυτονομία για επενδύσεις, εξαγορές και πειραματισμό. Έτσι μπορούσαν να καλύψουν τις ζημιές που προέκυπταν από βλαπτικά, παθολογικά αίτια και λανθασμένες ζωοτεχνικές προσεγγίσεις. Χαρακτηριστικό παράδειγμα η έλλειψη νηκτικής κύστης στα πρώτα ιχθύδια λαυρακιών των πρώτων ιχθυογεννητικών σταθμών. Θεωρούνταν τρομερή επιτυχία όταν τα ιχθύδια είχαν άρτια νηκτική κύστη σε ποσοστό 30% (στο υπόλοιπο 70% του πληθυσμού απουσίαζε εξολοκλήρου) ενώ στις μέρες μας η προδιαγραφές πώλησης ψαριών με νηκτική κύστη είναι 100%. Στις αρχές της δεκαετίας του 90 εδραιώθηκαν αρκετές ιδιωτικές μονάδες αμιγούς εκτροφής ψαριών και όχι μικτής (αλιεία- εκτροφή) που ήταν και περισσότερο σύνηθες έως τότε, από ιχθύδια που προέρχονταν από οικείους ιχθυογεννητικούς σταθμούς. Παράλληλα με αυτές τις μονάδες ξεκίνησε και η πιλοτική λειτουργία κρατικών ιχθυογεννητικών σταθμών. 22

Σήμερα οι ελληνικές υδατοεκτροφές πρωτοστατούν στην Ευρώπη καθώς έχουν την πρωτιά σε παραγωγή τσιπούρας και λαβρακιού, ενώ τα προϊόντα τους αποτελούν τη μεγαλύτερη εξαγωγική δύναμη της Ελλάδας. Η κρίση του 2008 έχει αναπροσαρμόσει το προφίλ λειτουργίας και δαπανών των μονάδων, με τις τιμές των προϊόντων να μεταβάλλονται συνεχώς, πάραυτα η δυναμική των εξαγωγών συνεχίζει να αυξάνεται. Η απότομη αύξηση των υδατοεκτροφών στην Ελλάδα δεν οφείλεται μόνο στο κλίμα και την ιδιαίτερη γεωμορφολογία της. Οφείλεται κυρίως στο ισχυρό επιστημονικό δυναμικό και το μεράκι και πείσμα όλων όσων ενεπλάκησαν και εμπλέκονται έως σήμερα στον κλάδο. Εξωπαρασιτώσεις στις Ελληνικές υδατοεκτροφές Με την άνθιση των υδατοεκτροφών και την εντατικοποίηση τους, αυξήθηκαν και οι νοσηρές καταστάσεις εξαιτίας παθογόνων οργανισμών. Η ιχθυοπαθολογία ως έννοια την περίοδο των δεκαετιών 80-90 ήταν ανύπαρκτη στην Ελλάδα και οι πρώτοι ιχθυοπαθολόγοι μπορούσαν να ειδικευθούν μόνο σε πανεπιστήμια του εξωτερικού. Στις περισσότερες περιπτώσεις υιοθετούσαν πρωτόκολλα εξωτικών ασθενειών τα οποία και προσάρμοζαν πειραματικά στους τοπικούς ασθενείς πληθυσμούς, άλλοτε με θετικά και άλλοτε με αρνητικά (κυρίως) αποτελέσματα. Μέσα όμως από αυτό τον πειραματισμό η ιχθυοπαθολογία στην Ελλάδα (και γενικά στη Μεσόγειο) έθεσε ισχυρές γνωστικές βάσεις για την αντιμετώπιση αρκετών ασθενειών. Οι πρώτοι βλαπτικοί παράγοντες που αντιμετωπίστηκαν με επιτυχία ήταν τα βακτηρίδια όπως Pasteurella sp. και Vibrio sp., ενώ στη συνέχεια ξεπεράστηκε και ο σκόπελος κάποιων εξωκυτταρικών πρωτόζωων (γένη Trichodina, Cryptocaryon Oodinium). Στις μέρες μας οι κύριοι βλαπτικοί αντιπρόσωποι οι οποίοι δεν μπορούν ακόμη να αντιμετωπιστούν με απόλυτη επιτυχία είναι οι εξωπαρασιτώσεις από Ισόποδα, κωπήποδα και πλατυέλμινθες και οι ενδοπαρασιτώσεις από μυξοσπορίδια. Η παρούσα έρευνα έρχεται να υπερκεράσει το πρόβλημα των εξωπαρασιτώσεων μέσα από τα δοσολογικά σχήματα των φαρμάκων που προτείνει, βοηθώντας τους παραγωγούς να περιορίσουν τις οικονομικές απώλειες και να παράξουν εντέλει ένα ανταγωνιστικά οικονομικό προϊόν. 23

Η εντατική εκτροφή ψαριών στις ακτές της Μεσογείου είναι ένα ιδανικό περιβάλλον που ευνοεί την παρουσία των ισόποδων και μονογενών παρασίτων. Η προσβολή της εκτρεφόμενης τσιπούρας (Sparus aurata) από μονογενή -και ειδικά το Sparicotyle (Microcotyle) chrysophrii αλλά και του λαβρακιού (Dicentrarchus labrax) από Ισόποδα και κωπήποδα, αποτελεί ένα συχνό πρόβλημα στη Μεσόγειο (Papapanagiotou & Trilles, 2001; Athanassopoulou et al., 2004a, 2009; Ragias et al., 2004, 2005a, b; Vagianou et al., 2006a,b). Από τα ψάρια ελεύθερης διαβίωσης, τα πιο κοινά είδη που προσβάλλονται από ισόποδα παράσιτα είναι οι κέφαλοι (Mugil sp, Lisa sp) (Ragias at al., 2005a), οι γόπες (Boops boops), οι σάλπες (Sarpa salpa), οι μουρμούρες (Lithognathus mormyrus) και οι σαργοί (Diplodus sargus) (Golomazou et al., 2006). Αυτά τα είδη ψαριών βρίσκονται συνήθως σε αφθονία γύρω από τους κλωβούς εκτροφής τρέφονται από την τροφή που δεν καταναλώνεται από τα εκτρεφόμενα ψάρια και αποτελούν παθητικούς φορείς για τη μεταβίβαση των παρασίτων στα εκτρεφόμενα ψάρια. Φαίνεται ότι αυτά τα ισόποδα δεν είναι ειδικά παράσιτα, αλλά μεταφέρονται στα εκτρεφόμενα ψάρια, από τα γειτονικά μολυσμένα ψάρια ελεύθερης διαβίωσης, που διαβιούν γύρω από τους κλωβούς. Η αύξηση της ιχθυοπυκνότητας των εκτρεφόμενων λαβρακιών ίσως έχει δημιουργήσει μια καινούρια σχέση μεταξύ παρασίτων και ξενιστών ούτως ώστε το παράσιτο Ceratothoa oestroides,να είναι το πιο κοινό από όλα τα ισόποδα παράσιτα και προκαλεί σοβαρές καταστροφές στα εκτρεφόμενα ψάρια (Vagianou et al, 2006b). Έρευνα στο Παν/μιο Θεσσαλίας έδειξε ότι με την αυξανόμενη παραγωγή και άλλα είδη παρασίτων όπως τα κωπήποδα προκαλούν προβλήματα σε εκτρεφόμενα ψάρια (Ragias et al., 2004). Έτσι άρχισαν και προκαταρκτικές μελέτες για την εύρεση θεραπείας (Athanassopoulou et al., 2001a, Athanassopoulou et al 2001b, 2004c). H μόλυνση από το μονογενές Sparicotyle (Microcotyle) chrysophrii τα δύο τελευταία χρόνια προκαλεί αυξημένες θνησιμότητες σε ψάρια της οικογένειας Sparidae, και δεν υπάρχουν εκτεταμένες μελέτες για το παράσιτο αυτό, την παθολογία του, την θεραπεία και την πρόληψή του. Μάλιστα, πρόσφατη Ελληνο- Ιταλική ερευνητική συνεργασία έδειξε ότι η γειτονική εκτροφή διαφορετικών Sparidae μπορεί να επιφέρει μεταπήδηση ξενιστών στα μονογενή παράσιτα (Ragias et al., 2005b). Σε αντίθεση με τα άλλα ζώα, η χρήση των αντιπαρασιτικών φαρμάκων ήταν μέχρι σήμερα, περιορισμένη στα ψάρια. Ενώ τελευταία έχει γίνει αρκετή έρευνα στον 24

τομέα των αντιμικροβιακών θεραπειών πολύ λίγες πληροφορίες υπάρχουν για ανθελμινθικά και ότι λιγοστό υπάρχει, αφορά ψάρια κρύων νερών και ειδικότερα της οικογένειας Salmonidae. H περισσότερη βιβλιογραφία και έρευνα αφορά την θεραπεία της θαλάσσιας ψείρας του σολομού. Υπάρχουν επίσης και ελάχιστες φαρμακοδυναμικές μελέτες για την Μεμπενταζόλη σε χέλια. Με την εντατικοποίηση όμως της Μεσογειακής θαλασσοεκτροφής τα παράσιτα τα τελευταία χρόνια αποκτούν πολύ μεγάλη σημασία αφού ορισμένες επιδημίες όπως το καλοκαίρι του 1997 από το πρωτόζωο Εnteromyxym leei αποδεκάτισε την παραγωγή της χιόνας μέχρι σημείου που να θεωρείται σήμερα ανασταλτικός παράγοντας εμπορικής ανάπτυξης ορισμένων νέων ειδών. Επιπλέον δε κατέδειξε την ανυπαρξία θεραπείας και έρευνας σε φάρμακα ιδιαίτερα για τα Μεσογειακά είδη. Κανένα από τα συνήθη αντιπαρασιτικά που χρησιμοποιούνται στις θαλάσσιες εκτροφές σήμερα δεν είναι εγκεκριμένα για τα Μεσογειακά είδη και δεν υπάρχουν νομοθετημένα MRL. Έτσι η δοσολογία αντιγράφεται από τα Salmonidae, πράγμα πολύ επικίνδυνο αφού και οι περιβαλλοντικές συνθήκες αλλά και οι βιολογικές συνθήκες των Μεσογειακών ειδών είναι πολύ διαφορετικές. Διεθνώς, από τη χρήση των κτηνιατρικών φαρμάκων [VMPs] στην καταπολέμηση των ασθενειών των ψαριών της εντατικής εκτροφής διαφαίνεται, ότι το θέμα πρέπει να επιλυθεί με την κατάρτιση ειδικών ερευνητικών προγραμμάτων μελέτης της κατανομής και της αποδρομής τους στα ψάρια των διαφόρων γεωγραφικών περιοχών [Βορά-Νότου] και πιο ειδικά σε κάθε είδος ψαριού χωριστά για την κάθε περιοχή. Παρά το μεγάλο αριθμό αντιμικροβιακών ουσιών που παράγονται και εγκρίνονται για χρήση στην ζωική παραγωγή μόνο ελάχιστες είναι εκείνες οι οποίες τελικά εγκρίνονται για τα ψάρια των ιχθυοεκτροφών. Ειδικότερα εγκρίνονται για τα ψάρια των ψυχρών-βόρειων περιοχών π.χ. σολομός. Για το λόγο αυτό και σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της ΕΜΕΑ επιβάλλεται η μελέτη των φαρμάκων και στα είδη ψαριών των θερμότερων-νότιων περιοχών, όπως και η Ελλάδα. Η παραδοσιακή αντιμετώπιση των εξωπαρασιτώσεων στην Ελλάδα έως τώρα γινόταν με φορμόλη. Η φορμόλη δεν δίδεται per os αλλά εφαρμόζεται άμεσα στο νερό της εκτροφής σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις. Στις μέρες μας χρησιμοποιούνται παρόμοιας φιλοσοφίας αντιπαρασιτικά διαλύματα τα οποία δρουν μέσω της εμβάπτισης του οργανισμού σε αυτά. Έως και το στάδιο της προπαχυνόμενης εκτροφής ψαριών (έως 20-25g), σε χερσαίες δεξαμενές η χρήση αντιπαρασιτικών με λουτρά είναι λειτουργική και 25

αξιόπιστη καθώς ο σταθερός όγκος των δεξαμενών διευκολύνει τους σωστούς υπολογισμούς των δόσεων, και παρέχουν αμεσότητα επέμβασης και παρατήρησης από τους χειριστές. Οι δεξαμενές μπορούν να παρέχουν άφθονο νερό σε περιπτώσεις υπερδοσίας ενώ υπάρχουν και αρκετές δικλείδες ασφαλείας για να μην κινδυνέψει το ζωικό κεφάλαιο, επιπρόσθετα οι ποσότητες των ουσιών που χρησιμοποιούνται είναι ελάχιστες καθώς υπάρχει η δυνατότητα μείωσης του όγκου νερού στις δεξαμενές. Σε επίπεδο όμως εντατικής εκτροφής σε ιχθυοκλωβούς θαλάσσης η πραγματικότητα είναι εντελώς διαφορετική. Ακόμη και οι μικροί ιχθυοκλωβοί (ᴓ 6m) έχουν βάθος περί τα 12 m. Για να μειωθεί ο χρόνος εφαρμογής και η ποσότητα της αντιπαρασιτικής ουσίας στο λουτρό, μειώνεται ο όγκος, ρηχαίνοντας το δίχτυ του κλωβού. Στη συνέχεια ο κλωβός καλύπτεται περιμετρικά με μουσαμά, ο οποίος εκτείνεται στα 4 με 5 μέτρα βάθος, για να περιορίσει την απώλεια του φαρμάκου και να εξασφαλίσει τη σωστή δράση. Αυτός ο χειρισμός δρα ως παράγοντας καταπόνησης για τα ήδη άρρωστα ψάρια, γιατί αυξάνεται γρήγορα η ιχθυοπυκνότητα. Εκείνη τη στιγμή το μόνο διαθέσιμο οξυγόνο είναι αυτό που υπάρχει διαλυμένο στο νερό και η ανανέωση του εξαρτάται από τη ροή των υδάτινων ρευμάτων (η οποία έχει περιοριστεί από τον μουσαμά. H παροχή οξυγόνου με φιάλες είναι επικουρική και τις περισσότερες φορές υπολείπεται στο να καλύψει τις πραγματικές ανάγκες του ζωικού κεφαλαίου σε οξυγόνο. Συνολικά σε έναν τέτοιο ζωοτεχνικό χειρισμό απαιτείται προεργασία μιας περίπου ώρας για τον κάθε κλωβό πριν από την εφαρμογή, ενώ το προσωπικό παραμένει κοντά στο κλωβό σε περίπτωση που χρειαστεί να επέμβει. Υπολογίζονται περί τις 6-8 εργατοώρες ανάλογα με το μέγεθος του κλωβού για να εφαρμοστεί το αντιπαρασιτικό με εμβάπτιση. Τα αποτελέσματα εξαρτώνται κάθε φορά από την ισχυρότητα των θαλάσσιων ρευμάτων, την εμπειρία του χειριστή και τον βαθμό παρασίτωσης, και είναι συνήθως μεικτά με την επαναμόλυνση να κυμαίνεται στις 5 με 7 ημέρες. 26

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο Mελέτη του βαθμού παρασίτωσης, της εποχικότητας και της παθολογίας των εξωπαρασιτώσεων 1.1 Υλικά και Μέθοδοι 1 ης Ενότητας 1.1.1 Περιοχές δειγματοληψιών εκτρεφόμενων πληθυσμών Συνολικά επιλέχθηκαν 3 μονάδες εκτροφής ευρύαλων μεσογειακών θαλάσσιων ιχθύων. Οι δύο πρώτες μονάδες εκτροφής εντοπίζονται στη περιοχή της λωρίδας Σαγιάδας Θεσπρωτίας (Ιόνιο Πέλαγος) και η τρίτη στην περιοχή του Μαλιακού Κόλπου πέριξ του διαύλου Ωρεών-Τρίκερι (Αιγαίο Πέλαγος). Ο βασικότερος λόγος επιλογής των συγκεκριμένων μονάδων εκτροφής ήταν για να εξασφαλιστεί κατά το δυνατότερο μια σαφέστερη εικόνα του παρασιτικού προφίλ των ψαριών και από τα δύο πελάγη της Ελλάδος. Η επιλογή της λωρίδας Σαγιάδας θεωρήθηκε ευθύς εξαρχής δεδομένη καθώς στη συγκεκριμένη περιοχή παράγονται σε ετήσια βάση πάνω από 3000 τόνοι ευρύαλων ψαριών από 12 μονάδες εκτροφής. Στη περιοχή του Διαύλου Ωρεών-Τρικερίου βρίσκονται 5 μονάδες εκτροφής με σαφώς μικρότερη ετήσια δυναμικότητα παραγωγής αλλά με όμοια χαρακτηριστικά εντατικής εκτροφής και ιχθυοφόρτισης με εκείνες της λωρίδας Σαγιάδας. Χαρτογράφημα 1. Απεικόνιση των περιοχών όπου έγιναν οι δειγματοληψίες (κόκκινοι κύκλοι). Δυτικά η περιοχή της λωρίδας Σαγιάδας και ανατολικά η περιοχή του Διαύλου Ωρεών-Τρικερίου. 27

1.1.2 Περιοχές δειγματοληψιών άγριων πληθυσμών και επιλογή ειδών Η αρχική σκέψη για την ορθότερη προσεγγιστική μεθοδολογία διερεύνησης της επιδημιολογίας των εξωπαρασίτων και της σχέσης μεταφοράς αυτών μεταξύ των άγριων και των εκτρεφόμενων πληθυσμών, ήταν όλα τα άγρια ψάρια της έρευνας να αλιεύονταν πέριξ των κλωβών εκτροφής. Έτσι παρατηρώντας το παρασιτικό προφίλ των άγριων ψαριών θα μπορούσε να εκτιμηθεί εάν τελικά αυτά λειτουργούν ως φορείς παρασίτων για τα εκτρεφόμενα. Η μεθοδολογία αυτή γρήγορα απορρίφθηκε καθώς μειονεκτούσε στο γεγονός πως δεν μπορούσε να ελεγχθεί η σχέση αιτίου-αιτιατού δηλαδή εάν τελικώς τα παράσιτα των άγριων πληθυσμών ήταν αυτά που μόλυναν τα εκτρεφόμενα ή το αντίστροφο. Για να έχει αυτή η μεθοδολογία διερευνητική αξία, θα πρέπει να πληρείται ένα σύνολο προϋποθέσεων όπου σε πραγματικές συνθήκες εκτροφής είναι αδύνατο να υπάρχουν ή να συνυπάρχουν, έτσι: Α) Θα πρέπει το σύνολο του ζωικού κεφαλαίου της υπό παρακολούθηση μονάδας εκτροφής να είναι ελεύθερο παρασίτων. Έτσι ώστε να μπορεί να ελεγχθεί εάν οι άγριοι πληθυσμοί είναι αυτοί οι οποίοι μολύνουν τους εκτρεφόμενους, π.χ. Σε θεωρητική μόλυνση εκτρεφόμενης σε κλωβό τσιπούρας με Lamellodiscus echeneis δεν θα μπορούμε ποτέ να εκτιμήσουμε εάν ο κύριος φορέας μετάδοσης είναι τα άγρια ψάρια εάν στο διπλανό κλωβό εκτρέφεται τσιπούρα στην οποία είχε εμφανιστεί όμοια παρασίτωση. Β) Η υπό παρακολούθηση μονάδα εκτροφής θα πρέπει να είναι απομονωμένη. Δηλαδή δε θα πρέπει να υπάρχει κοντά άλλη μονάδα εκτροφής η οποία μπορούσε δυνητικά να αποτελέσει δεξαμενή μόλυνσης των άγριων ψαριών με παράσιτα. Γ) Τα αλιευμένα άγρια ψάρια να μην αποτελούν διαφυγόντα άτομα εκτροφής. Πολλές φορές είναι πιθανό να διαφύγουν ψάρια εκτροφής για διάφορους λόγους (κακοκαιρία, σχισίματα διχτυών, ζωοτεχνικά λάθη). Τα ψάρια αυτά συνηθίζουν να μην απομακρύνονται από το σημείο και συνεχίζουν να μεγαλώνουν παραμένοντας κοντά στους κλωβούς εκτροφής. Έτσι υπάρχει ο κίνδυνος σε μια δειγματοληψία να αλιευθούν άγρια ψάρια τα οποία παλιά εκτρέφονταν. Φυσικά η παραπάνω προϋπόθεση έχει ισχύ μόνο για ψάρια (άγρια εκτρεφόμενα) όμοιου είδους. Τελικώς για να ξεπεραστούν οι παραπάνω περιορισμοί επιλέχθηκε μια προσεγγιστική δειγματοληψία κατά την οποία μπορούσε να διερευνηθεί το παρασιτικό προφίλ άγριων ψαριών χωρίς (ή ορθότερα με μειωμένο) το κίνδυνο 28

αλληλεπίδρασης των άγριων ψαριών με εκτρεφόμενα. Για το λόγο αυτό όλα τα άγρια ψάρια που μελετήθηκαν προέρχονταν από μηχανότρατες ανοικτής θάλασσας και μεγάλης αλιευτικής δυναμικότητας. Όλα τα ψάρια εκφορτώνονταν συσκευασμένα στην Ιχθυόσκαλα Κερατσινίου, όπου μετά από συνεννόηση με τους αλιείς μεταφέρονταν οδικώς την ίδια μέρα στο Εργαστήριο Ιχθυολογίας-Ιχθυοπαθολογίας του τμήματος Κτηνιατρικής Θεσσαλίας όπου και εξετάζονταν. 1.1.3 Παρασιτολογικές εξετάσεις 1.1.3.1 Παρασιτολογικές εξετάσεις δέρματος Για τις παρασιτολογικές εξετάσεις του δέρματος απαιτείται ενδελεχής παρατήρηση σε όλο το σώμα του ψαριού με μεγαλύτερη επιμονή στα σημεία των πτερυγίων και των βάσεων αυτών, καθώς επίσης και στη περιοχή της κεφαλής. Σε ψάρια ιδιαίτερης μορφολογίας (χριστόψαρο, καπόνι, σαλουβάρδος) και χρώματος (συκιός, σκορπίνα, μυλοκόπι), είναι προτιμότερη η επισκόπηση του δέρματος με τη βοήθεια μεγεθυντικού φακού με επαγόμενο φωτισμό. Από τη στιγμή εντοπισμού κάποιου παρασίτου, ο τρόπος μεταφοράς του σε αντικειμενοφόρο για παρατήρηση θα εξαρτηθεί από το μέγεθος και το είδος αυτού. Παράσιτα μεγάλου μεγέθους μπορούν με προσοχή να αποκολληθούν από το δέρμα με τη βοήθεια νυστεριού. Τα ισόποδα εξαιτίας του χιτινώδους περιβλήματος τους είναι πολύ ανθεκτικά σε πιέσεις και έτσι μπορούν να απομακρυνθούν και με λαβίδα. Παράσιτα μικρού μεγέθους είναι προτιμότερο να απομακρύνονται με ξέσμα με τη βοήθεια νυστεριού από το σημείο εντοπισμού αφού πρώτα ενυδατώσουμε τη περιοχή με θαλασσινό νερό ή σε περίπτωση που δεν υπάρχει θαλασσινό νερό με φυσιολογικό ορό. Ενυδάτωση με γλυκό νερό (0% Sal.), γίνεται μόνο σε ψάρια εσωτερικών υδάτων. Ο λόγος που βρέχουμε τη περιοχή είναι για να ενεργοποιήσουμε το παράσιτο να κινηθεί και για να λιπάνουμε τα σημεία μεταξύ των εξαρτημάτων προσάρτησης του παρασίτου και του δέρματος διευκολύνοντας έτσι την αποκόλληση του (Roberts, 1989). Από τη στιγμή που αποκολληθούν από το δέρμα, τα παράσιτα μεταφέρονται σε αντικειμενοφόρο πλάκα (διγενή Τρηματώδη, μονογενή, κεστώδη, κωπήποδα), ή σε τριβλίο (μεγάλα ισόποδα, μεγάλα κωπήποδα) για παρατήρηση και ταυτοποίηση. 29

1.1.3.2 Παρασιτολογικές εξετάσεις βραγχίων Η εξέταση των βραγχίων έγινε με μεθόδους βασιζόμενες στην εργασία της Αθανασοπούλου (1990). Αρχικά αφαιρείται από τη μια πλευρά το βραγχιακό επικάλυμμα για να αποκαλυφθούν τα σύστοιχα βραγχιακά τόξα. Με ένα ψαλίδι αποκόπτεται εκατέρωθεν το 1 ο βραγχιακό τόξο και τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Διαβρέχουμε το βραγχιακό τόξο με θαλασσινό νερό ή φυσιολογικό ορό και επισκοπούμε για τυχόν παρουσία μεγάλων παρασίτων. Εάν εντοπιστούν μεγάλα παράσιτα, τότε αυτά αφαιρούνται και μεταφέρονται σε τριβλίο για ταυτοποίηση. Το βράγχιο συγκρατείται με λαβίδα από τον χόνδρο και με τη βοήθεια νυστεριού γίνεται ξέσμα ασκώντας τόση πίεση στα πρωτογενή βραγχιακά νημάτια όση απαιτείται έτσι ώστε να αποκολληθεί ο επιθηλιακός ιστός χωρίς αυτά να κοπούν. Το τελικό νωπό παρασκεύασμα θα πρέπει να έχει κατά το δυνατόν λιγότερα πρωτογενή νημάτια και περισσότερο επιθηλιακό βραγχιακό ιστό. Τα περισσότερα παράσιτα προσαρτώνται στο επιθήλιο και όχι στον χόνδρο, έτσι αποκολλώντας το επιθήλιο συμπαρασύρονται μαζί και τα παράσιτα (Noga, 2000). Η ίδια διαδικασία συνεχίζεται και για τα υπόλοιπα βραγχιακά τόξα εκατέρωθεν των πλευρών. Τα παράσιτα καταγράφονται, καταμετρώνται και ταυτοποιούνται. Τα μεγάλα παράσιτα που βρίσκονται στα τριβλία παρατηρούνται κάτω από στερεοσκόπιο. 1.1.3.3 Παρασιτολογικές εξετάσεις στοματικής κοιλότητας Αρκετά παράσιτα εντοπίζονται συχνότερα σε ιδιαίτερα σημεία του σώματος όπως στη στοματική κοιλότητα και στον εσωτερικό περιβραγχιακό χώρο. Για τον εντοπισμό αυτών των παρασίτων γίνεται αποκοπή του στόματος αμφίπλευρα και διάνοιξη της στοματικής κοιλότητας. Σε αρκετά βαθύβια ψάρια η στοματική κοιλότητα και ιδιαίτερα ο περιβραγχιακός χώρος φέρουν υπολείμματα άμμου και διάφορων βενθικών υλικών. Εξαιτίας αυτού το γεγονότος στα συγκεκριμένα ψάρια πρώτα αφαιρούνται και εξετάζονται τα βράγχια ενώ στη συνέχεια ξεπλένεται η στοματική κοιλότητα αφαιρώντας κατά το δυνατόν αυτά τα υπολείμματα. Τα παράσιτα που εντοπίζονται συνήθως στη στοματική κοιλότητα είναι ισχυρά προσαρτημένα στο στοματικό επιθήλιο, έτσι δεν υπάρχει κίνδυνος να αποκολληθούν με το νερό. Ο λόγος που πρώτα αφαιρούνται τα βράγχια είναι γιατί σε αντίθεση με τα 30

παράσιτα του στόματος, εκείνα των βραγχίων είναι εύκολο να αποκολληθούν και για αυτό τον λόγο αφαιρούνται προ της πλύσης. Από τη στιγμή που θα εντοπιστεί κάποιο παράσιτο αφαιρείται είτε με νυστέρι (στη περίπτωση κωπήποδων), είτε με λαβίδα (στη περίπτωση ισόποδων)(noga 2000, Roberts 1989, υπό τροποποίηση). 1.1.3.4 Παρασιτολογικές εξετάσεις πεπτικού συστήματος Αν και τα παράσιτα του πεπτικού συστήματος δεν μπορούν να θεωρηθούν εξωπαράσιτα, είναι πολλές οι φορές εκείνες όπου σε μια εξέταση νωπών επιχρισμάτων βραγχίων εντοπίζονται αυγά διγενών προσαρτημένα στα πρωτογενή νημάτια, ή ακόμη και ανήλικα διγενή που μόλις έχουν εκκολαφθεί. Τα παράσιτα αυτά αν και στα βράγχια δεν προκαλούν παθολογικές καταστάσεις, εισχωρούν μέσω του πεπτικού και εγκαθίστανται σε διάφορα σημεία αυτού προκαλώντας ισχυρές αλλοιώσεις. Εκτός από τα αυγά των διγενών, συχνά παράσιτα αποτελούν και τα διγενή του γένους Didymocystis τα οποία είναι παράσιτα των βραγχίων όμως στα ανώριμα στάδια τους εντοπίζονται στο έντερο. Έτσι στη παρούσα έρευνα συμπεριλήφθηκαν και τα διγενή Τρηματώδη με παρασιτολογικό έλεγχο του πεπτικού συστήματος. Η κοπρανολογικές εξετάσεις που χρησιμοποιούνται ευρέως στον άνθρωπο και στα ζώα έχουν μικρή εφαρμογή στα ψάρια καθώς οι περισσότερες από αυτές στοχεύουν στη παρατήρηση κυρίως αυγών νηματωδών, κεστωδών και λιγότερο τρηματωδών παρασίτων. Η μεθοδολογία τους βασίζεται κατά κύριο λόγο σε τεχνικές επίπλευσης κατά τις οποίες μόνο τα αυγά των μεταζώων και τα πρωτόζωα μπορούν να ανιχνευθούν (μέθοδος εμπλουτισμού, Faust, Ritchie, Teleman, McMaster, Wisconsin), οι οποίες όμως στη περίπτωση των παρασίτων ψαριών είναι μικρής διαγνωστικής αξίας, διότι τα αυγά των θαλάσσιων διγενών τρηματωδών έχουν ελάχιστες μορφολογικές διαφορές μεταξύ τους καθιστώντας τη ταυτοποίηση πρακτικά αδύνατη. Για το λόγο αυτό η περισσότερο ασφαλής μέθοδος εντοπισμού παρασίτων είναι με απευθείας ξέσμα του εντέρου, του στομάχου και των πυλωρικών τυφλών, για την άμεση παρατήρηση των ώριμων παρασίτων. Πιο συγκεκριμένα, ακολουθώντας τις βασικές τεχνικές νεκροψίας (Noga, 2000), αποκαλύπτουμε το έντερο και αφού το αποπλέξουμε κόβουμε στο σημείο σύνδεσης του με την έδρα συγκρατώντας παράλληλα το άκρο με μια αιμοστατική λαβίδα. Αποκόπτουμε τη πρόσθια μοίρα του 31

εντέρου μετά το στόμαχο και το αφαιρούμε εξολοκλήρου. Στην συνέχεια κόβουμε ένα κομμάτι ξεκινώντας από όποια πλευρά του εντέρου προτιμάμε. Το μέγεθος του κομματιού καθορίζεται από τη διάμετρο του αυλού του εντέρου και το περιεχόμενο. Το κομμάτι αφήνεται σε αντικειμενοφόρο πλάκα και κρατώντας με λαβίδα τη μια άκρη, πιέζουμε ισχυρώς με ένα νυστέρι μετακινώντας το από τη μεριά της λαβίδας προς την ελεύθερη άκρη. Έτσι το περιεχόμενο του εντέρου αδειάζει εντελώς στην αντικειμενοφόρο πλάκα συμπαρασύροντας και όλα τα παράσιτα. Το άδειο έντερο που απομένει απορρίπτεται. Προσθέτουμε φυσιολογικό ορό και απλώνουμε το περιεχόμενο του εντέρου με το νυστέρι στην αντικειμενοφόρο. Τοποθετούμε μια επικαλυπτρίδα και σαρώνουμε το σύνολο επιχρίσματος κάτω από οπτικό μικροσκόπιο. Επαναλαμβάνουμε την ίδια διαδικασία κόβοντας το έντερο, το στόμαχο και τα πυλωρικά τυφλά σε όσα κομμάτια χρειάζεται για να εξεταστούν συνολικά. Πρόκειται για επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία η οποία όμως εξασφαλίζει ακριβή ποιοτική και ποσοτική καταμέτρηση του παρασιτικού φορτίου. 1.1.4 Χρωματισμός παρασίτων 1.1.4.1 Χρώση παρασίτων Για τις χρώσεις των παρασίτων έχουν προταθεί αρκετά διαφορετικά πρωτόκολλα τα οποία διαφοροποιούνται ανάλογα με το είδος του παρασίτου. Η πιο άμεση και αποτελεσματική μέθοδος χρώσης είναι με χρήση διαλύματος ακετοκαρμίνης. Βιβλιογραφικά εντοπίζονται πάνω από 6 διαφορετικές τροποποιήσεις της κύριας χρωστικής (Καρμίνης) για τη χρώση μονογενών και διγενών παρασίτων. Στη παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν 2 παραλλαγές, α) διάλυμα ακετοκαρμίνης (1%) και β) διάλυμα ακετοκαρμίνης 1% παρουσία FeCl 2. Η δεύτερη μέθοδος αν και προτιμάται σε πολλές εργασίες, στην παρούσα έρευνα θεωρούμε πως παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα σε σύγκριση με τη πρώτη μέθοδο και αυτό γιατί ο χλωριούχος σίδηρος αντιδρά με το θαλασσινό νερό σχηματίζοντας σκουρόχρωμα σωματίδια τα οποία περιορίζουν σημαντικά τη διακριτικότητα. Η εφαρμογή της χρώσης μπορεί να γίνει άμεσα στο νωπό επίχρισμα ή ακόμη και σε μονιμοποιημένο παράσιτο. Στο νωπό επίχρισμά το υπό εξέταση παράσιτο μεταφέρεται σε αντικειμενοφόρο πλάκα στην οποία έχει προηγουμένως προστεθεί 32