Mοντέλο αιμοποίησης. Nature Medicine 2015

αιμοσφαιρινοπάθειες

Mοντέλο αιμοποίησης Nature Medicine 2015

Το αμφίκοιλο σχήμα και τα χαρακτηριστικά της μεμβράνης των ερυθροκυττάρων δίνουν τη δυνατότητα στα ερυθροκύτταρα να ανταλλάσουν καλύτερα τα αέρια O 2 και CO 2 και να διαπερνούν διαμέσου των τριχοειδών αγγείων με μεγαλύτερη ευκολία, καθώς η διάμετρος αυτών είναι περίπου 3 μm. Η διάρκεια ζωής των ερυθροκυττάρων υπολογίζεται ότι είναι 120 ημέρες. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ~ 1% των ερυθροκυττάρων συντίθεται καθημερινά, ενώ σε παθολογικές καταστάσεις η σύνθεση αυτών μπορεί να αυξάνεται ή να μειώνεται

υποξία

ρόλος της ερυθροποιητίνης (ΕPO) παρεμποδίζει την απόπτωση των πρόδρομων μορφών ερυθροκυττάρων, ενισχύει το σχηματισμό των ερυθροβλαστών, Διεγείρει την επιβίωση και διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων παρεμποδίζει την καταστροφή των ώριμων ερυθροκυττάρων

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ Κύρια πρωτεΐνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων 64.4 kda Κύρια λειτουργία: Μεταφορά Ο2 από τους πνεύμονες στους ιστούς 2 ζεύγη ανόμοιων αλυσίδων-σφαιρινών και 4 μόρια αίμης (www.baileybio.com) Διπλωματική εργασία (Master Τhesis) : Λαμπρινή Τζίκαλου

Η αιμοσφαιρίνη βρίσκεται μέσα στα ερυθροκύτταρα ιδανικό όχημα για τη μεταφορά της σε μεγάλη ποσότητα συγκέντρωση στο αίμα 13-15 g/dl

http://bio.chem.niu.edu/resources/templates/hemoglobin/deoxy/tasks.htm

Οργάνωση γονιδίων αιμοσφαιρίνης Γενετικός τόπος γονιδίων α-σφαιρίνης Γενετικός τόπος γονιδίων β-σφαιρίνης

Είδη αιμοσφαιρινών στον άνθρωπο στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια α 2 β 2 = ΗbA α 2 γ 2 = HbF Διαφέρουν στη συνδετική ικανότητα με το οξυγόνο Wood W.G. Br. Med. Bull 32(3): 282-287,1976

Koolman, Rohm, 2004 J Clin Invest. 2005 June 1; 115(6): 1470 1473

Βlood 69 (1): 1-6 οι ελεύθερες β- αλυσίδες έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν ομοτετραμερή (β4) οι ελεύθερες α- αλυσίδες είναι πάρα πολύ ασταθείς και τείνουν να καθιζάνουν και να καταστρέφουν τη μεμβράνη των πρόδρομων ερυθροκυττάρων, προκαλώντας την απόπτωσή τους, γεγονός που οδηγεί σε μη αποτελεσματική ερυθροποίηση

Το 2002 ανακαλύφθηκε μια ερυθροειδική πρωτεΐνη, AHSP (Alpha-Hemoglobin Stabilizing Protein), η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη συγκρότηση του μορίου της αιμοσφαιρίνης καθώς λειτουργεί ως μοριακή συνοδός που παρεμποδίζει την καθίζηση των ελεύθερων α αλυσίδων ύστερα από αλληλεπίδραση με αυτές και σταθεροποίηση τους.

Παρουσία των αλυσίδων β-, το σύμπλεγμα α-ahsp διαχωρίζεται και οι β- αλυσίδες συνδέονται με τις α- αλυσίδες για το σχηματισμό ΗbΑ Μονοπάτια συγκρότησης του μορίου της HbA - ρόλος της AHSP πρωτεΐνης (Mollan, Yu et al. 2010 Antioxid Redox Signal 12 (2): 219-231, Favero and Costa 2011) Biochem Res Int

Φυσιολογικοί Δείκτες Ερυθροκυττάρων MCV= 80-100 fl (mean corpuscular volume: μέσος όγκος ερυθροκυττάρων) MCH= 27-32 pg (mean corpuscular hemoglobin: μέση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης / ερυθροκύτταρο) MCHC= 32-36 g/dl [mean corpuscular hemoglobin concentration: μέση συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης σε δεδομένο όγκο πακεταρισμένων ερυθρών αιμοσφαιρίων ή Hgb X 100 / Hct [hemoglobin (X 100) divided by hematocrit)]

Αιμοσφαιρινοπάθειες Όλες οι διαταραχές του μορίου της αιμοσφαιρίνης γενετικής προέλευσης 7 % του παγκόσμιου πληθυσμού αποτελεί φορείς, ενώ κάθε χρόνο έχουμε ~ 340.000 γεννήσεις παιδιών με αιμοσφαιρινοπάθειες Χωρίζονται σε δύο κατηγορίες:

1. Δομικές αλλαγές του μορίου της αιμοσφαιρίνης Χαρακτηρίζονται από αντικατάσταση της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης από μία παθολογική Π.χ. η Δρεπανοκυτταρική αναιμία Sickle Cell Disease που οφείλεται σε μια απλή σημειακή μετάλλαξη στο 17 ο νουκλεοτίδιο της «κωδικής» περιοχής (coding sequence, CDS) του γονιδίου της β-σφαιρίνης (Τ Α) με αποτέλεσμα να παράγεται η παθολογική αιμοσφαιρίνη HbS όπου το υδρόφιλο, αρνητικά φορτισμένο γλουταμινικό οξύ (6 ο αμινοξύ) αντικαθίσταται E με το υδρόφοβο αμινοξύ βαλίνη V

Σε καταστάσεις υποξίας, Η αιμοσφαιρίνη HbS (α2βs2) πολυμερίζεται και αυτό είναι που διαταράσσει τη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων και, που με τη σειρά του οδηγεί σε αιμόλυση, ισχαιμία των ιστών και δυσλειτουργία των οργάνων (Rees, Williams et al. 2010, Odievre, Verger et al. 2011). τα ερυθροκύτταρα παίρνουν χαρακτηριστικό δρεπανοειδές σχήμα και δεν ρέουν ομαλά μέσα στα μικρά αιμοφόρα αγγεία, (εν αντιθέσει με τα φυσιολογικά δισκοειδή ερυθροκύτταρα), με αποτέλεσμα τα αγγεία να αποφράζονται και να προκαλείται πόνος και βλάβη στα διάφορα όργανα (Olowoyeye and Okwundu 2012)

http://microbeonline.com/relationship-sickle-cell-anemia-malaria/ Η μετάλλαξη (Ε6V) έδινε πλεονέκτημα στα άτομαφορείς να προστατεύονται από τις συνέπειες προσβολής από το Plasmodium falciparum που προκαλεί την ελονοσία. Τα μεταναστευτικά κύματα των πολιτών οδήγησαν στην εξάπλωση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας σε όλο τον κόσμο (Rappaport, Velazquez et al. 2004, Kohne 2011, Papadopoulou and Tsiftsoglou 2013)

Σε ετερόζυγη κατάσταση η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι ασυμπτωματική. Ωστόσο κάποιες επιπλοκές μπορεί να εμφανιστούν σε συνθήκες υποξίας ή ύστερα από άνοδο σε απότομα ύψη. Λόγω της εκλεκτικής σύνδεσης της α-σφαιρίνης με τη φυσιολογική β-σφαιρίνη, η συγκέντρωση της HbA S είναι πολύ μικρότερη από 50%.

Σε ομόζυγη κατάσταση, Η κλινική εικόνα της HbS περιλαμβάνει χρόνια αιμολυτική αναιμία μέτριας ή σοβαρής έντασης, επώδυνα επεισόδια αγγειακής απόφραξης, μόνιμο κίνδυνο λοιμώξεων, εγκεφαλικά επεισόδια και πολλά άλλα σοβαρά προβλήματα σε διάφορα όργανα.

HPLC ανάλυση φυσιολογικών και παθολογικών δειγμάτων Δρεπανοκυτταρική (Μεταγγιζόμενος)

Θεραπευτική Αντιμετώπιση Eνυδάτωση Αντιβίωση για τις λοιμώξεις Mετάγγιση (όταν χρειάζεται) Χορήγηση οξυγόνου σε καταστάσεις υποξίας [κορεσμός σε οξυγόνο (Saturation O2) <92%]

Το ανθρώπινο γονίδιο της γ-σφαιρίνης στο έμβρυο είναι υπομεθυλιωμένο και μεταγράφεται, ενώ μετά τον 6 ο μήνα από τη γέννα, (που αρχίζει η έκφραση του γονιδίου της β-σφαιρίνης), το γ-γονίδιο μεθυλιώνεται και παραμένει «σιωπηλό»

Η υδοξυουρία (HU, hydroxycarbamide) είναι ένας αντιμεταβολίτης (inhibits DNA synthesis through the inhibition of ribonucleoside diphosphate reductase) και θεωρείται φάρμακο επιλογής για τους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, λόγω αύξησης των επιπέδων της HbF approved by FDA to stimulate HbF synthesis α2γ2 (HbF) and α2γβs tetramers are not involved in the polymerization process, induced by α2βs2 (HBS)

Γεωγραφική κατανομή της SCD

2. Διαταραχές στη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης π.χ. θαλασσαιμίες Χαρακτηρίζονται από ανεπαρκή σύνθεση των α- ή β- σφαιρινών α- και β- θαλασσαιμία

α-θαλασσαιμία 5% του παγκόσμιου πληθυσμού, ελάττωση συγκέντρωσης του τετραμερούς HbA και περίσσεια των αλυσίδων γ- και β- σφαιρίνης Η σύνθεση των α-αλυσίδων ελέγχεται από δύο γονίδια που εδράζονται στο χρωμόσωμα 16 απαλειφές των α-γονιδίων μειώνουν (α + ) ή οδηγούν σε μηδενική παραγωγή (α 0 ) των α-αλυσίδων 2012). (Harteveld and Higgs 2010, Vichinsky

http://calgaryguide.ucalgary.ca/systems/alpha%20thalassemia%20pathogenesis.jpg

ρωμόσωμα 16 Φυσιολογική Ασυμπτωματική Ασυμπτωματική ήπια μικροκυτταρική αναιμία (β 4 ) (γ 4 ) ασύμβατη με τη ζωή (Vichinsky 2012) Υψηλή δεσμευτική ικανότητα οξυγόνου Μειωμένη απόδοση οξυγόνου στους ιστούς

HbH: ενδιάμεση α-θαλασσαιμία η κλινική εικόνα ποικίλει από ήπια μέχρι πολύ σοβαρή αναιμία προληπτική θεραπεία για πιθανές επιπλοκές της ασθένειας: διόγκωση του σπλήνα, υπερφόρτωση σιδήρου υποστηρικτική θεραπεία για διάφορες εμπύρετες λοιμώδεις ασθένειες

β-θαλασσαιμία ή Μεσογειακή Αναιμία Περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1925 από τους Thomas Cooley και Pearl Lee >300 γονιδιακές μεταλλάξεις (σημειακές, ελλείψεις, προσθήκες, αναστροφές) στο γονίδιο της β-σφαιρίνης (http://globin.cse.psu.edu/hbvar/menu.html) 1. περιορισμένη σύνθεση β-σφαιρίνης= β -θαλασσαιμία 2. μηδενική σύνθεση β-σφαιρίνης = β -θαλασσαιμία ο +

http://calgaryguide.ucalgary.ca/systems/pathogenesis%20of%20beta%20thalassemia.jpg

Κλινικοί Φαινότυποι β-θαλασσαιμίας 1. Ετερόζυγη β-θαλασσαιμία 2. Ενδιάμεση β-θαλασσαιμία 3. Ομόζυγη β-θαλασσαιμία (α 2 δ 2 ) Διπλωματική εργασία (Master Τhesis) : Λαμπρινή Τζίκαλου (Cao and Galanello 2010).

Ετερόζυγη β-θαλασσαιμία ασυμπτωματική διαταραχή ανωμαλίες στη μορφολογία των ερυθροκυττάρων μικρή ή καθόλου αναιμία Η εξέταση επιχρίσματος αίματος μικροκυττάρωση (μείωση του όγκου των ερυθροκυττάρων καθώς και υποχρωμία που οφείλεται σε μειωμένη συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια). απαραίτητη η διάγνωσή τους καθώς υπάρχει 25% πιθανότητα ένα ζευγάρι φορέων να αποκτήσει παιδί με Μεσογειακή αναιμία (Galanello and Origa 2010). Urbinati, Madigan et al. 2006

Ενδιάμεση β-θαλασσαιμία ~10% των ασθενών με β-θαλασσαιμία μέτρια αναιμία και μεγάλη ετερογένεια στο αιματολογικό τους προφίλ, ενώ η κλινική εικόνα αυτών εμφανίζεται ανάμεσα στα 2 με 4 χρόνια της ζωής τους. ευρύ κλινικό φάσμα που κυμαίνεται ανάμεσα στην ασυμπτωματική κατάσταση και την εξαρτώμενη από μεταγγίσεις μεσογειακή αναιμία. Η πλειονότητα των ασθενών αυτών θα χρειαστούν κάποια στιγμή στη ζωή τους μετάγγιση, ιδιαίτερα σε καταστάσεις όπου οι αιμολυτικές κρίσεις μπορεί να οδηγήσουν σε οξείες λοιμώξεις αλλά και σε περίπτωση εγκυμοσύνης.

Ενδιάμεση β-θαλασσαιμία (Cao and Galanello 2010, Galanello and Origa 2010). Οι κλινικές εκδηλώσεις των ασθενών αυτών είναι ωχρότητα, ίκτερος, διόγκωση του ήπατος και του σπλήνα, σκελετικές ανωμαλίες, με τάση για οστεοπενία και οστεοπόρωση που οφείλονται κατά κύριο λόγο σε 3 σημαντικούς παράγοντες: 1) τη μη αποτελεσματική ερυθροποίηση 2) τη χρόνια αιμολυτική αναιμία και 3) την υπερφόρτωση με σίδηρο Η θεραπεία όλων των παραπάνω επιπλοκών στηρίζεται σε συμπτωματική θεραπεία: μεταγγίσεις, σπληνεκτομή και συμπληρώματα φολικού οξέος, ενώ θα πρέπει να είναι εξατομικευμένη κάθε φορά λόγω της μεγάλης κλινικής ετερογένειας

Ομόζυγη β-θαλασσαιμία ή Μεσογειακή Αναιμία Οι ασθενείς με ομόζυγη β-θαλασσαιμία εκδηλώνουν την ασθένεια από το πρώτο έτος της ζωής τους με επίπεδα αιμοσφαιρίνης <7,0 g/dl, δεν μπορούν να ζήσουν χωρίς την υποστηρικτική θεραπεία των μεταγγίσεων παρά μόνο μέχρι την πρώτη ή δεύτερη δεκαετία της ζωής τους, το αιματολογικό τους προφίλ δείχνει Αναιμία Υποχρωμία Μικροκυττάρωση στα ερυθροκύτταρα (Higgs, Engel et al. 2012).

Παθοφυσιολογία της β-θαλασσαιμίας 1. Μειωμένη σύνθεση αιμοσφαιρίνης, 2. Υποχρωμία, 3. Μικροκυττάρωση 4. Έλλειψη ισορροπίας μεταξυ α και β αλυσίδων 5. ΜΗ αποτελεσματική ερυθροποίηση 6. Αιμόλυση 7. Αναιμία

Η περίσσεια των α-αλυσίδων που συντίθενται κανονικά, καθιζάνει : α) στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα του μυελού των οστών, προκαλώντας μη αποτελεσματική ερυθροποίηση αλλά και β) στα ώριμα ερυθροκύτταρα, οδηγώντας σε καταστροφή των μεμβρανών τους και αιμόλυση Ο μικρότερος χρόνος ζωής των RBCs και η αιμόλυση (10-15 x faster destruction) απελευθερώνουν ΕΛΕΥΘΕΡΟ ΣΙΔΗΡΟ στο πλάσμα

(ΙΕ) Μη αποτελεσματική ερυθροποίηση λόγω μειωμένης διαφοροποίησης και αύξησης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης

Η κλινική εικόνα των ασθενών με Μεσογειακή αναιμία (Rund and Rachmilewitz 2005) Την κλασική κλινική εικόνα της ομόζυγης β- θαλασσαιμίας μπορεί να τη δει κανείς σήμερα μόνο σε αναπτυσσόμενες χώρες, όπου τα προγράμματα μεταγγίσεων δεν είναι συνεχώς διαθέσιμα. Τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των ατόμων αυτών: καθυστέρηση ανάπτυξης, ωχρότητα, ίκτερος, Ηπατοσπληνομεγαλία σκελετικές ανωμαλίες που προκύπτουν από την επέκταση του μυελού των οστών. Η υπερφόρτωση σιδήρου οδηγεί σε προβλήματα στην λειτουργία της καρδιάς (αρρυθμίες), στο ήπαρ (κίρρωση) και στους ενδοκρινείς αδένες (διαβήτης, υπογοναδισμός, προβλήματα στο θυρεοειδή και παραθυρεοειδή αδένα) (Cao and Galanello 2010, Galanello and Origa 2010). Διπλωματική εργασία (Master thesis): Tζικαλου Λαμπρινή

Ομόζυγη β-θαλασσαιμία ή Μεσογειακή Αναιμία αν με τις μεταγγίσεις επιτευχθούν επίπεδα HbA > 9,5-10,5 g/dl, η ανάπτυξη των ασθενών είναι φυσιολογική και χωρίς ιδιαίτερα προβλήματα μέχρι την ηλικία των 10 χρόνων. Μετά, εμφανίζονται επιπλοκές που σχετίζονται με την υπερφόρτωση σιδήρου λόγω των συχνών μεταγγίσεων κυρίως, διάφορα καρδιακά προβλήματα,

In normal RBCs, oxidation of HbA leads to methaemoglobin, but balanced levels of reduced / oxidized glutathione reverse the phenotype Color Atlas of Biochemistry, 1996 Koolman J and Rohm Klaus-Heinrich

Ιn contrast, oxidation of unpaired α- globin chains in thalassemic RBCs form haemichromes (α-globin/heme aggregates) Α : 4321-4330

Kαταβύθιση των haemichromes οδηγεί σε: a) Καταστροφή της ακεραιότητας της μεμβράνης των RBCs b) Αλλαγή της σύνθεσης της μεμβράνης των RBCs c) Αύξηση της φαγοκυττάρωσης των RBCs από τα μακροφάγα d) MH φυσιολογική ροή των RBCs

Παθοφυσιολογία της β-θαλασσαιμίας εξωμυελική ερυθροποίηση, και σπληνομεγαλία, που επιδεινώνει την αναιμία επέκταση του μυελού των οστών, αυξημένη συσσώρευση του σιδήρου σε διάφορους ιστούς (Galanello and Origa 2010) (Higgs, Engel, Stamatoyannopoulos 2012) Lancet 379(9813) : 373-383

φαινότυπος της β-θαλασσαιμίας, βελτιώνεται όταν μειωθεί η ΜΗ εξισορροπημένη παραγωγή α- / μη α- αλυσίδων σφαιρίνης που οδηγεί σε ελαχιστοποίηση της καθίζησης των α-αλυσίδων στα ερυθροκύτταρα (RBCs)

Πράγματι, ο φαινότυπος της β-θαλασσαιμίας βελτιώνεται όταν έχουμε: 1. συν-κληρονόμηση μεταλλάξεων στο γονίδιο της α- σφαιρίνης, που σχετίζονται με α-θαλασσαιμία, με άμεσο αποτέλεσμα τη μείωση των α αλυσίδων που παράγονται. 2. συν-κληρονόμηση οποιασδήποτε διαταραχής που οδηγεί σε αυξημένη σύνθεση της γ-σφαιρίνης, όπως συμβαίνει στην περίπτωση της Κληρονομικής Παραμονή της Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης (HPFH). Στην HPFH, οι επιπλέον αλυσίδες της γ-σφαιρίνης συνδέονται με την περίσσεια των α-αλυσίδων και σχηματίζουν την εμβρυική HbF αιμοσφαιρίνη (α 2 γ 2 ), κάτι που έχει διπλό αποτέλεσμα καθώς αυξάνεται και η παραγωγή μιας λειτουργικής αιμοσφαιρίνης (αν και δεσμεύει αρκετά ισχυρά το οξυγόνο) αλλά και μειώνεται η περίσσεια των α- αλυσίδων (Cao and Galanello 2010).

Διάγνωση β-θαλασσαιμίας Η διάγνωση της β-θαλασσαιμίας μπορεί να γίνει σε 3 διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης: στο προγεννητικό, στο εμβρυικό και στο στάδιο της ενήλικης ζωής

Διάγνωση β-θαλασσαιμίας οι μέθοδοι βασίζονται στην εκτίμηση μιας γενικής εξέτασης αίματος, της μορφολογίας των ερυθρών καθώς και Μια γενική εξέταση αίματος δίνει πληροφορίες για ορισμένους σημαντικούς δείκτες το ποσό της αιμοσφαιρίνης, ο αριθμός των ερυθροκυττάρων, ο μέσος όγκος ερυθρών της μέτρησης-αξιολόγησης των διάφορων κλασμάτων αιμοσφαιρίνης. (Fucharoen and Winichagoon 2012). Clarke and Higgins 2000, Fucharoen and Winichagoon 2012).

Διάγνωση β-θαλασσαιμίας Η μέθοδος της ηλεκτροφόρησηςσε πηκτές αγαρόζης σε αλκαλικό ph (8.4) και σε όξινο ph (6.2). αποτελεί εξέταση ρουτίνας για την ταυτοποίηση των διαφόρων κλασμάτων αιμοσφαιρίνης. ηλεκτροφόρηση π.χ. διαχωρισμός της HbS από τα άλλα κλάσματα αιμοσφαιρινών με την ίδια κινητικότητα με αυτήν. πολύ χρονοβόρα μέθοδος και παράλληλα ανακριβής στην ποσοτικοποίηση των κλασμάτων αιμοσφαιρίνης που βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση.

Διάγνωση β-θαλασσαιμίας Κύρια μέθοδος η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC), η οποία παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Η μέθοδος αυτή, συγκεκριμένα η χρωματογραφία αναταλλαγής κατιόντων (CE-HPLC), μπορεί και να ανιχνεύει και να ποσοτικοποιεί τα διάφορα φυσιολογικά (HbA 2 και HbF) και μη φυσιολογικά κλάσματα αιμοσφαιρίνης καθώς επίσης και να προσδιορίζει την τιμή της γλυκοσυλιωμένης (HbA 1c ) αιμοσφαιρίνης, κάτι που μπορεί να υποδείξει την ύπαρξη σακχαρώδους διαβήτη (Clarke and Higgins 2000, Wajcman and Moradkhani 2011).

HPLC ανάλυση φυσιολογικών και παθολογικών δειγμάτων Δρεπανοκυτταρική (Μεταγγιζόμενος) Μεταγγιζόμενος

Διάγνωση β-θαλασσαιμίας μέθοδοι μοριακής διαγνωστικής δίνουν τη δυνατότητα ανίχνευσης του γονοτύπου που προκύπτει από τις μεταλλάξεις του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Οι μέθοδοι αυτοί είναι πολύ χρήσιμοι κατά την προγεννητική διάγνωση καθώς μπορούν να προβλέψουν το φαινότυπο και να οδηγήσουν σε σωστό σχεδιασμό της θεραπείας των ασθενών. Στις τεχνικές αυτές ανήκουν διάφορα είδη αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και αλληλουχισης του γενετικού υλικού (Clarke and Higgins 2000, Fucharoen and Winichagoon 2012).

beta thalassemia is recognized after the 6th month postnatally, since the inability of transition to HbA make hemolytic anemia to be appeared. The transition from HbF to HbA begins before birth and by the 6th month postnatally all healthy adults have mainly the HbA (>> 90%).

Θεραπεία της Μεσογειακής Αναιμίας Συμπτωματική θεραπεία: Μεταγγίσεις αίματος Αποσιδήρωση (π.χ. δεφεριπρόνη) Σπληνεκτομή Επαγωγή σύνθεσης της HbF (π.χ. υδροξυουρία) Ριζική θεραπεία: Μεταμόσχευση μυελού των οστών από συμβατό δότη Μελλοντικές θεραπείες

Μεταγγίσεις Patients with beta thalasemia major (hemoglobin levels lower than 70 g/l) need long life safe, compatible to avoid alloimmunization, fresh units of RBCs (leucocyte reduced) transfusions every 2nd to 4th week to correct anemia Στόχος των μεταγγίσεων αποτελεί η διόρθωση της αναιμίας, patients with thalassemia major type develop severe anemia (30 g/l) and die soon η καταστολή της ερυθροποίησης και η παρεμπόδιση της γαστρεντερικής απορρόφησης του σιδήρου.

η ποσότητα του αίματος που μεταγγίζεται εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του βάρους του ασθενούς και της τελικής συγκέντρωσης της αιμοσφαιρίνης που θέλουμε να επιτύχουμε, η οποία για τους ενήλικες είναι 9-14 g/dl και για τα παιδιά είναι 10-13 g/dl. πριν από την πρώτη μετάγγιση, θα πρέπει να προσδιορίζεται η ομάδα αίματος των ασθενών ως προς το σύστημα ABO και Rh και οι ασθενείς να εμβολιάζονται τουλάχιστον έναντι της ηπατίτιδας Β (Galanello and Origa 2010, Rachmilewitz and Giardina 2011). η απόφαση να ξεκινήσουν οι συστηματικές μεταγγίσεις δεν πρέπει να καθυστερήσει, κυρίως, λόγω 1.της πιθανότητας ανάπτυξης αντισωμάτων ενάντι των ερυθροκυττάρων με αποτέλεσμα να αντιμετωπίζεται δυσκολία στην εύρεση συμβατών αιμοδοτών 2. πριν «μειωθούν σημαντικά» τα επίπεδα της HbF : ~ 1 ο έτος της ζωής

Θεραπεία της Μεσογειακής Αναιμίας Συμπτωματική θεραπεία: Μεταγγίσεις αίματος Αποσιδήρωση (π.χ. δεφεριπρόνη) Σπληνεκτομή Επαγωγή σύνθεσης της HbF (π.χ. υδροξυουρία) Ριζική θεραπεία: Μεταμόσχευση μυελού των οστών από συμβατό δότη

Θεραπεία αποσιδήρωσης Οι ασθενείς που εξαρτώνται από τις μεταγγίσεις οδηγούνται σε υπερσυσσώρευση σιδήρου και, καθώς δεν διαθέτουν κάποιο μηχανισμό για τη απομάκρυνση της περίσσειας του σιδήρου, απαιτούν θεραπεία με κάποιον χηλικό παράγοντα για την αποβολή του. Ξεκινά ύστερα από εφαρμογή 10-20 μεταγγίσεων ή όταν τα επίπεδα της φερριτίνης ανέβουν πάνω από 1.000 ng/ml.

Θεραπεία αποσιδήρωσης Το πρώτο φάρμακο σε αυτή την κατηγορία είναι η δεφεροξαμίνη που χορηγείται παρεντερικά και βοηθά στην απομάκρυνση του σιδήρου από τα ούρα και τα κόπρανα, αλλά παρουσιάζει πολλά μειονεκτήματα όπως πόνο, ερύθημα, πρήξιμο στην περιοχή χορήγησης, προβλήματα στην όραση και την ακοή πνευμονικές βλάβες. Rund and Rachmilewitz 2005, Muncie and Campbell 2009, Galanello and Origa 2010, Rachmilewitz and Giardina 2011)

Ναυτία, Αρθραλγία Γαστρεντερικές διαταραχές

Θεραπεία αποσιδήρωσης Χηλικές ενώσεις που χορηγούνται από του στόματος, με κύριο εκπρόσωπο την δεφεριπρόνη. Η δεφεριπρόνη παρουσιάζει επίσης κάποιες ανεπιθύμητες ενέργειες, όπως είναι η ναυτία, αρθραλγία και διάφορες γαστρεντερικές διαταραχές. Το φάρμακο δεφερασιρόξ είναι ένας ακόμη χηλικός παράγοντας που χορηγείται από του στόματος και που μελέτες έχουν δείξει ότι είναι αποτελεσματικό τόσο σε ενήλικες όσο και στα παιδιά (σημαντικές παρενέργειες, είναι ορισμένα δερματικά προβλήματα ) Rund and Rachmilewitz 2005, Muncie and Campbell 2009, Galanello and Origa 2010, Rachmilewitz and Giardina 2011)

Η σπληνομεγαλία επιδεινώνει την αναιμία και κατά συνέπεια αυξάνει τις ανάγκες για μεταγγίσεις. ο υπερσπληνισμός (έξαρση της αιμολυτικής δραστηριότητας του σπληνός που οδηγεί σε ελάττωση των έμμορφων συστατικών του αίματος και σπληνομεγαλία) Σπληνεκτομή στοχεύει στην αποφυγή εξωμυελικής ερυθροποίησης, στη βελτίωση των επιπέδων της αιμοσφαιρίνης και μείωση της ανάγκης για μεταγγίσεις και άρα σε ελαχιστοποίηση της συσσώρευσης σιδήρου Μειονέκτήματα: Αύξηση σοβαρών λοιμώξεων και θρομβοεμβολικών επεισοδίων (Rachmilewitz and Giardina 2011).

Επαγωγή της σύνθεσης της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF χρήση φαρμακολογικών παραγόντων που στοχεύουν σε αύξηση της παραγωγής της γ-σφαιρίνης, με απώτερο στόχο τη σύνδεση αυτής με την περίσσεια των α-αλυσίδων και τη δημιουργία της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF.

υδροξυουρία, φάρμακο επιλογής για τους ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. και σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία approved by FDA to stimulate HbF synthesis 5-αζακυτιδίνη: υπομεθυλιωτικός παράγοντας του DNA βουτυρικό οξύ: αναστολέας των απακετυλασών των ιστονών (HDAC) αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης

βουτυρικό οξύ (butyrates) short chain fatty acid derivatives αναστέλλουν τις απακετυλάσες των ιστονών Αυξάνεται η ακετυλίωση των ιστονών Αλλάζει η δομή της χρωματίνης Επιτρέπεται η πρόσβαση μεταγραφικών παραγόντων στον promoter του γονιδίου της γ- σφαιρίνης Αύξηση των επιπέδων μεταγραφής του γονιδίου της γ- σφαιρίνης αυξημένα επίπεδα της HbF

Ραπαμυκίνη: μακρολιδικό αντιβιοτικό (Streptomyces hygroscopicus) Αυξάνει τα επίπεδα του mrna του γ- γονιδίου

based on the pathophysiology of beta thalassemia, there are 3 levels potential targeting molecular therapy; Primary, Secondary Τertiary Quek L, Thein SL. 2007. Br J Haematol 136: 353-65

HSCT Γονιδιακή θεραπεία ipscs ΕPO HU αποσιδήρωση

Hepsidin πεπτιδική ορμόνη συντίθεται στο ήπαρ Παίζει ρόλο κλειδί στην ομοιόσταση του σιδήρου στους θαλασσαιμικούς ασθενείς τα επίπεδα της Hepsidin είναι μειωμένα οπότε παρεντερική χορήγηση ανασυνδυασμένης hepsidin θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί θεραπευτικά

Η Hepsidin απελευθερωνεται από το ήπαρ, συνδέεται με την ferroportin (iron transporter) στην επιφάνεια των εντεροκυτταρων και των μακροφάγων, υπευθυνων για την ανακύκλωση του σιδήρου από τα ερυθροκυτταρα και επάγει την ενδοκυτταρωση και διάσπαση της ferroportin, οπότε: 1. Μείωση της απορρόφησης του σιδηρου από το έντερο 2. Συσσώρευση σιδηρου στα δικτυοενδοθηλιακά κύτταρα. 3. Ελάττωση των επίπεδων του σιδηρου του συνδεδεμένου με την τρανσφερρινη στο πλάσμα. Στη β- θαλασσαιμία, τα συσσωρευμένα πρόδρομα ερυθροκυτταρα στο μυελό των οστών εκκρίνουν erythroferrone και GDF15, καταστέλλουν την παραγωγή της Hepsidin στο ήπαρ, οδηγούν σε μη φυσιολογική απορρόφηση σιδήρου στα εντεροκυτταρα και έκκριση σιδήρου από τα δικτυοενδοθηλιακα κύτταρα (μακροφάγα..)

Χορήγηση από-τρανσφερρίνης αύξηση έκφρασης της hepsidin μειώνει τα επίπεδα σιδηρου του ορού, την απόδοση σιδήρου στα πρόδρομα ερυθροκυτταρα, τη σύνθεση της αίμης, το σχηματισμό των hemichromes, το σχηματισμό των ROS άρα Μειώνει τη ΜΗ αποτελεσματική ερυθροποίηση (ΙΕ) http://www.uscnk.com/directory/apotransferrin(apotf)-1930.htm

Παρέμβαση στη μη ισορροπία μεταξύ των α- και β- αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης

Στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα υπάρχουν πρωτεολυτικοί μηχανισμοί για να διασπούν τις ελεύθερες (μη συνδεδεμένες) α-αλυσίδες Η πρωτεολυτική δραστηριότητα μειωμένη στα δικτυοερυθροκύτταρα (reticulocytes)

AHSP (alpha haemoglobin stabilizing protein) Σχηματίζει σταθερό σύμπλοκο με τη μη-συζευγμένη α-αλυσίδα και εμποδίζει τη διάσπασή της παρουσία της νεοσυντιθέμενης β-αλυσίδας απομακρύνεται από το σύμπλοκο AHSP / α για σχηματισμό της HbA Υπερέκφραση της AHSP πρωτεϊνης, η οποία είναι χαμηλή στη σοβαρή β-θαλασσαιμία θα μπορούσε να έχει θεραπευτική σημασία

Μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών (Βone Μarrow) Hemopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT) Η μόνη διαθέσιμη θεραπεία για τη ριζική αντιμετώπιση της ασθένειας Η κλινική εικόνα των ασθενών η ηλικία, το φύλο, η φυσική κατάστασή τους παίζει σημαντικό ρόλο στην επιτυχία της μεταμόσχευσης, η οποία μπορεί να φτάσει μέχρι το 90%. Ωστόσο ο κυριότερος παράγοντας που επηρεάζει την επιτυχία μιας μεταμόσχευσης είναι η εύρεση συμβατών (HLA matched) δοτών, για να μην απορριφθεί το μόσχευμα λόγω graft versus host disease (GVHD) 25-30% των ασθενών με μεσογειακή αναιμία βρίσκουν συμβατό δότη

Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα προς μεταμόσχευση μπορούν να ληφθούν και από το αίμα του ομφάλιου λώρου. Από το 1990, η χρήσή τους ξεπερνά το πρόβλημα δημιουργίας ιικής μόλυνσης από τα μοσχεύματα και επιπλέον η πιθανότητα εμφάνισης GVHD είναι μειωμένη. Ωστόσο ο μικρός αριθμός των κυττάρων που προέρχονται από το ομφάλιο αίμα αποτελούν τροχοπέδη στην επιτυχή μεταμόσχευση αυτών και για το λόγο αυτό η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιείται κυρίως στα παιδιά (Rachmilewitz and Giardina 2011, Higgs, Engel et al. 2012).

Γονιδιακή θεραπεία

Για την επιτυχία της γονιδιακής θεραπείας στη μεσογειακή αναιμία θα πρέπει να πληρούνται κάποιες προϋποθέσεις, όπως είναι: 1) αποτελεσματική γονιδιακή μεταφορά και ενσωμάτωση σε ένα μεγάλο ποσοστό αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων 2) ειδική έκφραση στα κύτταρα της ερυθράς σειράς 3) τα επίπεδα έκφρασης της β-σφαιρίνης να είναι σταθερά και, τέλος, 4) τα επίπεδα έκφρασης της β-σφαιρίνης να είναι ασφαλή, χωρίς να συμβαίνει ενσωμάτωση γενετικού υλικού των φορέων σε άλλες περιοχές του γονιδιώματος (φαινόμενα θέσεως) (Arumugam and Malik 2010). Μια κύρια δυσκολία για να γίνει εφικτή η γονιδιακή θεραπεία στην περίπτωση της β-θαλασσαιμίας ήταν η παραγωγή κατάλληλων φορέων του γονιδίου της β- σφαιρίνης. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν ρετροϊικοί φορείς όπου η έκφραση της β-σφαιρίνης ήταν ελάχιστη, ενώ οι λεντϊικοί φορείς που χρησιμοποιήθηκαν μετέπειτα είναι περισσότερο σταθεροί και εκφράζουν μεγαλύτερα ποσοστά β-σφαιρίνης (Arumugam and Malik 2010, Yannaki, Emery et al. 2010).

Η Μεσογειακή αναιμία αποτελεί μία από τις πρώτες γενετικές ασθένειες, για την οποία προτάθηκε η γονιδιακή θεραπεία, όπου έχουμε μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου της β-σφαιρίνης σε αυτόλογα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (HSCs) και τα οποία, ύστερα από τη επιδιόρθωση της γενετικής βλάβης, μεταφέρονται πίσω στον ασθενή. Τα πλεονεκτήματα της προσέγγισης αυτής είναι ότι η θεραπεία είναι μόνιμη, δεν ενέχει κάποιο περιορισμό στην εύρεση συμβατού δότη καθώς και ότι δεν έχουμε εμφάνιση ανοσολογικών αντιδράσεων, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των μεταμοσχεύσεων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. (Higgs, Engel et al. 2012) Αναλυτικά το πρωτόκολλο που ακολουθείται είναι το εξής: αρχικά απομονώνονται αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα από τον ασθενή, τα οποία στη συνέχεια διαμολύνονται (ex vivo) με τροποποιημένους ιικούς φορείς που φέρουν το φυσιολογικό γονίδιο της β-σφαιρίνης. Τέλος, τα διορθωμένα από τη γενετική βλάβη κύτταρα επιστρέφονται πίσω στον ασθενή ύστερα από μυελοκαταστολή του ασθενούς, προκειμένου να τα δεχτεί πίσω (Bank 2010, Yannaki, Emery et al. 2010, Higgs, Engel et al. 2012). Διπλωματική εργασία (Master thesis): Tζικαλου Λαμπρινή

Η πρώτη και μοναδική μέχρι στιγμής κλινική δοκιμή γονιδιακής θεραπείας σε ασθενή με β-θαλασσαιμία πραγματοποιήθηκε στη Γαλλία το 2007 από την ερευνητική ομάδα του Philippe Leboulch. Πιο συγκεκριμένα, ένας 18χρονος ασθενής με β Ε /β 0 θαλασσαιμία υποβλήθηκε στη θεραπεία, καταφέρνοντας ακόμη και σήμερα να είναι ανεξάρτητος από μεταγγίσεις. Παρόλα αυτά βέβαια, παρατηρήθηκε ότι ο λεντϊικός (LV) φορέας που χρησιμοποιήθηκε ενσωματώθηκε σε ένα πρωτοογκογονίδιο (HMGA2), πράγμα που μπορεί να αποτελεί προάγγελο μιας καρκινογένεσης (έχει συμβεί στο παρελθόν σε προσέγγιση γονιδιακής θεραπείας της φυλοσύνδετης σοβαρής συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας (X-SCID)). (Cavazzana-Calvo, Payen et al. 2010, Yannaki, Emery et al. 2010, Payen and Leboulch 2012).

Θεραπεία της Μεσογειακής αναιμίας με χρήση των ipscs διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα (ινοβλάστες δέρματος) μπορούν να επαναπρογραμματιστούν σε πολυδύναμα κύτταρα όμοια με τα εμβρυονικά βλαστοκύτταρα Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται ipscs (induced Pluripotent Stem Cells) και η δημιουργία τους οφείλεται στην εισαγωγή και έκφραση στα σωματικά κύτταρα ινοβλάστες τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων (Oct4, Sox2, KLF4, c-myc).

Θεραπεία της Μεσογειακής αναιμίας με χρήση των ipscs η μετάλλαξη για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία σε ipscs ποντικιών επιδιορθώθηκε Αρχικά τα κύτταρα διαφοροποιήθηκαν σε πολυδύναμα HSCs και έπειτα τα κύτταρα αυτά επαναχορηγήθηκαν στα ποντίκια και δημιούργησαν ένα νέο αιμοποιητικό σύστημα που δεν έφερε πλέον τη βλάβη που οδηγούσε σε δρεπανοκυτταρική αναιμία Παρόλα αυτά πολλά εμπόδια θα πρέπει να ξεπεραστούν αλλά και οι τρόποι παραγωγής των ipscs θα πρέπει να βελτιωθούν, καθώς και να αναπτυχθούν σωστά πρωτόκολλα και προκλινικά μοντέλα προκειμένου να μπορέσει η τεχνολογία των ipscs να αποτελέσει θεραπεία για τη Μεσογειακή αναιμία (Ye, Zhan et al. 2009, Yannaki, Emery et al. 2010, Higgs, Engel et al. 2012). Διπλωματική εργασία (Master thesis): Tζικαλου Λαμπρινή

Πειραματικές - Μελλοντικές Θεραπείες Θεραπεία μέσω των ips cells (Higgs, Engel, Stamatoyannopoulos 2012) Lancet 379(9813) : 373-383

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ Ταυτοποίηση των φορέων στα πλαίσια του γενετικού ελέγχου πριν από την πρώτη εγκυμοσύνη (premarital genetic testing program), ειδικά σε περιοχές με υψηλά ποσοστά εμφάνισης των θαλασσαιμιών καθώς και η προγεννητική διάγνωση