ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ I. Καραµπάς, Μ. Όρκουλα, Χ. Κοντογιάννης, Τµήµα Φαρµακευτικής, Πανεπιστήµιο Πατρών, Ρίο- Πάτρας 26500 & ΙΤΕ-ΕΙΧΗΜΥΘ, Ρίο-Πάτρας E-mail: kontoyan@upatras.gr, τηλ: 2610969328, fax: 2610997658 1. Εισαγωγή Το οστό αποτελεί ένα σύνθετο υλικό, χαρακτηριζόµενο από µια πολύπλοκη ιεραρχική δοµή. Κύρια δοµικά συστατικά του αποτελούν ο βιοαπατίτης ο οποίος είναι ένα χηµικό και δοµικό ανάλογο της χηµικής ένωσης υδροξυαπατίτης [Ca 10 (PO ) 6 (OH) 2 ] και η πρωτεΐνη κολλαγόνο (τύπου Ι). Τα δύο αυτά υλικά µαζί αποτελούν πάνω από το 95% της κατά βάρος σύστασης του οστού [1]. Η σχετική αναλογία των δύο αυτών συστατικών επηρεάζει καίρια τις µηχανικές ιδιότητες των οστών και αποτελεί ένα σηµαντικό παράγοντα εκτίµησης του κινδύνου ευθραυστότητάς τους. ιάφορες ασθένειες έχουν συσχετιστεί µε αυτή την αναλογία όπως είναι η οστεοπόρωση, η οστεοµαλακία, η ατελής οστεογένεση κ.α. [2-]. Συνεπώς, η γνώση της σύστασης του οστού, ως µέσω εκτίµησης των µηχανικών του ιδιοτήτων, θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως δείκτης της ποιότητάς του ή και ακόµα ως µέθοδος διάγνωσης της παθολογικής του κατάστασης. Τεχνικές οι οποίες θα µπορούσαν να απαντήσουν σ αυτή την απαίτηση αποτελούν οι φασµατοσκοπικές τεχνικές, οι οποίες έχουν εισέλθει δυναµικά στο πεδίο ανάλυσης των οστών µε κύριους εκπροσώπους τους τη φασµατοσκοπία υπερύθρου (IR) και τη φασµατοσκοπία Raman (RS). Και οι δύο αυτές τεχνικές έχουν την ικανότητα να δίνουν πολλές πληροφορίες για τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του οστού αλλά και για την ποσότητα τόσο του ανόργανου όσο και του οργανικού τµήµατος [5,6]. Η RS χαρακτηρίζεται από κάποια σηµαντικά πλεονεκτήµατα όπως είναι η απαίτηση για ελάχιστη ή ακόµα και µηδαµινή επεξεργασία του υπό ανάλυση δείγµατος και η απουσία παρεµποδίσεων στο φάσµα από την παρουσία νερού στο δείγµα. Και οι δύο παραπάνω λόγοι είναι ιδιαίτερα σηµαντικοί στην ανάλυση βιογενών υλικών. Μάλιστα, εξελίξεις των τελευταίων χρόνων στην οργανολογία της RS [7] της προσέδωσαν την ιδιαίτερης σπουδαιότητας δυνατότητα για µη επεµβατική ανάλυση του οστέινου ιστού [8]. Λαµβάνοντας υπόψη τη σπουδαιότητα της σύστασης του οστού στην πρόβλεψη διαφόρων ασθενειών αλλά και τα ιδιαίτερα πλεονεκτήµατα που προσφέρει η ανάλυσή του µε τη RS, σκοπός της συγκεκριµένης εργασίας είναι η ανάπτυξη µεθοδολογίας για τον υπολογισµό της σχετικής αναλογίας βιοαπατίτη και κολλαγόνου στο οστό µε τη βοήθεια της συγκεκριµένης τεχνικής. 2. Μεθοδολογία 2.1 Υλικά και µέθοδοι Για την επίτευξη του παραπάνω στόχου συλλέχθηκε ένας σηµαντικός αριθµός βόειων οστών. Από αυτά, αποµακρύνθηκε µε τη βοήθεια νυστεριού ο µαλακός ιστός που τα περιβάλλει και στη συνέχεια αποθηκεύθηκαν στους -80 o C µέχρι τη χρησιµοποίησή τους. Ακολούθως, πραγµατοποιήθηκε καθαρισµός τους από το µυελό και τα λιπίδια τα οποία συναντώνται στο πορώδες τους µε την εφαρµογή πρωτοκόλλου που κάνει χρήση διαλύµατος 1:1 µεθανόλης χλωροφορµίου [9]. Ένα πλήθος από τα απαλλαγµένα από τα λιπίδια και το µυελό οστά χρησιµοποιήθηκε για την αποµόνωση βιοαπατίτη (αποπρωτεϊνοποίηση) ενώ ένας αριθµός οστών χρησιµοποιήθηκε για την

αποµόνωση κολλαγόνου. Η πρώτη διεργασία επετεύχθη εµβαπτίζοντας τα δείγµατα σε υδραζίνη και ακολουθώντας τη µέθοδο που έχει προταθεί από τον Termine [10] ενώ το κολλαγόνο αποµονώθηκε διαλύοντας το βιοαπατίτη σε διάλυµα 1% w/v EDTA [11]. Το κολλαγόνο και ο βιοαπατίτης που λήφθηκαν από τα δείγµατα των οστών κονιοποιήθηκαν σε κρυογενή σφυρόµυλο (Freezer/Mill 6750). Στη συνέχεια, προσεκτικά ζυγισµένες ποσότητες των δύο υλικών αναµείχθηκαν µέχρι επίτευξης οµογενοποίησης προκειµένου να παρασκευαστούν µίγµατα µε γνωστές περιεκτικότητες σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο (πρότυπα µίγµατα). έκα συνολικά πρότυπα µίγµατα παρασκευάστηκαν µε περιεκτικότητες από 60% ως 90% σε βιοαπατίτη και από 0% ως 10% σε κολλαγόνο αντίστοιχα. 2.2 Οργανολογία Τρεις αναλυτικές τεχνικές χρησιµοποιήθηκαν για τους σκοπούς της συγκεκριµένης µελέτης. Αυτές ήταν η φασµατοσκοπία Raman, η φασµατοσκοπία ατοµικής απορρόφησης (ΦΑΑ) και η θερµοσταθµική ανάλυση (TGA). Τα φάσµατα Raman των δειγµάτων λήφθηκαν στο µοντέλο FRA 106/S FT-Raman της εταιρείας Bruker, το οποίο χρησιµοποιεί laser Nd:YAG µε εκπεµπόµενη ακτινοβολία στα 106 nm. Έγιναν 200 σαρώσεις µε ένταση προσπίπτουσας ακτινοβολίας 00 mw. Οι µετρήσεις ατοµικής απορρόφησης πραγµατοποιήθηκαν στο µοντέλο ΑΑ 300 της PerkinElmer. Χρησιµοποιήθηκε φασµατική γραµµή στα 22,7 nm, χαρακτηριστική του ατοµικού φάσµατος του ασβεστίου. Τα πειράµατα θερµοσταθµικής ανάλυσης έλαβαν χώρα στο όργανο Q50 (ΤΑ Instruments) σε οξειδωτική ατµόσφαιρα (αέρας) και ο ρυθµός θέρµανσης ήταν 15 ο C/min. 3. Αποτελέσµατα-Συζήτηση Στο σχήµα 1 παρουσιάζεται το φάσµα Raman του οστού µε επισηµασµένες τις κυριότερες δονήσεις του. Για τον προσδιορισµό της περιεκτικότητας του οστού σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο απαιτείται η χρήση µιας κορυφής του φάσµατος που να αντιστοιχεί σε δόνηση του βιοαπατίτη και µια κορυφή που οφείλεται σε δόνηση του κολλαγόνου. Για το βιοαπατίτη η δόνηση ν 1 -ΡΟ 3- που αποτυπώνεται ως η κυριότερη κορυφή του φάσµατος στα 960 cm -1, αποτελεί τον πιο διαδεδοµένο δείκτη της ποσότητας του βιοαπατίτη. Όσον αφορά το κολλαγόνο, ως δείκτες της ποσότητάς του έχουν χρησιµοποιηθεί διάφορες δονήσεις, πιο συνηθισµένες από τις οποίες είναι αυτή του αµιδικού δεσµού στα 1667 cm -1 και του δεσµού ν-c-h 2 στα 291 cm -1. Τα τελευταία χρόνια µια οµάδα ερευνητών έχει προτείνει και την περιοχή 850-880 cm -1 στην οποία παρατηρούνται οι δονήσεις των αµινοξέων προλίνης και υδροξυπρολίνης [12]. Στη παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν και οι τρεις παραπάνω περιοχές δονήσεων για το κολλαγόνο ενώ για το βιοαπατίτη η δόνηση στα 960 cm -1. Από τα φάσµατα των πρότυπων µιγµάτων υπολογίστηκαν οι λόγοι υψών και εµβαδών βιοαπατίτη προς κολλαγόνου των κορυφών που αντιστοιχούν στις δονήσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω. Οι συγκεκριµένοι λόγοι συνδέονται γραµµικά µε τις κατά βάρος περιεκτικότητες των βιοαπατίτη (Χ ΒΑΡ ) και κολλαγόνου (Χ COL ) µέσω της σχέσης: i I X BAP = K (1) j I X COL όπου µε Ι συµβολίζεται η ένταση της δόνησης στον κυµατάριθµο i ή j (εκφρασµένη ως το ύψος ή το εµβαδό της κορυφής), Κ είναι ένας συντελεστής που εξαρτάται από το όργανο µέτρησης και από τους κυµατάριθµους i και j που χρησιµοποιήθηκαν. Με εφαρµογή της µεθόδου των ελαχίστων τετραγώνων στα δεδοµένα από τα φάσµατα των πρότυπων µιγµάτων προέκυψε η τιµή του συντελεστή Κ. Ανάλογα µε το ποιος

συνδυασµός δονήσεων βιοαπατίτη και κολλαγόνου χρησιµοποιήθηκε, αναπτύχθηκαν συνολικά 8 διαφορετικές ευθείες βαθµονόµησης δηλαδή 8 µοντέλα ποσοτικής ανάλυσης. v 1 PO 3- v-(c-h 2 ) Raman Intensity v PO 3-2 v PO 3- hydroxyproline proline v 1 CO 2-3 / v 3 PO 3- Amide III δ-(c-h 2 ) Amide I Κολλαγόνο Βιοαπατίτης 00 800 1200 1600 2800 3200 3600 000 Raman Shift (cm -1 ) Σχήµα 1. Φάσµατα Raman του οστού, του βιοαπατίτη και του κολλαγόνου. Οι κορυφές του φάσµατος του οστού που επισηµάνονται µε () ανήκουν σε δονήσεις του βιοαπατίτη ενώ αυτές µε () σε δονήσεις του κολλαγόνου Επίσης, αναπτύχθηκε ένα επιπλέον µοντέλο ποσοτικής ανάλυσης χρησιµοποιώντας τη χηµειοµετρική µέθοδο PLS (Partial Least Squares). Με τη συγκεκριµένη µέθοδο µια ευρεία περιοχή του φάσµατος αναλύεται µε βάση ένα µαθηµατικό αλγόριθµο και έτσι προκύπτουν οι τιµές των άγνωστων µεγεθών. Kάνοντας χρήση των φασµάτων των πρότυπων µιγµάτων αναπτύχθηκε το χηµειοµετρικό µοντέλο πρόβλεψης της σύστασης µε τη µέθοδο PLS. Μετά από διάφορες δοκιµές αποδείχθηκε ότι τα πιο αξιόπιστα αποτελέσµατα προέκυψαν µε χρήση της περιοχής του φάσµατος 370-1800 cm -1 και µε εφαρµογή του SNV (Standard Normal Variate) µετασχηµατισµού των δεδοµένων. Χρησιµοποιώντας τις εξισώσεις των καµπυλών αναφοράς και του µοντέλου PLS είναι δυνατός ο υπολογισµός της περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο οποιουδήποτε δείγµατος οστού. Το ερώτηµα όµως που έµενε να απαντηθεί αφορούσε το πιο από τα εξαγόµενα µοντέλα ήταν τα πιο αξιόπιστο στον υπολογισµό της σύστασης του οστού. Για την απάντηση στο παραπάνω ερώτηµα χρησιµοποιήθηκαν δέκα οστά άγνωστης περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο, των οποίων η σύσταση προσδιορίστηκε µε κάθε ένα από τα αναπτυχθέντα µοντέλα ποσοτικής ανάλυσης µε βάση τη RS και µε τις τεχνικές των ΦΑΑ και TGA. Ακολούθως, οι τιµές περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο που προέκυψαν από την ανάλυση του φάσµατος Raman συγκρίθηκαν µε τις αντίστοιχες που υπολογίστηκαν από τις άλλες δύο τεχνικές.

Στην τεχνική της ΦΑΑ υπολογίστηκε η περιεκτικότητα των οστών (µετά από ξήρανση) σε βιοαπατίτη µετρώντας την απορρόφηση του ασβεστίου που περιέχονταν στα δείγµατα. Η εναποµένουσα ποσότητα του δείγµατος αντιστοιχούσε στην µάζα του κολλαγόνου. Η τεχνική TGA παρέχει πληροφορίες για το οργανικό τµήµα των οστών. Συγκεκριµένη ποσότητα ενός δείγµατος θερµαίνεται και καταγράφεται η µεταβολή της µάζας του σε συνάρτηση µε τη θερµοκρασία. Στην περίπτωση του οστού, καταγράφηκε απώλεια µάζας γύρω στο 6-7% µέχρι τους 200 ο C, η οποία οφειλόταν στην αποµάκρυνση του νερού ενώ µια εντονότερη απώλεια µάζας παρατηρήθηκε στην περιοχή 190-60 o C. Αυτή οφειλόταν στην πλήρη οξείδωση του κολλαγόνου και συνεπώς αντιστοιχούσε στη µάζα του κολλαγόνου στο οστό. Η ποσότητα του δείγµατος που παρέµεινε αποτελούσε την ποσότητα του βιοαπατίτη. Ο πίνακας 1 παρουσιάζει την υπολογιζόµενη από τις δύο παραπάνω τεχνικές % περιεκτικότητα κάθε οστού σε βιοαπατίτη. Προφανώς, για το κολλαγόνο ισχύει Χ COL =100-X BAP. Σηµειώνεται ότι 5 από τα δέκα συνολικά οστά κατέστη δυνατό να αναλυθούν µε την TGA. Από τα αποτελέσµατα του πίνακα 1 είναι εµφανές ότι οι τεχνικές της ΦΑΑ και της TGA υπολογίζουν παραπλήσιες τιµές όσον αφορά την περιεκτικότητα του βιοαπατίτη. Εκτός από το οστό 2 σε όλες τις άλλες περιπτώσεις οι διαφορές κυµαίνονται από 0,5 ως 1,5 περίπου ποσοστιαίες µονάδες. Για την επιλογή του ακριβέστερου µοντέλου από αυτά που αναπτύχθηκαν µε τη βοήθεια της RS, πραγµατοποιήθηκε σύγκριση των υπολογιζόµενων τιµών της % περιεκτικότητας των δειγµάτων σε βιοαπατίτη µε τις αντίστοιχες τιµές που προσδιορίστηκαν από την ΦΑΑ και την TGA. Η σύγκριση των τιµών και για τα δέκα οστά πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια του όρου RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction) ο οποίος ορίζεται ως εξής [13]: RMSEP= N t i= 1 i i ( X X ) όπου Χ i st είναι η υπολογιζόµενη από τη ΦΑΑ ή την TGA % περιεκτικότητα του βιοαπατίτη και X i pred η προβλεπόµενη από τη RS. Ν t είναι ο αριθµός των αναλυόµενων δειγµάτων (Ν t =10). Όσο µικρότερη είναι η τιµή του RMSEP τόσο καλύτερη είναι η σύγκλιση µεταξύ των συγκρινόµενων µεγεθών από τα δύο πλήθη. Από τις υπολογιζόµενες τιµές του RMSEP προέκυψε ότι οι µικρότερες τιµές, τόσο µετά τη σύγκριση των τιµών βιοαπατίτη που υπολογίστηκαν από RS και ΦΑΑ όσο και µετά από τη σύγκριση των τιµών από RS και TGA, παρατηρήθηκαν για το µοντέλο το οποίο χρησιµοποιεί τους λόγους των υψών των κορυφών στα 960 cm -1 (δείκτης της ποσότητας του βιοαπατίτη) και του αθροίσµατος των υψών στα 855 cm -1 και 878 cm -1 (δείκτης της ποσότητας του κολλαγόνου). Οι τιµές του RMSEP ήταν 1,077 για σύγκριση µεταξύ RS και ΦΑΑ και 0,80 για σύγκριση µεταξύ RS και TGA. Η εξίσωση βαθµονόµησης που χαρακτηρίζει το συγκεκριµένο µοντέλο είναι η: 960 H X BAp =. 107( ± 0. 070) 0. 177( ± 0. 283) 855 878 (3) H + H X COL όπου µε Η i συµβολίζεται το ύψος της κορυφής του φάσµατος στον i κυµατάριθµο. Εφαρµόζοντας την εξίσωση 3 για την πρόβλεψη της περιεκτικότητας των οστών που αναλύθηκαν προηγουµένως µε ΦΑΑ και TGA σε βιοαπατίτη και κολλαγόνο, προέκυψαν οι τιµές που παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Συγκρίνοντας τις υπολογισθείσες από τις τρεις τεχνικές τιµές περιεκτικότητας εύλογα καταδεικνύεται ότι υπάρχει πολύ ικανοποιητική συµφωνία της RS σε σχέση µε τις άλλες δύο τεχνικές. Οι ποσοστιαίες διαφορές κυµαίνονται στη 1 ποσοστιαία µονάδα περίπου. st N t pred 2 (2)

Πίνακας 1. Υπολογιζόµενες τιµές περιεκτικότητας σε βιοαπατίτη για τα δέκα οστά χρησιµοποιώντας τις τεχνικές των ΦΑΑ, TGA και το βέλτιστο µοντέλο ποσοτικής ανάλυσης µε βάση τη RS. 1 2 3 5 6 7 8 9 10 ΦΑΑ 75.26 76.51 7.7 72.87 73.38 67.58 70.09 66.81 70.93 68. TGA 73.93 73.5 73.8 67.32 66.82 RS 7,21 75,2 73,2 73,93 72,88 68,82 72,29 67,5 70,25 68,17. Συµπεράσµατα Στην παρούσα ερευνητική εργασία επιχειρήθηκε η ανάπτυξη µεθοδολογίας για την ποσοτική ανάλυση βιοαπατίτη και κολλαγόνου στα οστά, µε χρήση της φασµατοσκοπίας Raman. Σύγκριση των αποτελεσµάτων από τη φασµατοσκοπία Raman µε τα αντίστοιχα από τις τεχνικές των ΦΑΑ και TGA αποκάλυψε ότι η µεθοδολογία που αναπτύχθηκε είναι ικανή να προβλέψει µε αξιόλογη ακρίβεια τη σύσταση δειγµάτων οστών και προσδοκάται ότι µπορεί να αποτελέσει ένα διαγνωστικό εργαλείο των ασθενειών που σχετίζονται µε τον οστέινο ιστό. Βιβλιογραφικές αναφορές [1] J.K. Gong, J.S. Arnold, S.H. Cohn. The Anatomical Record 19 (196) 325-331. [2] A.L. Boskey, E. DiCarlo, E. Paschalis, P. West, R. Mendelsohn. Osteoporosis Int. 16 (2005) 2031-2038. [3] J.S. Khurana, L.A. Fitzpatrick, "Osteoporosis and metabolic bone disease," in: Bone Pathology, J.S. Khurana, Humana Press, 2009. [] F.H. Glorieux, L.M. Ward, F. Rauch, L. Lalic, P.J. Roughley, R. Travers. J. Bone Miner. Res. 17 (2002) 30-38. [5] S. Gamsjäger, R. Zoehrer, P. Roschger, P. Fratzl, K. Klaushofer, R. Mendelsohn, E.P. Paschalis, Proc. Optics in Bone Biology and Diagnostics (Proceedings of SPIE)20097166. [6] S. Gourion-Arsiquaud, A.L. Boskey. Curr. Opin. Orthop. 18 (2007) 99-50. [7] P. Matousek, I.P. Clark, E.R.C. Draper, M.D. Morris, A.E. Goodship, N. Everall, M. Towrie, W.F. Finney, A.W. Parker. Appl. Spectrosc. 59 (2005) 393-00. [8] M.V. Schulmerich, J.H. Cole, J.M. Kreider, F. Esmonde-White, K.A. Dooley, S.A. Goldstein, M.D. Morris. Appl. Spectrosc. 63 (2009) 286-295. [9] D. Bettin, J. Polster, V. Rullkotter, R. von Versen, S. Fuchs. Acta Orthop. Scand. 7 (2003) 70-75. [10] J.D. Termine, E.D. Eanes, Greenfie.Dj, M.U. Nylen, R.A. Harper. Calcif. Tissue Res. 12 (1973) 73-90. [11] K.M. Shah, J.C.H. Goh, R. Karunanithy, S.L. Low, S. Dasde, K. Bose. Calcif. Tissue Int. 56 (1995) 78-82. [12] Gurjit S. Mandair, Ted A. Bateman, M.D. Morris, Proc. Optics in Bone Biology and Diagnostics (Proceedings of SPIE)20097166. [13] T. Naes, T. Isaksson, T. Fearn, T. Davies, A User-Friendly Guide to Multivariate Calibration and Classification, NIR Publications (2002)