Π Ε ΡΙΠΗ ΨΗ Η απόπτωση συνοδεύεται από μεγάλες αναδιατάξεις στη στερεοδιαμόρφωση της χρωματίυης. Στις αναδιατάξεις αυτές σημαντικό ρόλο παίζουν επιγενετικές τροποποιήσεις όπως είναι η ακετυλίωση!αποακετυλίωση των ιστονών του πυρήνα ταυ υουκλεοσώματος, καθώς και ορισμένες ποικιλομορφίες ιστονών, με πρωτεύοντα ρόλο τις ιστόυες του συνδέτου DNA, Η1. Αναστολείς των αποακετυλασών προκαλούν την συσσώρευση ακετυλιώσεων στις ουρές των ιστονών ταυ πυρήνα του υουκλεοσώματος, με αποτέλεσμα να χαλαρώνει η δομή της χρωματίυης και υα επάγεται η μεταγραφή ορισμένων γονιδίων, ένα εκ των οποίων είναι και το γονίδιο της ιστόνης αντικατάστασης, Η1.0, η οποία ανήκει στην οικογένεια των Η1 ιστονών του συνδέτου DNA. Η αλλαγή της μεταγραφικής ενεργότητας που επιφέρουν αυτές αι ουσίες έχει σαν τελικό αποτέλεσμα, ανάλογα με το κυτταρικό σύστημα, την αναστολή ταυ κυτταρικού κύκλου, την επαγωγή της τερματικής διαφοροποίησης, ή την επαγωγή της απόπτωσης. Επίσης, η χαλάρωση της χρωματίνης, που επιφέρουν τα αυξημένα επίπεδα ακετυλίωσης. δίνει την δυνατότητα πρόσβασης ενδουουκλεασώυ στο DNA. οι οποίες κατακερματίζουν τα DNA κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης. Πολύ σημαντικό για την παρούσα μελέτη είναι το γεγονός πως ή ενδουουκλεάση, DFF40, η οποία παίζει μείζονα ρόλο κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης σε μεγάλο αριθμό κυτταρικών συστημάτων και αποπτωτικώυ συνθηκών, έχει δειχτεί με in vitro πειράματα άλλων ομάδων πως ενεργοποιείται από πρωτείνες του συνδέτου DNA. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η διαφορική επίδραση της τριχοστατίνης Α και του βουτυρικού νατρίου, δύο αναστολέων των αποακετυλασών των ιστονών, στην επαγωγή απόπτωσης σε έξι λευχαιμικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής παθολογικής προέλευσης. Μελετήθηκε η επίδραση των δύο αναστολέων στα βαθμό ακετυλίωσης της ιστόνης Η4, στην επαγωγή ή αύξηση της έκφρασης της ιστόνης του συνδέτου Η1.0, σε σύγκριση με τα επίπεδα επαγωγής απόπτωσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι έξι λευχαιμικές κυτταρικές σειρές εμφανίζουν διαφορετική ευαισθησία έναντι των δύο αναστολέων και εκτός από την ερυθρολευχαιμκή σειρά Κ562. η οποία αποδεικνύεται ανθεκτική στους δύο αναστολείς. η επαγόμευη απόπτωση στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές έχει τιμές που χαρακτηρίζουν την κάθε σειρά. Προκειμένου να απαντηθεί το ερώτημα αν τόσα η ακετυλίωση της Η4 όσο και η αύξηση της έκφρασης της Η1.0 μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προαποπτωτικοί δείκτες. πραγματοποιήθηκε μια σειρά πειραμάτων κινητικής χρόνου σε τρεις επιλεγμένες μεταξύ
των έξι λευχαιμικών σειρών (ΜΟLΤ-4, ΝΒ4 και ΗL60) στις οποίες εξετάστηκε ποια από τις τρεις παραμέτρους (ακετυλίωση της Η4, αύξηση των επιπέδων της Η1.0 και επαγωγή απόπτωσης) προηγείται χρονικά, ποια έπεται και ποια ακολουθεί. Η ακετυλίωση της Η4 προηγείται χρονικά, ακολουθεί με μικρή χρονική καθυστέρηση η αύξηση των επιπέδων της Η1.0 και έπεται η επαγωγή του φαινομένου της απόπτωσης. Σημαντικό είναι το εύρημα πως στα ανθεκτικά (ως προς την επαγωγή απόπτωσης) Κ562 κύτταρα, επίσης δεν παρατηρήσαμε αύξηση των επιπέδων ακετυλίωσης ή την επαγωγή της Η1.0. Αξίζει να αναφέρουμε πως κάτω από ορισμένες συνθήκες, η αποπτωτική διαδικασία ενδέχεται να ολοκληρωθεί και χωρίς αποδόμηση του DNA ή υα εκτελεστεί η αποδόμηση με άλλη ενδονουκλεάση. Επομένως, η επιλογή της (των) καταλληλότερης σειράς βασίστηκε στην εμπλοκή της συγκεκριμένης ενδονουκλεάσης στην αποπτωτική πορεία κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης. Με βάση όλα αυτά τα αποτελέσματα επιλέχτηκε η ΝΒ4 κυτταρική σειρά και η τριχοστατίνη A για την συνέχιση της εργασίας. Το δεύτερο μέρας της διατριβής εστιάστηκε σε πειράματα όπου μελετήθηκε η αλληλεπίδραση, καθώς και ο βαθμός αυτής της αλληλεπίδρασης, του DFF40 με συγκριμένους υποτύπους της τάξης των Η 1 ιστουών για υα διερευνηθεί αν κάτω από τις συγκεκριμένες αποπτωτικές συνθήκες και στην συγκεκριμένη επιλεγμένη λευχαιμική σειρά, κάποιος Η1 υπότυπος παίζει έναν πιο εξειδικευμένο ρόλο στην ενεργοποίηση και στην αποπτωτική δράση ταυ DFF40. Οι υπότυποι που μελετήθηκαν ήταν πρωτίστως η Η1.0, αλλά και οι υπότυποι Η1.5, Η1.3 και Η1.1, εφόσον, από βιβλιογραφικά δεδομένα, οι διάφοροι υπότυποι της οικογένειας Η1 έχουν συνδεθεί με λειτουργικές διαδικασίες κατά την αναδιάταξη της χρωματίνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε αποπτωτικές συνθήκες α DFF (είναι το ανενεργό ετεροδιμερές αποτελούμενο από του DFF40-DFF45) εντοπίζεται στο εσωτερικά του πυρήνα, και συγκεκριμένα στην χρωματϊυη. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σημαντικά διότι παλαιότερα πειραματικά δεδομένα από άλλες ερευνητικές ομάδες είχαν δείξει ότι ο DFF40-DFF45 βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα κάτω από μη αποπτωτικές συνθήκες και εισέρχεται στο πυρήνα μετά από αποπτωτικό ερέθισμα. Στην συνέχεια, με in vivo πειράματα συναυοσοκατακρήμνισης διαπιστώθηκε η αλληλεπίδραση του DFF40 με την ιστόνη Η1 (ολικό κλάσμα) και με όλους τους υποτύπους (Η1.1, Η1.3, Η1.5 και Η1.0) που μελετήθηκαν, τόσο σε φυσιολογικές, όσα και σε αποπτωτικές συνθήκες. Όμως κάτω από αποπτωτικές συνθήκες παρατηρήθηκε
μία εκλεκτική (σημαντικά αυξημένη) αλληλεπίδραση του DFF40 με τις Η1.5 και Η1.0 σε αντίθεση με την Η1.3, η οποία είχε σαφέστατα χαμηλότερη αλληλεπίδραση. Το αποτέλεσμα αυτά είναι ουσιώδες εφόσον in vitro πειράματα άλλης ομάδας, με γυμνά DNA και με μεταλλαγμένα κατασκευάσματα, είχαν δείξει πως όλοι οι σωματικοί υπότυποι (Η1.1, Η1.2, Η1.3, Η1.4, Η1.5), καθώς και ο υπάτυπος αντικατάστασης, Η1.0, αλληλεπιδρούν εξίσου με τον DFF40. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν πως ο DFF40 αλληλεπιδρά διαφορικά in vivo' εύρημα που ενδέχεται να σχετίζεται όχι μόνο με την συγκεκριμένη λευχαιμική σειρά αλλά και με το συγκεκριμένο αποπτωτικό μέσο, καθώς και με άλλους, ακόμη άγνωστους, παράγοντες της χρωματίνης που φυσικά απουσίαζαν από τα πειράματα της συγκεκριμένης ερευνητικής ομάδας με γυμνά DNA. Επίσης, το ποσοστό αλληλεπίδρασης κάθε υποτύπου με την ενεργή νουκλεάση μπορεί να σχετίζεται με τον λειτουργικά ρόλο αυτού στη στερεοδιαμάρφωση της χρωματίνης. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι η τριχοστατίνη A αποτελεί έναν πολύ σημαντικό αναστολέα των αποακετυλασών των ιστονών που είναι ικανός υα επάγει τα φαινόμενο της απόπτωσης σε μια σειρά από επιλεγμένες λευχαιμικές σειρές ανθρώπου (κατά ένα χρονο-εξαρτώμενο και κυτταρο-εξαρτώμενο τρόπο) μέσω της υπερακετυλίωσης των ιστονών. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης οδηγούν στα ακόλουθα συμπεράσματα: (α) η αύξηση των επιπέδων ακετυλίωσης από αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών ενδεχομένως να αποτελέσει έναν επιπλέον χρήσιμο δείκτη για την αξιολόγηση της ικανότητας συγκεκριμένων αναστολέων να επάγουν απόπτωση σε συγκεκριμένες λευχαιμικές σειρές, (β) τα ετεροδιμερές DFF40-DFF45 εντοπίζεται στον πυρήνα και μάλιστα στην χρωματίνη, ακόμη και σε μη αποπτωτικές συνθήκες όπου ο μη πρωτεολυμέυος (από την κασπάση 3) DFF45 διατηρεί ταυ DFF40 σε μη ενεργή μορφή και, (γ) ο DFF40 αλληλεπιδρά διαφορικά με κάθε Η1 υπότυπο που αναλύθηκε στη παρούσα μελέτη κάτω από τις αποπτωτικές συνθήκες που επάγονται από τα TSA στα ΝΒ4 προμυελοκυτταρικά λευχαιμικά κύτταρα.
SUMMARY The apoptotic process is accompanied by chromatin conformational changes. Among the numerous factors that take part in these chromatin rearrangement events, of importance, are epigenetic modifications, such as acetylationldeacetylation of nucleosomal histones, and certain histone subtypes, of which the Η1 DNA linker histone subtypes play a major role. Histone deacetylase inhibitors cause the accumulation of acetylated nucleosomal histones, resulting in the "relaxation'' of the chromatin structure and transcription of certain genes, one of which is the Η1 linker histone replacement subtype, H1.0. Depending on the cell type, the transcriptional changes which are brought about by these agents, may lead to cell cycle inhibition, induction of terminal differentiation or induction of apoptosis. Moreover, hyperacetylated nucleosomes may be more accessible to DNA endonucleases which are responsible for the DNA fragmentation that takes place during the last stages of apoptosis. Of importance in this thesis work, is that in vitro experiments of other groups have shown that one of the major and most significant apoptotic endonucleases, DFF40, is activated by DNA linker proteins. In light of the above, the first part of this thesis work involved the investigation of the differential effects of trichostatin A and sodium butyrate, two histone deacetylase inhibitors in six leukemic cell lines of different pathological origin. This part of the study focused on the effect of these two inhibitors as to the degree of histone 1-14 acetylation, the induction of, or increase in expression levels of the DNA linker histone, Η1.0, as compared to the degree of apoptosis induction. The results showed that the six leukemic cell lines responded differently (showed differential sensitivity) to the inhibitors and with the exception of the Κ562 cell line which was completely resistant, the degree of apoptosis induction was different and specific for each of the responsive cell lines. In order to answer the question as to whether histone Η4 acetylation and/or the induction or upregulation of Η1.0 expression can be used as proapoptotic markers, 24-hour time kinetics experiments were carried out in 3 (most responsive, MOLT-4, ΝΒ4, HL60) of the 6 cell lines in order to access the chronological order of each parameter (i.e., histone acetylation, Η1.0 induction, apoptosis). The results demonstrated that histone Η4 acetylation is an early event followed, after a short time-lag, by the induction or up-
regulation of Η1.0 expression and. lastly, by the induction of apoptosis. Important is the finding that the resistant (to apoptosis) Κ562 cell line did not have increased acetylation levels or H1.0 induction. It is worth mentioning at this point, that under certain conditions, the apoptotic process may take place without DNA fragmentation or DNA fragmentation may be executed by another endonuclease. Therefore, the choice of the of the cell line for the second part of this thesis work was also based on the involvement of the endonuclease, DFF40, in the apoptotic events induced by these inhibitors. Based an all the results briefly mentioned above. the NΒ4 cell line and trichostatin A were chosen for the continuation of this thesis work. The second part of this study specifically focused on the investigation of the interaction (and the degree of this interaction) of DFF40 with specific Η1 subtypes in order to ascertain, under these specific apoptotic conditions and with the selected cell line, whether a certain subtype played a more preferential role in the activation and the apoptotic activity of DFF40. The subtypes that were analyzed were Η1.0 as well as three of the five somatic subtypes, Η1.5, Η1.3 and Η1.1. The relevance of analyzing these four different subtypes is that previous work of other groups have shown that the Η1 subtypes may have specific functional roles in chromatin structural reorganization events. The results of this line of work showed that, both under physiological, as well as under apoptotic conditions, DFF (the non-active heterodimer, DFF40-DFF45) is located in the nucleus and, specifically, on chromatin. These results are of significance since previous work of other investigators suggested that DFF40-DFF45 resides in the cytoplasm under non-apoptotic conditions and is translocated to the nucleus after the induction of apoptosis. In continuation, co-immunoprecipitation experiments showed that DFF40 interacts with total histone Η1 and also with all the subtypes (Η1.1, Η1.3, Η.15, Η1.0) studied in this investigation under both apoptotic as well as non-apoptotic conditions. However, under apoptotic conditions, DFF40 preferentially interacted (interacted to a significantly greater extent) with Η1.5 and Η1.0, in contrast to Η1.3, with which a significant decrease in the interaction with DFF40 and this subtype was observed. These results are of significance since the in vitro experiments of another group, using naked DNA and truncated constructs, had shown that all somatic Η1 subtypes (H1.1, Η1.2, Η1.3, Η1.4, Η1.5) as well as the replacement subtype, Η1.0, interacted to the same extent with DFF40. The results of this thesis work show that DFF40 interacts in a
preferential manner with specific Η1 subtypes in vivo. This may be cell-type specific and/or specific to the apoptotic agent. Moreover, other, as yet, unknown chromatin factors may be involved which were absent from the in vitro experiments. Another enticing explanation, for the in vivo preferences shown by DFF40 in this work may possibly be related to the specific functional roles played by each subtype in chromatin reorganization events. In conclusion, in this work, it was found that trichostatin A is an effective histone deacetylase inhibitor with the ability to hyperacetylate histones and induce apaptosis in the leukemic cell lines of this study in a time- and cell-type-dependent manner. The following briefly summarize the main conclusions and/or implications from the findings of this thesis work: (1) the increase in histone acetylation levels by histone deacetylase inhibitors may possibly be used as an additional index for accessing the apoptotic responsiveness or sensitivity of cancer cell types to other histone deacetylase inhibitors as to their effectiveness in inducing apaptosis, (2) the heterodimer, DFF40-45 resides in the nucleus and moreover, in the chromatin fraction, even under nonapoptotic conditions where the non-hydrolyzed (by caspase-3) DFF45 maintains DFF40 in a non-activated state and, (3) DFF40 interacts with each Η1 subtype analyzed in this study in a preferential manner under the apoptotic conditions induced by TSA in the ΝΒ4 leukemic cell line.