Μέτρηση και αξιολόγηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων με. ανοσοφθορισμό και στρατηγική στην εργαστηριακή διάγνωση των. αυτοάνοσων νοσημάτων.

Μέτρηση και αξιολόγηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων με ανοσοφθορισμό και στρατηγική στην εργαστηριακή διάγνωση των αυτοάνοσων νοσημάτων. Κ. Ε. Κεραμάρης 1,2, Π. Καραμπάτσης 2, Λ.Χ. Μαργαρίτης 1 1.Τομέας Κυτταρικής Βιολογίας & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών. 2. Τμήμα Ανοσολογικό, Εργαστήρια Αναφοράς και Ποιοτικού Ελέγχου, Μικροανάλυση Α.Ε.Β.Ε. Εισαγωγή Τα αντιπυρηνικά αντισώματα παράγονται στον οργανισμό σε μια ποικιλία αυτοάνοσων νοσημάτων και στρέφονται εναντίον ιδίων αντιγόνων στόχων προκαλώντας ιστικές οργανοειδικές ή μη οργανοειδικές βλάβες 1-4,18,19. Τα κυριότερα πυρηνικά αντιγόνα που αποτελούν στόχους των αυτοαντισωμάτων είναι τα εξής: ssdna, dsdna, RNA, ιστόνες, U1- nrnp, Sm, SS-A (Ro), SS-B (La), U3-nRNP/φιμπριλαρίνη, RNA-πολυμεράση 1, PM-Scl (PM-1), 7-2-RNP (To), 4-6-S-RNA, οι πρωτεΐνες οργάνωσης του πυρηνίσκου, οι πρωτεΐνες του κινητοχώρου, Scl-70 (τοποϊσομεράση 1), η κυκλίνη 1 (PCNA), οι πρωτεΐνες του πυρηνικού σκελετού, το Ku, Mi-1, Mi-2 και οι λαμίνες 5-11,15,17-21,25-33. Η μέθοδο επιλογής για τον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων είναι ο έμμεσος ανοσοφθορισμός σε κυτταρικό υπόστρωμα HEp-2 επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων 15,16. Το κυτταρικό υπόστρωμα HEp-2 σε συνδυασμό με ψυκτικές τομές από συκώτι πιθήκου, μπορεί να μας αποκαλύψει περισσότερα από 30 πυρηνικά και κυτταροπλασματικά αντιγόνα στόχους των αυτοαντισωμάτων 15. Ασφαλώς και υπάρχουν εναλλακτικές μέθοδοι για την ανίχνευση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων, όπως η ΕΙΑ και το Western Blot, όμως η πληροφορία που δίνουν αυτές οι μέθοδοι είναι περιορισμένες, αφού χρησιμοποποιούνται για

τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων έναντι συγκεκριμένων αντιγόνων 7,8,15-16,22,23,24. Αρκετοί ερευνητές προτείνουν εναλλακτικά την μέθοδο ΕΙΑ για τον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων, η οποία παρουσιάζει ικανοποιητικά επίπεδα ευαισθησίας και ειδικότητας 13,14. Η τοπολογία και η συγκέντρωση του κάθε αντιγόνου στον πυρήνα διαφέρει, με αποτέλεσμα ανάλογα με τον αντιγονικό στόχο να διαφοροποιείται η εικόνα του ανοσοφθορισμού 25-33. Έτσι διαμορφώνονται οι τύποι ανοσοφθορισμού, που ο καθένας συσχετίζεται με συγκεκριμένα αντιγόνα, που παραμπέμπουν σε συγκεκριμένα αυτοάνοσα νοσήματα 15. Εκτός, από τον τύπο του φθορισμού σημαντική διαγνωστική αξία έχει ο θετικός τίτλος της ανοσοαντίδρασης. Από πολλούς συγγραφείς αναφέρεται ότι η μέθοδος του ανοσοφθορισμού σε κυτταρικό υπόστρωμα ΗEp-2 παρουσιάζει πολλά ψευδώς θετικά αποτελέσματα σε χαμηλούς τίτλους 12,13,16. Από την άλλη πλευρά είναι ένα υπόστρωμα που προσδίδει μεγάλη ευαισθησία και υψηλή ικανότητα ανίχνευσης των αυτοαντισωμάτων έναντι του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος 12,15,16,24. Σκοπός της μελέτης μας αυτής είναι να καταδείξουμε τα ποσοστά των ασθενών με θετικά χαμηλότιτλα και υψηλότιτλα αντιπυρηνικά αντισώματα, τους τύπους του φθορισμού και την αξιολόγηση των πληροφοριών αυτών στην στρατηγική για τη διάγνωση των αυτοάνοσων νοσημάτων. Υλικό και μέθοδοι Ασθενείς: Η μελέτη μας διενεργήθηκε το δεκάμηνο Σεπτεμβρίου 2000 έως Ιούνιο 2001, όπου μετρήθηκαν 9561 οροί ασθενών για τον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων. Πρόκειται για δείγμα εξωνοσοκομειακών κυρίως ασθενών, διαφόρων ηλικιών, που παρεπέμφθηκαν από τον κλινικό γιατρό για την εργαστηριακή διερεύνηση μιας συμπτωματολογίας συμβατής με αυτοάνοσο ρευματικό νόσημα.

Μέτρηση αντιπυρηνικών αντισωμάτων: Ο προσδιορισμός των αντιπυρηνικών αντισωμάτων, κλάσεως IgG, γίνεται με την μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού 40 σε διπλό υπόστρωμα, HΕp-2 κυττάρων και ψυκτικών τομών συκωτιού πιθήκου, της εταιρείας EUROIMMUN, η οποία χρησιμοποιεί την τεχνολογία των BIOCHIPs για την επίστρωση των υποστρωμάτων σε πλαστικές αντικειμενοφόρες πλάκες 15. Ο τύπος (pattern) και ο τίτλος του φθορισμού καταγράφεται, με βάση το κυτταρικό υπόστρωμα, για να αξιολογηθεί στη συνέχεια. Είναι σημαντικό να προσθέσουμε ότι σε πολλούς ορούς ασθενών είχαμε συνδυασμό τύπων φθορισμού. Οι οροί αυτοί ομαδοποιήθηκαν σύμφωνα με τον επικρατέστερο τύπο. Η αρχική αραίωση των ορών είναι η 1:100 και ακολούθως τα θετικά δείγματα ελέγχονται στις αραιώσεις 1:200, 1:320 και 1:1000. Tα θετικά δείγματα ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με τον τίτλο θετικότητας σε 1:100, 1:200 και 1:320 και ανάλογα με τον τύπο σε στικτό, ομοιογενή, πυρηνισκικό, κοκκιώδη, κεντρομεριδιακό και πυρηνικής μεμβράνης (περιφερικό). Επιπλέον, σε ένα ποσοστό των θετικών δειγμάτων γίνεται έλεγχος, με ανοσοενζυματική μέθοδο ELISA 38,39, για την παρουσία αυτοαντισωμάτων έναντι του dsdna και των πρωτεϊνικών αντιγόνων SS-A, SS-B, U1-nRNP/Sm, Sm, Scl-70, Jo-1, που είναι γνωστά ως ΕΝΑ poolplus 1 (extractable nuclear antigens plus Jo-1) 7,8,12. Τεχνική έμμεσου ανοσοφθορισμού: Οι οροί αραιώνονται 1:100 σε διάλυμα PBS-Tween 20 (200 mm NaCl, 3,5 mm Kcl, 1,5 mm KH 2 PO 4, 16,5 mm Na 2 HPO 4, 0,1 % (v/v) Tween 20). Σε 500 μl διαλύματος προσθέτονται 5 μl ορού και ακολουθεί ανάμειξη με vortex. Σε ειδικά υποθέματα (reagents support) τοποθετούνται στις αριθμημένες θέσεις 25 μl από το αραιωμένο δείγμα και στη συνέχεια το πλακάκι που περιέχει το υπόστρωμα τοποθετείται στο υπόθεμα με τρόπο ώστε το υπόστρωμα να ακουμπάει τις σταγόνες. Η τεχνική αυτή σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας εξασφαλίζει την αποφυγή εξάτμισης, λαθών κατά την τοποθέτηση των δειγμάτων και ανάμειξης των σταγόνων κατά τη διάρκεια της

Ανοσοενζυματική μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκε η ανοσοπροσροφητική επώασης. Η επώαση διαρκεί για 30 λεπτά και ακολουθεί ξέπλυμα με PBS-Tween 20, επώαση με το δεύτερο αντίσωμα, που έχει προσδεδεμένο το φθορίζον μόριο FITC (anti-human IgG- FITC) και το τελικό ξέπλυμα με PBS-Tween 20, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την διαφορική χρώση των κυττάρων και του ιστού χρησιμοποιούμε Evans blue, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί μαζί με το δεύτερο αντίσωμα ή στο τελικό διάλυμα ξεπλύματος. Μετά το τελικό ξέπλυμα ακολουθεί κάλυψη με καλλυπτρίδες και παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού OLYMPUS BH-2. Ως αρνητικά θεωρούνται τα δείγματα που δεν παρουσιάζουν καθόλου φθορισμό ή παρουσιάζουν τέτοιο οριακό φθορισμό, που δεν μπορεί να προσδιοριστεί ο τύπος (pattern). ενζυμοσυνδεόμενη δοκιμασία (ELISA) 38,39 για τον προσδιορισμό των αυτοαντισωμάτων, κλάσεως IgG, έναντι του μίγματος των πυρηνικών αντιγόνων SS-A, SS-B, nrnp/sm, Sm, Scl-70 και ενός κυτταροπλασματικού αντιγόνου της ιστιδυλικής- trna συνθετάσης (Jo-1). Θετικά θεωρούνται τα δείγματα με τίτλους > 20 U/ml. Επιπλέον, η ίδια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων IgG έναντι του dsdna. Θετικά θεωρούνται τα δείγματα με τίτλο > 100 IU/ml. Η διαδικασία διεκπεραιώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας, EUROIMMUN, των συγκεκριμένων αντιδραστηρίων (anti-ena poolplus IgG και anti-dsdna IgG). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διάκριση των τύπων φθορισμού και εργαστηριακή στρατηγική αξιολόγησης των αντιπυρηνικών αντισωμάτων. Με βάση την εικόνα του ανοσοφθορισμού στο κυτταρικό υπόστρωμα, οι οροί των ασθενών που εξετάστηκαν ομαδοποιήθηκαν στους τέσσερεις κύριους τύπους φθορισμού:

στικτό (granular or speckled), ομοιογενή (homogeneous), πυρηνισκικό (nucleolar) και κοκκιώδη (dotted). Στον κοκκιώδη τύπο φθορισμού ανήκει ο κεντρομεριδιακός, που αποτελεί ξεχωριστεί ομάδα, όπως επίσης ξεχωριστεί κατηγορία αποτελεί ο φθορισμός πυρηνικής μεμβράνης, περιφερικός (peripheral or rim). Στην εικόνα 1 φαίνονται οι τύποι του πυρηνικού φθορισμού, όπου μπορούμε να διακρίνουμε τις διαφορές στα μεσοφασικά και μιτωτικά κύτταρα σε κάθε τύπο. Ο έλεγχος των αντιπυρηνικών αντισωμάτων σε διπλό υπόστρωμα HEp-2 κυττάρων/ συκωτιού πιθήκου, μας δίνει τη δυνατότητα της καλύτερης συσχέτισης του τύπου του φθορισμού με το συγκεκριμένο αντιγόνο, στόχο των αυτοαντισωμάτων. Διαπιστώσαμε ότι αρκετοί οροί με στικτό τύπο φθορισμού στο κυτταρικό υπόστρωμα, στα κύτταρα του συκωτιού έδειχναν λιγότερη ένταση φθορισμού (SSA, SSB τύπος) ή παρόμοια ένταση φθορισμού με το κυτταρικό υπόστρωμα (nrnp/sm τύπος) ή σε άλλες περιπτώσεις έδειχναν διάσπαρτο πυρηνικό φθορισμό ίδιας εντάσης (Ku τύπος) ή καθόλου φθορισμό (Cyclin I, II). Επίσης, στον πυρηνισκικό φθορισμό, μπορούμε να διακρίνουμε τον ομοιογενή πυρηνισκικό (PM-Scl) ή το στικτό πυρηνισκικό (φιμπριλλαρίνη, RNA πολυμεράση Ι). Επιπλέον, πρέπει να τονίσουμε την παρουσία σε αρκετά δείγματα αντικυτταροπλασματικού φθορισμού, που οφείλεται σε διάφορα κυτταροπλασματικά αντιγόνα, όπως μιτοχονδριακά ένζυμα, ριβοσωμικές πρωτεΐνες, λυσσόσωμα, σύμπλεγμα Golgi και t-rna συνθετάσες. Στην εικόνα 2, φαίνεται η ενδεδειγμένη στρατηγική για την αξιολόγηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων. Ο τύπος του φθορισμού μας οδηγεί σε συγκεκριμένα αντιγόνα, τα οποία έχουμε την δυνατότητα να διερευνήσουμε με μεθόδους ELISA και Western blot. Το κάθε αντιγόνο έχει κάποια συσχέτιση με συγκεκριμένα αυτοάνοσα νοσήματα και σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα του ασθενή μπορεί να μας οδηγήσει σε ασφαλή διάγνωση του αυτοάνοσου νοσήματος.

Εικόνα 1: a) Στικτός τύπος φθορισμού με απροσδιόριστο αριθμό κοκκίων στα μεσοφασικά κύτταρα. Στα μιτωτικά κύτταρα (βέλος), η κεντρική χρωμοσωμική περιοχή εμφανίζεται σκοτεινόχρωμη, ενώ υπάρχει περικεντρική εντόπιση κοκκίων. Το κυτταρόπλασμα είναι χρωματισμένο κόκκινο εξαιτίας του Evans blue. b) Ομοιογενής τύπος φθορισμού, με ομοιόμορφη χρώση των πυρήνων των μεσοφασικών κυττάρων (καμπυλωτό βέλος) και της χρωμοσωμικής περιοχής των μιτωτικών κυττάρων (βέλος). c) Πυρηνισκικός τύπος φθορισμού, με τους πυρηνίσκους (5-6 ανά κύτταρο) να εμφανίζονται έντονα χρωματισμένοι. d) Πυρηνισκικός τύπος φθορισμού, με τους πυρήνες να εμφανίζονται ομοιογενώς χρωματισμένοι με εντονότερη χρώση των πυρηνίσκων. Πρόκειται για χαρακτηριστικό φθορισμό του Scl-70 (τοποϊσομεράση 1). e) Φθορισμός πυρηνικής μεμβράνης, με τους πυρήνες των μεσοφασικών κυττάρων (μικρό βέλος) ομοιογενώς χρωματισμένους και την κεντρική χρωμοσωμική περιοχή των μιτωτικών κυττάρων (μεγάλο βέλος) σκοτεινόχρωμη. f) Φθορισμός πυρηνικής μεμβράνης σε υπόστρωμα ψυκτικών τομών συκωτιού πιθήκου. Είναι χαρακτηριστική η δακτυλιοειδής χρώση των πυρήνων (περιφερειακή), ενώ το πυρηνόπλασμα εμφανίζεται σκοτεινόχρωμο (βέλος). g) Κοκκιώδης κεντρομεριδιακός τύπος φθορισμού, με χαρακτηριστική εντόπιση 46 ή 92 κοκκίων στους πυρήνες των μεσοφασικών κυττάρων. Η χρωμοσωμική περιοχή των μιτωτικών κυτταρών (βέλος) εμφανίζει επίσης κοκκιώδη φθορισμό. h) Κοκκιώδης τύπος φθορισμού. Στους πυρήνες των μεσοφασικών κυττάρων εντοπίζονται 10-20 κοκκία. Στα μιτωτικά κύτταρα (βέλος) η χρωμοσωμική περιοχή φαίνεται σκοτεινόχρωμη.

Εικόνα 2: Παρουσίαση της στρατηγικής που ακολουθούμε για την ανίχνευση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Στα θετικά δείγματα επισημαίνουμε τον τύπο του φθορισμού, που σχετίζεται με συγκεκριμένα αντιγόνα, που μπορούμε να διερευνήσουμε περαιτέρω με άλλες μεθόδους.

Μέτρηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων και προσδιορισμός του τίτλου και του τύπου του ανοσοφθορισμού. Από τους 9561 ασθενείς, άνδρες και γυναίκες, που εξετάστηκαν για αντιπυρηνικά αντισώματα οι 5339, ποσοστό 55,9 %, βρέθηκαν αρνητικοί. Οι 1563, ποσοστό 16,3 %, βρέθηκαν θετικοί σε τίτλους 1:320, ενώ οι 1453 (15,2 %) και 1206 (12,6%) οριακά θετικοί 1:100 και ασθενώς θετικοί 1:200, αντίστοιχα (πίνακας 1). Από τους 4222 (44,1 %) ασθενείς με θετικά ΑΝΑ, ένα μεγάλο ποσοστό 63 % παρουσιάζουν οριακούς ή ασθενώς θετικούς τίτλους, που προβληματίζουν το εργαστήριο για την εγκυρότητά τους, αλλά και τον θεράποντα ιατρό για την διαγνωστική τους αξία. Από το σύνολο των ασθενών το 25,4 % ήταν άνδρες και το 74,6 % γυναίκες (πίνακας 2). Στους άνδρες διαπιστώθηκε ότι τα θετικά ΑΝΑ με τίτλους 1:320 αποτελούν το 9,1 % του συνόλου, ενώ στις γυναίκες το 19,3 %. Σε αντίθεση με τα υψηλότιτλα θετικά δείγματα, άνδρες και γυναίκες παρουσιάζουν τα ίδια ποσοστά οριακών θετικών δειγμάτων 1:100, ενώ παρατηρείται μικρή διαφοροποίηση στα ασθενώς θετικά δείγματα με τίτλο 1:200. Επιπλέον, ΑΝΑ αρνητικά παρουσίασε το 64,9 % (0,02 <p< 0,05) των ανδρών και το 51,8 % των γυναικών. Στο σύνολο των 4222 ασθενών με θετικά ή ασθενώς θετικά ΑΝΑ, διαπιστώσαμε ότι το 70,1 % παρουσιάζουν στικτό τύπο φθορισμού, το 16,1 % ομοιογενή φθορισμό, το 9,9 % πυρηνισκικό, το 1,4 % κοκκιώδη, το 1,4 % κεντρομεριδιακό και το 1,1 % φθορισμό πυρηνικής μεμβράνης (πίνακας 3). Τα γνωστά αντιγόνα που συνδέονται με τον κάθε τύπο ανοσοφθορισμού αναφέρονται στην εικόνα 2 και τα περισσότερα από αυτά μπορούν να ανιχνευτούν με μεθόδους ELISA και western blotting. Πίνακας 1: Μέτρηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων και μηνιαία καταγραφή των αποτελεσμάτων. Στα θετικά δείγματα καταγράφεται ο τίτλος του φθορισμού 1:100,1:200 και 1:320.

Μήνας Αρ. δειγμάτων θετικά 1:100 θετικά 1:200 θετικά 1:320 αρνητικά Σεπτέμβριος 969 133 (13,7 %) 66 (6,8 %) 85 (8,8 %) 685 (70,7 %) Οκτώβριος 970 176 (18,1 %) 118 (12,2 %) 138 (14,2 %) 538 (55,5 %) Nοέμβριος 957 135 (14,1 %) 127 (13,3 %) 140 (14,6 %) 555 (58,0 %) Δεκέμβριος 728 130 (17,9 %) 105 (14,4 %) 116 (15,9 %) 377 (51,8 %) Ιανουάριος 968 153 (15,8 %) 134 (13,8 %) 165 (17,1 %) 516 (53,3 %) Φεβρουάριος 884 141 (16,0 %) 152 (17,2 %) 191 (21,6 %) 400 (45,2 %) Μάρτιος 1129 211 (18,7 %) 182 (16,1 %) 166 (14,7 %) 570 (50,5 %) Απρίλιος 799 101 (12,6 %) 89 (11,1 %) 121 (15,2 %) 488 (61,1 %) Μαΐος 1132 139 (12,3 %) 127 (11,2 %) 248 (21,9 %) 618 (54,6 %) Ιούνιος 1025 134 (13,1 %) 106 (10,3 %) 193 (18,8 %) 592 (57,8 %) ΣΥΝΟΛΟ 9561 1453 1206 1563 5339 ποσοστό % (15,2 %) (12,6 %) ( 16,3 %) ( 55,9 %) Πίνακας 2: Μέτρηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων και καταγραφή των αποτελεσμάτων σε άνδρες και γυναίκες, ως ποσοστό %. Φύλο Θήλυ Σύν. δειγμάτων σε ποσοστό % 74,6 % ΑΝΑ 1:100 ΑΝΑ 1 :200 ΑΝΑ 1:320 ΑΝΑ αρνητικά 15,4 % 13,5 % 19,3 % 51,8 % Άρρεν 25,4 % 15,0 % 11,0 % 9,1 % 64,9 % Πίνακας 3: Μέτρηση των αντιπυρηνικών αντισωμάτων και κατάταξη των δειγμάτων ανάλογα με τον τύπο του ανοσοφθορισμού.

ΑΝΑ θετικά 4222 2960 Στικτός Ομοιογενής Πυρηνισκικός Κοκκιώδης Κεντρομεριδιακό ς 678 420 58 60 Πυρηνικής μεμβράνης 46 (70,1 %) (16,1 %) (9,9 %) (1,4 %) (1,4 %) (1,1 %) Προσδιορισμός των αυτοαντισωμάτων αντι-ενα. Ο προσδιορισμός των αντι-ενα (extractable nuclear antigens) αντισωμάτων διενεργείται κυρίως σε δείγματα ασθενών με στικτό, ομοιογενή και πυρηνισκικό τύπο φθορισμού. Τα δείγματα με θετικά τα SS-A, SS-B και nrnp/sm, χαρακτηρίζονται από στικτό και σπανιότερα από ομοιογενή τύπο φθορισμού, ενώ αυτά που έχουν θετικό Scl-70, από πυρηνισκικό τύπο. Από τους 288 ασθενείς με θετικά ΑΝΑ που εξετάστηκαν για αντι-ενα, οι 68 βρέθηκαν θετικοί, ποσοστό 23,6 %. Από τα 151 δείγματα με τίτλο ΑΝΑ 1:320, τα 63 (41,7 %) παρουσιάσαν αντι-ενα θετικά. Ενώ, από τα 137 δείγματα με χαμηλότιτλο ΑΝΑ, μόνο 5 (3,8 %) παρουσίασαν θετικά αντι-ενα. Από τα δείγματα με υψηλότιτλο ΑΝΑ και με στικτό τύπο φθορισμού το 48,3 % παρουσίασε αντι-ενα θετικά, ενώ από τα χαμηλότιτλα με στικτό φθορισμό το 3,8 % είχαν αντι-ενα θετικά. Από τα δείγματα με τίτλο ΑΝΑ 1: 320 και πυρηνισκικό φθορισμό, το 21,7 % είχαν αντι-ενα θετικά. Τα δείγματα με ομοιογενή φθορισμό, όπως αναμενόταν, ήταν αρνητικά για αντι-ενα (πίνακας 4). Επίσης, πρέπει να σημειώσουμε ότι όλα τα δείγματα (407 ασθενών) με ΑΝΑ αρνητικά που εξετάστηκαν παρουσίασαν αντι-ενα αρνητικά.

Πίνακας 4: Μέτρηση των αντι-ενα αντισωμάτων σε δείγαμτα με θετικά ΑΝΑ και συγκεκριμένο τύπο ανοσοφθορισμού. Τίτλος ΑΝΑ 1:320 ΑΝΑ 1:200 και 1:100 Τύπος Στικτός Ομοιογ. Πυρην/κός Στικτός Ομοιογ. Πυρην/κός ΑΝΑ Θετικά 120 8 23 132 2 3 αντι-ενα Θετικά 58 0 5 5 0 0 ποσοστό % 48,3-21,7 3,8 - - Προσδιορισμός των αυτοαντισωμάτων αντι-dsdna Σε 3594 ορούς ασθενών με θετικά αντιπυρηνικά αντισώματα, μετρήσαμε τα αντι-dsdna αντισώματα. Στο σύνολο των δειγμάτων μόνο 64 (ποσοστό 1,8 % ) είχαν θετικά αντι-dsdna. Πρέπει να σημειώσουμε ότι το 10 % των δειγμάτων με θετικά αντι-dsdna παρουσιάζει χαμηλότιτλα αντιπυρηνικά αντισώματα. Επίσης, τα μισά περίπου από τα δείγματα με θετικά αντι-dsdna, παρουσίασαν ΑΝΑ με ομοιογενή τύπο φθορισμού και τίτλο θετικότητας 1:320. Ανίχνευση κυτταροπλασματικών αντιγόνων Στο σύνολο των δειγμάτων που εξετάσαμε, ένα ποσοστό 4 % παρουσίασε αντισώματα έναντι των μιτοχονδριακών ενζύμων (AMA). Επίσης, σε ποσοστό μικρότερο από 0,5 % παρατηρήθηκε κυτταροπλασματικός φθορισμός έναντι P ριβοσωμικών πρωτεϊνών, ακτίνης, βιμεντίνης, συσκευής Golgi, λυσοσωμάτων και έναντι t-rna συνθετασών (Jo-1, PL-7, PL- 12, OJ, EJ). Σε ελάχιστες περιπτώσεις, παρατηρήθηκε φθορισμός μόνο στα μιτωτικά κύτταρα, όπου τα υπεύθυνα αντιγόνα ήταν η μιτωτική άτρακτος (MSA-1), το ενδιάμεσο σώμα (MSA- 2) και τα αντιγόνα που σχετίζονται με τα χρωμοσώματα (MSA-3). Κάποια από αυτά τα

κυτταροπλασματικά αντιγόνα μπορούν τα προσδιοριστούν με ELISA ή westernblot (AMA, P ριβοσωμικές πρωτεΐνες, Jo-1). ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η ανίχνευση των ΑΝΑ με την μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού εξασφαλίζει μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα, αφού δίνει την δυνατότητα εντοπισμού του συνόλου των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών αντιγόνων, που αποτελούν στόχους των αυτοαντισωμάτων 12,15,16. Ο συνδυασμός του τίτλου και του τύπου του φθορισμού, μας οδηγεί στην περαιτέρω διερεύνηση με μεθόδους ELISA και Westernblot, ώστε να καταλήξουμε σε ασφαλές εργαστηριακό αποτέλεσμα 12,13,22-24. Στα αποτελέσματά μας είναι σαφές ότι το 16,3 % των ασθενών παρουσίασε θετικά ΑΝΑ σε τίτλους 1:320 και 27,8 % των ασθενών παρουσίασε ασθενώς θετικά ΑΝΑ σε τίτλους 1:100 και 1:200. Στο σύνολο των δειγμάτων με θετικό ΑΝΑ το 63 % παρουσιάζει χαμηλούς τίτλους, που η αξιολόγησή τους προβληματίζει το εργαστήριο, καθώς και τον θεράποντα ιατρό. Παρόμοιες μελέτες σε υγιή πληθυσμό υπολογίζουν το ποσοστό των θετικών ΑΝΑ, σε χαμηλούς τίτλους, περίπου στο 7% 34. Άλλοι ερευνητές διαπιστώνουν, σε ομάδα ασθενών με νοσήματα χαμηλής συσχέτισης με τα ΑΝΑ, ότι περίπου το 30 % παρουσιάζει ΑΝΑ θετικά σε χαμηλούς τίτλους 1:40, 1:80, ενώ αρνητικά ΑΝΑ παρουσιάζει περίπου το 60 % των ασθενών 16. Συνήθως, τίτλοι >1:160 έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να είναι σημαντικοί 12. Οι ιδιαιτερότητες της μεθόδου του ανοσοφθορισμού, η μεγάλη ευαισθησία του κυτταρικού υποστρώματος, αλλά και η υποκειμενικότητα της παρατήρησης είναι παράγοντες που μπορεί να δώσουν αποτελέσματα σε χαμηλούς ή οριακούς τίτλους 12. Ο τύπος του ανοσοσφορισμού είναι συνήθως ενδεικτικός της ειδικότητας του αποτελέσματος. Ο πυρηνισκικός ή κοκκιώδης τύπος ή ακόμη και ο φθορισμός πυρηνικής

μεμβράνης, εξ αιτίας της καθορισμένης τοπολογίας των αντιγόνων στον πυρήνα των κυττάρων θεωρείται περισσότερο ειδικός και μπορεί να αξιολογηθεί ευκολότερα ως εργαστηριακό εύρημα 21,27,28,30-33. Αντίθετα, ο στικτός και ομοιογενής τύπος σε χαμηλούς τίτλους και με την ασαφή εντόπιση του φθορισμού, προκαλεί δυσκολίες στην αξιολόγησή του. Στην μελέτη μας από τα 4222 δείγματα θετικά για ΑΝΑ τα μισά περίπου εμφανίζουν στικτό ή ομοιογενή φθορισμό σε χαμηλούς τίτλους 1:100 ή 1:200. Φαίνεται από τα ευρήματά μας ότι οι χαμηλοί αυτοί τίτλοι δεν αξιολογούνται στις περισσότερες περιπτώσεις. Η πρώτη ισχυρή ένδειξη προς αυτή την κατεύθυνση είναι το δεδομένο που προκύπτει από τα αποτελέσματά μας, ότι μεταξύ ανδρών και γυναικών τα οριακά θετικά ΑΝΑ σε τίτλο 1:100, βρίσκονται ακριβώς στο ίδιο ποσοστό (περίπου 15 %), ενώ υψηλότιτλα ΑΝΑ συναντάμε στο 19,3 % των γυναικών και στο 9,1 % των ανδρών. Είναι γνωστό ότι τα αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα προσβάλλουν περισσότερο τις γυναίκες και αναμέναμε αυτή η διαφοροποίηση μεταξύ ανδρών και γυναικών να διατηρείται και στα χαμηλότιτλα δείγματα. Η δεύτερη καθοριστική ένδειξη ως προς της αξιολόγηση των χαμηλότιτλων ΑΝΑ 1:100 και 1:200, είναι τα ευρήματα από την μελέτη των δειγμάτων με στικτό φθορισμό για τον προσδιορισμό των αντι-ενα, μεταξύ των οποίων διαπιστώνεται εξαιρετική συσχέτιση 16. Μόνο το 3,8 % των δειγμάτων με χαμηλότιτλα ΑΝΑ παρουσιάζουν θετικά αντι-ενα και προέρχονται κυρίως από ασθενείς με σύνδρομο Sjogren s (SS-A θετικά). Αντίθετα, τα μισά περίπου δείγματα (48,3 %) με ΑΝΑ θετικό σε τίτλο 1:320 και στικτό τύπο φθορισμού, παρουσιάζουν αντι-ενα θετικό. Από τα δείγματα με θετικό ΑΝΑ και πυρηνισκικό φθορισμό περίπου το 1/5 παρουσιάζει θετικά αντι-ενα, που σημαίνει με μεγάλη βεβαιότητα ότι το υπεύθυνο αντιγόνο στόχος είναι το Scl-70 16. Προκύπτει, ότι το αντι-ενα είναι μια κατάλληλη επιβεβαιωτική δοκιμασία στις περιπτώσεις στικτού και πυρηνισκικού τύπου ανοσοφθορισμού σε υψηλότιτλα θετικά ΑΝΑ, ενώ σε δείγματα με ΑΝΑ θετικά σε χαμηλούς

τίτλους, πρέπει να διενεργείται σε περιπτώσεις που τα κλινικά ευρήματα επιβάλλουν τον περαιτέρω έλεγχο. Πρέπει να σημειώσουμε ότι οι πληροφορίες που πέρνουμε με τον ανοσοφθορισμό μας καθοδηγούν να προβλέψουμε το υπεύθυνο αντιγόνο. Το Ku δίνει χαρακτηριστική εικόνα φθορισμού στα κύτταρα του ήπατος, όπως και το RNP ή τα SS-A, SS-B. Επίσης, ο πυρηνισκικός φθορισμός διαφοροποιείται ανάλογα με το αντιγόνο. Το πιο χαρακτηριστικό είναι το Scl-70 και το Pm-Scl, αλλά και η φιμπριλλαρίνη και η RNA-πολυμεράση Ι. Είναι πολύ σημαντικό να έχουμε ταυτόχρονη εικόνα σε κυτταρικό υπόστρωμα και ηπατικό ιστό, για να μπορούμε να αξιολογούμε το αποτέλεσμα. Μια σημαντική παρατήρηση, που συνηγορεί υπέρ της μη αξιολόγησης των χαμηλότιτλων ΑΝΑ είναι ότι τα δείγματα αυτά δεν δίνουν φθορισμό στον ηπατικό ιστό και θεωρούνται αρνητικά. Παρόμοιες μετρήσεις ΑΝΑ άλλων ερευνητικών ομάδων 16, δείχνουν μια συμφωνία 75,4 % με απόκλειση ± 1 τίτλο μεταξύ συκωτιού αρουραίου και ΗΕp-2. Επίσης, μετρήσεις των ΑΝΑ σε υγιή πληθυσμό, στα δύο υποστρώματα έδειξαν μια σημαντική μείωση των θετικών δειγμάτων, από το 6,9 % στα ΗEp- 2 στο 1,9 % στο συκώτι 34. Εκτός από τα πρωτεϊνικά αντιγόνα, στόχο των αυτοαντισωμάτων αποτελούν και τα ds DNA, ss DNA και RNA. Από το σύνολο των ασθενών με θετικό ΑΝΑ, μόνο το 1,8 % παρουσιάζει αντι-dsdna θετικά. Από αυτά περίπου το 10 % προέρχεται από δείγματα με χαμηλότιτλο ΑΝΑ. Υπολογίζουμε ότι, από το σύνολο των δειγμάτων με θετικά ΑΝΑ σε τίτλους 1:100, 1:200, ένα πολύ μικρό ποσοστό < 0,5 % εμφανίζει αντι-ds-dna θετικά. Το ποσοστό αυτό στο σύνολο των δειγμάτων με θετικά ΑΝΑ σε τίτλους 1/320 ανέρχεται περίπου στο 5 %. Αυτό αποτελεί μια επιπλέον ένδειξη για την χαμηλή διαγνωστική αξία των χαμηλών θετικών τίτλων των αντιπυρηνικών αντισωμάτων, Ο τύπος του φθορισμού στα δείγματα αυτά είναι κυρίως ομοιογενής ή στικτός. Είναι γεγονός ότι ο ομοιογενής τύπος φθορισμού, που παρουσιάζεται σε διάφορες μορφές, με θετικό ή αρνητικό πυρηνίσκο ή με

στοιχεία στικτού τύπου με θετικές μιτώσεις 16, είναι περισσότερο δύσκολη η συσχέτισή του με συγκεκριμένα αντιγόνα, αφού τα ποσοστά των δειγμάτων με θετικά αντι-dsdna, αντιssdna και αντι-ιστονών είναι πολύ χαμηλά. Τέλος, πρέπει να επισημάνουμε την σπουδαιότητα της περαιτέρω μελέτης των αυτοαντισωμάτων έναντι του κυτταροπλάσματος 37, αφού σε αρκετές περιπτώσεις η κλινική συσχέτιση των αυτοαντισωμάτων αυτών δεν είναι ξεκάθαρη. Ιδιαίτερα, τα αντισώματα έναντι της συσκευής Golgi 35,36, των ινιδίων βιμεντίνης και τροπομυοσίνης, των λυσοσωμάτων και των μιτωτικών κυττάρων αποτελούν πεδίο πολύ σημαντικό για μελλοντικές μελέτες 37. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην μελέτη μας χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IIF) σε διπλό υπόστρωμα Hep-2 κυττάρων / συκώτι πιθήκου της εταιρείας Euroimmun, για τον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (ΑΝΑ) σε 9561 ασθενείς. Από το σύνολο των ασθενών το 55,9 % βρέθηκε αρνητικό, το 16,3 % των ασθενών βρέθηκαν θετικοί σε τίτλους 1:320 και το 15,2 % και 12,6 %, οριακά θετικοί 1:100 και ασθενώς θετικοί 1:200, αντίστοιχα. Θετικά ΑΝΑ σε τίτλους 1:320 βρέθηκαν στο 9,1 % των ανδρών και στο 19,3 % των γυναικών, ενώ τα χαμηλότιτλα ΑΝΑ ήταν περίπου στα ίδια ποσοστά σε άνδρες και γυναίκες. Στο σύνολο των θετικών δειγμάτων το 70,1 % παρουσίασε στικτό τύπο φθορισμού, το 16,1 % ομοιογενή, το 9,9 % πυρηνισκικό, το 1,4 % κοκκιώδη, το 1,4 % κεντρομεριδιακό και το 1,1 % φθορισμό πυρηνική μεμβράνης. Στα δείγματα με θετικό ΑΝΑ σε τίτλους 1:320 και στικτό φθορισμό προσδιορίστηκαν θετικά αντι-ενα (SS-A, SS-B, nrnp/sm, Sm, Scl-70, Jo-1) στο 48,3 %, ενώ σε αυτά με πυρηνισκικό φθορισμό, στο 21,7 %. Στα δείγματα με χαμηλότιτλο ΑΝΑ, μόνο το 3,8 % παρουσίασε αντι-ενα θετικό. Στο σύνολο των ΑΝΑ θετικών δειγμάτων το 1,8 % εμφάνισε αντι-dsdna θετικά, ενώ διαπιστώσαμε και δείγματα με αντισώματα έναντι των κυτταροπλασματικών συστατικών. Τα αποτέλεσματα αυτά

συμφωνούν με μελέτες άλλων ερευνητών, που συμπεραίνουν ότι η μέθοδος του ανοσοφθορισμού παρουσιάζει μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα, αλλά δίνει μεγάλα ποσοστά χαμηλότιτλων ΑΝΑ, που φαίνεται να μην αξιολογούνται στις περισσότερες των περιπτώσεων. Επιπλέον, η χρησιμοποίηση του διπλού υποστρώματος Hep-2 κυττάρων / συκώτι πιθήκου και ο τύπος του φθορισμού, είναι καθοριστικά για την στρατηγική της εργαστηριακής διάγνωσης, αφού μας καθοδηγούν στην εύρεση του υπεύθυνου αντιγονικού στόχου.

Measurement and estimation of antinuclear antibodies by immunofluorescence and strategy in laboratory diagnosis of autoimmune diseases. K.E. Keramaris 1,2, P. Karampatsis 2, L.H. Margaritis 1 1 Division of Cell Biology & Biophysics, Dept. of Biology, Athens University. 2 Dept. of Immunology, Laboratory of reference and quality control, Microanalysis S.A., Athens. In our study, we used the standard indirect immunofluorescence (IIF) method, on double substrate HEp-2 cells/frozen sections of primate liver (Euroimmun GmbH), for the measurement of the antinuclear antibodies (ANA) in sera from 9561 patients, with clinical symptoms associated with autoimmune diseases. The sera with granular, homogeneous and nucleoli pattern tested with ELISA for the detection of the anti-ena antibodies (extractable nuclear antigens, nrnp/sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 plus Jo-1, Euroimmun GmbH). In addition, 3594 sera with positive ANA analysed for the detection of anti-dsdna antibodies. The purpose of this study was the determination of the low and high titer positive ANA, the fluorescence pattern and their significance in the strategy of the laboratory diagnosis of autoimmune diseases. From the 9561 patient samples the 5339 (55,9 %) were ANA negative, the 1453 (15,2%) were low positive at titer 1:100, the 1206 (12,6 %) were positive at titer 1:200 and the 1563 (16,3%) were positive at titer 1:320. From the total patients the 74,6 % was females and the 25,4% was males. The 19,3 % of the females and the 9,1 % of the males appeared positive ANA at titer 1:320 and the 15 % of the females and males showed low positive ANA at titers 1:100. From the 4222 samples with positive ANA, the 70,1 % appeared granular pattern, the 16,1 % homogeneous, the 9,9 % nucleoli pattern, the 1,4 % nuclear dots, the 1,4 % centromere and 1,1 % nuclear membrane pattern. From the 120 samples with

positive ANA at titer 1:320 and granular pattern, the 58 (48,3 %) appeared positive ENA antibodies. From the 132 samples with low titer positive ANA at 1:100 and at 1:200 only the 5 (3,8%) showed positive ENA antibodies. In addition, from the 3594 ANA positive sera only the 64 (1,8 %) were anti-dsdna positive. The our results are according with other studies concluded that the immunofluorescence method shows high sensitivity and specificity but indicates high percentage of low titer positive ANA. In most cases, the low positivity of ANA is insignificant without clinical association. Also, is necessary the patient samples are tested in parallel against both substrates HEp-2 cells and liver tissue sections. The substrate combination and the fluorescence pattern constitute the correct strategy to ascertain of cell nucleus antibodies. The fluorescence pattern is depending on the location of the individual autoantigens which are identified with ELISA or western blot, in order to the laboratory results to lead the safe diagnosis of autoimmune disease.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. TAN E.M., CHAN E.K.L., SULLIVAN K.F., RUBIN R.L.. Antinuclear antibodies (ANAs): Diagnostically specific immune markers and clues toward the understanding of systemic autoimmunity. Clin. Immunology and immunopathology. 1988. 47:121-141. 2. EMLEN W. AND O NEILL L.: Clinical significance of antinuclear antibodies. Arthr. Rheum. 1997, 40: 1612-1618. 3. SLATER C.A., DAVIS R.B., SHMERLING R.H.: Antinuclear antibody testing. A study of clinical utility. Arch. Intern. Med. 1996, 156:1421-1425. 4. TAN E.M.: Antinuclear antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv.Immunol.. 1989, 44: 93-151. 5. NAKAMURA R.M., TAN E.M. Recent advances in laboratory tests and the significance of autoantibodies to nuclear antigens in systemic rheumatic diseases. Clinics in Laboratory Medicine, 1986. 6: 41-53. 6. HAUG L.M., NAKAMURA R.M. Current concepts and advances in clinical laboratory testing for autoimmune disease. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.. 1997. 34:275-311. 7. HORSFALL A.C.: Detection and clinical relevance of anti-dna/anti-ena antibodies. Immunol. Today. 1988, 9: 159-160. 8. BRINKMAN K., TERMAAT R., VAN DEN BRINK H. et. al..the specificity of the anti-dsdna ELISA. J. Immunol. Meth..1991, 139:91-100. 9. FRITZLER M.J.. Autoantibodies in scleroderma. Journal of Dermatology. 1993. 20:257-268. 10. TOWER Y., BUSKILA D. SHOENFIELD Y.. Pathogenic significance and diagnostic value of lupus autoantibodies. Inter. Arch. of Allergy and Immunology. 1993. 100:293-306.

11. VAN VENROOIJ W.L.,CHARLES P., MAINI R.N.. The consensus workshop for detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. Journal of Immunological Methods, 1991. 140:181-189. 12. EGNER W. The Use of laboratory tests in diagnosis of SLE. J. Clin. Path. 2000, 53(6): 424-432. 13. GNIEWEK H., STITES D.P., MCHUGH T.M., HILTON J.F., NAKAGAWA M.. Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1997, 4:185-188. 14. JASKOWSKI T.D., SCHRODER C., MARTINS T.B., MOURITSEN C.L., LITWIN C.M., HILL H.R.. Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am. J. Clin. Path.. 1996. 105:468-473. 15. SCHLUMBERGER W., OLBRICH S., MULLER-KUNERT E, STOCKER W. Human epithelial cells (HEp-2) and primate liver: A BIOCHIP-combination for the diagnosis of autoimmune diseases. 2000, Review pp 1-28. Euroimmun, Laboratory for experimental Immunology, GmbH. 16. KERN P., KRON M., HIESCHE K.. Measurement of antinuclear antibodies: Assessment of different test systems. Clin. and Diagn. Lab. Immunol. 2000, 1(7):72-78. 17. REIMER G., HUSCHKA U., KELLER J., KAMMERER R., HORNSTEIN O.P.. Immunofluorescence studies in progressive systemic sclerosis (scleroderma) and mixed connective tissue disease. Br J Dermatol. 1983. 109(1):27-36. 18. MOUTSOPOULOS H.M. Immunopathology of Sjogren s syndrome: more questions than answers. Lupus. 1993. 2: 49-53. 19. XANTHOU G., TERINOS N.I., POLIHRONIS M., NEZIS I.P., MARGARITIS L.H., MOUTSOPOULOS H.M.. CD4 cytotoxic and dendritic cells in the immunopathologic lesion of Sjogren s syndrome. 1999. 118: 154-163.

20. EVANS J., REUBEN A., CRAFT J.. PBC 95k, a 95-kilodalton nuclear autoantigen in primary biliary cirrhosis. 1991, 34(6): 731-736 21. BUNN C.C., DENTON C.P., SHI-WEN X., KNIGHT C., BLACK C.M.. Anti-RNA polymerases and other autoantibody specificities in systemic sclerosis. Br J Rheumatol. 1998. 37(1):15-20. 22. CAPIN N.G., RODRIGUEZ M.R., LAVALLE C.M., ORTIZ-ORTIZ L.. Immunoblot assay for detection of autoantibodies in autoimmune disease. J. Clin. Lab. Anal.. 1992. 6(5):319-323. 23. SCHLUMBERGER W., MEYER W., PROOST S., DAHNRICH C., MULLER- KUNERT E., SONNENBERG K., OLBRICH S., STOCKER W.. The new EUROBLOT technology: Differentiation of autoantibodies against cell nuclei. European Jornal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 1995, 33:116. 24. RONDEEL J.M., VAN GELDER W., VAN DER LEEDEN H., DINKELAAR R.B.. Different strategies in the laboratory diagnosis of autoimmune disease: immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbent assay or both? Ann Clin Biochem. 1999. 36 ( Pt 2):189-95. 25. WERMUTH D.J., GEOGHEGAN W.D., JORDON R.E.. Anti-Ro/SSA antibodies. Association with a particulate (large speckledlike thread) immunofluorescent nuclear staining pattern. Arch Dermatol. 1985. 121(3):335-8. 26. FELTKAMP T.E., KLEIN F., JANSSENS M.B.. Standardisation of the quantitative determination of antinuclear antibodies (ANAs) with a homogeneous pattern. Ann Rheum Dis. 1988. 47(11):906-9. 27. DAGENAIS A., BIBOR-HARDY V., SENECAL J.L.. A novel autoantibody causing a peripheral fluorescent antinuclear antibody pattern is specific for nuclear pore complexes. Arthritis Rheum. 1988. 31(10):1322-7.

28. ZUBER M., HEYDEN T.S., LAJOUS-PETTER A.M.. A human autoantibody recognizing nuclear matrix-associated nuclear protein localized in dot structures. Biol. Cell, 1995, 85(1): 77-86. 29. STRASSBURG C.P., MANNS M.P.. Antinuclear antibody (ANA) patterns in hepatic and extrahepatic autoimmune disease. J Hepatol. 1999. 31(4):751. 30. REMMEL T., PIIRSOO A., KOIVEER A., REMMEL H., UIBO R., SALUPERE V.. Clinical significance of different antinuclear antibodies patterns in the course of primary biliary cirrhosis. Hepatogastroenterology. 1996. 43(11):1135-40. 31. PARVEEN S., MORSHED S.A., NISHIOKA M.. High prevalence of antibodies to recombinant CENP-B in primary biliary cirrhosis: nuclear immunofluorescence patterns and ELISA reactivities. J Gastroenterol Hepatol. 1995. 10(4):438-45. 32. SENECAL J.L., RAYMOND Y.. Autoantibodies to DNA, lamins, and pore complex proteins produce distinct peripheral fluorescent antinuclear antibody patterns on the HEp-2 substrate. Arthritis Rheum. 1991. 34(2):249-51. 33. FRITZLER M.J., VALENCIA D.W., MCCARTY G.A.. Speckled pattern antinuclear antibodies resembling anticentromere antibodies. Arthritis Rheum. 1984. 27(1):92-6. 34. AZIZAH M.R., SHAHMAZ M., ZULKIFLI M.N, NASURUDDIN B.A.. Antinuclear, anti-mitochondrial, anti-smooth muscle and anti-pariental cell antibodies in the healthy Malaysian population. Malays. J. Patho., 1995. 17(2):83-86. 35. BIZZARO N., PASINI P., GHIRARDELLO A., FINCO B.. High anti-golgi autoantibody levels: an early sign of autoimmune disease? Clin. Rheumatol.. 1999, 18(4):346-348. 36. HOHG H.S., MORSHED S.A., TANAKA S., FUJIWARA T., IKEHARA Y., NISHIOKA M.. Anti-golgi antibody in rheumatoid arhritis patients recognizes a novel antigen of 79 kda (doublet) by western blot. Scand. J. Immunol., 1992, 36(6):785-792.

37. KOH W.H., DUNPHY J., WHYTE J., DIXEY J., MCHUGH N.J.. Characterisation of anticytoplasmic antibodies and their clinical associations. Ann Rheum Dis. 1995 Apr;54(4):269-73. 38. VOLLER A., BARLETT A.,BIDWELL D.E. Enzyme immunoassay techniques. In:Ligand Assay, 1978. Edited by J. Langan and J.J. Clapp. New York, Masson Publishing, p 113. 39. MAGGIO E.T.. Enzyme-immunoassay. CRC Press, Boca Raton, Frorida, 1980, 295 p. 40. BULLOCK G.R., PETRUSZ P.. Techniques in immunocytochemistry. 1989. Vols 1,2,3, Academic Press