ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΛΑΣΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ

ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΛΑΣΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ Δρ ΣΙΜΟΝΑ ΚΑΡΑΜΠΕΛΑ Ιατρός Βιοπαθολόγος Διευθύντρια ΕΣΥ Μικροβιολογικό Εργαστήριο και Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων ΓΝΝΘΑ «Η ΣΩΤΗΡΙΑ» email:simonakarabela@yahoo.gr Tuberculosis cases down by 5% each year But Europe fails to cure majority of multidrug-resistant patients (Stockholm/Copenhagen 18/3/2014) Across the 53 countries of the WHO European Region, an estimated 353 000 patients fell sick with tuberculosis (TB) in 2012, according to new data published by the European Centre for Disease Prevention and Control and the WHO Regional Office for Europe. The data show an average annual 5% decline in TB incidence across the Region over the last decade. Since 2011, the countries of the European Union and European Economic Area (EU/EEA) observed a 6% decrease in TB cases with 68 000 reported cases in 2012. Overall, the EU/EEA countries met their target of an average five-year decline. However, Europe has not yet met the set targets for successful treatment of multidrug-resistant TB. ECDC Director Marc Sprenger stressed: If we are not able to diagnose and treat patients with multidrug-resistant tuberculosis early and successfully, this not only puts patients lives at risk but also paves the way for XDR TB. This is why it is essential to enable healthcare workers across Europe to fully support all MDR TB patients during the full course of treatment and make sure they finish it successfully. Florida Tuberculosis Outbreak: Health Officials Sent Patients To Live At Monterey Motel Filed by Amanda McCorquodale JACKSONVILLE The CDC officer had a serious warning for Florida health officials in April: A tuberculosis outbreak in Jacksonville was one of the worst his group had investigated in 20 years. Linked to 13 deaths and 99 illnesses, including six children, it would require concerted action to stop. By Stacey Singer Palm Beach Post Staff Writer

Mycobacterium tuberculosis Beijing outbreak in a school in Marseille, France, 2012. Golesi F; Brignatz J; Bellenfant M;Raoult D; Drancourt M. Between January and September 2012, a teacher and four students at a technical college in Marseille, France, developed pulmonary tuberculosis. All Mycobacterium tuberculosis isolates from these cases were identical and belonged to the Beijing strain family, multispacer sequence type 72, a rare genotype identified only once in our laboratory in the previous two years. This report highlights once more the potential for M. tuberculosis Beijing strains to cause outbreaks, this time in a school setting. Euro Surveillance 18(2)2013. Tuberculosis Outbreak in a Primary School, Milan, Italy Volume 19, Number 3 March 2013 Marino Faccini, Luigi Ruffo Codecasa, Giorgio Ciconali, Serafina Cammarata, Catia Rosanna Borriello, Costanza De Gioia, Alessandro Za, Andrea Filippo Marino, Valentina VighiComments to Author, Maurizio Ferrarese, Giovanni Gesu, Ester Mazzola, and Silvana Castaldi Investigation of an outbreak of tuberculosis (TB) in a primary school in Milan, Italy, found 15 schoolchildren had active TB disease and 173 had latent TB infection. TB was also identified in 2 homeless men near the school. Diagnostic delay, particularly in the index case-patient, contributed to the transmission of infection. NATURE NEWS Totally drug-resistant TB emerges in India Discovery of a deadly form of TB highlights crisis of 'mismanagement'. Physicians in India have identified a form of incurable tuberculosis there, raising further concerns over increasing drug resistance to the disease. Although reports call this latest form a new entity, researchers suggest that it is instead another development in a longstanding problem. The discovery makes India the third country in which a completely drug-resistant form of the disease has emerged, following cases documented in Italy in 2007 and Iran in 2009. Katherine Rowland 13 January 2012

Δηλωθέντα κρούσματα φυματίωσης σε Έλληνες και αλλοδαπούς διαχρονική εξέλιξη, Ελλάδα 2004 2013. Δηλούμενη επίπτωση φυματίωσης ανά 100.000 πληθυσμό διαχρονική εξέλιξη Ελλάδα, 2004-2013 Δηλωθέντα κρούσματα φυματίωσης σε Σωφρονιστικά Καταστήματα και Κέντρα Κλειστής Φιλοξενίας Αλλοδαπών/Καταυλισμούς, Ελλάδα, 2004-2013. Δηλωθέντα κρούσματα φυματίωσης σε Χ.Ε.Ν. Διαχρονική τάση, Ελλάδα 2007-2013. ΤΒ ΑΝΤΟΧΗ Φυσική αντοχή Υπάρχει στο βακτήριο χωρίς προηγούμενη επαφή του με το φάρμακο Δεν αναπτύσσεται με πρόσληψη γονιδίων

Αντοχή μυκοβακτηριδίων Πρωτοπαθής αντοχή (primary drug-resistance ή drug-resistance among new cases) Δευτεροπαθής ή επίκτητη αντοχή (acquired drug-resistance ή drug-resistance among previously treated cases) Μεταλλάξεις (RIF, EMB, FQ) και τροποποιήσεις των φαρμακευτικών στόχων Ενζυμική αδρανοποίηση του φαρμάκου (AMK)

Αδυναμία ενεργοποίησης ενός προφαρμάκου (INH, EMB, PYR) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ κάθε εξέταση έχει τη δική της χρησιμότητα, τα δικά της προβλήματα, τα δικά της πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΥΛΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΒΑΣΙΣΜΕΝΗΣ ΣΕ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ.. με την αξιοποίηση ειδικών ποσοτικών πληροφοριών Επιπολασμό επίπτωση νόσου Ευαισθησία- ειδικότητα μίας διαγνωστικής μεθόδου Θετική αρνητική προγνωστική αξία κτλ

ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΚΑΙ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΠΟΣΟ ΣΥΧΝΑ ΕΝΑ ΑΤΟΜΟ ΠΟΥ ΠΑΣΧΕΙ Η ΔΕΝ ΠΑΣΧΕΙ ΑΠΟ ΜΙΑ ΝΟΣΟ ΕΧΕΙ ΘΕΤΙΚΗ Η ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ εκατοστιαία αναλογία των αληθώς θετικών αποτελεσμάτων (μικρή πιθανότητα ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων) ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ εκατοστιαία αναλογία των αληθώς αρνητικών αποτελεσμάτων (μικρή πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων) ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΗ (ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ) ΑΞΙΑ ΠΟΣΟ ΣΥΧΝΑ ΕΝΑ ΘΕΤΙΚΟ Η ΑΡΝΗΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΔΕΙΧΝΕΙ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ Η ΤΗΝ ΑΠΟΥΣΙΑ ΜΙΑΣ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΗΣ ΝΟΣΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΞΙΑ Πιθανότητα παρουσίας της νόσου, όταν η ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΙΝΑΙ ΘΕΤΙΚΗ ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΞΙΑ Πιθανότητα απουσίας της νόσου, όταν η ΕΞΕΤΑΣΗ ΕΙΝΑΙ ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΘΕΩΡΗΜΑ ΤΟΥ BAYES ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣ ΝΟΣΟΥ ΠΡΙΝ ΤΗΝ ΕΞΕΤΑΣΗ (pre-test probability) ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΥΠΟΘΕΣΗ απότονκλινικόιατρό(συνεκτιμώντας το ιστορικό, την αντικειμενική εξέταση, τον επιπολασμό των νοσημάτων στη πληθυσμιακή ομάδα που ανήκει ο ασθενής), = η πιθανότητα ο ασθενής να έχει μια συγκεκριμένη νόσο (pre-test probability)

ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ (ΜΕ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ) ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΕΓΙΝΕ Ο ΕΛΕΓΧΟΣ (POST-TEST PROBABILITY). Η τελική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων γίνεται από τον κλινικό ιατρό, που εκτιμά την πιθανότητα ο ασθενής με το συγκεκριμένο αποτέλεσμα να έχει τη νόσο για την οποία έγινε ο έλεγχος (Post-test probability). Ο ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ADA ΣΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΔΟΥΣ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙΔΑΣ

ΑΚΑΤΑΛΛΗΛΟ ΔΕΙΓΜΑ Επισημαίνεται ότι καμία φροντίδα ή τεχνική επιδεξιότητα από μέρους του προσωπικού του Εργαστηρίου δεν μπορεί να αποτρέψει ένα λανθασμένο τελικό αποτέλεσμα, εάν το λάθος έχει γίνει κατά τη διάρκεια της συλλογής, της μεταφοράς ή της διατήρησης του δείγματος. ΓΕΝΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ Το δείγμα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό της βλάβης Τα δοχεία συλλογής πρέπει να είναι αποστειρωμένα, μίας χρήσεως, με κατάλληλη σήμανση και χωρίς συντηρητικά Εάν δεν είναι δυνατή η άμεση αποστολή στο εργαστήριο, τα κλινικά δείγματα θα πρέπει να συντηρούνται στο ψυγείο (4 C). Εξουδετέρωση του γαστρικού υγρού Όλατακλινικάυλικάθαπρέπεινασυνοδεύονταιαπόσυμπληρωμένα παραπεμπτικά. επικοινωνίας

Μικροσκοπική εξέταση Η ταχύτερη μέθοδος ανίχνευσης Ευαισθησία 40-45% (ως προς την καλλιέργεια) Ειδικότητα 96-98 % Αύξηση λοιμώξεων από άτυπα μυκοβακτηρίδια ελαττώνει την ειδικότητα και τη θετική προγνωστική αξία Ανιχνεύει 1000-10000 βακτήρια/ml υλικού Οξεάντοχα Mycobacterium spp Mycobacterium leprae Nocardia spp Gordonia spp Tsukamurella spp Legionella micdadei Rhodococcus spp Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora Σπόροι μικροβίων Άγκιστρα εκχινοκόκκου Nocardia spp Καλλιέργεια Μέθοδος αναφοράς Ευαισθησία 80-85% Ειδικότητα 98% Ανιχνεύει 10-100 βακτήρια/ml υλικού Χρόνος επώασης 6-8 εβδομάδες Απαραίτητη για ταυτοποίηση του είδυς δοκιμασία ευαισθησίας στα αντιφυματικά γονοτυπικό έλεγχο (επιδημιολογικές μελέτες και έλεγχος εργαστηριακής επιμόλυνσης)

ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΥΓΡΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ L-J Bactec 460 MGIT 960 Χρόνος ανάπτυξης 24,1 14,4 15,2 Κίνδυνος επιμολύνσε ων 2-4% 4,9% 8,1% ΔΟΚΙΜΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΦΥΜΑΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ (DRUG SUSCEPTIBILITY TESTING DST) Πότε γίνεται? Πρώτη απομόνωση του μυκοβακτηριδίου Σεκαλλιέργειαμετάαπό3 μήνες θετική Αν δεν υπάρχει ικανοποιητική ανταπόκριση στη θεραπεία, επαναλαμβάνεται η DST στο νέο στέλεχος που απομονώνεται Πιθανότητες αντοχής αγρίου τύπου τύπου / φάρμακα υψηλές (10-3 ): Ethionamide, Capreomycin, Cycloserine, Thiacetazone μεσαίες (10-6 ): Isoniazide, Streptomycin, Ethambutole, Kanamycin, PAS χαμηλές (10-8 ): Rifampicin INH + RIF: 10-6 χ 10-8 = 10 10-14

Geneva, 26 March 2007 Use of Liquid TB culture and drug susceptibility testing (DST) in low- and medium- income settings International TB laboratory experts and representatives of partner organizations recommend the use of TB liquid culture and DST in low income settings. Liquid culture systems are the standard of care for TB diagnosis and patient management in industrialized countries. Liquid culture and DST systems are more complex and sensitive than solid culture and DST media. Increased bacterial contamination and an increased frequency of nontuberculous mycobacterial (NTM) isolation must be addressed. A rapid method to differentiate M. tuberculosis complex from other mycobacterial species is essential. ECDC.. Οέλεγχοςγιαδευτερεύοντααντιφυματικάφάρμακαείναι υποχρεωτικός για την πολυανθεκτική φυματίωση (MDR-TB) για ασθενείς που έχουν λάβει προηγούμενη θεραπεία με δευτερεύοντα φάρμακα ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ Φαινοτυπικός έλεγχος ευαισθησίας στα πρωτεύοντα: αξιόπιστος σε στερεά και υγρά συστήματα καλλιέργειας Φαινοτυπικός έλεγχος ευαισθησίας στα δευτερεύοντα: αξιόπιστος σε στερεά αλλά προβληματικός στα υγρά συστήματα καλλιέργειας

Επίπεδο βιοασφάλειας 3 (BSL-3) και συνεχής εκπαίδευση προσωπικού Εναλλακτικές μη-εμπορικές φαινοτυπικές μέθοδοι Δοκιμασία νιτρικής αναγωγάσης (Nitrate reductase assay- NRA) Ταχεία ανίχνευση MDR-TB Χρήση σε άμεσα κλινικά δείγματα Μη ειδικός εξοπλισμός Χαμηλό κόστος Εκπαίδευση προσωπικού Εναλλακτικές μη-εμπορικές φαινοτυπικές μέθοδοι THIN-LAYER AGAR (TLA) MDR/XDR-TB COLOUR TEST A complete MDR-XDRTB colour test: sputum is collected into disinfectant transport medium that is applied directly to the culture plate as soon as it reaches the laboratory, without any processing. An MDR-XDRTB colour test for drugsusceptible TB that only grew in the clear detection quadrant (red dots), not the coloured antibiotic-containing quadrants. MDRTB grew in detection, isoniazid and rifampiein containing quadrants, but the quinolone (blue) prevented TB growth, ruling out XDRTB.

Εναλλακτικές μη-εμπορικές φαινοτυπικές μέθοδοι Χρήση μόνο σε στελέχη Χρήση μη-ειδικού εξοπλισμού Χαμηλό κόστος Εκπαίδευση Colorimetric redox indicator method (CRI) Εναλλακτικές μη-εμπορικές φαινοτυπικές μέθοδοι Microscopic Observation Drug Susceptibility assay (MODS) Προτυποποίηση Πλήρης συμφωνία με DST 2011-έγκριση ΠΟΥ Αποτέλεσμα <7 ημέρες Χαμηλό κόστος Εκπαίδευση TUBERCULOSIS SERODIAGNOSIS TESTS Ιn the best interests of patients and caregivers in the private and public health sectors, the World Health Organization (WHO) is calling for an end to using serological tests to diagnose tuberculosis (TB)," said Dr Mario Raviglione, Director of WHO Stop TB Department, in a 20 July WHO statement. "A blood test for diagnosing active TB disease is bad practice. Test results are inconsistent, imprecise and put patients' lives in danger." This is the first time WHO has issued an explicit "negative" policy recommendation against a practice that is widely used in tuberculosis care. Testing for active TB disease by detecting antibodies in the blood is extremely difficult. Patients can have different antibody responses suggesting that they have active TB even when they do not. Antibodies may also develop against other organisms which again could wrongly indicate they have active TB. In addition, different organisms share the same antigens, making tests results unreliable. These factors can result in TB disease not being identified or wrongly diagnosed.

Ανίχνευση αντιγόνου Point-of-care tests (POC) Lipoarabinomannan (LAM) Πιθανή εφαρμογή σε διάφορα βιολογικά υγρά Ανίχνευση στα ούρα Venn diagrams showing the proportions of patients diagnosed by sputum culture, Xpert MTB/RIF (1 sample), sputum-smear microscopy (sputum acid-fast bacilli), and Determine TB-LAM Mutually exclusive proportions of patients shown in each of the compartments. Proportions of all patients with tuberculosis (A; n=85). Proportions of patients with CD4 cell counts less than 100 cells per μl (B; n=29). AFB=acid-fast bacilli. ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ Το άτομο έχει έρθει σε επαφή με το μυκοβακτηρίδιο αλλά δεν έχει αναπτύξει ενεργό νόσο Παραμονή και χαμηλού βαθμού πολ/σμός του βακίλλου μέσα στα μακροφάγα, ανοσιακή απάντηση από τον ξενιστή Χωρίς κλινικά, ακτινολογικά και βακτηριολογικά (καλλιέργεια) στοιχεία

TST (Tuberculin Skin Test) αντίδραση υπερευαισθησίας επιβραδυνόμενου τύπου αντιγόνο: εκχύλισμα πρωτεϊνών MTB ( 200) κοινές πρωτεΐνες με M. bovis BCG και αρκετά NTB Αρχή μεθόδου προσδιορισμού IFN-γ Τα Τ-λεμφοκύτταρα ευαισθητοποιημένων ατόμων με τα αντιγόνα του MTB παράγουν IFN-γ, όταν ενεργοποιηθούν από τα ίδια αντιγόνα (PPD, ESAT-6, CFP10) Προσδιορισμός της ποσότητας IFN-γ Προσδιορισμός του αριθμού των Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν IFN-γ Μεθοδολογίες IGRAs Ανίχνευση ιντερφερόνης-γ QuantiFERON-TB Gold (QFT) ελεγχόμενα αντιγόνα: ESAT-6 και CFP-10 μέθοδος ELISA Έγκριση από FDA (QuantiFERON-TB Gold in Tube, QFT-IT) αντιγόνα ESAT-6, CFP-10 και TB7.7 Προσδιορισμός Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν ιντερφερόνη-γ T SPOT-TB ελεγχόμενα αντιγόνα: ESAT-6 και CFP-10 μέθοδος ELISPOT εκκρεμεί η έγκριση από FDA

QuantiFERON-TB Gold in Tube Μυκοβακτηριδιακά αντιγόνα: ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target-6), CFP-10 (Culture Filtrate Protein-10) TB-7 (p4) Μυκοβακτηριδιακά είδη διαθέτοντα αντιγόνα ESAT-6 και CFP-10 Tuberculosis complex Antigens ESAT CFP M tuberculosis + + M africanum + + M bovis + + *BCG substrain gothenburg - - moreau - - tice - - tokyo - - danish - - glaxo - - montreal - - pasteur - - Environmental strains Antigens ESAT CFP M abcessus - - M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - M fortuitum - - M gordonii - - M intracellulare - - M kansasii + + M malmoense - - M marinum + + M oenavense - - M scrofulaceum - - M smegmatis - - M szulgai + + M terrae - - M vaccae - - M xenopi - - ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011.

ΜΕΘΟΔΟΣ ELISPOT IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 1. ΜΠΟΡΕΙ ΜΟΝΗ ΤΗΣ ΝΑ ΔΙΑΓΝΩΣΕΙ ΤΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ; OXI European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 2. ΜΠΟΡΕΙ NA ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΕΙ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ; Συνήθως: δεν έχει προσθετική αξία Συμπληρωματικές πληροφορίες: εξωπνευμονική ΤΒ, παιδιά, διαφοροδιάγνωση με ΝΤΜ, κλινική ΤΒ με μικροσκοπική και καλλιέργεια αρνητικές European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011.

IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ ΜΠΟΡΕΙ NA ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΕΙ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ; IGRA (-) δεν αποκλείει την ενεργό ΤΒ European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ Sensitivity of IGRAs and TST in the diagnosis of active TB in patients with clinical suspicion of TB disease European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ Specificity of IGRAs and TST in the diagnosis of active TB European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011.

IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 3. ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΟΛΗ Sensitivity and specificity of T-SPOT.TB in the diagnosis of active TB in patients undergoing chronic dialysis Sensitivity and specificity of T-SPOT.TB in the diagnosis of extrapulmonary TB in immunocompetent and immunocompromised patients European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 4. HIV+ Sensitivity and specificity of T-SPOT.TB in the diagnosis of active TB in patients with HIV infection, stratified by CD4 T-cell count European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. IGRAs - ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 5. ΠΑΙΔΙΑ Sensitivity of IGRAs and TST in the diagnosis of active TB in children Specificity of IGRAs and TST in the diagnosis of active TB in children European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011.

IGRAs- ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 1. IGRA-ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΑΤΟΜΩΝ ΠΟΥ ΧΡΙΖΟΥΝ ΘΕΡΑΠΕΙΑ (-) IGRA ΔΕΝ ΑΠΟΚΛΕΙΕΙ ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ IGRAs- ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. IGRAs- ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011.

IGRAs- ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-gamma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011. ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ IGRAS ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΑ ΝΟΣΟΣ Όσον αφορά στη διάγνωση της λανθάνουσας φυματίωσης, οι IGRAs θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τη συνολική εκτίμηση κινδύνου για την αναγνώριση των ατόμων που πρέπει να λάβουν προφυλακτική αγωγή (πχ. παιδιά, ανοσοκατασταλμένοι, στενές επαφές ασθενών, πρόσφατη έκθεση στη νόσο κλπ.) ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΗΣ-γ (IGRAs) ΕΝΕΡΓΟΣ ΝΟΣΟΣ Δεν είναι δυνατή η διάκριση μεταξύ λανθάνουσας και ενεργού νόσου Οι IGRAs δεν έχουν θέση στη διάγνωση της ενεργού νόσου, παρά μόνο σε ειδικές περιπτώσεις (HIV, ασθενείς υπό ανοσοκατασταλμένοι, παιδιά) Δεν αντικαθιστούν τις κλασικές μεθόδους διάγνωσης της νόσου καθώς ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει την ενεργό φυματίωση

ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ IGRAs Έλεγχος ατόμων που έχουν έρθει σε επαφή με περίπτωση φυματίωση Οι IGRAs αποδίδουν καλύτερα από το TST λόγω μεγαλύτερης ειδικότητας. Εάν ο κίνδυνος εξέλιξης σε ενεργό νόσο είναι υψηλός (μικρά παιδιά, ανοσοκατασταλμένοι) θα πρέπει να εφαρμοστούν και οι δύο δοκιμασίες. Σε περίπτωση που κάποια από τις δύο δοκιμασίες είναι θετική ενδείκνυται η θεραπεία της λανθάνουσας φυματίωσης. ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ IGRAs Στοχευμένος έλεγχος- χαμηλός κίνδυνος (εργαζόμενοι σε χώρους υγείας, εμβολιασμένοι με BCG, λοιμώξεις από άτυπα μυκοβακτηρίδια) Ενδείκνυται οι δοκιμασίες IGRAs επειδή τα θετικά TST είναι συνήθως ψευδή Στοχευμένος έλεγχος- μέτριος και υψηλός κίνδυνος (μετανάστες, έγκλειστοι φυλακών, άστεγοι) Ευαισθησία IGRAs είναι ίση ή μεγαλύτερη του TST, αλλά πολλές φορές οικονομικοί λόγοι είναι πιο σημαντικοί σ αυτές τις ομάδες, γι αυτό ενδείκνυται οποιαδήποτε από τις δύο δοκιμασίες ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ IGRAs Έλεγχος σε ενεργό φυματίωση: αρνητικά αποτελέσματα δοκιμασιών λανθάνουσας φυματίωσης δεναποκλείουντηνόσο. μία θετική δοκιμασία IGRA σε άτομο ύποπτο για φυματίωση σε χώρες με χαμηλή επίπτωση φυματίωσης, αυξάνει τη πιθανότητα διάγνωσης. Ίση ευαισθησία των IGRAs και του TST. Η δοκιμασία Τ-SPOT είναι πιο ευαίσθητη από το Quantiferon.

ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ IGRAs Παιδιά: στα παιδιά<5 ετών, λόγω μεγάλου κινδύνου εξέλιξης σε ενεργό νόσο και ψευδών αρνητικών IGRAs ή TST, ενδείκνυται η εφαρμογή και των δύο μεθόδων. Στα μεγαλύτερα παιδιά, οι συστάσεις είναι ίδιες με τους ενήλικες. ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ IGRAs Ανοσοκατασταλμένοι ξενιστές: η εφαρμογή εξαρτάται από το βαθμό ανοσοκαταστολής. Οι ανοσοκατασταλμένοι έχουν μεγαλύτερο ποσοστό αρνητικών TST και αρνητικών ή απροσδοιορίστων IGRAs αποτελεσμάτων. Η δοκιμασία T-SPOT είναι πιο ευαίσθητη από τη δοκιμασία Quantiferon. Σε άτομα με σοβαρή ανοσοκαταστολή συνιστάται η εφαρμογή και των δύο μεθόδων για τη μείωση της πιθανότητας αποτυχίας της διάγνωσης. ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ IGRAs Άτομα με προ-ανοσοκαταστολή: Στα άτομα που πρόκειται να λαμβάνουν ανοσοκατασταλτική θεραπεία, με κίνδυνο αναζωπύρωσης της φυματίωσης, συνιστάται η εφαρμογή των δοκιμασιών IGRAs. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος και αποκλεισμού της φυματίωσης, οι ασθενείς θα πρέπει να λάβουν θεραπεία για λανθάνουσα φυματίωση, ενώ σε περίπτωση αρνητικού αποτελέσματος IGRAs και υποψία για λανθάνουσα φυματίωση ο έλεγχος θα πρέπει να περιλαμβάνει και τη δοκιμασία TST.

QFT-Plus Product Format New product format ELISA remains mainly the same. Same procedure New labeling New instructions for use New plate layout 4 wells per patient New QFT-Plus analysis software Easy transition for the lab Tubes have the same phlebotomy practice and handling process. Custom QFT-Plus tubes: Nil same grey color TB1 green, CD4 only TB2 yellow: optimized to detect both CD4 and CD8! Mitogen same purple Standard lithium heparin tube (optional) Flexible sample collection, but still allows remote incubation QuantiFERON-TB Gold Plus: the Most Accurate Test for TB Infection, Location, Date Antigen-Specific CD8 + T Cells in Tuberculosis Clear evidence for role of CD8+ T cells in M. tuberculosis (MTB) immunity MTB-specific CD8 + T cells secrete IFN- and other soluble factors to (1 3): Suppress MTB growth Kill infected cells Directly lyse intracellular MTB TB-specific CD8 + T cells that produce IFN- have been: More frequently detected in those with active TB disease vs. latent infection Associated with recent exposure to TB Detectable in active TB subjects with HIV coinfection and young children Observed to decline when patients are exposed to anti-tuberculosis treatment 1. Turner, J. et al. (1996) Immunology 87, 339. 2. Brookes, R.H. et al. (2003) Eur. J. Immunol. 33, 3293. 3. Stenger, S. et al. (1998) Science 282, 121. 4. Day, C.L. et al. (2011) J. Immunol. 187, 2222. 5. Rozot, V. et al. (2013) Eur. J. Immunol. 43, 1568. 6. Nikolova, M. et al. (2013) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 75, 277. 7. Chiacchio, T. et al. (2014) J. Infect. http://dx.doi.org/10.1016/j.jinf.2014.06.009. 8. Lanicioni, C. et al. (2012) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 185, 206. 9. Nyendak M. Et al. (2014) PLoS ONE 8, e81564. Epub. Sensitivity of QFT-Plus QFT-Plus has markedly improved sensitivity at >95% (1) Sensitivity results by study site Study site Positive Negative Indeterminate Sensitivity (95% CI) Japan 1 36 7 0 84% (69-93) Japan 2 53 1 2 98% (90-100) Japan 3 54 0 0 100% (93-100) Australia 21 0 0 100% (84-100) Sensitivity results by TB antigen tube Result TB1 TB2* QFT-Plus Positive 160 163 164 Negative 11 9 8 Indeterminate 3 2 2 Sensitivity (95% CI) 93.6% (88.8-96.7) 94.8% (90.3-97.6) 95.3%(90.9-97.9) *Important note: 4 positive by TB2 only, including 1 that would have been indeterminate by TB1 only. 1. QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus) ELISA Package Insert. Rev. 02. February 2015.1083163.

Κυτταρομετρία ροής Intracellular ESAT-6: A new biomarker for Mycobacterium tuberculosis infection Nikolaos Poulakis, Angelos D. Gritzapis, Maria Ploussi, Michail Leventopoulos, Chrysovalantis V. Papageorgiou, Andreas Anastasopoulos, Pantelis Constantoulakis, Simona Karabela, Evangelos Vogiatzakis, Vassilis Tsilivakos Early secreted antigenic target 6 (ESAT-6) is a virulent factor of Mycobacterium tuberculosis (MTB). The identification of intracellular (i/c) ESAT-6 in host cells would be a direct marker of MTB infection. We developed a method to detect i/cesat-6 by flow cytometry. The aim of this study is to investigate the expression of i/cesat-6 in the host cells of individuals with MTB infection. Conclusions The i/cesat-6 is a promising biomarker of MTB infection that could be used in the evaluation of active TB patients and in the diagnosis of latent TB infection. Further studies are needed to validate its potential diagnostic role. CYTOMETRY PART B: CLINICAL CYTOMETRY 2014 Dec 27. doi: 10.1002/cyto.b.21220. Flow cytometry analysis of CD4+ IFN-γ+ T-cells for the diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection. Papageorgiou CV 1, Anastasopoulos A 2,PloussiM 3, Leventopoulos M 3, Karabela S 4, Fotiadis K 5, Papavasileiou A 6, Vogiatzakis E 4, Ioakeimidis D 5, Gritzapis AD 3,7, Poulakis N 1. CD4+ cells expressing Interferon-γ (IFN-γ), following stimulation with specific mycobacterial antigens, identified with flow cytometry (FCM-CD4+IFN-γ+), is a new method for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis (MTB) infection. The aim of this study is to investigate the performance of FCM-CD4+IFN-γ+ in comparison with tuberculin skin test (TST) and Quantiferon TB Gold In-Tube (QFT-G-IT) in the diagnosis of latent MTB infection (LTBI), in close contacts and in patients with rheumatic diseases under treatment with anti-tnfa and other biologic agents. In close contacts, 63% were FCM-CD4+IFN-γ+ ESAT-6(+), 70% FCM-CD4+IFN-γ+ PPD(+), 41% QFT-G-IT(+) and 57% TST(+). FCM-CD4+IFN-γ+ ESAT-6 was the only test that was strongly correlated to the exposure time to infection. In the immunosuppressed group, 49% were FCM- CD4+IFN-γ+ ESAT-6(+), 62% FCM-CD4+IFN-γ+ PPD(+), 4.6% QFT-G-IT(+), and 18% TST(+). CONCLUSION: FCM-CD4+IFN-γ+ assays are more sensitive than QFT-G-IT and TST for the diagnosis of LTBI in close contacts and in immunosuppressed patients under anti-tnf-a treatment. FCM-CD4+IFN-γ+ is not affected by the chronic use of biologic agents. CYTOMETRY:PART B CYTOM 2015 Jul 22. doi: 10.1002/cyto.b.21275.

ΑΤΥΠΑ ΜΥΚΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΑ NTM (Nontuberculus mycobacteria ) ΜΟΤΤ (mycobacteria other than tuberculosis) NPEM (nonpathogenic environmental mycobacteria) ΝΤΜ >140 είδη Παντού στο περιβάλλον,νερά, χώμα, ζώα, μη παστεριωμένο γάλα, στόμια βρυσών, σκόνη σπιτιών,ύπαιθρο ΝΤΜ Συνεχή αύξηση ασθενών με πνευμονική νόσο από ΝΤΜ AIDS και Μ.avium complex (MAC) Βελτίωση μεθοδολογίας για ταυτοποίηση ΝΤΜ

ΝΤΜ επιδημιολογία Δύσκολο να γνωρίζουμε την επίπτωση της νόσου (μη υποχρεωτική καταγραφή και δήλωση των περιστατικών) Ό,τι απομονώνεται δεν είναι απαραίτητα παθογόνο πχ. Μ. gordonae Συχνά τα δείγματα επιμολύνονταικαι ανευρίσκονται: MAC, M. kansasii, M. simiae, M. abscessus, M. xenopi Σε περιπτώσεις παθογόνου, δεν είναι βέβαιο ότι η νόσος εξελίσσεται ΝΤΜ επιδημιολογία USA : Επίπτωση 8.6/100000 πληθυσμού 60% M.avium complex (MAC) Winthrop et al. AJRCCM, vol 182, pp 977-982, 2010

NTM # Μ.tuberculosis complex Ευρύ φάσμα παθογενετικότητας: - M. gordonae σπάνια παθογόνο - Μ. kansasii σχεδόν πάντα παθογόνο Δεν μεταδίδονται από άνθρωπο σε άνθρωπο (νερό, χώμα) Όταν είναι παθογόνα, τα περισσότερα συνήθως είναι ανθεκτικά στα φάρμακα, δύσκολα θεραπεύονται με μεγάλα ποσοστά αποτυχίας και υποτροπών NTM - παθογένεια Η πηγή της λοίμωξης φαίνεται να είναι η περιβαλλοντική έκθεση Ημετάδοσηαπόάνθρωπο σε άνθρωπο δεν περιγράφεται Γονοτυπικές μέθοδοι (DNAαποτύπωμα) κατέδειξαν παρόμοια patterns μεταξύ των καλλιεργηθέντων ΝΤΜ ασθενείς/περιβάλλον Στις περισσότερες περιπτώσεις η πηγή της λοίμωξης ήταν το νερό και λιγότερο το χώμα Nishiuchi Y. et al.cid 2007;45:347-351 ATS/IDSA statement : diagnosis, treatment and prevention of NTM Am J Respir Crit Care Med 2007;175:367-416 ΝΤΜ- προδιαθεσικοί παράγοντες ΧΑΠ, βρογχεκτασίες, κυστική ίνωση, παλαιά ΤΒ, πνευμονοκονίωση, χρόνια εισρόφηση, λιποαναρρόφηση, καθετηριασμοί, αντικατάσταση καρδιακών βαλβίδων, αντικατάσταση αρθρώσεων, φακοί επαφής και LASER Λήψη αντι-tnfa, HIV(+) και ανωμαλίες στην έκκριση INF-γ ή IL- 12 και IL-10 προδιαθέτουν σε αιματογενή διασπορά Γυναίκες με θωρακικές ανωμαλίες (σκολίωση,εισολκή στέρνου), πρόπτωση μιτροειδούς, αρθροπάθειες και βρογχεκτασίες

NTM κυστική ίνωση Σε ασθενείς με M.avium complex και βρογχεκτασίες οι οποίοι δεν πάσχουν από κυστική ίνωση, παρατηρούνται πολύ συχνά μεταλλάξεις CFTR οι οποίες ενοχοποιούνται για την ανάπτυξη των βρογχεκτασικών βλαβών. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator channel dysfunction in non-cystic fibrosis bronchiectasis. Αm J Respir Crit Care 2010 ΝΤΜ Κλινική εικόνα Πνευμονική νόσος (65% MAC) Με κοιλότητα όπως η φυματίωση Με μικροζιδιακή σκίαση και βρογχεκτασίες AJRCCM 2007:175:367 416 ΝΤΜ Κλινική εικόνα Αιματογενής διασπορά (MAC, M.kansasii) σε ανοσοκαταστολή και HIV νόσο Συνήθως αποικίζεται το γαστρεντερικό σύστημα από μολυσμένοφαγητόήνερό Οι HIV+ ασθενείς νοσούν με αιματογενή διασπορά από NTM όταν CD4 <50 (μυελός οστών, ήπαρ, σπλήνας, λεμφαδένες) AJRCCM 2007:175:367 416

ΝΤΜ Κλινική εικόνα Λεμφαδενίτιδα στα παιδιά (MAC, M. kansasii, RGM) ηλικίας 1 5 ετών χωρίς γενετικές ανωμαλίες χωρίς υποκείμενη νόσο του αναπνευστικού AJRCCM 2007:175:367 416 ΝΤΜ Κλινική εικόνα Λοίμωξη δέρματος,μαλακών μορίων, οστών, αρθρώσεων (M. abscessus, M.fortuitum, M. chelonae, M. marinum και M. ulcerans) M.marinum AJRCCM 2007:175:367 416 ATS 2007- ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗ ΝΟΣΟ ΑΠΟ ΝΤΜ Κλινικά: συμβατά πνευμονικά συμπτώματα και σημεία (βήχας, κούραση, καταβολή, πυρετός, απώλεια ΣΒ, νυχτερινές εφιδρώσεις, αιμόπτυση, δύσπνοια) AJRCCM 2007:175:367-416 + Απεικονιστικά: οζώδεις ή κοιλοτικές σκιάσεις στην Α/α θώρακα ή βρογχεκτασίες και μικροζιδιακή σκίαση στην HRCT και αποκλεισμός άλλης νόσου

ATS 2007-ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΣΕ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗ ΝΟΣΟ ΑΠΟ ΝΤΜ Βακτηριδιολογικά κριτήρια: 2 θετικές καλλιέργειες πτυέλων από 3 ξεχωριστά δείγματα ή Θετική καλλιέργεια σε τουλάχιστον 1 δείγμα από βρογχικές εκκρίσεις ή BAL ή Διαβρογχική ή άλλη βιοψία με συμβατά ευρήματα και θετική καλλιέργεια για ΝΤΜ ή Συμβατή βιοψία μαζί με τουλάχιστον 1 θετική καλλιέργεια από πτύελα ή BAL ή άλλου εξωπνευμονικού δείγματος ή Θετική καλλιέργεια πλευριτικού υγρού ή αλλου εξωπνευμονικού δείγματος AJRCCM 2007:175:367-416 ΝΤΜ Μικροβιολογική διάγνωση Ταυτοποίηση (στέλεχος από καλλιέργεια) μη ειδικές τεχνικές (χρόνος ανάπτυξης, παραγωγή χρωστικής, μορφολογία αποικιών, οξεάντοχη χρώση) βιοχημικές τεχνικές (δοκιμασία νιασίνης, παραγωγή ουρεάσης, αναγωγή νιτρικών.) μοριακές τεχνικές (με τεχνικές ανάστροφου υβριδισμού,ανίχνευση και ταυτοποίηση 13 (Genotype Mycobacterium CM) και 16 ειδών (Genotype Mycobacterium AS). Η διάκριση μεταξύ των ειδών γίνεται με βάση τις διαφορές στο γενετικό υλικό τους. ΝΤΜ έλεγχος ευαισθησίας CLSI M24-A2 Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard, M24-A2E (broth microdilution method) ATS -2007 M.avium complex στα μακρολίδια M.kansasii στη ριφαμπικίνη M.abscessus, M.chelonae, M.fortuitum σε αμικασίνη,τομπραμυκίνη, κινολόνες, μακρολίδη, ιμιπενέμη, δοξυκυκλίνη, κεφοξιτίνη, λινεζολίδη, σουλφομεθοξαζόλη, κλοφαζιμίνη,τιγεκυκλίνη

Στο εμπόριο SENSITITRE Broth Microdilution (MIC) Method: For Rapidly Growing Mycobacteria (RGM), Slowly Growing Nontuberculosis Mycobacteria, Nocardia and other Aerobic Actinomycetes ΝΤΜ εμβόλιο??? Δεν υπάρχει εμβόλιο για θεραπεία ή πρόληψη Σουηδοί και Τσέχοι θεωρούν ότι το BCG προσφέρει κάποια προστασία στη λοίμωξη από ΝΤΜ Η ΝΤΜ λεμφαδενίτιδα βρέθηκε μειωμένη σε παιδιά με BCG Το BCG φαίνεται να παρέχει σχετική προστασία έναντι του M. ulcerans (Buruli ulcer)