Εργαστηριακή ιάγνωση Μυκοβακτηριδιακών Λοιμώξεων. ρ. Ε. ΦΑΚΙΡΗ Αν. /ντρια Κλινική Μικροβιολόγος Σισμανόγλειο Γενικό Νοσοκομείο Αττικής

Transcript

1 Εργαστηριακή ιάγνωση Μυκοβακτηριδιακών Λοιμώξεων ρ. Ε. ΦΑΚΙΡΗ Αν. /ντρια Κλινική Μικροβιολόγος Σισμανόγλειο Γενικό Νοσοκομείο Αττικής

2 ιάγνωση Απαιτείται ταχεία και ακριβής μέθοδος διάγνωσης κλινική εικόνα ακτινολογικά ευρήματα Πιθανή Επιβεβαιωμένη εξειδικευμένες εξετάσεις A G AT T C TA A TA G C A G T AT C G T C

3 Αρχές Σωστής Συλλογής Κλινικών ειγμάτων Αντιπροσωπευτικό δείγμα χωρίς επιμολύνσεις Ενημέρωση του ασθενούς ώστε το δείγμα να προέρχεται από βαθιά απόχρεμψη και όχι σάλια Σωστός χρόνος λήψης του δείγματος Επαρκής ποσότητα Κατάλληλα δοχεία συλλογής Όχι χρήση στυλεών Εξασφάλιση υγρασίας Παραπεμπτικό Αριθμός Μητρώου Όνομα ασθενούς, πατέρα Κλινική Ημερομηνία Είδος κλινικού δείγματος Κλινικές πληροφορίες Ζητούμενες δοκιμασίες Υπογραφή γιατρού Αυτοκόλλητη ταινία στο δοχείο συλλογής Όνομα ασθενούς Κλινική Ημερομηνία Είδος κλινικού δείγματος Εξωτερικός ασθενής Τηλέφωνο

4 Μακροσκοπική εικόνα Αποδεκτό δείγμα Κλινικά δείγματα από το αναπνευστικό Ενδοτραχειακές αναρροφήσεις BAL Προστατευμένη ψήκτρα 8/10/08 Γ. Πνευμονλογκό Τμήμα

5 Μεταφορά-Φύλαξη δείγματος Γρήγορη μεταφορά με ασφαλή τρόπο και αποφυγή επιμολύνσεων Φύλαξη δείγματος στο ψυγείο Εξουδετέρωση της οξύτητας του γαστρικού υγρού Επεξεργασία του δείγματος όσο το δυνατόν ταχύτερα

6 σάλια πύο Αντιπροσωπευτικό δείγμα χωρίς επιμολύνσεις 6

7 Επεξεργασία του δείγματος Ρευστοποίηση δείγματος για την καταστολή των άλλων μικροβίων Ποιότητα των αντιδραστηρίων και η αυστηρή τήρηση του χρόνου ομογενοποίησης (15min) Φυγοκέντρηση (κατάλληλη, ασφαλής φυγόκεντροςστροφές-χρόνος-λήψη ιζήματος) Εξουδετέρωση (ph 6,8) Φυγοκέντρηση

8 Επίδραση της φυγοκέντρησης στην ευαισθησία μικροσκοπικής και καλλιέργειας RCF* Σχέση θετικών παρασκευασμάτων & Καλλιεργειών *Relative centrifugal force Rickman TW, Moyer NP: J Clinical Microbiology 11: , % 40% 82%

9

10 Three sputum smears are optimal Cumulative Positivity First Second Third Role of Laboratory Services in TB Control C N Paramasivan Tuberculosis Research Centre Indian Council Of Medical Research, Chennai, India

11 ιαγνωστικές εργαστηριακές μέθοδοι Κλινικό δείγμα Εμπλουτισμός Μικροσκοπική εξέταση Μοριακή μέθοδος Καλλιέργεια Στερεό υλικό Υγρό υλικό Μικροσκοπική εξέταση Ταυτοποίηση μυκοβακτηριδίων Έλεγχος αντοχής

12 Μικροσκοπική εξέταση

13 ιάγνωση Σε άμεσο Μετά εμπλουτισμό Σε καλλιέργεια Μικροσκοπική εξέταση Γιατί γίνεται? Πορεία νόσου Ανταπόκριση στην θεραπεία Άρση των μέτρων μόνωσης του ασθενούς Επιδημιολογία - οικονομικοί μετανάστες

14 Μικροσκοπική εξέταση Η ταχύτερη μέθοδος ανίχνευσης Ευαισθησία 50-80% (ως προς την καλλιέργεια) Αύξηση λοιμώξεων από άτυπα μυκοβακτηρίδια ελαττώνει την ειδικότητα και τη θετική προγνωστική αξία Ανιχνεύει βακτήρια/ml υλικού

15 Μικροσκόπηση Ζ-Ν 300 οπτικά πεδία (10 λεπτά) Σε ένα παρασκεύασμα 1χ2cm αν εξεταστούν οπτικά πεδία, αντιπροσωπεύουν μόνο 1-4% του παρασκευάσματος (3 min) Σε χρώση αουραμίνης-ροδαμίνης 30 οπτικά πεδία (περίπου 90 sec)

16 Φθορίζουσα χρώση Αουραμίνη Ο Αουραμίνη-Ροδαμίνη Θετικό αποτέλεσμα επιβεβαιώνεται με Ζiehl- Neelsen 16

17 1 3 Ατμοί ναι 2 Φυσσαλίδες όχι Προσοχή στον αποχρωματισμό /10/08 Γ. Πνευμονλογκό Τμήμα 17

18

19

20

21 Πιθανότητα θετικής μικροσκοπικής ανάλογα με τον αριθμό των μυκοβακτηριδίων ανά ml κλινικού δείγματος Αποτέλεσμα Μέση συγκέντρωση οξεάντοχων/ml πτυέλων Πιθανότητα θετικού αποτελέσματος (%) (-) >

22 Οξεάντοχες χρώσεις Αξιολόγηση - Απάντηση Αριθμός οξεάντοχων Απάντηση που δίδεται Z-N (Χ1000) Φθορίζουσα χρώση (Χ250) Φθορίζουσα χρώση (Χ450) εν βρέθηκαν οξεάντοχα Αμφίβολο αποτέλεσμα Επανάληψη /300 οπ 1-2/30 οπ 1-2/70 οπ /100 οπ 1-9/10 οπ 2-18/50 οπ /10 οπ 1-9 κοπ 4-36/10 οπ κοπ κοπ 4-36/οπ 4+ >9 κοπ >90/οπ >36/οπ Manual of Clinical Microbiology, 2007, p. 556

23 Ψευδώς αρνητικά Ακατάλληλο κλινικό δείγμα ανεπαρκής ποσότητα ακατάλληλο δοχείο συνθήκες και χρόνος φύλαξης Μικροσκοπική εξέταση μικρός αριθμός μυκοβακτηριδίων ανεπαρκής χρόνος έλλειψη εμπειρίας Λάθη στον εμπλουτισμό, στις χρώσεις και χρωστικές Τα ταχέως αναπτυσσόμενα μπορεί να φαίνονται οξεάντοχα σε ποσοστό <10% σε πρόσφατο καλλιέργημα και να μη βάφονται με φθορίζουσα χρωστική

24 Artifacts Ψευδώς θετικά Πρόσμιξη τροφών Επιμολύνσεις Λάθη στις τεχνικές εμπλουτισμού και χρώσεων Σαπροφυτικά ΑFB Χρήση νερού επιμολυσμένου με ΝΤΜ (συνήθως M. gordonae) Φακοί-κεδρέλαιο

25 Οξεάντοχα Mycobacterium spp Mycobacterium leprae Nocardia spp Gordonia spp Tsukamurella spp Legionella micdadei Rhodococcus spp Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora

26 Οξεάντοχα-Nocardia

27 M. tuberculosis M. kansasii M. avium

28 Καλλιέργεια

29 Καλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό υλικό QC υλικού και παρτίδας Θερμοκρασία Ατμόσφαιρα Ευαισθησία 80-85% Ειδικότητα 98% Ανιχνεύει βακτήρια/ml υλικού Χρόνος επώασης 6-8 εβδομάδες Προσοχή Επιμολύνσεις Καθαριότητα χώρου Προστασία προσωπικού

30 Καλλιέργεια σε L.J. Ρευστοποίηση δείγματος με προσθήκη NaOΗ 4% ήακετυλοκυστείνη(απαιτείται για την καταστολή των άλλων μικροβίων). Εάν παραταθεί ο χρόνος ομογενοποίησης >15min καταστρέφονται και μυκοβακτηρίδια Φυγοκέντρηση Λήψη ιζήματος Εξουδετέρωση Προστίθεται υδατικό διάλυμα κρυσταλλικής πενικιλλίνης και H 2 SO 4 Φυγοκέντρηση Εμβολιασμός του ιζήματος σε 2 σωληνάρια L.J. Επώαση σε κεκλιμένη θέση στους 37 C

31 Θρεπτικά υλικά για μυκοβακτηρίδια Στερεά υλικά με βάση το αυγό: Lowenstein-Jensen, Ogawa Στερεά ημισυνθετικά υλικά με βάση το άγαρ: Middlebrook 7H10 or 7H11 Υγρά υλικά: Middlebrook 7H9, 7H12, Dubos Tween medium, MGIT

32 Καλλιέργεια σε BACTEC 460 Από το ίδιο ίζημα που καλλιεργούμε στο L.J εμβολιάζουμε και το υγρό θρεπτικό υλικό του Bactec Ραδιομετρική μέθοδος: Τα μυκοβακτηρίδια χρησιμοποιούν το θρεπτικό υπόστρωμα με 14 C και παράγουν CO 2 που μετράται σε θάλαμο ιονισμού Πλεονέκτημα: Μείωση του χρόνου θετικού αποτελέσματος κατά 2 εβδομάδες Μειονέκτημα: Κίνδυνος μεταφοράς μυκοβακτηριδίου από το ένα φιαλίδιο στο άλλο κατά τις φάσεις εμβολιασμού

33 Καλλιέργεια σε MGIT 960 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ είκτης φθορισμού, ευαίσθητος στη κατανάλωση οξυγόνου ενσωματώνεται στη σιλικόνη του πυθμένα Ενεργοποιείται και φθορίζει, όταν το οξυγόνο του θρεπτικού υλικού καταναλώνεται κατά τον μεταβολισμό του μικροβίου Mycobacterium Grouth Indicator Tube (MGIT)

34 Καλλιέργεια Σε υγρά θρεπτικά υλικά Απαιτούμενος χρόνος: ημέρες Ανάπτυξη και άλλων μυκοβακτηριδίων και βακτηρίων Μη δυνατότητα παρατήρησης της μορφολογίας των αποικιών

35 Χρόνος αναπαραγωγής Μυκοβακτηρίδια: 15-22h Άλλα μικρόβια: 20-30min Μέσος χρόνος ανάπτυξης M.tb BACTEC MGIT 960: 11 ημέρες Löewenstein-Jensen: 25 ημέρες

36 Απάντηση καλλιέργειας Ανάγνωση Καμία ανάπτυξη Αναφορά Αρνητική 1-19 αποικίες Θετική (αριθμός αποικιών) αποικίες Θετική (1+) αποικίες Θετική (2+) (σχεδόν συρρέουσες αποικίες) Θετική (3+) >500 αποικίες (συρρέουσες αποικίες) Επιμόλυνση Θετική (4+) Επιμόλυνση

37 Θρεπτικά Υλικά Εσωτερικός Ποιοτικός Έλεγχος Κάθε νέα παρτίδα (υγρού ή στερεού) θρεπτικού υλικού, που παρασκευάζεται στο εργαστήριο, ή προέρχεται από εταιρεία, πρέπει να ελέγχεται για την: Στειρότητα Ικανότητα υποστήριξης ανάπτυξης του μικροοργανισμού Εκλεκτική ή / και ανασταλτική ικανότητα Θετικός αρνητικός μάρτυρας

38 Καλλιέργεια Απαραίτητη Ταυτοποίηση του είδους οκιμή ευαισθησίας στα αντιφυματικά Γονοτυπικός έλεγχος (επιδημιολογικές μελέτες και έλεγχος εργαστηριακής επιμόλυνσης)

39 Καλλιέργεια & απομόνωση Μυκοβακτηριδίων Ταυτοποίηση Test Ευαισθησίας LJ MGIT E-test Φάγοι Μοριακά

40 Γιατί κάνουμε Μοριακές Τεχνικές? Άμεση ανίχνευση μυκοβακτηριδίων Ταυτοποίηση είδους Έλεγχος ευαισθησίας

41 Μοριακές Τεχνικές Άμεση ανίχνευση μυκοβακτηριδίου

42 Μοριακές τεχνικές σε δείγματα αναπνευστικού Μοριακές τεχνικές Ευαισθησία Μ(+) % Ευαισθησία Μ(-) % Ειδικότητα % Στόχος Σχόλια RT-PCR Roche/ Αmplicor Mycobacterium tuberculosis Test (Amplicor MTB) S rrna Έγκριση FDA Μ(+) IAC (+) TMA -Gen-Probe / Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTD2) S rrna Έγκριση FDA Μ(+) Μ(-) IAC (-) LCR -Abbott / LCx MTB assay, ABBOTT LCx probe system DNA antigen b IAC (-) SDA (Real-time) - Becton Dickinson / BD ProbeTec energy transfer (ET) system (DTB) IS S rrna IAC (+)

43 Μοριακές τεχνικές σε δείγματα αναπνευστικού Μοριακές τεχνικές Ευαισθησία Μ(+) % Ευαισθησία Μ(-) % Στόχος Σχόλια Reverse Hybridization Assay - Innogenetics/ INNO-LiPA RIF. TB assay DNA rpob gene Ανιχνεύει και αντοχή στη Rifampin IAC (-) NASBA + DNA strip technology - Hain/ GenoType MTBDRplus 90,2? DNA rpob, katg inha, ahpc Ανιχνεύει και αντοχή στη Rifampin και Isoniazid IAC (+) DNA strip technology - Hain/ GenoType Mycobacteria Direct ? RNA Ανιχνεύει και άτυπα (M.avium, M.kansasii, M.intracellulare, M.malmoense) ταυτόχρονα IAC (+) Real-time PCR?? rpob, katg και embb genes Ανιχνεύει και αντοχή στη Rifampin, Isoniazid και Ethambutol IAC (+)

44 Μοριακές τεχνικές σε εξωπνευμονικά δείγματα Μοριακές τεχνικές Ευαισθησία Μ(+) % Ευαισθησία Μ(-) % Έγκριση FDA RT-PCR -Roche Αmplicor Mycobacterium tuberculosis Test (Amplicor MTB) TMA -Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTD2) SDA - Becton Dickinson BD ProbeTec energy transfer (ET) system (DTB)

45 Μοριακές τεχνικές σε δείγματα αναπνευστικού Ευαισθησία Με μικροσκοπική (+) % Με μικροσκοπική (-) 60 70% Ειδικότητα %

46 Μοριακές μέθοδοι Ανίχνευση ειδικής αλληλουχίας νουκλεϊνικών οξέων με υβριδισμό με μια συμπληρωματική αλληλουχία (probe) και ακολούθως ανίχνευση του υβριδίου Η ευαισθησία της μεθόδου αυξάνεται αν προηγηθεί πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων (PCR)

47 ιαδικασία Εξέτασης Εκχύλιση DNA ή RNA Πολλαπλασιασμός Υβριδισμός Αξιολόγηση conjugate control universal control TBC ειδικός ανιχνευτής Ειδικοί ανιχνευτές ειδών

48 Πότε εφαρμόζεται μια μοριακή τεχνική στη διάγνωση της φυματίωσης? Μικροσκοπική (+) επιβεβαίωση ταυτοποίηση Σε ασθενείς με ιστορικό παλιάς φυματίωσης Σε μικροσκοπική (-), αλλά με ύποπτη κλινική εικόνα Σε ειδικές ομάδες ασθενών (παιδιά, HIV κλπ) Σε μη αναπνευστικά δείγματα (συνήθως η μικροσκοπική είναι αρνητική)

49 Μοριακές τεχνικές - προβλήματα Κατάλληλος χώρος Κατάλληλος εξοπλισμός (θάλαμος βιολογικής ασφάλειας II, ρύγχη με φίλτρο) Πολύ καλή απολύμανση του χώρου εργασίας Σωστή επιλογή των δειγμάτων Προσοχή στην εκτέλεση των τεχνικών Σωστή αξιολόγηση Παρακολούθηση των εξελίξεων των μεθόδων

50 Smear (+) sample NAA Positive Negative MTB100% NTM 0% MTB 10% NTB 90% NAA: Nucleic Acid Assays

51 Smear (-) sample High Clinical Suspicion (80%) NAA Positive Negative MTB 98% NTM 2% MTB 63% NTB 37% Αρνητική μοριακή δοκιμασία δεν αποκλείει την ΤΒ όταν υπάρχει έντονη κλινική σημειολογία

52 Smear (-) sample Low Clinical Suspicion (5%) NAA Positive Negative MTB 39% NTM 61% MTB 2% NTB 98% Θετική προγνωστική αξία μικρή Συνήθωςψευδώςθετικά Aρνητική προγνωστική αξία πολύ υψηλή

53 Πώς αξιολογούνται μοριακές τεχνικές στη διάγνωση της φυματίωσης? AFB NAA Κλινική υποψία Σχόλια Θετική Θετική Υψηλή /Χαμηλή Ενεργός ΤΒ Αρνητική Αρνητική Υψηλή /Χαμηλή εν αποκλείεται η ενεργός ΤΒ Αρνητική Θετική (σε 2 δείγματα) Υψηλή (80%) Υποψία TB 98% Έναρξη θεραπευτικής αγωγής και επανεκτίμηση θεραπείας με τα αποτελέσματα της καλλιέργειας Αρνητική Θετική (σε 2 δείγματα) Χαμηλή (5%) Ενεργός ΤΒ 39%, παλαιά ΤΒ ή επιμόλυνση Θετική Αρνητική (έλεγχος παρουσίας αναστολέων) Υψηλή TB 10% ή ΝTM 90% Έναρξη θεραπευτικής αγωγής και επανεκτίμηση θεραπείας με τα αποτελέσματα της καλλιέργειας Θετική Αρνητική (έλεγχος παρουσίας αναστολέων) Χαμηλή Συχνά ΝΤΜ. εν αποκλείεται TB Έναρξη θεραπευτικής αγωγής και επανεκτίμηση θεραπείας με τα αποτελέσματα της καλλιέργειας

54 Οδηγίες CDC Συλλέγονται και αποστέλλονται στο εργαστήριο τρία δείγματα πτυέλων σε τρεις διαδοχικές μέρες για άμεση μικροσκοπική εξέταση και καλλιέργεια Μικροσκοπική (-): Συνιστάται η εφαρμογή μοριακής μεθόδου στο 1 ο δείγμα Μικροσκοπική (+): Συνιστάται η εφαρμογή μοριακής μεθόδου στο δείγμα ή τα δείγματα που είναι θετικά

55 Οδηγίες FDA Σε δείγματα αναπνευστικού, ασθενών με μικροσκοπική (+), δεν πρέπει να εφαρμόζονται οι μοριακές τεχνικές* αν έχουν λάβει: Αντι-TB για 7 μέρες Αντι-TB θεραπεία τους τελευταίους 12 μήνες * ψευδώς θετικά αποτελέσματα

56 Ταυτοποίηση

57 Ταχείαταυτοποίησημετημέθοδο του υβριδισμού Nucleic acid probe identification Accuprobe τεχνική (Gen-Probe) PCR-ανάστροφος υβριδισμός Inno-LiPA Mycobacteria (Innogenetics) GenoType Mycobacteria (Hain LifeScience & Symbiosis) PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), ανάλυση με στόχους: hsp65 πρωτεΐνη 16S rdna 16S-23S rrna gene spacer rpob γονίδιο Direct sequence analysis με στόχο 16S rrna γονίδιο

58 AccuPROBE (Gen-Probe Inc.) M. tuberculosis complex M. avium complex M. avium M. intracellulare M. gordonae M. kansasii Ταυτοποίηση από καλλιέργημα είτε σε ζωμό είτε σε L.J. Απαιτούνται τουλάχιστον 10 6 μικροοργανισμοί

59 GenoType Mycobacteria (Hain LifeScience) Geno Type Mycobacterium CM M. avium M. kansasii M. celatum M. malmoence M. chelonae M. peregrinum M. fortuitum I M. phlei M. fortuitum II M. scrofulatium M. gordonae MTB complex M. intracellulare M. xenopi GenoType Mycobacterium AS M.simiae M.szulgai/M.intermedium M.mucogenicum M.phlei M.gondii M.haemophilum M.celatum M.kansasii M.smegmatis M.genavense M.lentiflavum M.heckesornense M.ulcerans M.gastri M.asiaticum M.shimodei

60 οκιμή ευαισθησίας

61 οκιμή ευαισθησίας στα αντιφυματικά φάρμακα (drug susceptibility testing- DST) Πότε γίνεται? Πρώτη απομόνωση του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης Ασθενείς με ατελή θεραπεία Με αποτυχημένη θεραπεία Με αναζωπύρωση της νόσου Με πιθανή MDR TB Ασθενείς που παρά τη θεραπεία έχουν μικροσκοπική (+) Σεκαλλιέργειαμετάαπό3 μήνες θετική

62 Ανθεκτική φυματίωση Η αντοχή οφείλεται στην παρουσία φυσικών μεταλλακτών μέσα σε κάθε μικροβιακό πληθυσμό εν υπάρχει συσχέτιση με τη χρωμοσωμιακή διασπορά της ανθεκτικότητας

63 Everybody was Willing to Accept One Single Method for DST, but Ended up with Three Different Ones.. Absolute Concentration Method Resistant Ratio Method Proportion Method Meetings WHO 1963 and 1969 Georges Canetti

64 Μέθοδοι ελέγχου ευαισθησίας Α. Στερεό θρεπτικό υλικό (LJ, 7H10, 7H11) Μέθοδος αναφοράς (Gold Standard) Προτυποποιημένη μέθοδος Μέτρηση αποικιών Μακρά διάρκεια επώασης 3-5 εβδομάδες

65 Ημιαυτόματα συστήματα Bactec 460 (Becton Dickinson) ESPII(TrekDiagnosticsSystem) MGΙT 960 (Becton Dickinson) MB/BacT ALERT 3D system (biomerieux) Αποτελέσματα σε 4-14 ημέρες Μέθοδος MIC Ε-ΤΕSΤ Μέθοδος Βακτηριοφάγου

66 Ανίχνευση αντοχής με φάγους 1. Οι μυκοβακτηριοφάγοι μολύνουν τα βραδέως αναπτυσσόμενα μυκοβακτηρίδα 2. Οι εξωγενείς φάγοι αδρανοποιούνται. Οι ενδογενείς προστατεύονται 3. Οι ενδογενείς φάγοι πολλαπλασιάζονται με αντιγραφή 4. Οι νέοι φάγοι λύουν τον 5. Οι νέοι φάγοι μολύνουν ταχέως ξενιστή αναπτυσσόμενα μυκοβακτηρίδια και ακολουθούν νέοι κύκλοι αντιγραφής και λύσης 6. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των νέων φάγων είναι ενδεικτικός του αριθμού των ζώντων M. tb στο αρχικό δείγμα

67 Ανίχνευση αντοχής Με φάγους Γρήγορο Οικονομικό Εύκολο Αξιόπιστο Σε ερευνητικά εργαστήρια Λύση φάγων

68 Clin Microbiol Infect 2007; 13: In studies that examined the major susceptibility testing methods available at the time, significant differences were noted in the media used, the inoculum size the minimum concentrations of drug tested, and the criteria used to establish resistance

69 1 ης γραμμής Φάρμακα Canetti Löwenstein-Jensen Agar Proportion method SM SM INH INH RIF ETH ETH MIGT 1 μg/ml 4 μg/ml 0.1 μg/ml 0.4 μg/ml 1 μg/ml 5 μg/ml 7.5 μg/ml CDC CLSI 4 μg/ml 0,2 μg/ml 40 μg/ml 2 μg/ml ΝΝΘΑ 5 μg/ml 10 μg/ml 0,2 μg/ml 1 μg/ml 20 μg/ml 40 μg/ml 2 μg/ml 4 μg/ml

70 2 ης γραμμής φάρμακα Drug 7H10μg/ml 7H11μg/ml M24-A (2003) NCCLS /CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institude) Capreomycin Ethionamide 5 10 Ethamputol Kanamycin 5 6 Ofloxacin 2 2 p-aminosalicylic acid 2 8 Rifabutin Streptomycin Οι μέθοδοι δεν είναι προτυποποιημένες για τα 2 ης γραμμής αντιφυματικά

71 Τί πρέπει να προσέχουμε στη δοκιμή ευαισθησίας; Κατάλληλα θρεπτικά υλικά Φάρμακα σε καθαρή μορφή, αποστειρωμένα και σωστά συντηρημένα Επώαση όσο χρόνο απαιτείται Συνεργασία με εργαστήριο αναφοράς Ποιοτικός έλεγχος Ταυτόχρονος έλεγχος προτύπου στελέχους αλλά και γνωστού στελέχους

72 Ανθεκτική Φυματίωση Πρωτοπαθής (αρχική) ανθεκτικότητα Ανθεκτικότητα που αναπτύσσεται χωρίς να προηγηθεί θεραπεία ευτεροπαθής (επίκτητη) ανθεκτικότητα Ανθεκτικότητα που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της θεραπείας ως αποτέλεσμα ανεπαρκούς αντιφυματικής αγωγής

73 First-Line Treatment of TB for Drug-Sensitive TB

74 Multidrug-Resistant Tuberculosis (MDR TB) and Possible Effective Treatments Πολυαθεκτικά στελέχη ΜDR ΤΒ M. tuberculosis στελέχη ανθεκτικά τουλάχιστον στην ισονιαζίδη και ριφαμπικίνη Αποτέλεσμα εκλεκτικής επιλογής σε ανεπαρκή θεραπεία μη συμμόρφωση του ασθενούς χορήγηση λανθασμένης θεραπείας

75 Extensively Drug-Resistant Tuberculosis (XDR TB) Diminishing Options for Treatment Υπερανθεκτικά στελέχη XDR TB XDR ΤΒ = MDR ΤΒ + αντοχή στις φλουοροκινολόνες + αντοχή τουλάχιστον σε 1-3 iv χορηγούμενα δευτερεύοντα αντi-tb: καπρεομυκίνη καναμυκίνη αμικασίνη

76 TB Patient Is Isolated After Taking Two Flights By LAWRENCE K. ALTMAN Published: May 30, 2007 Federal and international officials are tracking down passengers and crew members on two trans-atlantic flights earlier this month who may have been exposed to a man infected with an exceptionally dangerous form of tuberculosis.

77 TB Patient Is Isolated After Taking Two Flights By LAWRENCE K. ALTMAN Published: May 30, 2007 Federal and international Σχέδιο «Περσέας» officials από are τοtracking down passengers and υπουργείο crew members Υγείαςon γιαtwo τονtrans-atlantic flights earlier Αμερικανόασθενήμεφυματίωση this month who may have been exposed to a man infected with an exceptionally dangerous form of tuberculosis.

78 The Return to a Pre-antibiotic Era Drug susceptible TB* MDR-TB 1990 XDR-TB 2006 Total DR? *or limited resistance manageable with 4 drug regimen - DOTS Resistance to H&R Treatable with 2 nd line drugs Resistance to 2 nd line drugs Treatment options seriously restricted Resistance to all available drugs No treatment options

79 Συνήθη Σφάλματα στη δοκιμή ευαισθησίας Λάθος στην ταυτοποίηση (π.χ.άτυπο) Πυκνό εναιώρημα - Ψευδώς ανθεκτικό Τεχνικά σφάλματα

80 Πυραζιναμίδη ρα σε όξινο ph (ph 5.6) εν γίνεται δοκιμή ευαισθησίας σε στερεά θρεπτικά υλικά Επιτυχής σε ημιαυτόματα συστήματα (υγρά ΜGIT)

81 Κλασικές μέθοδοι Πολλές τεχνικές δυσκολίες Πολλές μέρες για την απάντηση Μοριακές Τεχνικές ανίχνευσης αντοχής

82 Μέθοδοι Ανίχνευσης Μεταλλάξεων Μυκοβακτηριδίων DNA sequencing (gold standard) RFLP Single strand conformation polymorphism (SSCP) Heteroduplex analysis Line probe assay Molecular beacons Oligonucleotide ή DNA μικροσυστοιχίες Amplification refractory mutation system

83 Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics) Άμεση ανίχνευση M. tuberculosis και αντοχή στη RIF Ειδικότητα: 100% Ευαισθησία: 80%- 100% η R2: Asp516Val R4a: His526Tyr R4b: His526Asp R5: Ser531Leu

84 MTBDRplus Ανίχνευση των συχνότερων μεταλλάξεων ταυτόχρονα στα rpob InhA και katg γονίδια, υπεύθυνα για την αντοχή σε RIF και ΙΝΗ Ευαισθησία: 99% RIF 88.4% ΙΝΗ Ειδικότητα: 100%

85 Ανίχνευση μεταλλάξεων με real-time PCR και beacon probes Αλληλουχία μεταλλαγμένου στελέχους Αλληλουχία άγριου τύπου Μη υβριδισμός (molecular-beacon off) Υβριδισμός (molecular-beacon on) Ευαισθησία: 89-98% Ειδικότητα: % Proc Am Thorac Soc, 2006

86 DNA sequencing ( εύρεση της αλληλουχίας κατά Sanger) Τα νουκλεοτίδια είναι συνδεδεμένα με σημασμένο ιχνηθέτη. Καθένα με διαφορετικό χρώμα. Το μηχάνημα μπορεί να δει το χρώμα και διαβάζει την αλληλουχία Χρησιμοποιεί το προϊόν της PCR αλλά μία αλυσίδα κάθε φορά Είναι η καλύτερη μέθοδος για τη μελέτη μεταλλάξεων, αλλά κοστίζει αρκετά

87 DNA Mικροσυστοιχίες (η κιβωτός του Νώε της βιοχημείας) Ν Ολικό mrna σημαίνεται με φθορίζουσα χρωστική και υβριδίζεται με τα όμοια στοιχεία που βρίσκονται επάνω στη συστοιχία Κάθε κηλίδα της συστοιχίας ενώνεται με το αντίστοιχο φθορίζον μόριο του διαλ/τος προκαλώντας φθορισμό ανάλογο με το επίπεδο έκφρασης κάθε γονιδίου Gryadunov D, Clin Microbiol Infect, 2005 Φ

88 Molecular detection of drug resistance Drug Isoniazid Rifampicin Pyrazinamide Ethambutol Putative resistance gene katg inha ahpc kasa rpob pnca embb Resistant strains with mutation (%) Riska et al. Int J Tuberc Lung Dis 2000; 4(2):S4-10

89 Ποιοτικός έλεγχος (QC) Πρότυπα Στελέχη (Reference Strains) Γενετική σταθερότητα Η37Rv (ATCC 27294) ευαίσθητο σε όλα Όταν εξετάζονται και οι 2 συγκεντρώσεις της ΙΝΗ προτείνεται να ελέγχεται πρότυπο στέλεχος ανθεκτικό στη χαμηλή συγκέντρωση και ευαίσθητο στην υψηλή της ΙΝΗ Τα διαθέσιμα σήμερα μονοανθεκτικά στελέχη είναι ανθεκτικά στις υψηλές συγκεντρώσεις και επομένως επικίνδυνα για το προσωπικό

90 Αλγόριθμος ανίχνευσης αντοχής με Μοριακές Τεχνικές είγμα Smear (+) Καλλιέργεια (+) Επιβεβαίωση ΜΤΒ με Μοριακές Τεχνικές Ανίχνευση γονιδίων αντοχής στη RIF και ΙΝΗ Αναμονή αποτελεσμάτων κλασικών τεχνικών (Telenti A. JCM, 1997)

91 Σε ποιο εργαστήριο θα γίνει δοκιμή ευαισθησίας Σε εργαστήριο Αναφοράς Πολλά δείγματα-σύγκριση αποτελεσμάτων-εμπειρία

92 Συμπεράσματα Οι μοριακές μέθοδοι έχουν μεγαλύτερη ειδικότητα και ευαισθησία από την μικροσκοπική εξέταση και δίνουν ταχύτερα αποτελέσματα από την καλλιέργεια καθώς και ταχεία διάγνωση ευαισθησίας στα αντιφυματικά Είναι εξειδικευμένες εξετάσεις υψηλού κόστους και δεν μπορούν να εφαρμοστούν ευρέως Η άμεση μικροσκοπική εξέταση πλεονεκτεί έναντι των νέων εξετάσεων για την παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία γιανακριθείοασθενήςμημολυσματικός Η καλλιέργεια είναι η μέθοδος αναφοράς για τη διάγνωση της φυματίωσης Κάθε μοριακή μέθοδος πρέπει να γίνεται σε συνδυασμό με την καλλιέργεια

93 Συμπεράσματα Συλλογή δείγματος πριν την έναρξη της θεραπείας Σωστή δοκιμή ευαισθησίας είναι ουσιώδης για τη θεραπεία του ασθενούς Λάθος δοκιμή είναι χειρότερη από το να μη γίνει καθόλου Γονοτυπικές και φαινοτυπικές νεώτερες μέθοδοι με λογικό κόστος Για MDRTB, ελέγχονται τα 2ης γραμμής αντι-τβ βάσει της εμπειρίας του κάθε εργαστηρίου (απαιτούνται βελτιώσεις) Γρήγορη ανίχνευση αντοχής στη rifampicin και isoniazid ( λογικό κόστος - αποτελέσματα σε 2 μέρες)

94 Επίπεδα Πληροφορίας Γενετική Πληροφορία Έλεγχος ευαισθησίας Βιοχημική ταυτοποίηση Καλλιέργεια Μικροσκοπική εξέταση Αξία Πληροφορίας & κόστος

95 Ανίχνευση κυτταρικής ανοσίας / ιάγνωση λανθάνουσας φυματίωσης QuantiFERON(QFT)-TB Gold (FDA approoved) μέτρηση επιπέδων IFN-γ σε ολικό αίμα με τη χρήση τεχνικής ELISA T-SPOT TB μέτρηση Τλεμφοκυττάρωντου περιφερικού αίματος που παράγουν ΙFN-γ μετητεχνικήelispot Στηρίζονται στην παραγωγή και απελευθέρωση ΙFN-γ από τα Τ-λεμφοκύτταρα μετά από ειδικό αντιγονικό ερεθισμό (IGRAs). Χρήση ESAT-6 (Early Secreted Antigen Target -6) και η CFP-10 (Culture Filtrate Protein-10) ειδικών αντιγόνων του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης Διαθέτουν εσωτερικό θετικό μάρτυρα Ευασθησία QFT-ΤΒ Gold: 76% (7% - 83%) T.SPOT-TB: 88% (81% - 95%)

96 Κλινικός Γιατρός Κλινικός Μικροβιολόγος ιαγνωστική προσπέλαση φυματίωσης Παθολογο- ανατόμος

97 The Quality Assurance Cycle Reporting Patient/Client Prep Sample Collection Data and Lab Management Safety Customer Service Personnel Competency Test Evaluations Sample Receipt and Accessioning Record Keeping Sample Transport Quality Control Testing