Μελέτη της επίδρασης των α5gaba A υποδοχέων στη συναπτική πλαστικότητα μεταξύ ραχιαίου & κοιλιακού ιπποκάμπου

Μελέτη της επίδρασης των α5gaba A υποδοχέων στη συναπτική πλαστικότητα μεταξύ ραχιαίου & κοιλιακού ιπποκάμπου Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών: Εισαγωγή στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Διπλωματική εργασία Ερμής Ποφάντης A.M. 1867 Μονάδα Νευροφυσιολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών

ΕΥΧΑΡΙΣΤΊΕΣ Με την παρούσα εργασία μου δόθηκε η δυνατότητα να εμβαθύνω τις γνώσεις μου και την εμπειρία μου στην επιστήμη της νευροφυσιολογίας, και την δυνατότητα αυτή μου την έδωσε ο καθηγητής μου κ. Κώστας Παπαθεοδωρόπουλος, του οποίου η υποστήριξη είναι ανεκτίμητη. Η προθυμία και ο ενθουσιασμός του να με βοηθήσει σε κάθε περίπτωση, ακαδημαϊκή και μη, ήταν πολύτιμη και αισθάνομαι ιδιαίτερα τυχερός που δούλεψα κοντά του. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Στέλιο Κούβαρο για την πολύτιμη βοήθειά του στα τρέχοντα ζητήματα του εργαστηρίου και για την άριστη συνεργασία μας, και τον Δημήτρη Σακελλαρίου και τον Κώστα Μπάμπο για το πολύ καλό και φιλικό κλίμα στον χώρο της έρευνάς μας. Ευχαριστώ, επίσης, την κα. Φεβρωνία Αγγελάτου και τον κ. Γεώργιο Κωστόπουλο για την μεγάλη προθυμία τους να συμμετάσχουν στην εξεταστική επιτροπή. Τέλος, η αδιάκοπη ηθική και υλική υποστήριξη της οικογένειάς μου καθ' όλη τη διάρκεια των σπουδών και των επιλογών μου ήταν καθοριστική και γι' αυτό τους οφείλω πάρα πολλά.

ΠΕΡΙΕΧΌΜΕΝΑ 1. Νευροανατομία του Ιππόκαμπου 7 1.1 Τα κύρια πεδία του ιππόκαμπου 7 1.2 Νευροανατομία του ιππόκαμπου του επίμυος 8 2. Συναπτική λειτουργία 13 2.1 Επισκόπηση 13 2.2 Γλουταμινεργική συναπτική διαβίβαση 13 2.3 GABAεργική συναπτική διαβίβαση 14 3. Συναπτική πλαστικότητα 17 3.1 NMDA εξαρτώμενη Μακροπρόθεσμη Ενίσχυση (LTP) 17 3.2 Μακροπρόθεσμη Καταστολή (LTD) και απο ενίσχυση 20 3.3 Λειτουργικός ρόλος του ανθρώπινου ιππόκαμπου 21 4. Σκοπός της εργασίας 23 5. Μέθοδοι και Υλικά 25 5.1 Παρασκευή τομών 25 5.2 Σύσταση τεχνητού εγκεφαλονωτιαίου υγρού 26 5.3 Ερεθισμός και καταγραφή της ηλεκτρικής δραστηριότητας 26 5.4 Ανάλυση της ηλεκτρικής δραστηριότητας 26 6. Αποτελέσματα 29 6.1 Νεαρά Ζώα 29 6.1.1 Βασικές μετρήσεις (EPSP, PS) 29 6.1.2 Επίδραση των 10Hz σε ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο 33 6.1.3 Επίδραση του L-655,708 σε ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο 35 6.1.4 Επίδραση των 10Hz παρουσία του L-655,708 σε ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο 39 6.2 Ενήλικα ζώα 42 6.2.1 Επίδραση των 10Hz σε ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο 42 6.2.2 Επίδραση του L-655,708 και των 10Hz σε ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο 44 7. Συζήτηση & Συμπεράσματα 47 8. Παραπομπές 49

Τμήμα ιππόκαμπου κουνελιού χρωματισμένο με την μέθοδο Golgi, από την εργασία του Camillo Golgi το 1886. Το σχέδιο αναπαριστά, συγκεκριμένα, την περιοχή όπου μία δέσμη νευρικών ινών συνδέεται με τα μικρά γαγγλιακά κύτταρα του fascia dentata. (Πηγή: Golgi, Bentivoglio & Swanson, 2001) 6

1. ΝΕΥΡΟΑΝΑΤΟΜΊΑ ΤΟΥ ΙΠΠΌΚΑΜΠΟΥ Ένα από τα πιο ελκυστικά για τους νευροφυσιολόγους χαρακτηριστικά του ιππόκαμπου είναι η νευροανατομία του. Η σχετικά απλή οργάνωση των κυτταρικών του στιβάδων μαζί με την υψηλά οργανωμένη ελασματώδη κατανομή αρκετών εισόδων του, έχει προάγει την χρήση του ως ένα πρότυπο σύστημα για την σύγχρονη νευροβιολογία. 1.1 ΤΑ ΚΎΡΙΑ ΠΕΔΊΑ ΤΟΥ ΙΠΠΌΚΑΜΠΟΥ Η κύρια ιπποκάμπεια δομή έχει τρεις υποδιαιρέσεις: CA1, CA2 και CA3. Οι υπόλοιπες περιοχές του ιππόκαμπου περιλαμβάνουν την οδοντωτή έλικα (dentate gyrus), το υπόθεμα (subiculum), το προϋπόθεμα (presubiculum), και το παραϋπόθεμα (parasubiculum). Χωρίζεται επίσης, κατά μήκος του σε διαφραγματικό (dorsal) και κροταφικό (ventral). Σχηματική αναπαράσταση του εγκεφάλου επίμυος με τον διαφραγματικό κροταφικό άξονα και τις επιμέρους περιοχές του ιππόκαμπου σημειωμένες στην τομή. (Πηγή: Amaral & Witter, 1989, τροπ.) 7

1.2 ΝΕΥΡΟΑΝΑΤΟΜΊΑ ΤΟΥ ΙΠΠΌΚΑΜΠΟΥ ΤΟΥ ΕΠΊΜΥΟΣ 1.2.1 Το βασικό νευρωνικό κύκλωμα του ιππόκαμπου Ένα κοινό οργανωτικό χαρακτηριστικό των συνδέσεων μεταξύ διαφόρων περιοχών του νεοφλοιού είναι η αμοιβαιότητά τους. Εάν η περιοχή Α στον φλοιό προβάλλει στην περιοχή Β του φλοιού, τότε η περιοχή Β θα στέλνει και αυτή μια προβολή πίσω στην περιοχή Α. Όπως περιγράφηκε όμως αρχικά από τον Ramón y Cajal (1893), στην περίπτωση του ιππόκαμπου δεν συμβαίνει κάτι τέτοιο. Ο ενδορινικός φλοιός (entorhinal cortex) θεωρείται το πρώτο βήμα στο ιπποκάμπειο κύκλωμα και αυτό συμβαίνει διότι αρκετά από τα ερεθίσματα του νεοφλοιού που κατευθύνονται προς τον ιππόκαμπο, εισέρχονται σε αυτόν μέσω του ενδορινικού φλοιού. Κύτταρα στα επιφανειακά επίπεδα του ενδορινικού φλοιού φέρουν άξονες οι οποίοι προβάλλουν, πέρα από άλλους προορισμούς, και στην οδοντωτή έλικα. Οι προβολές αυτές αποτελούν μέρος του κυριότερου ιπποκάμπειου μονοπατιού εισόδου που ονομάζεται διατητραίνουσα οδός (perforant pathway). Παρ όλο που ο ενδορινικός φλοιός παρέχει την κυριότερη είσοδο στην οδοντωτή έλικα δεν συμβαίνει και το αντίθετο. Αυτό το μονοπάτι συνεπώς είναι μη αμοιβαίο ή μονής κατεύθυνσης. Παρομοίως, από τα κύρια κύτταρα της οδοντωτής έλικας, τα κοκκοειδή κύτταρα, εκφύονται άξονες που αποκαλούνται βρυώδεις ίνες (mossy fibers) οι οποίοι συνδέονται με τα πυραμιδικά κύτταρα της CA3 περιοχής του ιππόκαμπου. Τα κύτταρα της CA3 όμως δεν προβάλλουν στα κοκκοειδή κύτταρα. Τα πυραμιδικά κύτταρα της CA3, με Η ιπποκάμπεια διαμόρφωση. Νευρώνες από το επίπεδο ΙΙ του ενδορινικού φλοιού προβάλλουν στην οδοντωτή έλικα και στην περιοχή CA3 μέσω της διατητραίνουσας οδού. Νευρώνες από το επίπεδο ΙΙΙ του ενδορινικού φλοιού προβάλλουν στην περιοχή CA1 και στο υπόθεμα μέσω της διατητραίνουσας οδού. Το οδοντωτά κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας προβάλλουν στην περιοχή CA3 μέσω των βρυώδων ινών. Πυραμιδικοί νευρώνες στην περιοχή CA3 του ιππόκαμπου προβάλλουν στην CA1 μέσω των παράπλευρων ινών του Schaffer. Πυραμιδικά κύτταρα στην CA1 προβάλλουν στο υπόθεμα. Και η CA1 και το υπόθεμα προβάλλουν στο βαθύ στρώμα του ενδορινικού φλοιού. (Πηγή: Andersen et al, 2006. Τροποποιημένο) 8

την σειρά τους, είναι η κύρια πηγή εισόδου στην CA1 περιοχή. Αυτοί οι άξονες ονομάζονται παράπλευρες ίνες του Schaffer (Schaffer collaterals). Παρομοίως, η CA1 δεν προβάλει πίσω στην CA3, παρά μόνο προς το υπόθεμα, παρέχοντάς του την κυριότερη διεγερτική του είσοδο. Και πάλι, το υπόθεμα δεν προβάλλει στην CA1. Η CA1 περιοχή έχει την ιδιαιτερότητα να προβάλλει ταυτόχρονα και στο υπόθεμα αλλά και στον ενδορινικό φλοιό. Επιπλέον, στον ενδορινικό φλοιό προβάλλει και το υπόθεμα. Με αυτές τις δύο οδούς, κλείνει το ιπποκάμπειο κύκλωμα. Είναι λοιπόν φανερό πως ο ιπποκάμπειος σχηματισμός είναι οργανωμένος με έναν θεμελιωδώς διαφορετικό τρόπο από τις υπόλοιπες φλοιικές περιοχές. 1.2.2 Οδοντωτή έλικα Κυτταρική οργάνωση Η οδοντωτή έλικα αποτελείται από τρία επίπεδα. Επιφανειακά βρίσκεται μια σχετικά ακύτταρη στιβάδα που ονομάζεται μοριώδης στιβάδα. Η κυρίως στοιβάδα (στιβάδα κοκκιωδών κυττάρων) βρίσκεται βαθιά στη μοριακή στιβάδα και αποτελείται από ένα πυκνό επίπεδο πάχους τεσσάρων με οκτώ κοκκιωδών κυττάρων. Η κοκκιώδης στιβάδα και η μοριώδης στιβάδα σχηματίζουν μια δομή σχήματος V ή U, η οποία περιβάλλει μια κυτταρική περιοχή, την κυτταρική στιβάδα πολυμορφικών κυττάρων η οποία αποτελεί το τρίτο επίπεδο της οδοντωτής έλικας. Τύποι Νευρώνων Οδοντωτό κοκκιώδες κύτταρο. Ο κύριος κυτταρικός τύπος της οδοντωτής έλικας είναι το κοκκιώδες κύτταρο. Το οδοντωτό κοκκιώδες κύτταρο έχει σώμα ελλειπτικού σχήματος και έχει ένα χαρακτηριστικό κωνοειδές δέντρο από ακανθώδεις δενδρίτες με όλους τους κλάδους κατευθυνόμενους προς το επιφανειακό μέρος της μοριώδους στιβάδας. Είναι χαρακτηριστικό το γεγονός ότι η πυκνότητα και το πάχος των κοκκιωδών στιβάδων διαφέρει κατά μήκος του διαφραγματικού κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας (Gaarskjaer, 1978). Η πυκνότητα με την οποία είναι στοιβαγμένα τα κοκκιώδη κύτταρα είναι μεγαλύτερη στη διαφραγματική περιοχή του ιππόκαμπου, σε σχέση με την κροταφική. Επειδή όμως η αντίστοιχη πυκνότητα των CA3 πυραμιδικών κυττάρων ακολουθεί αντίστροφη διαβάθμιση, το καθαρό αποτέλεσμα είναι ένας λόγος 12:1 των κοκκιωδών κυττάρων προς τα πυραμιδικά κύτταρα της CA3 περιοχής διαφραγματικά, ενώ κροταφικά ο λόγος μειώνεται στο 2:3. Επειδή τα CA3 πυραμιδικά κύτταρα είναι οι κύριοι παραλήπτες της νεύρωσης από τα κοκκιώδη κύτταρα και ο αριθμός των συνάψεων από τις βρυώδεις ίνες είναι περίπου ο ίδιος κατά το μήκος του διαφραγματικού κροταφικού άξονα, η πιθανότητα επαφής είναι πολύ μικρότερη διαφραγματικά παρά κροταφικά. 9

Πυραμιδικό καλαθοειδές κύτταρο. Ο πιο καλά μελετημένος διανευρώνας είναι το πυραμιδικό καλαθοειδές κύτταρο. Το καλαθοειδές μέρος του ονόματός τους αναφέρεται στο ότι ο άξονας αυτών των κυττάρων σχηματίζει περικυτταρικά πλέγματα που περιβάλλουν και δημιουργούν συνάψεις με τα κυτταρικά σώματα των κοκκιωδών κυττάρων. Η πλειονότητα αυτών των κυττάρων περιέχουν βιοχημικούς σηματοδότες για τον ανασταλτικό διαβιβαστή γ αμινοβουτιρικό οξύ (GABA) και είναι συνεπώς και αυτοί ανασταλτικοί (Ribak et al, 1978 Ribak & Seress, 1983). 1.2.3 Ιππόκαμπος Κυτταρική οργάνωση Η κύρια κυτταρική στιβάδα του ιππόκαμπου ονομάζεται στιβάδα πυραμιδικών κυττάρων (pyramidal cell layer). Το στενό και χωρίς κύτταρα επίπεδο που βρίσκεται κάτω από την πυραμιδική στιβάδα, ονομάζεται πολυμορφική στιβάδα (stratum oriens). Αυτή η στιβάδα περιέχει τους βασικούς δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων και πολλές κατηγορίες διανευρώνων. Πάνω από την στιβάδα πυραμιδικών κυττάρων, στην περιοχή CA3 αλλά όχι στην CA2 ή CA1, βρίσκεται μια στενή ακυτταρική στιβάδα, η διαυγαστική στιβάδα (stratum lucidum), η οποία καταλαμβάνεται από βρυώδεις ίνες. Τυπικός νευρώνας της CA2 περιοχής. Ο άξονάς του σημειώνεται με βέλος. hf, hippocampal fissure pcl, pyramidal cell layer sl, stratum lucidum sl m, stratum lacunosum molecolare so, stratum oriens sr, stratum radiatum. 10

Η ακτινωτή στιβάδα (stratum radiatum) βρίσκεται επιφανειακά της διαυγαστικής στιβάδας στην CA3 περιοχή και ακριβώς από πάνω από την πυραμιδική στιβάδα στις περιοχές CA2 και CA1. Σε αυτή τη στιβάδα γίνονται οι συνδέσεις CA3 με CA3 κυττάρων καθώς και εκεί βρίσκονται οι παράπλευρες ίνες του Schaffer. Η πιο επιφανειακή στιβάδα του ιππόκαμπου ονομάζεται βοθριώδης μοριώδης στιβάδα (stratum lacunosum moleculare). Σε αυτή τη στιβάδα τερματίζουν οι ίνες από τον ενδορινικό φλοιό. Τύποι Νευρώνων Πυραμιδικά κύτταρα του ιππόκαμπου. Ο κύριος νευρωνικός κυτταρικός τύπος του ιππόκαμπου είναι το πυραμιδικό κύτταρο, το οποίο έχει βασικούς δενδρίτες που εκτείνονται στη πολυμορφική στιβάδα και ακιδωτούς δενδρίτες που εκτείνονται στην ιπποκάμπεια σχισμή. Διανευρώνες. Παρ όλο που στον ιππόκαμπο η πιο πολυπληθής ομάδα είναι οι πυραμιδικοί νευρώνες, υπάρχει και μια ετερογενής ομάδα διανευρώνων που είναι διασκορπισμένοι σε όλες τις στιβάδες (Freund & Buzsaki, 1996). Το πυραμιδικό καλαθοειδές κύτταρο βρίσκεται μέσα ή κοντά στη πυραμιδική στιβάδα και οι δενδρίτες του εκτείνονται έως τη πολυμορφική, την ακτινωτή και την βοθριώδη μοριώδη στιβάδα. Τα περισσότερα διεγερτικά σήματα εισόδου προέρχονται από τα πυραμιδικά κύτταρα του ιππόκαμπου. Επειδή μόνο μία σύναψη από κάθε πυραμιδικό κύτταρο δημιουργείται σε κάθε πυραμιδικό καλαθοειδές κύτταρο, ο βαθμός της σύγκλισης των πυραμιδοειδών κυττάρων σε ένα μεμονωμένο καλαθοειδές κύτταρο είναι τεράστιος. Στην πραγματικότητα, κάθε πυραμιδικό καλαθοειδές κύτταρο λαμβάνει πάνω από 2000 διεγερτικά σήματα εισόδου. Στο πλέγμα που δημιουργεί ο άξονας του κυττάρου υπάρχουν 10.000 συνάψεις από τα πυραμιδικά κύτταρα και επειδή ένα καλαθοειδές κύτταρο δημιουργεί μόνο 2 με 10 συνάψεις με κάθε πυραμιδικό κύτταρο, ένα τυπικό καλαθοειδές κύτταρο μπορεί να συνδέεται με πάνω από 1000 πυραμιδικά κύτταρα. Ένα μοναδικό λοιπόν καλαθοειδές κύτταρο μπορεί να έχει μία σημαντική ανασταλτική επίδραση σε έναν μεγάλο πληθυσμό πυραμιδικών κυττάρων. Ένας δεύτερος κύριος τύπος διανευρώνων του ιππόκαμπου μοιάζει με «πολυέλαιο», ή αξοαξονικό κύτταρο. Τα σώματά τους βρίσκονται μέσα ή δίπλα στην πυραμιδική στιβάδα και οι δενδρίτες τους εκτείνονται σε όλα τα στρώματα του ιππόκαμπου. Οι άξονές τους εκτείνονται επιφανειακά της πυραμιδικής στιβάδας και ανά σημεία δημιουργούν παράπλευρους άξονες που εισέρχονται στην στιβάδα των πυραμιδικών κυττάρων και τερματίζουν στους άξονες των πυραμιδικών κυττάρων. Άλλοι τύποι διανευρώνων περιλαμβάνουν τα πολυμορφικά βοθριώδη μοριώδη κύτταρα (oriens lacunosum moleculare associated cells), τα διστιβαδωτά κύτταρα (bistratified cells), τα βοθριώδη μοριώδη κύτταρα της βοθριώδους μοριώδους στιβάδας (stratum lacunosum moleculare cells) και τους διανευρώνες που νευρώνουν επιλεκτικά άλλους διανευρώνες (interneuron selective interneurons). Όλοι οι παραπάνω διανευρώνες είναι ανοσοθετικοί σε ενώσεις σηματοδότες του GABA που είναι ο κύριος ανασταλτικός διαβιβαστής στο κεντρικό νευρικό σύστημα. 11

Τομή ιππόκαμπου από διαγονιδιακό επίμυ, όπου χάρη στον μηχανισμό του ανασυνδιασμού, σε κάθε νευρώνα συμβαίνει μια τυχαία επιλογή έκφρασης μεταξύ τριών η περισσότερων φθοριζουσών προτεϊνών. Με αυτό τον τρόπο είναι δυνατή η χρωματική διαφοροποίηση μεταξύ παραπλεύρων νευρώνων καθώς και η οπτικοποίηση διαφόρων νευρικών αλληλεπιδράσεων. (Πηγή: Livet, Weissman, et al, 2007) 12

2. ΣΥΝΑΠΤΙΚΉ ΛΕΙΤΟΥΡΓΊΑ 2.1 ΕΠΙΣΚΌΠΗΣΗ Η σύναψη ως οργανίδιο έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον για πολλούς λόγους. Αρχικά, η πληροφορία που περνά διαμέσου των συνάψεων ενός νευρώνα αντικατοπτρίζει το αποτέλεσμα των ενοποιητικών του λειτουργιών. Δεύτερον, εκτός από ορισμένες εξαιρέσεις, δρα ως μια μονόδρομη «βαλβίδα» διαβιβάζοντας πληροφορία από τον προ στον μετασυναπτικό νευρώνα. Τρίτον, η πλαστικότητα της συναπτικής διαβίβασης είναι ο κυριότερος υποψήφιος για τις λειτουργίες της διαμόρφωσης και αποθήκευσης της μνήμης σε κυτταρικό επίπεδο. 2.2 ΓΛΟΥΤΑΜΙΝΕΡΓΙΚΉ ΣΥΝΑΠΤΙΚΉ ΔΙΑΒΊΒΑΣΗ Ο κύριος διεγερτικός διαβιβαστής στον ιππόκαμπο είναι το γλουταμινικό. Αυτό διεγείρει τους τρεις κύριους τύπους υποδοχέων ιοντοτροπικής διεγερτικής διαβίβασης: AMPA, kainate και NMDA. Αυτοί οι υποδοχείς παίρνουν το όνομά τους από τους αντίστοιχους αγωνιστές τους που τους ενεργοποιούν σχετικά επιλεκτικά. 2.2.1 Υποδοχείς AMPA Οι υποδοχείς AMPA (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid) αποτελούνται από διαφορετικούς συνδυασμούς τεσσάρων υπομονάδων (GluR1-4). Υπάρχουν σχεδόν σε όλες τις διεγερτικές συνάψεις του ιππόκαμπου και ρυθμίζουν ένα κανάλι κατιόντων. Το μεγαλύτερο μέρος του δυναμικού οφείλεται στη εισροή Na +, αλλά το κανάλι είναι διαπεράσιμο και σε άλλα μικρά μονοσθενή κατιόντα, οπότε μπορεί να υπάρξει και εισροή K +. Οι υποδοχείς AMPA απαιτούν έναν γρήγορο παλμό γλουταμινικού για να ανοίξουν και απενεργοποιούνται γρήγορα όταν η διαθεσιμότητα του γλουταμινικού μειωθεί. Εάν όμως η ποσότητα του γλουταμινικού δεν μειωθεί, τότε οι υποδοχείς AMPA κλείνουν γρήγορα και εισέρχονται σε μια φάση απευαισθητοποίησης από την οποία επανέρχονται στην αρχική τους κατάσταση σχετικά αργά. 2.2.2 Υποδοχείς NMDA Οι NMDA (N-methyl-D-aspartic-acid) υποδοχείς αποτελούνται από υπομονάδες που ανήκουν σε δύο σχετικά ξεχωριστούς υπότυπους υπάρχουν ως ετεροπολυμερή NR1 και NR2A D υπομονάδων. Η συμπεριφορά τους είναι πιο σύνθετη, καθώς η κινητική τους είναι πιο αργή από αυτή των AMPA υποδοχέων. Έχουν την ικανότητα να διατηρούν μια εισροή ιόντων για πολλές εκατοντάδες mili δευτερολέπτων μετά το τέλος του γλουταμινικού παλμού. Αυτή η αργή κινητική εξηγείται από έναν εξαιρετικά αργό ρυθμό αποδέσμευσης του υποδοχέα. 13

2.3 GABAΕΡΓΙΚΉ ΣΥΝΑΠΤΙΚΉ ΔΙΑΒΊΒΑΣΗ Η ροή της διέγερσης διαμέσου του ιππόκαμπου (από τα κύτταρα της οδοντωτής έλικας στα πυραμιδικά κύτταρα της CA3 και από εκεί στα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής) χρονίζεται από παλμούς GABA που προέρχονται από τους διανευρώνες. Ένας τυπικός παλμός GABA ενεργοποιεί τόσο την γρήγορη αναστολή μέσω των ιοντοτροπικών υποδοχέων GABA A όσο και την αργή αναστολή μέσω των μεταβοτροπικών υποδοχέων GABA B. Και οι δύο τύποι υποδοχέων μπορούν να είναι προ- ή μετασυναπτικοί, όπως επίσης και εξωσυναπτικοί ή περισυναπτικοί. Οι τελευταίοι ενεργοποιούνται μέσω της δίαχυσης του GABA από τη συναπτική σχισμή. Το εξωσυναπτικό GABA δεν παρέχει ένα καθαρό χρονοεξαρτώμενο σήμα, σε αντίθεση με τους φασικούς παλμούς GABA στην σύναψη. Γι' αυτό, η εξωσυναπτική αναστολή ονομάζεται και "τονική αναστολή". Ιδιαίτερα, η εξωσυναπτική αναστολή των GABA A υποδοχέων είναι συνήθως μονίμως παρούσα, συνιστώντας μία συνεχή αγωγιμότητα που έχει ως αποτέλεσμα την ελαφρά υπερπόλωση του μεμβρανικού δυναμικού. 2.3.1 Υποδοχείς GABA A Οι GABA A υποδοχείς είναι διαπερατοί μόνο σε ανιόντα, κυρίως Cl- αλλά και HCO3-, οι οποίοι όταν ανοίγουν υπερπολώνουν την μεμβρανικό δυναμικό. Οι υποδοχείς GABA A είναι ετεροπενταμερείς και αποτελούνται από υπομονάδες από τουλάχιστον επτά διαφορετικές οικογένειες: α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, π και θ. Από αυτές, οι α6, ε, π και θ δεν υπάρχουν στον ιππόκαμπο του επίμυος ή εμφανίζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Από τις υπόλοιπες υπομονάδες, στην οδοντωτή έλικα υπάρχουν οι α 1, α2, α5, β3, και γ2 (Sperk et al, 1997) ενώ στον ιππόκαμπο υπάρχουν διαφορετικές συγκεντρώσεις των διαφόρων υπομονάδων κατά μήκος του διαφραγματικού κροταφικού άξονα, με μεγαλύτερη συγκέντρωση του α1/β1/γ2 υπότυπου στον διαφραγματικό ιππόκαμπο και του α2/β1/γ2 υπότυπου στον κροταφικό. Ιδιαίτερο ρόλο στηντονική αναστολή παίζουν οι GABA A υποδοχείς που περιέχουν την α5 υπομονάδα (α5gaba A Rs), καθώς βρίσκονται στην μεγάλη τους πλειοψηφία στις εξωσυναπτικές περιοχές των δενδριτικών περιοχών των πυραμιδικών νευρώνων της CA1 περιοχής. Ρυθμίζουν, έτσι, την δενδριτική διεγερσιμότητα και συνεισφέρουν με αυτόν τον τρόπο στην νευρωνική πλαστικότητα που διέπει τις διαδικασίες της μνήμης και της μάθησης. Και αυτοί οι υποδοχείς παρουσιάζουν διαφοροποίηση κατα μήκος του ραχιαιο-κοιλιακού άξονα, εμφανίζοντας μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στον κοιλιακό ιππόκαμπο (Sotiriou, Papatheodoropoulos, & Angelatou, 2005). Η συναπτική αναστολή πρέπει να ρυθμιστεί καλά στον εγκέφαλο, διότι μεγάλη αναστολή μπορεί να προκαλέσει απώλεια της συνείδησης και κώμα ενώ μικρή αναστολή οδηγεί σε επιληπτική κρίση. Αυτή η ανάγκη εξηγεί γιατί ο δίαυλος GABA A έχει, εκτός από την περιοχή σύνδεσης του GABA, περιοχές σύνδεσης και άλλων χημικών ουσιών όπως οι βενζοδιαζεπάμες και τα βαρβιτουρικά. Από μόνα τους, αυτά τα φάρμακα επηρεάζουν τη λειτουργία του διαύλου, όταν όμως το GABA είναι κοντά, οι βενζοδιαζεπάμες αυξάνουν τη συχνότητα του ανοίγματος των διαύλων καθώς και 14

την αγωγιμότητα του Cl- στον δίαυλο του GABA A, ενώ τα βαρβιτουρικά αυξάνουν τη διάρκεια διάνοιξης των διαύλων. 2.3.2 Υποδοχείς GABA B Οι μεταβοτροπικοί GABA B υποδοχείς είναι ετεροδιμερή και αποτελούνται από τις πρωτεΐνες GBR1 και GBR2. Συναντώνται προσυναπτικά και μετασυναπτικά, καθώς και σε εξωσυναπτικές μεμβράνες. Οι υποδοχείς GABA B δρουν μέσω G πρωτεΐνών προκειμένου να ανοίξουν διαύλους K +, να αναστείλουν το άνοιγμα τασεοελεγχόμενων διαύλων Ca 2+, αλλά και να ενεργοποιήσουν ή να απενεργοποιήσουν την αδενυλική κυκλάση. 15

Λεπτή δομή του ιπποκαμπιαίου νευροπιλήματος. Τα βέλη υποδεικνύουν μοναδικές ασυμετρικές γλουταμινεργικές συνάψεις σε μία περιοχή της ακτινωτής στιβάδας της CA1 περιοχής του επίμυος. Οι προσυναπτικές απολήξεις περιέχουν πολυάριθμα κυστίδια, ορισμένα από τα οποία είναι "αγκυροβολημένα" στην προσυναπτική μεμβράνη και είναι πιθανόν έτοιμα για εξωκύττωση. Δύο προσυναπτικές απολήξεις είναι χρωματισμένες πράσινες. Τα αστροκύτταρα, χρωματισμένα με μπλε, στερούνται κυστιδίων και έρχονται σε επαφή, σε κάποιες περιπτώσεις, με την συναπτική περίμετρο (μικρά βέλη). Μπάρα = 1μm. (Πηγή: Ventura & Harris, 1999) 16

3. ΣΥΝΑΠΤΙΚΉ ΠΛΑΣΤΙΚΌΤΗΤΑ Μία από τις πιο καλά μελετημένες ιδιότητες των ιπποκάμπειων συνάψεων είναι η ικανότητά τους να απαντούν σε συγκεκριμένα μοτίβα ερεθισμού με μακροπρόθεσμες αυξήσεις η μειώσεις στην συναπτική αποτελεσματικότητα (LTP, long term potentiation και LTD, long term depression). 3.1 NMDA ΕΞΑΡΤΏΜΕΝΗ ΜΑΚΡΟΠΡΌΘΕΣΜΗ ΕΝΊΣΧΥΣΗ (LTP) Από την εποχή του Cajal που έδειξε τη σύνδεση των νευρικών κυττάρων μέσω εξειδικευμένων δομών που ο Sherrington ονόμασε συνάψεις είχε υποτεθεί ότι η μνήμη αποθηκεύεται στον εγκέφαλο με την τροποποίηση της συναπτικής διαβίβασης. Εξ αυτού ορμώμενος, ο ψυχολόγος Donald Hebb διατύπωσε, το 1949 την περίφημη αρχή του: "Όταν ο νευράξονας ενός κυττάρου Α διεγείρει ένα άλλο κύτταρο Β και συμμετέχει συνεχώς ή επανειλημμένα στην εκπόλωσή του, παρατηρούνται ορισμένες διεργασίες αύξησης ή μεταβολικές αλλαγές στο ένα ή και στα δύο κύτταρα, έτσι ώστε η αποτελεσματικότητα του κυττάρου Α, το οποίο είναι ένα από τα κύτταρα που εκπολώνει το κύτταρο Β, να αυξάνεται". Η αρχή του Hebb, που ουσιαστικά ισοδυναμεί με τη φράση "ό,τι χρησιμοποιείται, ενδυναμώνεται", έχει αποτελέσει ισχυρή βάση για την ερμηνεία πειραματικών αποτελεσμάτων και την ανάπτυξη θεωριών και μοντέλων νευρωνικών δικτύων, τόσο βιολογικών, όσο και τεχνητών θεωρητικών. Οι διαδικασίες της μακρόχρονης ενδυνάμωσης και αποδυνάμωσης (LTP και LTD), όπως αυτές συναντώνται στον ιππόκαμπο των θηλαστικών είναι και οι φορείς της συμπεριφοράς που περιέγραψε ο Hebb. Σύγκριση του LTP στις δύο ομάδες ιπποκάμπειων τομών από την κροταφική (κύκλοι) και από την διαφραγματική (τρίγωνα) περιοχή. Τα νούμερα στην παρένθεση δηλώνουν τον αριθμό των τομών. (Πηγή: Papatheodoropoulos & Kostopoulos, 2000) 17

Η μακρόχρονη ενδυνάμωση (Long Term Potentiation - LTP) αναφέρεται στην αύξηση της ισχύος της συναπτικής διαβίβασης σε ένα νευρωνικό μονοπάτι. Το LTP χαρακτηρίζεται από τρεις γενικές ιδιότητες, που είναι αναγκαίες για την επαγωγή του: Η συνεργατικότητα (cooperativity) αναφέρεται στην ύπαρξη ενός κατωφλίου έντασης ερεθισμού, που εξαρτάται από τον αριθμό των ερεθιζόμενων προσαγωγών ινών και το μοτίβο του ερεθισμού, κάτω από το οποίο δεν επιτυγχάνεται συναπτική ενδυνάμωση. Δηλαδή για την επαγωγή του LTP είναι απαραίτητη η ταυτόχρονη ή χρονικά συγγενής (συνεργατική) και επαναλαμβανόμενη διέγερση αρκετών προσαγωγών ινών. Η συνειρμικότητα (associativity) περιγράφει την ενδυνάμωση μιας αδύναμης σύναψης που ενεργοποιείται μαζί με μια δυνατότερη και συγκλίνουσα, και προσδίδει στο LTP το χαρακτήρα του εντοπιστή συγκυριών (coincidence-detector) που είχε προταθεί ως βάση για τη μάθηση από τους Hebb και Konorski. Τέλος, το LTP χαρακτηρίζεται από εξειδίκευση, δηλαδή την ιδιότητα να ενδυναμώνονται μόνο οι συνάψεις που ενεργοποιούνται μαζί με άλλες, και καμία άλλη. Έτσι, επαγωγή του LTP στους ανώτερους δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων (στο stratum radiatum) δεν επηρεάζει τη συναπτική διαβίβαση στους βασικούς (στο stratum oriens) και αντίστροφα. Είτε διεξάγεται in vivo, είτε in vitro, ένα τυπικό πείραμα LTP περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα. Το ζώο, ή η τομή του εγκεφάλου του προετοιμάζεται, τοποθετούνται ηλεκτρόδια καταγραφής και ερεθισμού στις κατάλληλες θέσεις και καταγράφονται τα σήματα προκειμένου να διασφαλιστεί ότι οι ηλεκτροφυσιολογικές αποκρίσεις είναι σταθερές. Μόλις αυτή η προκαταρκτική δουλειά ολοκληρωθεί, το κύριο μέρος του πειράματος χωρίζεται σε τρεις φάσεις. Κατά την πρώτη φάση, προκαλούνται βασικές απαντήσεις μέσω ηλεκτρικών παλμών (συνήθως ανά 30 δευτερόλεπτα) για μια περίοδο αρκετή ώστε να πιστοποιηθεί η σταθερότητα της συναπτικής απάντησης (η περίοδος εξαρτάται από τον τύπο του πειράματος αλλά τυπικά είναι στο εύρος των 10-60 λεπτών). Στη συνέχεια, προκαλείται τέτανος στο ερεθιζόμενο μονοπάτι. Τα τυπικά πρωτόκολλα ερεθισμού περιλαμβάνουν παλμούς των 100 Hz συνήθως για 1 δευτερόλεπτο ή μοτίβα με μικρότερα «τρένα» παλμών που προσομοιάζουν τον θήτα ρυθμό. Κατά την τρίτη φάση ο ερεθισμός ξαναγίνεται χαμηλής συχνότητας, στην ίδια συχνότητα κατά τις οποίες έγινε η λήψη των βασικών απαντήσεων στη πρώτη φάση. Είναι άκρως σημαντικό η ένταση του ερεθισμού να παραμένει σταθερή καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Σε ένα τυπικό πείραμα LTP η απάντηση που ακολουθεί αμέσως μετά τον τέτανο είναι πολύ ενισχυμένη και αποτελεί την έκφραση της βραχύχρονης συναπτικής πλαστικότητας που καλείται μετατετανική ενίσχυση και βασίζεται κυρίως σε προσυναπτικούς μηχανισμούς. Η αρχική αυτή κλίση της καμπύλης της συναπτικής απάντησης είναι πολύ απότομη, στη συνέχεια όμως σταθεροποιείται σε επίπεδα αρκετά υψηλότερα από αυτά της βασικής απάντησης. Χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο των 100 παλμών στα 100 Hz, έχει βρεθεί ότι, ανάμεσα σε διαφραγματικό και κροταφικό ιππόκαμπο, τα επίπεδα της μακροπρόθεσμης ενίσχυσης διαφέρουν σημαντικά, με την ενίσχυση στον 18

διαφραγματικό ιππόκαμπο να είναι αρκετά υψηλότερη από αυτή στον κροταφικό, στην CA1 περιοχή (Papatheodoropoulos & Kostopoulos, 2000). Αριστερά: Καταγραφή ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος, στο οποίο το LTD προκλήθηκε με ερεθισμό χαμηλής συχνότητας (LFS). Δεξιά: Μέσες καμπύλες από 10 συνεχόμενες καταγραφές πριν και μετά τον ερεθισμό, όπως υποδεικνύεται από τα νούμερα στην αριστερή εικόνα. (Πηγή: Dudek & Bear, 1992) 3.1.1 Ο ρόλος των υποδοχέων GABA στην επαγωγή της NMDA εξαρτώμενης μακρόχρονης ενίσχυσης Είναι γνωστό πως ο αποκλεισμός της GABA αναστολής μπορεί να διευκολύνει την επαγωγή NMDAR-εξαρτώμενου LTP. Ο μηχανισμός αυτού του φαινομένου είναι καλά διερευνημένος. Κανονικά, όταν προκαλείται ένα EPSP μέσω του ερεθισμού μίας προσαγωγού οδού, όπως οι Παράπλευρες Ίνες του Schaffer, αυτό περιορίζεται από ένα διφασικό ανασταλτικό μετασυναπτικό δυναμικό (IPSP) που αποτελείται από ένα γρήγορο μέρος που προκαλείται από τους GABAA υποδοχείς και από ένα αργό μέρος που προκαλείται από τους GABAB υποδοχείς. Η υπερπολωτική επίδραση του IPSP ενισχύει τον αποκλεισμό του Mg2+ στους NMDARS, και έτσι περιορίζεται δραστικά η επίδραση των NMDARS στην συναπτική απάντηση. Συγκεκριμένα, η κινητική του IPSP που προκαλείται από τους υποδοχείς GABAA συμπίπτει με το μεγαλύτερο μέρος της αγωγιμότητας που προκαλείται από τους NMDA υποδοχείς. Ο ρόλος της GABA αναστολής στην επαγωγή του LTP είναι κομβικός. Αυτό αποδεικνύεται και από την αξιοσημείωτη αποτελεσματικότητα των πρωτοκόλλων ερεθισμού που έπονται ενός "εναυσματικού" ερεθισμού (primer), κατά τα οποία ένας και μόνο ερεθισμός προηγείται μίας σύντομης υψηλόσυχνης ριπής ερεθισμών κατά 200ms περίπου. Ένα τέτοιου είδους πρωτόκολλο τεσσάρων παλμών που έπεται κατά 200ms από έναν μοναδικό ερεθισμό μπορεί να προκαλέσει LTP. Η δραστικότητα αυτής της ριπής έγκειται στο γεγονός ότι ο ερεθισμός έναυσμα προκαλεί μία σημαντική μείωση στα IPSP που προκαλούνται από τους υποδοχείς GABA. Το ίδιο συμβαίνει και με τον τελευταίο ερεθισμό κάθε ριπής κατά τη διάρκεια των λεγόμενων "θήτα" πρωτοκόλλων ερεθισμού (TBS). Ο μηχανισμός γι' αυτή τη διαδικασία έχει διερευνηθεί εκτενώς. Ένα ποσό από το GABA που απελευθερώνεται ως απάντηση στον ερεθισμό έναυσμα ενεργοποιεί αυτοϋποδοχείς GABAB, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή 19

επακόλουθης απελευθέρωσης GABA. Έτσι, ο ερεθισμός έναυσμα απελευθερώνει φυσιολογικά επίπεδα GABA, αλλά οι ερεθισμοί που ακολουθούν απελευθερώνουν σημαντικά λιγότερο GABA, και έτσι διευκολύνεται η συναπτική ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA στους πυραμιδικούς νευρώνες. Η κινητική του μηχανισμού των GABAB αυτοϋποδοχέων καθορίζει και τον ιδανικό χρονισμό του ερεθισμού εναύσματος έχει μία καθυστέρηση περίπου 20ms, φτάνει στην κορυφή του στα 200ms, και διαρκεί περίπου 1 δευτερολεπτο. Συνεπώς, τα μοτίβα Θήτα δραστηριότητας είναι συντονισμένα στην μέγιστη καταστολή της αναστολής GABA, μέσω του μηχανισμού των αυτοϋποδοχέων, κάτι που υποδηλώνει, από την σκοπιά της φυσιολογίας, ότι οι ιπποκάμπιες συνάψεις είναι ίσως ιδιαίτερα επιδεκτικές σε μακρόχρονη ενδυνάμωση κατά τη διάρκεια της εξερεύνησης, της μετακίνησης και άλλων συμπεριφορικών καταστάσεων που ενεργοποιούν Θήτα δραστηριότητα στον ιππόκαμπο. 3.2 ΜΑΚΡΟΠΡΌΘΕΣΜΗ ΚΑΤΑΣΤΟΛΉ (LTD) ΚΑΙ ΑΠΟ ΕΝΊΣΧΥΣΗ Εάν η εξαρτώμενη από την δραστηριότητα πλαστικότητα λειτουργούσε μόνο για να αυξήσει τη συναπτική αποτελεσματικότητα, τότε κάποια στιγμή θα επέρχονταν κορεσμός της αποτελεσματικότητας. Ένα νευρωνικό δίκτυο του οποίου όλες οι συνάψεις θα βρίσκονταν στη μέγιστη αποτελεσματικότητά τους, θα ήταν ανίκανο μάθησης. Παρ όλο που πολλές, αν και όχι όλες, οι ενισχυμένες συνάψεις μπορούν με την πάροδο του χρόνο να επανέλθουν στα βασικά τους επίπεδα, ένας μηχανισμός που θα βασίζονταν στη δραστηριότητα και θα επέτρεπε τη διαγραφή ή την αποενίσχυση του LTP, θα ενίσχυε την υπολογιστική ικανότητα του δικτύου. Ένας επιπλέον μηχανισμός που θα επέτρεπε μακροπρόθεσμη καταστολή ξεκινώντας από τα βασικά επίπεδα με βάση κάποια δραστηριότητα, ανεξαρτήτως του LTP, θα ενίσχυε επιπλέον την ευελιξία του συστήματος και θα αύξανε την αποθηκευτική του χωρητικότητα (Dayan & Willshaw, 1991). Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας για την ύπαρξη αυτών των μηχανισμών είναι η ανάγκη διατήρησης της ισορροπίας μεταξύ ενίσχυσης και καταστολής, η οποία καθορίζει την συνολική σταθερότητα του δικτύου. Ανεξέλεγκτη ενίσχυση θα επέφερε τον κίνδυνο της διατάραξης αυτής της ισορροπίας και θα οδηγούσε το σύστημα σε αστάθεια και επιληψία. Ο κυριότερος πειραματικός μηχανισμός πρόκλησης LTD in vitro ανακαλύφθηκε από τους Dudek και Bear (1992) και περιλαμβάνει παρατεταμένους ερεθισμούς στο 1Hz και για 900 παλμούς, σε νεαρούς επίμυες. Το LTD που παράγεται με αυτό το πρωτόκολλο είναι μακροπρόθεσμο, NMDA εξαρτώμενο, προφανώς κορεστό, και αναστρέψιμο με τετανικό ερεθισμό (Dudek & Bear, 1992). Δύο είναι οι κυριότεροι μηχανισμοί πρόκλησης LTD: τo NMDAR εξαρτώμενο και το mglur εξαρτώμενο LTD, και η εμφάνιση ενός από τους δύο εξαρτάται από το πειραματικό πρωτόκολλο (Oliet, Malenka, & Nicoll, 1997). Μία μακρόχρονη καταστολή ορίζεται ως NMDAR εξαρτώμενη εάν δεν συμβαίνει παρουσία του D AP5 ή άλλων NMDA ανταγωνιστών (Dudek & Bear, 1992 Mulkey & Malenka, 1992). Αντίστοιχα, το mglur εξαρτώμενο LTD αναστέλλεται παρουσία ανταγωνιστών του mglur όπως η (RS)-αλφα-μέθυλ-4-καρβοξυφαινυλγλυκίνη (Bashir, et al., 1993). 20

Αυτές οι δύο μορφές του LTD έχουν διαφορετικές αναπτυξιακές ιδιότητες In vitro, και τα δύο είδη LTD συμβαίνουν στην περιοχή CA1 των νεογνών, υποχωρώντας στον ενήλικο επίμυ προς χάρη του mglur εξαρτώμενου LTD (Kemp et al, 2000).Εάν φραχθεί φαρμακολογικά η αφομοίωση του L γλουταμινικού, τότε διευκολύνεται η πρόκληση NMDA εξαρτώμενου LTD στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου (Yang, Huang, & Hsu, 2005). Αυτό δείχνει ότι οι μηχανισμοί για την δημιουργία NMDA εξαρτώμενου LTD υπάρχουν και στον ενήλικο επίμυ, αλλά οι φυσιολογικοί μηχανισμοί αφομοίωσης περιορίζουν την εμφάνισή του. Μέσος όρος της επίδρασης 900 παλμών σε διάφορες συχνότητες. Η μέτρηση έγινε 30 λεπτά μετά τον ερεθισμό. (Πηγή: Dudek & Bear, 1992) 3.3 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΌΣ ΡΌΛΟΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΏΠΙΝΟΥ ΙΠΠΌΚΑΜΠΟΥ Στις προσπάθειες να απαντηθεί η ερώτηση "τι κάνει ο ανθρώπινος ιππόκαμπος", τον κυριότερο ρόλο έχουν παίξει έρευνες σε ασθενείς με αμνησία, λειτουργικές νευροαπεικονιστικές μελέτες, και ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές σε ανθρώπους. Σε γενικές γραμμές, έχουμε μάθει πολλά πράγματα σχετικά με τα είδη της μνήμης στα οποία ο ιππόκαμπος εμπλέκεται ή μη. Ο ιππόκαμπος είναι μέρος ενός συστήματος που παίζει κρίσιμο ρόλο στη κωδικοποίηση και ανάκτηση μακροπρόθεσμων μνημών δεδομένων και γεγονότων. Ως σύνολο, το σύστημα είναι ζωτικό γι αυτή τη "δηλωτική" (declarative) ή "κατηγορηματική" (explicit) μορφή μνήμης αλλά δεν εμπλέκεται σε άλλες μορφές μακροπρόθεσμης μνήμης, σε μη μνημονικές πτυχές της νόησης, ή σε άμεση (working) μνήμη. Επιπλέον, η εμπλοκή του στη δηλωτική μνήμη δεν είναι διαρκής αλλά περιορισμένη χρονικά. Γνωρίζουμε, συνεπώς, πολλά σχετικά με τον ρόλο που διαδραματίζει αυτό το σύστημα στην ανθρώπινη μνήμη. Η κατανόησή μας, όμως, των ρόλων των μεμονωμένων 21

στοιχείων του συστήματος είναι πολύ λιγότερο ολοκληρωμένη. Στον άνθρωπο, το σύστημα περιγράφεται συνήθως ως αποτελούμενο από δύο κύριων τύπων δομές. Ένα σετ δομών, συχνά περιγραφόμενο ως η "ιπποκάμπεια δομή", αποτελείται από τις περιοχές CA του ιππόκαμπου, της οδοντωτής έλικας, και του υποθέματος. Για προφανείς λόγους, οι περισσότερες από τις μελέτες σε ανθρώπους δεν περιλαμβάνουν ιστολογικές αναλύσεις. Δυστυχώς, χωρίς ιστολογικές αναλύσεις, είναι αρκετά δύσκολο να απομονωθεί η μία δομή από την άλλη, οπότε οι περισσότερες μελέτες που αναφέρουν δεδομένα από τον "ιππόκαμπο" περιλαμβάνουν δεδομένα από την πιο διευρυμένη ιπποκάμπεια περιοχή. Αυτή δεύτερη ομάδα δομών περιλαμβάνει τις παρακείμενες φλοιικές περιοχές κοντά στον ιππόκαμπο. Αποτελείται από τον ενδορινικό, περιρινικό και παραϊπποκάμπιο φλοιό. Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες προκειμένου να ερμηνευθεί η λειτουργία του ιππόκαμπου. Μία κατηγορία θεωριών προτείνει μία λειτουργική διαφοροποίηση που ξεχωρίζει ποιοτικά την ιπποκάμπεια περιοχή από τις γειτονικές περιοχές στον έσω κροταφικό λοβό, ορίζοντας τι μπορεί να κάνει η ιπποκάμπεια περιοχή που δεν μπορούν να κάνουν οι άλλες δομές και το αντίθετο. Αυτές οι θεωρίες έχουν συνδέσει την λειτουργία του ιππόκαμπου με συνδετικές (Sutherland & Rudy, 1989 O'Reilly & Rudy, 2000), σχεσιακές (Coehn, Poldrack, & Eichenbaum, 1997), και επεισοδιακές, αναμνησιακές ή συνειρμικές (Brown & Aggleton, 2001) μορφές μνήμης. Μία δεύτερη θεωρία, η υπόθεση της δηλωτικής μνήμης, είναι πιο ποσοτική, προτείνοντας ότι η ιπποκάμπεια περιοχή "συνδυάζει και επεκτείνει" την επεξεργασία των γειτονικών φλοιικών δομών, και μαζί σχηματίζουν το μνημονικό σύστημα του έσω κροταφικού λοβού (Squire & Zola-Morgan, 1991). Το σημαντικό ποσό έρευνας που έχει γίνει μάς έχει επιτρέψει να φτάσουμε σε κάποια καθαρά συμπεράσματα. Πρώτον, παράλληλα με τις γειτονικές φλοιικές δομές στην παραϊπποκάμπεια έλικα, η ανθρώπινη ιπποκάμπεια περιοχή εμπλέκεται σε κρίσιμο βαθμό στην μνήμη δεδομένων και γεγονότων (δηλωτική ή κατηγορηματική μνήμη). Δεύτερον, αυτή η εμπλοκή είναι περιορισμένη χρονικά. Τρίτον, η ιπποκάμπεια περιοχή και ο γειτονικός φλοιός δεν εμπλέκονται σε άμεσες ή τρέχουσες μνημονικές λειτουργίες και δεν εμπλέκονται σε ένα ευρύ πεδίο σιωπηλών ή μη δηλωτικών μακροπρόθεσμων μνημονικών διεργασιών. Τέταρτον, η ιπποκάμπεια περιοχή δεν εμπλέκεται σε μη μνημονικές πτυχές της νόησης συμπεριλαμβανόμενης της χωρικής επεξεργασίας. Η εμπλοκή του ιππόκαμπου σε συνειρμική, αναμνησιακή ή άλλες συνιστώσες της μνήμης, είναι αρκετά ξεκάθαρη. Βλάβες στην ιπποκάμπεια περιοχή αποφέρουν ελλείψεις σε δοκιμασίες που αξιολογούν αυτές τις μορφές της μνήμης, και νευροαπεικονιστικές μελέτες έχουν παρατηρήσει δραστηριότητα που συσχετίζεται με αυτές τις βλάβες. Παρ όλες αυτές τις προόδους, η διαφοροποίηση της λειτουργίας ανάμεσα στην ιπποκάμπεια περιοχή και των γειτονικών φλοιικών περιοχών της παραϊπποκάμπειας έλικας δεν είναι προς το παρόν διακριτή. Είναι όμως ξεκάθαρο πως η ιπποκάμπεια περιοχή δεν είναι παρά ένα από τα επιμέρους συστήματα, εν τούτοις ένα ζωτικό σύστημα, της ευρύτερης διαδικασίας της δημιουργίας της μνήμης. 22

4. ΣΚΟΠΌΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΊΑΣ Με βάση τα στοιχεία που παρουσιάστηκαν, η συναπτική πλαστικότητα είναι ένα εξαιρετικά πολύπλευρο και πολυσύνθετο φαινόμενο, του οποίου οι μηχανισμοί μόλις έχουν αρχίσει να ανακαλύπτονται. Είναι ήδη γνωστό πως η ικανότητα του ιπποκάμπου για μακρόχρονη συναπτική πλαστικότητα διαφέρει κατά μήκος του ραχιαιο-κοιλιακού άξονα, με τον κοιλιακό ιππόκαμπο να επιδεικνύει σημαντικά μικρότερη ικανότητα για μακρόχρονη συναπτική ενίσχυση (LTP), έπειτα από υψηλόσυχνο ερεθισμό (Papatheodoropoulos & Kostopoulos, 1999). Επιπροσθέτως, έχει δειχθεί ότι ο ερεθισμός 10Hz σε συνδυασμό με τον αποκλεισμό των GABA A υποδοχέων που περιέχουν την α5 υπομονάδα, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την τονική αναστολή στους πυραμιδικούς νευρώνες, οδηγεί σε LTP (Martin et al., 2010) και οι υποδοχείς α5gaba A είναι πολυπληθέστεροι στον κοιλιακό ιππόκαμπο απ' ό,τι στον ραχιαίο (Sotiriou et al., 2005). Επίσης, τα επίπεδα του εξωκυττάριου GABA στον κοιλιακό ιππόκαμπο είναι υψηλότερα από αυτά του ραχιαίου (Hortnagl et al., 1991) και υψηλά επίπεδα GABA μπορούν να οδηγήσουν σε υψηλότερη τονική αναστολή και μικρότερη φασική (Jensen et al., 2003 Mody, 2005). Πράγματι, η φασική αναστολή στον κοιλιακό ιππόκαμπο είναι μικρότερη από τον ραχιαίο (Papatheodoropoulos et al., 2002). Λαμβάνοντας υπ' όψιν τα παραπάνω ευρήματα, θελήσαμε να περιγράψουμε αφ' ενός την επίδραση του ερεθισμού των 10Hz στον ραχιαίο και στον κοιλιακό ιππόκαμπο, και αφ' ετέρου την επίδραση του συγκεκριμένου ερεθισμού στους δύο πόλους υπό συνθήκες αποκλεισμού της τονικής αναστολής που άγεται από τους υποδοχείς α5gaba A. Η τεχνική των in vitro τομών προσφέρει ένα ελεγχόμενο μικροπεριβάλλον το οποίο ελαχιστοποιεί την πειραματική διακύμανση, συγκριτικά με in vivo τεχνικές, προσφέρει αξιόπιστη δυνατότητα σύγκρισης και προσδιορισμού της διαφοροποίησης κατά μήκος του διαφραγματικού κροταφικού άξονα καθώς επίσης δίνει τη δυνατότητα απομόνωσης της ηλεκτρικής δραστηριότητας των διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών. Καθίσταται, με αυτόν τον τρόπο, δυνατή η μελέτη των τυχών διαφορετικών αποκρίσεων που επιδεικνύουν οι διαφραγματικές σε σχέση με τις κροταφικές τομές ως απόκριση στο συγκεκριμένο πειραματικό πρωτόκολλο ερεθισμού. Οι διαφορές αυτές είναι δυνατόν στη συνέχεια να δώσουν νέα ισχυρά στοιχεία για τη βιοχημική, δομική και λειτουργική διαφοροποίηση που παρατηρείται μεταξύ των τμημάτων αυτών του ιππόκαμπου. 23

a CA1 CA3 Dentate gyrus 250 µm b c 10 µm d e 10 µm Figure 4 Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus. Έκφραση των υπομονάδων των υποδοχέων GABA A στον ιππόκαμπο. a Ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός της α5 υπομονάδας στον ιππόκαμπο ενήλικου μυ (χρώση περοξιδάσης) αποκαλύπτει μία ειδική κατανομή σε στρώσεις στην CA1, CA3 και στην οδοντωτή έλικα. b c Διπλή ανοσοϊστοχημική σήμανση της α5 υπομονάδας (κόκκινο) και της πρωτεΐνης γεφυρίνης που σχετίζεται με τους GABA A υποδοχείς (πράσινο) στην ακτινωτή στιβάδα. Η εικόνα με την διπλή σήμανση δεν δείχνει κάποια χωρική συσχέτιση της α5 υπομονάδας με την γεφυρίνη. d e Διπλή ανοσοϊστοχημική σήμανση της α2 υπομονάδας (κόκκινο) και της γεφυρίνης (πράσινο) στην ακτινωτή στιβάδα του ενήλικου μυ. Σε αντίθεση με την α5 υπομονάδα, η α2 συμπίπτει χωρικά με την γεφυρίνη (κίτρινο), υποδεικνύοντας συνάθροιση της α2 υπομονάδας σε μετασυναπτικές περιοχές. (Πηγή: Farrant & Nusser, 2005) 24

5. ΜΈΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΆ 5.1 ΠΑΡΑΣΚΕΎΗ ΤΟΜΏΝ Ο συνολικός αριθμός των πειραματόζωων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν 12 αρσενικοί αλφικοί Wistar επίμυες, ηλικίας από 31 έως 38 ημερών και 25 αρσενικοί αλφικοί Wistar επίμυες, ηλικίας από 57 έως 83 ημερών. Τα πειραματόζωα διατηρούνταν στο ζωοτροφείο του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών σε συνθήκες θερμοκρασίας 22-24 ο C με ημερονύκτιο κύκλο φωτός (12 ώρες φως και 12 ώρες σκοτάδι). Ο χειρισμός των πειραματόζωων τόσο κατά τη διατήρησή τους όσο και κατά τη θυσία τους έγινε υπό προϋποθέσεις που εξασφάλιζαν το ελάχιστο του άλγους και συμβάδιζαν με τους κανονισμούς του συμβουλίου της Ευρωπαϊκής Ένωσης (86/609/EEC)για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών πειραματόζωων. Οι επίμυες αναισθητοποιούνταν βαθιά με διεθυλαιθέρα και θυσιάζονταν στη συνέχεια με ειδική λαιμητόμο. Ο εγκέφαλος απομονώνονταν με μικροχειρουργική διαδικασία κατά την οποία το κρανίο αφαιρούνταν μετά από τρεις τομές με ψαλίδι: μία κατά μήκος της μέσης οβελιαίας γραμμής και δύο κατά μήκος των δύο έσω καρωτίδων. Ο εγκέφαλος διαβρέχονταν συνεχώς με τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό κορεσμένο σε O2. Ο απομονωμένος εγκέφαλος τοποθετούνταν αργότερα σε τρυβλίο petri πλήρες σε κορεσμένο με O2 τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ACSF) και σε θερμοκρασία 2-4 ο C. Για την απομόνωση του ιππόκαμπου αρχικά αφαιρούνταν η παρεγκεφαλίδα με μετωπιαία τομή στα διδύμια και έπειτα ακολουθούσε η απομάκρυνση των μετωπιαίων λοβών με μετωπιαία τομή στο ύψος του βρεγματικού τρήματος. Στη συνέχεια διαχωρίζονταν τα δύο ημισφαίρια και η εξαγωγή του ιππόκαμπου γίνονταν μετά από αποχωρισμό τμημάτων του διεγκεφάλου και κοπή της ψαλίδας. Με χρήση του μικροτεμαχιστή McIllwain παρασκευάζονταν τομές πάχους 500-550 μm από την περιοχή του διαφραγματικού και του κροταφικού ιππόκαμπου. Κάθε τομή μεταφέρονταν με τη χρήση πινέλου στα ειδικά διαμερίσματα της συσκευής καταγραφής (setup). Τα διαμερίσματα αυτά είναι συσκευές υδατόλουτρου στις οποίες εξασφαλίζεται η διατήρηση εγκεφαλικού ιστού με τη δημιουργία κατάλληλου μικροπεριβάλλοντος. Η θερμοκρασία στη συσκευή κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν 31,5±0,2 ο C και απελευθερώνονταν συνεχώς αέριο μίγμα 95% O2 και 5% CO2. Οι τομές διαβρέχονταν συνεχώς με τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό κορεσμένο σε O2 και με ρυθμό ροής 0,8-1,0 ml/min. Κατά τη διάρκεια προετοιμασίας του κάθε πειράματος οι τομές χωρίζονταν σε δύο διαχωρισμένες περιοχές του υδατόλουτρου, η κάθε μία από τις οποίες έχει ξεχωριστή και ανεξάρτητη παροχή ACSF. Έπειτα, πραγματοποιούνταν τα πειράματα σε τομές χωρίς φάρμακο στη μία περιοχή και όταν πλησίαζαν προς το τέλος τους, στην άλλη περιοχή προστίθονταν το φάρμακο. Για τις φαρμακολογικές μελέτες, χρησιμοποιήθηκε το L-655,708 [ethyl (13aS)- 7-methoxy-9-oxo-11,12,13,13a-tetrahydro-9H-imidazo[1,5-]pyrrolo[2,1-c][1,4] benzodiazepine-1-carboxylate] σε συγκέντρωση 100nm. Η συγγένεια του L-655,708 για 25

τους α5gaba A υποδοχείς είναι 50 με 100 φορές μεγαλύτερη από ότι για τους υποδοχείς GABA A που περιέχουν τις α1, α2 και α3 υπομονάδες (Martin et al., 2010). Η εφαρμογή του φαρμάκου γίνονταν τουλάχιστον 45 λεπτά πριν την έναρξη του πειράματος. 5.2 ΣΎΣΤΑΣΗ ΤΕΧΝΗΤΟΎ ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΊΟΥ ΥΓΡΟΎ Η σύσταση του τεχνητού εγκεφαλονωτιαίου υγρού ήταν, σε mm: NaCl 124, KCl 4, γλυκόζη 10, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1,25, NaHCO3 26. 5.3 ΕΡΕΘΙΣΜΌΣ ΚΑΙ ΚΑΤΑΓΡΑΦΉ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΉΣ ΔΡΑΣΤΗΡΙΌΤΗΤΑΣ Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εντός κλωβού Faraday. Προκειμένου οι τομές να αναρρώσουν από την διαδικασία της παρασκευής τους, η έναρξη ερεθισμού και καταγραφής της δραστηριότητάς τους γινόταν περίπου μιάμιση ώρα μετά την τοποθέτησή τους στο υδατόλουτρο. Οι καταγραφές των διεγερτικών μετασυναπτικών δυναμικών πεδίου (fepsps field excitatory postsynaptic potentials) γίνονταν από την ακτινωτή στιβάδα (stratum radiatum) και από την πολυμορφική στιβάδα (stratum oriens) της CA1 περιοχής χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια ανθρακονήματος με διάμετρο 7-10μm (Kation scientific, Minneapolis, USA). Ένα διπολικό ηλεκτρόδιο από κράμα πλατίνας και ιριδίου, διαμέτρου 25μm χρησιμοποιήθηκε για πρόκληση ηλεκτρικών παλμών (10-60μA, 100μsec). Μόνο τομές με σταθερή απάντηση για τουλάχιστον 20 λεπτά χρησιμοποιήθηκαν για πειραματισμό. Για την πρόκληση της μακροπρόθεσμης ενίσχυσης (LTp Long Term Potentiation) στις συνάψεις μεταξύ των παράπλευρων ινών του Schaffer και των πυραμιδικών κυττάρων της CA1 περιοχής, χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο ερεθισμού 10Hz που αποτελείται από 900 παλμούς με συχνότητα 10Hz, για 1,5 λεπτά. Βασικές απαντήσεις καταγράφηκαν για τουλάχιστον 10 λεπτά πριν εφαρμοσθεί το συγκεκριμένο πρωτόκολλο για την πρόκληση LTp. Μετά το πρωτόκολλο 10Hz η καταγραφή συνεχίζονταν για τουλάχιστον 60 λεπτά. Πριν την έναρξη της καταγραφής των βασικών απαντήσεων καθώς και μετά το πέρας του πειράματος σε κάθε τομή, λαμβάνονταν αποκρίσεις με βάση την ένταση του ρεύματος μέχρι σημείο κορεσμού του μετασυναπτικού δυναμικού (input/output). Τα εξωκυττάρια σήματα ενισχύονταν και φιλτράρονταν στα 0,5Hz με 2KHz χρησιμοποιώντας το σύστημα Neurolog (Digitimer Limited, UK). 5.4 ΑΝΆΛΥΣΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΙΚΉΣ ΔΡΑΣΤΗΡΙΌΤΗΤΑΣ 5.4.1 Επισκόπηση των ειδών ηλεκτρικής δραστηριότητας και ποσοτικοποίησή τους Τα είδη δυναμικών πεδίου που καταγράφηκαν στις τομές ιππόκαμπου ήταν πληθυσμιακά δυναμικά ενέργειας προσυναπτικών αξόνων (fiber volley fv), διεγερτικά 26

μετασυναπτικά δυναμικά πεδίου (fepsps ή EPSPs) ορθόδρομα πληθυσμιακά δυναμικά ενέργειας (population spikes PS). Το fiber volley καταγράφεται ως μία αρνητική απόκλιση του δυναμικού, μικρότερης καθυστέρησης από αυτής των EPSP και PS, και οφείλεται στα αθροιζόμενα δυναμικά ενέργειας των διεγερμένων προσυναπτικών αξόνων (παράπλευρων ινών του Schaffer) και έτσι αποτελούν ένα μέτρο της προσυναπτικής διέγερσης. Είναι αναλογικό της έντασης του ερεθισμού, καθώς εντονότερος ερεθισμός προκαλεί τη διέγερση περισσότερων ινών και κατά συνέπεια μεγαλύτερο fv. Υπολογίζεται ως η απόσταση της αρνητικής αιχμής από την οριζόντια ευθεία που ορίζει το επίπεδο του δυναμικού πριν τον ερεθισμό. Το EPSP είναι ένα συναπτικό δυναμικό και γι αυτό είναι ένα βραδύ κύμα διάρκειας 10-40ms. Αποτελεί ένδειξη της συναπτικής ενεργοποίησης και υπολογίστηκε ως η μέγιστη κλίση της ανερχόμενη φάσης του (αρνητική στην ακτινωτή στιβάδα). Συμβατικά η κλίση αναφέρεται με θετικό πρόσημο. Το EPSP ποσοστικοποιήθηκε μετρώντας την μέγιστη κλίση της φάσης ανόδου του. Το PS αποτελεί μια καθυστερημένη, σε σχέση με το EPSP, σύντομη αλλαγή του δυναμικού καθώς οφείλεται στα δυναμικά ενέργειας των πυραμιδικών κυττάρων. Έχει διάρκεια 2-3ms και καταγράφεται στην πυραμιδική στιβάδα. Αποτελεί μια μέτρηση του αριθμού των συναπτικά διεγερμένων νευρώνων αλλά και του συγχρονισμού της διέγερσής τους. Το PS ποσοτικοποιήθηκε από την έντασή του, μετρώντας την απόσταση μεταξύ της αρνητικής κορυφής του και της γραμμής που ενώνει τις δύο θετικές κορυφές της κυματομορφής του PS. 5.4.2 Συναρτήσεις μετρήσεων Συνάρτηση συναπτικής αποτελεσματικότητας fv / κλίση EPSP & ένταση / κλίση EPSP Η μέθοδος συναρτήσεων εισόδου/εξόδου βασίζεται στη σχέση μεταξύ προσυναπτικής διέγερσης και μετασυναπτικής ενεργοποίησης. Δίνει μία εικόνα της μετασυναπτικής απάντησης της περιοχής που ερεθίζεται σε όλο το εύρος της έντασης του ρεύματος που μπορεί να δεχθεί. Είναι συνήθως γραμμική. Για την κατασκευή τους ερεθιζόταν κάθε 30 δευτερόλεπτα οι παράπλευρες ίνες του Schaffer με ηλεκτρικούς παλμούς μεταβαλλόμενης έντασης και καταγράφονταν στην ακτινωτή στιβάδα το EPSP και στην πολυμορφική στιβάδα το PS. Η ένταση του ρεύματος ξεκινούσε από το σημείο όπου παρατηρούνταν το μικρότερο δυνατό EPSP, αυξανόταν σε διαστήματα των 10 μα και έφτανε μέχρι το σημείο όπου η κλίση του EPSP ήταν μέγιστη και δεν αυξάνονταν σε περαιτέρω αύξηση της έντασης. Αυτή η διαδικασία γίνονταν δύο φορές σε κάθε πείραμα: πριν την λήψη της βασικής απάντησης και έπειτα από την λήψη της απάντησης που έπονταν του πρωτοκόλλου ερεθισμού. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η προσυναπτική διέγερση εκφράζεται με το καταγραφόμενο fv, συνεπώς και με βάση την σχετικά γραμμική σχέση του fv και της έντασης του ερεθισμού, για την κατασκευή των συναρτήσεων χρησιμοποιήθηκε και το fiber volley. 27

Με βάση αυτές τις μετρήσεις, υπολογίστηκαν βασικοί δείκτες της συναπτικής διεγερσιμότητας, όπως είναι το ημιμέγιστο και το μέγιστο EPSP, τόσο σε απόλυτες τιμές της κλίσης τους, όσο και διαιρεμένοι με τα αντίστοιχα fv. Η νευρωνική διεγερσιμότητα ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας το vμέγιστο PS, την ένταση του απαιτούμενου ερεθισμού προκειμένου να παραχθεί το ημιμέγιστο PS (I 50 ), την μετασυναπτική διέγερση που χρειάζεται προκειμένου να παραχθεί το ημιμέγιστο PS (EPSP 50 ), καθώς και ο λόγος μεταξύ του PS και του αντίστοιχου EPSP 50 (PS/EPSP). Συνάρτηση μετασυναπτικής διεγερσιμότητας στον χρόνο κλίση EPSP / χρόνος Προκειμένου να γίνουν αντιληπτά τα αποτελέσματα ενός συγκεκριμένου μοτίβου ερεθισμού (στην συγκεκριμένη εργασία 900 παλμοί με συχνότητα 1 Hz) είναι αναγκαία η παρατήρηση των βασικών απαντήσεων πριν και μετά τον ερεθισμό. Προκειμένου να θεωρηθεί μια αλλαγή στην συναπτική πλαστικότητα μακροπρόθεσμη, ενίσχυση δηλαδή ή καταστολή, πρέπει να διατηρηθεί για 30-60 λεπτά μετά την πρόκληση του μοτίβου ερεθισμού. 28

6. ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ 6.1 ΝΕΑΡΆ ΖΏΑ Το κύριο κομμάτι της έρευνας πραγματοποιήθηκε σε νεαρά ζώα (31 38 ημερών), στα οποία έχει βρεθεί ότι επάγεται LTP με μεγαλύτερη ευκολία. 6.1.1 Βασικές μετρήσεις (EPSP, PS) 6.1.1.1 Διεγερτικό Μετασυναπτικό Δυναμικό Πεδίου (EPSP) Για την μέτρηση και σύγκριση του EPSP χρησιμοποιήθηκαν δύο παράμετροι: το μέγιστο EPSP της κάθε τομής, και το ήμισυ του κάθε μέγιστου EPSP (ημιμέγιστο EPSP), κατά την διαδικασία κατασκευής καμπυλών εισόδου εξόδου στην αρχή και στο τέλος κάθε πειράματος. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε ξεχωριστό εύρος εντάσεων ερεθισμού για κάθε τομή, ξεκινώντας από την ένταση στην οποία λαμβάνονταν η ελάχιστη απάντηση έως την ένταση εκείνη στην οποία η κλίση του EPSP δεν αυξάνονταν πλέον. Τόσο στο ημιμέγιστο, όσο και στο μέγιστο EPSP ο κοιλιακός ιππόκαμπος επέδειξε σημαντικά μεγαλύτερα EPSP απ' ό,τι ο ραχιαίος. Είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι οι διαφορές μεταξύ των δύο πόλων διακρίνονται μόνο έπειτα από την διαίρεση των τιμών του EPSP με το αντίστοιχο fv. Η σημαντικότητα των διαφορών αποδείχθηκε με τη χρήση του στατιστικού t test για ανεξάρτητα δείγματα. Τα αποτελέσματα φαίνονται στις ακόλουθες εικόνες (6.1 & 6.2), όπως επίσης και στον Πίνακα Ι. 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 mv/ms 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Dorsal EPSP halfmax Α Ventral Dorsal EPSP halfmax / fv Ventral Εικόνα 6.1 Α Το ημιμέγιστο EPSP στις ραχιαίες και στις κοιλιακές τομές. Β Παρότι το EPSP δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ ραχιαίου και κοιλιακού ιπποκάμπου, ο λόγος EPSP/fv είναι σημαντικά μεγαλύτερος στον κοιλιακό ιππόκαμπο σε σχέση με τον ραχιαίο (p<0.001). Β 29

8 6 mv/ms 4 2 0 Dorsal EPSPmax Α Ventral Dorsal EPSPmax / fv Β Ventral Εικόνα 6.2 Το μέγιστο EPSP στις ραχιαίες και στις κοιλιακές τομές (Α). Όταν διαιρεθεί με το αντίστοιχο fv (Β) είναι σημαντικά μεγαλύτερο στον κοιλιακό ιππόκαμπο σε σχέση με τον ραχιαίο (p=0.001). 6.1.1.2 Μέγιστο Πληθυσμιακό Δυναμικό (PS) Η καταγραφή του PS γίνονταν μεταξύ της δενδριτικής στιβάδας και του stratum oriens. Η ανάλυση των μέγιστων PS για τις δύο ομάδες τομών, ραχιαίου και κοιλιακού ιππόκαμπου, δεν έδειξε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά. Τα αποτελέσματα, φαίνονται στην Εικόνα 6.3, και στον Πίνακα Ι. 6 4 mv 2 0 Dorsal Ventral PSmax Εικόνα 6.3 Το μέγιστο PS στις ραχιαίες και στις κοιλιακές τομές. 6.1.2 Διεγερσιμότητα (I50, EPSP50, PS/EPSP) Για την ποσοτικοποίηση της διεγερσιμότητας του νευρωνικού δικτύου, μετρήθηκαν τρεις δείκτες. Το I50 είναι η ένταση του ερεθισμού που χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να επιτευχθεί το ημιμέγιστο PS, το EPSP50 είναι η μετασυναπτική διέγερση που χρειάστηκε 30

προκειμένου να παραχθεί το ημιμέγιστο PS και ο δείκτης ps/epsp αντιπροσωπεύει τον λόγο του PS προς το αντίστοιχο EPSP50. Το I50 δείχνει ότι ο κοιλιακός ιππόκαμπος έχει μεγαλύτερη διεγερσιμότητα από τον ραχιαίο. Παρ' όλο που η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο της σημαντικότητας δεν ξεπερνά το 95% (p=0,097), αναμένεται ότι ένας μικρός αριθμός περαιτέρω πειραμάτων θα επιβεβαιώσουν αυτή την τάση και με στατιστικώς σημαντικά αποτελέσματα. Η αυξημένη διεγερσιμότητα των κοιλιακών τομών σε σχέση με τις ραχιαίες, σημαίνει πως η ίδια προσυναπτική ενεργοποίηση προκαλεί ευκολότερα την διέγερση του κοιλιακού ιππόκαμπου απ' ό,τι του ραχιαίου. Τα αποτελέσματα φαίνονται στις εικόνες 6.4 έως 6.6, καθώς και στον Πίνακα Ι. 150 ( ) 4 ( ) 1,0 3 0,8 100 μa 50 mv/ms 2 0,6 0,4 1 0,2 0 Dorsal I 50 Ventral 0 Dorsal EPSP 50 Ventral 0,0 Dorsal Α Β Γ PS/EPSP Εικόνα 6.4 Α. Η τιμή I50 για τους δύο πόλους του ιπποκάμπου. Ο κοιλιακός ιππόκαμπος είναι πιο διεγέρσιμος από τον ραχιαίο. B. Το EPSP50 δεν διαφέρει στις δύο ομάδες μτρήσεων. Γ. Ο λόγος PS/EPSP. Ventral 7 5 Dorsal Ventral 6 Dorsal Ventral 4 5 PS (mv) 3 2 PS (mv) 4 3 2 1 1 0 60 80 100 120 140 160 180 200 I (μa) Α 0 0 1 2 3 4 5 6 7 EPSP (mv/ms) Εικόνα 6.5 Α. Δύο παραδείγματα τομών με διαφορετική διεγερσιμότητα. Η θέση της κοιλιακής τομής προς τα αριστερά σε σχέση με τη ραχιαία σημαίνει ότι η κοιλιακή διεγείρεται περισσότερο με τον ίδιο ερεθισμό. Β. Από το διάγραμμα PS προς EPSP υπολογίζεται η τιμή EPSP50. Παράδειγμα δύο τομών. Β 31