ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΥΚΛΙΝΗΣ D1 ΚΑΙ ΤΗΣ ΟΔΟΥ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΗΣ ΚΕΦΑΛΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΟΓΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2011-2012 Αριθμός: 2805 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΥΚΛΙΝΗΣ D1 ΚΑΙ ΤΗΣ ΟΔΟΥ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΗΣ ΚΕΦΑΛΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΔΙΟΝΥΣΟΠΟΥΛΟΥ ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΙΑΤΡΟΥ ΠΑΘΟΛΟΓΟΥ ΟΓΚΟΛΟΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012 1

2

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) 2. ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙΔΟΥ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 3. ΘΩΜΑΣ ΖΑΡΑΜΠΟΥΚΑΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) 2. ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙΔΟΥ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 3. ΘΩΜΑΣ ΖΑΡΑΜΠΟΥΚΑΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 4. ΜΙΧΑΗΛ ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 5. ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΙΔΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 6. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΑΡΚΟΥ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 7. ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΚΩΤΟΥΛΑ ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Ή έγκρισης της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, αρθρ. 202 2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 3

4

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ 5

6

Στη σύζυγό μου Ευλαμπία Στα αδέρφια μου Θωμά και Γλυκερία - Παναγιώτα Στους γονείς μου Γιώργο και Αγνή 7

8

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 11 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ.... 15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1) Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου...... 19 2) Μοριακή βιολογία του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου από πλακώδες επιθήλιο... 21 3) Οικογένεια υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptror, EGFR) 23 4) Τρόποι αυξημένης ενεργοποίησης των υποδοχέων EGFR 29 5) Οδοί μεταγωγής σήματος των υποδοχέων EGFR... 30 6) Ρόλος του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα στην παθογένεση του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου..... 37 7) Κυκλίνη D1 42 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΣΚΟΠΟΣ-ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 55 Β. ΥΛΙΚΟ-ΑΣΘΕΝΕΙΣ. 57 Γ. ΜΕΘΟΔΟΙ..... 57 Δ. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ.... 62 Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 65 1. Κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και έκβαση..... 65 2. Γονιδιακά αντίγραφα (CNVs) και mrna έκφραση των βιοδεικτών...... 67 3. Συσχετίσεις μεταξύ των DNA/RNA βιοδεικτών και των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών... 71 9

4. Συσχετίσεις δεδομένων ανοσοϊστοχημείας... 74 5. Προγνωστική σημαντικότητα... 77 ΣΤ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ.... 83 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 91 SUMMARY... 93 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 95 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...103 10

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το καρκίνωμα της κεφαλής και του τραχήλου από πλακώδες επιθήλιο (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC) είναι ένα νεόπλασμα της ανώτερης αναπνευστικής οδού το οποίο σχετίζεται αιτιολογικά με το κάπνισμα και την χρήση αλκοόλ και χαρακτηρίζεται από τοπική επιθετικότητα, αυξημένη συχνότητα πρώιμης υποτροπής αλλά και εμφάνισης δεύτερου πρωτοπαθούς όγκου. Οι σύγχρονες θεραπευτικές στρατηγικές που συνδυάζουν τη χημειοθεραπεία, την ακτινοθεραπεία και τη χειρουργική αντιμετώπιση, παρά την επιτυχία στη διατήρηση της λειτουργικότητας και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής, προσφέρουν ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης που φτάνει το 50%, ποσοστό που δεν έχει αλλάξει την τελευταία 30ετία. Τα υπάρχοντα κλινικοπαθολογοανατομικά κριτήρια, στάδιο ΤΝΜ (Tumor Node Metastasis), βαθμός διαφοροποίησης κλπ, δεν επαρκούν για να ταξινομήσουν τους ασθενείς όσον αφορά την πρόγνωση. Επιπρόσθετα, ο καρκίνος της κεφαλής και του τραχήλου περιλαμβάνει μια ετερογενή ομάδα όγκων όσον αφορά την ανατομική θέση, την ιστολογία, τη βιολογία και την κλινική συμπεριφορά. Υπάρχει μεγάλη ετερογένεια στην κλινική έκβαση και στην ανταπόκριση στη θεραπεία σε ασθενείς που με βάση τα κλινικοπαθολογοανατομικά κριτήρια κατατάσσονται στην ίδια ομάδα κινδύνου. Πολλές σύγχρονες μελέτες έχουν εστιάσει στην ανίχνευση βιολογικών και κλινικών παραγόντων που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως προγνωστικοί δείκτες για τον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου. Η πρόσφατη πρόοδος στη γενωμική (genomics), την πρωτεωμική (proteomics) και την βιοπληροφορική (bioinformatics), έχει συμβάλλει πολύ στην καλύτερη κατανόηση του βιολογικού υπόβαθρου της δημιουργίας και της εξέλιξης των νεοπλασματικών όγκων. H σε βάθος έρευνα των βιολογικών αυτών μηχανισμών επιχειρεί να ρίξει φως στα μοριακά χαρακτηιστικά της ανάπτυξης και της εξέλιξης του επιδερμοειδούς καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Στην εποχή της «μοριακής» ιατρικής, όπου κυριαρχεί το μοντέλο της εφαρμογής των εργαστηριακών ανακαλύψεων μέσω της μοριακής τεχνολογίας στην κλινική πράξη «bench to bedside 11

application» είναι φανερή η σημασία της ανακάλυψης νέων μοριακών δεικτών, για την πιο αποτελεσματική αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Από τη θέση αυτή νιώθω την ανάγκη να απευθύνω τις θερμές μου ευχαριστίες στον δάσκαλό μου Καθητητή κ. Γεώργιο Φούντζηλα, ο οποίος με μεταξύ άλλων με ενέπνευσε να ασχοληθώ με την Ογκολογία, τόσο για την ανάθεση αυτής της εργασίας όσο και για το ενδιαφέρον του και την βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της πραγματοποίησής της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Στυλιανή Χαραλαμπίδου και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ζαραμπούκα Θωμά, μέλη της τριμελούς επιτροπής, για τη υποστήριξη και την συμβολή τους στην εκπόνηση της εργασίας αυτής. Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Ογκολογίας και την Κλινική Παθολογικής Ογκολογίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Κωτούλα Βασιλική, η οποία ως διευθύντρια του Εργαστηρίου Μοριακής Ογκολογίας, με την επιστημονική της καθοδήγηση αλλά και την τεχνική υποστήριξη, σε όλα τα στάδια εκπόνησης της διατριβής, συνέβαλε ουσιαστικά στην πραγματοποίησή της. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τις διδάκτορες βιολόγους κ.κ. Ελπίδα Χαραλάμπους και Κυριακή Παπαδοπούλου, καθώς και τους διδάκτορες παθολογοανατόμους κ.κ. Ματθαίο Μπόμπο και Δέσποινα Τελεβάντου για την πολύπλευρη και πολύτιμη βοήθειά τους. Υποχρέωσή μου να ευχαριστήσω επίσης τον στατιστικολόγο κ. Γεώργιο Κουβατσέα για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, τον υπεύθυνο μεταφραστικής έρευνας της Ελληνικής Συνεργαζόμενης Ογκολογικής Ομάδας κ Κωνσταντίνο Καλογερά για τις πολύτιμες υποδείξεις και συμβουλές του, τη νοσηλεύτρια κα. Μαρία Μαλλιότα για τη βοήθεια στη συλλογή των δειγμάτων και την κα. Στέλλα Δαλλίδου για την επιμέλεια του κειμένου. 12

Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου, στη σύζυγό μου Ευλαμπία, για την υπομονή της, αγάπη και υποστήριξη, τα αδέρφια μου Θωμά και Γλυκερία-Παναγιώτα, συνεχή πηγή έμπνευσης και πυλώνες στήριξης και στους γονείς μου, Γιώργο και Αγνή, που έθεσαν τις βάσεις και μου προσέφεραν όλα τα εφόδια για προοδεύσω στη ζωή μου. 13

14

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΤΝΜ Tumor Node Metastasis HNSCC Head and Neck Squamous Cell Carcinoma HPV Human Papilloma Virus PCR Polymerase Chain Reaction CDK4 Cyclin Dependent Kinase 4 EGFR Epidermal Growth Factor Receptor TGF-α Transforming Growth Factor α AREG Amphiregulin EGF Epidermal Growth Factor AR Amphiregulin BTC Betacellulin HB-EGF Heparin Binding Epidermal Growth Factor NRG1,2 Neuregulins 1,2 ADAM A Disintegrin And Metalloprotease EGFRvIII EGFRvariant III PLC Phospholipase C Ras Rat sarcoma (small GTPase of Ras family) Raf Rapidly accelerated fibrosarcoma Rac Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Src Sarcoma Abl Abelson leukemia oncogene Sos Son of sevenless gene GAP GTPase-Activating Protein MAPKs Mitogen Activated Protein Kinases PI3K Phospaditylinositol-3 Kinase SAPKs Stress Activated Protein Kinases STAT Signal Transducers and Activators of Transcrption PTP1D Phosphotyrosine phosphatase 1D GTPase Guanine Tri-Phosphate hydrolase RTKs Receptor Tyrosine Kinases SH2 Src homology 2 MAPKK Mitogen Activated Protein Kinase Kinase MAP Mitogen Activated Protein Kinase ERK Extracellular signal Regulated Kinase CREB camp response element binding JAK Janus Kinase 15

GPCR G Protein Coupled Receptors IAP Inhibitors of Apoptosis MMP Matrix Metalloproteinase PGE2 Prostaglandin E2 COX2 Cyclooxygenase 2 VGFR Vascular Endothelial Growth Factor mtor mammalian Target Of Rapamycin CDK Cyclin Dependent Kinase CDKN Cyclin Dependent Kinase Inhibitor E2F Eucaryotic Transcription Factor gene family Rb Retinoblastoma protein BRCA Breast Cancer ERa Estrogen Receptor a AR Androgen Receptor PPAR- γ Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ SRC1 Steroid Receptor Coactivator 1 GRIP1 Glucocorticoid Receptor Interacting Protein 1 AIB1 Amplified in Breast 1 DMP1 Dentin matrix acidic phopsphoprotein 1 NEUROD1 Neurogenic Differentiation Factor 1 MYOD Myogenic Differentiation factor C/EBPβ CCAAT Enhancer Binding Protein β HAT Histone Acetyltransferases HDACs Histone Deacetylaces GSK3β Glycogen Synthase Kinase 3β XPO1 Exportin 1 APC Anaphase Promoting Complex AQUA Automated in situ Quantitative Analysis PTEN Phosphatase and Tensin Analogue CNV Copy Number Variation MGB Minor Groove Binding NTC No Template Control RQ Relative Quantification CT Cycle Threshold 16

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18

1) ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΚΕΦΑΛΗΣ ΚΑΙ ΤΡΑΧΗΛΟΥ Το καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου από πλακώδες επιθήλιο (HNSCC) αποτελεί το 90% των νεοπλασμάτων τα οποία εξορμώνται από το επιφανειακό επιθήλιο και εμφανίζονται στις διάφορες ανατομικές θέσεις της περιοχής αυτής. Περιλαμβάνει τον καρκίνο πέντε ανατομικών εντοπίσεων: 1. της στοματικής κοιλότητας (που περιλαμβάνει τους καρκίνους του χείλους, των πρόσθιων δύο τριτημορίων της γλώσσας, των ούλων, του ε- δάφους του στόματος, και της σκληρής υπερώας), 2. του ρινοφάρυγγα 3. του στοματοφάρυγγα, (που περιλαμβάνει τους καρκίνους της βάσης της γλώσσας, της μαλακής υπερώας, των αμυγδαλικών βοθρίων και του φάρυγγα) 4. του υποφάρυγγα, και 5. του λάρυγγα.[1] Είναι σχετικά σπάνιος καρκίνος αφού αποτελεί μόνο το 5% του συνόλου των κακοήθων νεοπλασιών, δεν παύει όμως να αποτελεί σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας με περίπου 600.000 νέα περιστατικά το χρόνο παγκοσμίως. Υπολογίζεται ότι το 2008 στις ΗΠΑ παρατηρήθηκαν 47.561 νέα περιστατικά και υπήρξαν 11.260 θάνατοι από τη νόσο. Η αναλογία ανδρών προς γυναίκες είναι 2 προς 1 για την στοματική κοιλότητα και τον ρινοφαρυγγικό καρκίνο, 4 προς 1 για τον καρκίνο του φάρυγγα, ενώ φτάνει 6 προς 1 για τον καρκίνο του λάρυγγα. Η αναλογία αυτή τείνει να μειωθεί τα τελευταία 20 χρόνια αντικατοπτρίζοντας την αύξηση του καπνίσματος στις γυναίκες σ αυτή τη χρονική περίοδο.[2,3] Η μέση ηλικία διάγνωσης είναι μετά τα 40 έτη με εξαίρεση τον καρκίνο του ρινοφάρυγγα και των σιελογόνων αδένων που μπορούν να εμφανίζονται και σε νεότερες ηλικίες. Το κάπνισμα και το αλκοόλ είναι οι σημαντικότεροι παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση καρκίνου σε πολλαπλές θέσεις, και η δράση τους είναι συνεργική. Είναι αξιοσημείωτη η παρατήρηση ότι καπνιστές που εμφανίζουν καρκίνο κεφαλής και τραχήλου έχουν αυξημένο κίνδυνο για εμφάνιση καρκίνου του οισοφάγου και του πνεύμονα.[4] 19

Παγκοσμίως το κάπνισμα ευθύνεται για το 42% των θανάτων από καρκίνους της στοματικής κοιλότητας και του φάρυγγα ενώ η αυξημένη κατανάλωση αλκοόλ για το 16%. Τα αντίστοιχα ποσοστά για τις χώρες με υ- ψηλό κατά κεφαλήν εισόδημα είναι περίπου 70% και 30% αντίστοιχα.[5] Υπολογίζεται ότι 10% των περιπτώσεων καρκίνων κεφαλής και τραχήλου έχουν ισχυρό κληρονομικό υπόβαθρο, γεγονός ενδεικτικό της γενετικής προδιάθεσης.[6] Συναθροίσεις σε οικογένειες περιπτώσεων στοματοφαρυγγικού καρκίνου έχουν παρατηρηθεί σε ορισμένες εθνικές ομάδες. Επίσης μελέτες έχουν δείξει αύξηση μέχρι και 3.8 φορές του κινδύνου α- νάπτυξης στοματοφαρυγγικού καρκίνου σε ασθενείς που έχουν συγγενή πρώτου βαθμού με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.[7,8] Ο ιός του θηλώματος του ανθρώπου, (Human Papilloma Virus, HPV), θεωρείται σήμερα ότι έχει παθογενετικό ρόλο στην ανάπτυξη ορισμένων περιπτώσεων καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Σε μία αρχική μελέτη αιτιοπαθολογικής συσχέτισης σε 253 ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, με χρήση τεχνικών PCR και in situ υβριδισμού, ο ιός HPV ανιχνεύτηκε σε ποσοστό περίπου 25% των περιπτώσεων, και σχεδόν αποκλειστικά (90%) ήταν αυξημένου κινδύνου ογκογόνοι τύποι του ιού (HPV-16).[9] Χαμηλή διαφοροποίηση και εντόπιση στον στοματοφάρυγγα αύξανε την πιθανότητα ανίχνευσης του ιού HPV. Αυτοί οι HPV-θετικοί όγκοι του στοματοφάρυγγα, φαίνεται ότι αποτελούν ιδιαίτερη κλινικοπαθολογική οντότητα, έχουν χαρακτηριστική μορφολογία (basaloid), έχουν μικρότερη συσχέτιση με το κάπνισμα και τη χρήση αλκοόλ, μικρότερη πιθανότητα να εμφανίζουν μεταλλάξεις του p53, και μεγαλύτερη πιθανότητα να εμφανίζουν αδρανοποίηση του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος. Επιπλέον ανταποκρίνονται καλύτερα στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία και γενικά παρουσιάζουν καλύτερη πρόγνωση. Η συχνότητά τους παρουσιάζει σταθερή αύξηση τις τελευταίες δεκαετίες, πιθανότατα λόγω αλλαγής της σεξουαλικής συμπεριφοράς, και σε συνδυασμό με τη σταθερή μείωση των οφειλόμενων στο κάπνισμα καρκίνων έχει ως αποτέλεσμα την σχεδόν εξίσωση της συχνότητας των δύο αυτών μορφών καρκίνου κεφαλής και τραχήλου.[10] 20

2) ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΚΕΦΑΛΗΣ ΚΑΙ ΤΡΑΧΗΛΟΥ ΑΠΟ ΠΛΑΚΩΔΕΣ ΕΠΙΘΗΛΙΟ Η ανάπτυξη του καρκίνου, μιας περίπλοκης γενετικά νόσου, είναι αποτέλεσμα της συνάθροισης ποικίλων γενετικών αλλαγών, οι οποίες περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση πρωτο-ογκογονιδίων και την αναστολή γονιδίων ανασταλτικών του καρκίνου. Επιπλέον για την αδρανοποίηση των ανασταλτικών γονιδίων επιβάλλεται η αδρανοποίηση και των δύο αλληλίων, συνηθέστερα μέσω σημειακών μεταλλάξεων ή απωλειών τμημάτων χρωματοσωμάτων. Η μετάβαση από τον φυσιολογικό βλεννογόνο σε μια καρκινωματώδη βλάβη γίνεται σταδιακά και προοδευτικά με την εμφάνιση αρχικά μιας βλάβης καλοήθους υπερπλασίας (που συχνά δεν διακρίνεται κλινικά από το φυσιολογικό βλεννογόνο), η οποία εξελίσσεται σε βλάβη δυσπλασίας και καρκινώματος in situ, ενώ βλάβες όλων των σταδίων μπορούν να συνυπάρχουν σε διαφορετικά σημεία στον ίδιο ασθενή (Εικόνα 1Α). [11] Η συσχέτιση συγκεκριμένων γενετικών αλλαγών με τις ιστοπαθολογικές εικόνες των διαφόρων βλαβών κατά τη μετάβαση από προκαρκινωματώδεις βλάβες στο διηθητικό καρκίνωμα, έχουν οδηγήσει στην καθιέρωση ενός μοριακού μοντέλου ανάπτυξης του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου. Αυτό το μοντέλο προσφέρει νέους μοριακούς στόχους που γίνονται αντικείμενο μελέτης με σκοπό την βελτιστοποίηση της διάγνωσης, της πρόγνωσης και των θεραπευτικών στρατηγικών.[12] Η πιο συχνή γενετική αλλαγή που επισυμβαίνει πολύ νωρίς σε αυτό το μοριακό μοντέλο είναι η απώλεια της χρωματοσωμικής περιοχής 9p21-22 (Εικόνα 1C). Η απώλεια του τμήματος 9p21 παρατηρείται στους περισσότερους διηθητικούς καρκίνους ενώ είναι ανιχνεύσιμη σε μεγάλη συχνότητα και στις πιο πρώιμες αναγνωρίσιμες προκαρκινωματώδεις βλάβες, συμπεριλαμβανομένης της δυσπλασίας και του καρκινώματος in situ. Το κύριο αποτέλεσμα αυτής της απώλειας είναι η αδρανοποίηση του γονιδίου p16 ενός γονιδίου ανασταλτικού των συμπλόκων κυκλίνης D1 και εξαρτώμενης από την κυκλίνη κινάσης 4, cyclin-dependent kinase 4 (CDK4), το οποίο αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου. 21

Εικόνα 1. Κλινική (Α), Παθολογοανατομική (Β) και Μοριακή (C) πρόοδος του καρκίνου της στοματικής κοιλότητας. LOH = Loss Of Heterozygocity Forastiere A. N Engl J Med, Vol. 345, No. 26 December 27, 2001 Περίπου στις μισές περιπτώσεις καρκίνου κεφαλής και τραχήλου παρατηρείται μετάλλαξη του γονιδίου p53, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17p13. Η απώλεια της λειτουργίας του p53, σχετίζεται με την πρόοδο από μη διηθητικές σε διηθητικές βλάβες και αυξάνει την πιθανότητα ανάπτυξης και άλλων γενετικών αλλαγών. Τέλος η υπερέκφραση της χρωματοσωμικής περιοχής 11q13, που σχετίζεται με την υπερέκφραση του πρωτο-ογκογονιδίου της κυκλίνης D1 (PRAD1, CCND1), μιας πρωτεΐνης που συστηματικά ενεργοποιεί την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου έχει παρατηρηθεί στο ένα τρίτο περίπου των περιπτώσεων και σχετίζεται με διηθητική νόσο.[11,12] 22

3) ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ (EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTROR, EGFR) Οι διαμεμβρανικοί υποδοχείς με δράση κινάσης της τυροσίνης (Receptors Tyrosine Kinases, RTKs) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε ποικίλα φυσιολογικά κυτταρικά φαινόμενα, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση, αλλά και η επιβίωση και η διαφοροποίηση των κυττάρων. Μια από τις σημαντικότερες ομάδες υποδοχέων αυτού του τύπου έχει ως πρότυπο τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) ο οποίος ονομάζεται και HER1 ή ErbB1 στη διεθνή βιβλιογραφία και είναι ο πρώτος που ανακαλύφθηκε το 1978.[13] Ο EGFR είναι μια γλυκοπρωτεΐνη της κυτταρικής μεμβράνης με μοριακό βάρος 170 kilodaltons, και τρεις διακριτές περιοχές: Ένα τμήμα εξωκυττάριο (εξωμεμβρανικό) που περιλαμβάνει το αμινοτελικό άκρο με την περιοχή σύνδεσης των μορίων συνδετών του υποδοχέα [epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor-a (TGFα), amphiregulin (AREG), κλπ]. Ένα τμήμα διαμεμβρανικό που περιλαμβάνει μια σύντομη υδρόφοβη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Ένα τμήμα ενδοκυττάριο (κυτταροπλασματικό) που περιλαμβάνει την καταλυτική περιοχή με δράση κινάσης της τυροσίνης (kinase domain), την περιοχή ρύθμισης της ενδοκύττωσης του υποδοχέα (internalization domain), και το καρβοξυτελικό άκρο που περιέχει πολλαπλές θέσεις αυτοφωσφορυλίωσης υπολειμμάτων τυροσίνης και αποτελεί τη ρυθμιστική περιοχή της δραστηριότητας του υποδοχέα. (Εικόνα 2) [14]. Εκτός από τον ErbB1-HER1 η οικογένεια HER-ErbB περιλαμβάνει και τους συγγενικούς υποδοχείς ErbB2-HER2 (επίσης Neu2) καθώς και τους ErbB3-HER3 και ErbB4-HER4. Οι 3 αυτοί υποδοχείς έχουν ομολογία των εξωκυττάριων αλυσίδων τους σε σχέση με τον EGFR κατά 44%, 36% και 48% αντίστοιχα, ενώ για την καταλυτική περιοχή με δράση κινάση τυροσίνης έχουν ομολογία κατά 82%, 59% και 79 % αντίστοιχα. Οι ομολογίες 23

για την ρυθμιστική καρβοξυτελική αλυσίδα είναι μικρότερες της τάξης του 32%, 24% και 28% αντίστοιχα.[14] Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της δομής ενός υποδοχέα με δράση τυροσίνης κινάσης. Mitsudomi T. FEBS Journal 277;277:301-308 Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί 12 μόρια συνδέτες για τους 4 υποτύπους του υποδοχέα: O Επιδερμικός Αυξητικός Παράγοντας, EGF (Epidermal Growth Factor), η αμφιρεγκουλίνη, AR (amphiregulin) και ο Μεταμορφωτικός Αυξητικός Παράγοντας-α, TGF-a (Transforming Growth Factor α), συνδέονται με τον EGFR. Η Βητασελλουλίνη, BTC (betacellulin), ο Συνδέων την Ηπαρίνη Επιδερμικός Αυξητικός Παράγοντας, HB EGF (heparin-binding EGF) και η Επιρεγκουλίνη, EPR (epiregulin) συνδέονται και με τον EGFR αλλά και με τον ErbB4. 24

Οι Νευρεγκουλίνες 1 και 2, NRG1 και NRG2 (Neuregulins), συνδέονται κατά προτίμηση με τους ErbB3 και ErbBB4, ενώ οι Νευρεγκουλίνες 3 και 4 συνδέονται με τον ErbB4 (Εικόνα 3).[15] Εικόνα 3. Σχηματική αναπαράσταση των 4 υποδοχέων της οικογένειας του Επιδερμικού Αυξητικού Παράγοντα, των συνδετών τους και της λειτουργίας τους μέσω του σχηματισμού διμερών. Pradip Nair. Current Science, Vol. 88, No. 6, 25 March 2005. Οι συνδέτες αυτοί συντίθενται ως διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και οι διαλυτοί αυξητικοί παράγοντες προέρχονται από την πρωτεολυτική τους διάσπαση μέσω πρωτεϊνών ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease) οι οποίες είναι μεταλλοπρωτεάσες προσκολλημένες στην κυτταρική μεμβράνη.[16] Οι υποδοχείς αυτού του τύπου για να ενεργοποιηθούν πρέπει να σχηματίσουν διμερή σύμπλοκα, τα οποία μπορούν να είναι είτε ομοδιμερή, όταν αποτελούνται από δύο μόρια του ίδιου υποδοχέα, ή ετεροδιμερή, ό- ταν αποτελούνται από δύο μόρια διαφορετικών υποδοχέων της ίδιας οικογένειας. 25

Αν και το ομοδιμερές ErbB1-ErbB1 είναι το περισσότερο μελετημένο και το περισσότερο διαδεδομένο, πολλά άλλα διμερή έχουν περιγραφεί αν και δεν έχουν ανιχνευτεί μέχρι σήμερα όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί. Έτσι μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί 9 διμερή: τρία ομοδιμερή ErbB1- ErbB1, ErbB3- ErbB3 και ErbB4- ErbB4 στα οποία προστίθενται τα 6 πιθανά ετεροδιμερή.[17] Η σύνδεση ενός συνδέτη στην εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα προκαλεί μια μεταβολή στην τρισδιάστατη δομή του μορίου ευνοώντας το συσχετισμό με ένα δεύτερο μόριο υποδοχέα, τη γειτνίασή τους και τον επακόλουθο σχηματισμό διμερούς. Κατά τον σχηματισμό ενός διμερούς οι εξωκυττάριες περιοχές με τους συνδεδεμένους συνδέτες παρουσιάζουν διπλή συμμετρία (στοιχειομετρικά 2:2, δηλαδή 2 υποδοχείς και 2 συνδέτες) με άξονα συμμετρίας κάθετο στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα 4).[18] Εικόνα 4. Σχηματική αναπαράσταση της ενεργοποίησης του EGFR μέσω του σχηματισμού διμερούς. Zhang et al. Cell 2006;125:1037-1049. Η αλληλεπίδραση των ενδοκυττάριων περιοχών είναι τόσο «μηχανική», η μία αλυσίδα ωθεί την άλλη ώστε να αλλάξει τρισδιάστατη δομή και να ενεργοποιηθεί, όσο και «καταλυτική» με αυτο-φωσφορυλίωση αλλά 26

και τρανς-φωσφορυλίωση υπολειμμάτων τυροσίνης τα οποία βρίσκονται στη ρυθμιστική καρβοξυτελική ουρά της ενδοκυττάριας περιοχής. Η φωσφορυλίωση αυτών των υπολειμμάτων τυροσίνης αλλάζει τη δομή της κυτταροπλασματικής καρβοξυτελικής ουράς του υποδοχέα και αφενός απελευθερώνει την καταλυτική περιοχή, αφετέρου δημιουργεί τις θέσεις αλληλεπίδρασης με τους διαφόρους ενδοκυττάριους μεσολαβητές μεταγωγής του σήματος.[19,20] Στη δημιουργία του ενδοκυττάριου συμπλόκου του διμερούς, το οποίο σε αντίθεση με το σύμπλοκο των εξωκυττάριων περιοχών παρουσιάζει ασυμμετρία, σημαντικό ρόλο παίζουν τα προσκείμενα στην κυτταρική μεμβράνη τμήματα της ενδοκυττάριας περιοχής (juxtamembrane regions). Τα τμήματα αυτά έχουν ελικοειδή διαμόρφωση που επιτρέπει τις απαραίτητες «μηχανικές» αλλαγές της τρισδιάστατης δομής των αλυσίδων των ενδοκυττάριων περιοχών ώστε να δημιουργηθεί το ασύμμετρο σύμπλοκο με τις ενεργοποιημένες καταλυτικές περιοχές. Επιπλέον η αλληλεπίδρασή τους οδηγεί και στην σταθεροποίηση του συμπλόκου του διμερούς υποδοχέα στην ενεργοποιημένη διαμόρφωσή του. Ο ρόλος του παρά την κυτταρική μεμβράνη τμήματος της ενδοκυττάριας περιοχής του υποδοχέα φαίνεται να είναι ρυθμιστικός καθώς φαίνεται ότι δεν επιτρέπει την απελευθέρωση και ενεργοποίηση της καταλυτικής περιοχής των διμερών που σχηματίζονται απουσία συνδέτη.[21,22] Ο ErbB2 δεν μπορεί να ενεργοποιηθεί από κανέναν γνωστό συνδέτη και ο ErbB3 δεν έχει δράση τυροσίνης κινάσης. Το ετεροδιμερές ErbB2/ErbB3 αποτελεί έτσι μια εξελικτική προσαρμογή της οικογένειας των υποδοχέων αυτών όπου δύο «ελαττωματικοί» υποδοχείς συνδυάζονται για να σχηματίσουν έναν σύμπλοκο υποδοχέα με ισχυρή δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταγωγής σήματος.[23] Η σύνδεση των διαφόρων συνδετών στους τέσσερις υποδοχείς της οικογένειας του EGFR και η επακόλουθη ενεργοποίησή τους με το σχηματισμό ομο- η ετερο-διμερών ποικίλει ανάλογα με την κατάσταση του κυττάρου και το εξωκυττάριο σήμα που πρόκειται να μεταδοθεί. Φαίνεται ότι ανάλογα με το είδος του συνδέτη, σχηματίζονται διαφορετικά σύμπλοκα, στα οποία επιπλέον φωσφορυλιώνονται ανά περίσταση διαφο- 27

ρετικά υπολείμματα τυροσίνης στην καρβοξυτελική ουρά του συμπλόκου υποδοχέα. Η διαφορική αυτή φωσφορυλίωση της ενδοκυττάριας ουράς, καθορίζει το είδος των ενδιάμεσων μεσολαβητών που θα αλληλεπιδράσουν με τον υποδοχέα και συνεπακόλουθα το είδος των ενδοκυττάριων μονοπατιών που θα ενεργοποιηθούν καθώς και το είδος της κυτταρικής απάντησης (Εικόνα 3).[15,24] 28

4) ΤΡΟΠΟΙ ΑΥΞΗΜΕΝΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ EGFR Υπάρχουν πολλοί γνωστοί τρόποι αυξημένης ενεργοποίησης του υποδοχέα EGFR όπως: Αύξηση της έκφρασής του (αύξηση του αριθμού των υποδοχέων στην επιφάνεια του κυττάρου). Σε φυσιολογικές συνθήκες πάνω από 40.000 με 100.000 μόρια υποδοχέα βρίσκονται στην επιφάνεια του κυττάρου. Ο αριθμός τους μπορεί να αυξηθεί σε αρκετά εκατομμύρια σε ορισμένους τύπους καρκίνου μέσω της αύξηση της μεταγραφής τους ή μέσω της αυξημένης σταθερότητας και ελαττωμένης αποδόμησης των υποδοχέων. Μετάλλαξη στο επίπεδο του DNA με αποτέλεσμα τη σύνθεση ενός σταθερά ενεργοποιημένου υποδοχέα που δεν αποδομείται με ενδοκύττωση (η περισσότερο μελετημένη μετάλλαξη είναι αυτή της απώλειας των εξονίων 2-7 με αποτέλεσμα την παραλλαγή ενεργοποιημένου υποδοχέα, EGFRvIII). Παρουσία σε μεγάλη ποσότητα ενός μορίου συνδέτη του υποδοχέα και συγκεκριμένα του TGFα, στην περίπτωση του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου και του καρκίνου του πνεύμονα. Εκτός από τον TGFα, και άλλοι συνδέτες μπορούν να υπερεκφράζονται με διακριτούς ρόλους, ειδικοί για κάθε είδος ιστού.[25] Υπερέκφραση του γονιδίου του υποδοχέα. Αυτή η περίπτωση είναι η λιγότερο συχνή (20-30%) και περιορίζεται σε ορισμένους τύπους καρκίνου όπως τα γλοιώματα και οι όγκοι του νεφρού.[26] 29

5) ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ EGFR Οι υποδοχείς του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα μεταφέρουν ποικίλα βιολογικά μηνύματα μέσω της φωσφορυλίωσης διαφορετικών συνδυασμών υπολειμμάτων τυροσίνης του κυτταροπλασματικού τους τμήματος, οι οποίοι αναγνωρίζονται από συγκεκριμένες πρωτεΐνες-μεσολαβητές της οδού μεταγωγής σήματος. Οι κυτταροπλασματικοί μεσολαβητές-μεταγωγείς σήματος που ενεργοποιούνται από τον ενεργοποιημένο EGFR περιλαμβάνουν τη φωσφολιπάση γ (PLCγ), την οδό Ras-Raf-MEK-MAPKs, την οδό της φωσφατιδυλινοσιτόλη-3-κινάσης, PI3K και Akt, την Src, τις ενεργοποιήμενες από stess πρωτεϊνικές κινάσες SAPKs (Stress-Activated Protein Kinases), την οδό PAK-JNKK-JNK, και τις πρωτεΐνες τύπου STAT (signal transducers and activators of transcription).[27,28] Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση των ενδοκυττάριων μονοπατιών μεταγωγής σήματος συνεπεία ενεργοποίησης του EGFR, και των ποικίλων αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Kalyankrishna S, JCO 2006;24:2666-71. Η ειδικότητα και η ένταση του επαγόμενου σήματος από τον ενεργοποιημένο υποδοχέα EGFR, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος του συνδέτη που τον ενεργοποιεί καθώς και από τα κυτταρικά επίπεδα των 30

συν-υποδοχέων HER2, ErbB3 και ErbB4 με τους οποίους ο EGFR μπορεί να σχηματίζει ετεροδιμερή. Ο κύριος όμως καθοριστής είναι ο συνδυασμός των θέσεων αυτοφωσφορυλίωσης στο καρβοξυτελικό τμήμα του υποδοχέα που καθορίζει ποια κυτταροπλασματικά μόρια μεσολαβητές-επαγωγείς του ενδοκυττάριου σήματος θα συνδεθούν, τα οποία βεβαίως διαφέρουν ανάλογα με τον συν-υποδοχέα που θα σχηματίσει ομοδιμερές ή ετεροδιμερές με τον EGFR.[23] Σε κύτταρα που συνεκφράζουν τον HER2, ο ενεργοποιημένος μέσω κάποιου συνδέτη του, EGFR, συνδυάζεται κατά προτίμηση με τον HER2, δημιουργώντας ένα ετεροδιμερές σύμπλοκο το οποίο παρουσιάζει αυξημένο ρυθμό ανακύκλωσης, καθώς και αυξημένη σταθερότητα και σηματοδοτική ισχύ σε σύγκριση με ομοδιμερή EGFR.[23] Η διάρκεια και η ένταση της ενεργοποίησης της φωσφατιδυλινοσιτόλης-3-κινάσης, PI3K, κριτικού ενδιάμεσου μεσολαβητή για την ενεργοποίηση αντιαποπτωτικών μονοπατιών, αυξάνονται με τον συνδυασμό του EGFR με τους ErbB3 και ErbB4, ετεροδιμερή τα οποία μπορούν να συνδέονται απ ευθείας με την PI3K, κάτι που δεν ισχύει για το ετεροδιμερές EGFR/HER2. Η ενεργοποίηση της οδού μεταγωγής σήματος χαρακτηρίζεται είτε ως άμεση, όταν οι πρωτεΐνες-μεσολαβητές διαθέτουν ενδογενείς ενζυματικές ιδιότητες τύπου φωσφολιπάσης (PLC), φωσφατάσης (PTP1D) ή κινάσης (Src, Abl), είτε ως έμμεση όταν αυτές έχουν ρόλο ρυθμιστικό επιτρέποντας π.χ. τον έλεγχο μιας δραστηριότητας GTP-ase τύπου Ras ή Rac μέσω των ρυθμιστικών τους μορίων (όπως τα Sos, GAP ή Vav).[17,28] Η οικογένεια (super-family) των γονιδίων Ras κοδικοποιούν τη σύνθεση μικρών πρωτεϊνών που συνδέουν την GTP και είναι υπεύθυνες για τη ρύθμιση πολλών κυτταρικών λειτουργιών συμπεριλαμβανομένων της διαφοροποίησης, της οργάνωσης του κυτταρικού σκελετού και τη μεταφοράς πρωτεϊνών. Έχουν περιγραφεί τουλάχιστον 20 διαφορετικές πρωτεΐνες της οικογένειας Ras στα κύτταρα των θηλαστικών με 30% ομοιότητα στην αλληλουχία των αμινοξέων τους. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν τις M-Ras/R-Ras3, R-Ras, TC21/R-Ras2, Rap1A, -1B, -2A, και -2B, Ral A και B, Rit, Rin, Rheb (Ras homolog enriched in brain), Rhes, και B-Ras 1 31

και 2, καθώς και τις κλασσικές Ras πρωτεΐνες. Κάθε πρωτεΐνη Ras αποτελείται από περίπου 190 αμινοξέα. Οι περισσότερες διαφορές ανάμεσα στους διαφορετικούς τύπους πρωτεϊνών Ras βρίσκονται στην υπερμεταβλητή περιοχή του καρβοξυτελικού τους άκρου. Οι διαφορετικές τους λειτουργίες καθορίζονται από την ίδια υπερμεταβλητή περιοχή. Επιπρόσθετα στα γονίδια R-ras και M-ras, ογκογονίδια τύπου Ras στα ανθρώπινα κύταρα περιλαμβάνουν τα H-ras, N-ras και K-ras. Οι μεταμορφωτικές 21-Κd πρωτείνες των γονιδίων H-ras και K-ras, αναγνωρίστηκαν αρχικά ως τα ανθρώπινα αντίστοιχα των Harvey και Kirsten rat sarcoma viruses, ενώ το ογκογονίδιο Ν-ras απομονώθηκε από κύτταρα νευροβλαστώματος και δεν έχει βρεθεί σε ρετροϊούς. Οι πρωτεΐνες τύπου Ras βρίσκονται στην εσωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης και λειτουργούν ως διακόπτες on/off (Ras-GTP/ Ras-GDP) που ελέγχονται από υποδοχείς της επιφάνειας της κυτταρικής μεμβράνης και μεταφέρουν τα εξωκυττάρια μηνύματα στον πυρήνα του κυττάρου. Οι πρωτεΐνες αυτές αποτελούν πρωταρχικής σημασίας μεσολαβητές οδών μεταγωγής σήματος που ελέγχουν μεταξύ άλλων τον κυτταρικό κύκλο, την επιβίωση των κυττάρων αλλά και το σχήμα και την κινητικότητα των κυττάρων.[28,29] Η ενδοκυττάρια μεταγωγή σήματος μέσω της οδού Ras έχει αποσαφηνιστεί τα τελευταία χρόνια. Τα μόρια-μεσολαβητές συνδέονται σε φωσφορυλιωμένα υπολείμματα τυροσίνης των υποδοχέων με δράση κινάσης της τυροσίνης RTKs, μέσω τμημάτων με ομολογία src 2, (src homology 2, SH2), ή μέσω μιας προσαρμοστικής πρωτεΐνης, Grb2/SOS στην περίπτωση των πρωτεϊνών Ras. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη Ras ενεργοποιεί την πρωτεΐνη Raf, η οποία είναι μία κινάση σερίνης/θρεονίνης. Η Raf ενεργοποιεί την κινάση MAPKK, (mitogen-activated protein kinase kinase), που ονομάζεται και ΜΕΚ, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί την κινάση ΜΑΡ, (mitogen activated protein kinase), ή την κινάση ERK, (extracellular signal regulated kinase). H ενεργοποίηση της κινάσης ΜΑΡ, έχει ως αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της κινάσης του ριβοσώματος S6 καθώς και μεταγραφικών παραγόντων όπως οι c-jun, c-myc και c- fos, με αποτέλεσμα την έκφραση ενός αριθμού γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική αύξηση. Η μεταγωγή του σήματος μέσω αυτής της οδού 32

είναι προφανώς πολύ περισσότερο πολύπλοκη απ ότι περιγράφηκε παραπάνω καθώς υπάρχουν και οδοί ενεργοποίησης των κινασών ΜΑΡ ανεξάρτητες από τις Ras και Raf. Επίσης έχει περιγραφεί και μία υποοικογένεια κινασών ΜΑΡ, 54 kda που δρουν ανεξάρτητα από τις κινάσες ΜΕΚ. Εικόνα 6. Σχηματική αναπαράσταση του δικτύου ενδοκυττάριας μεταγωγής σήματος των υποδοχέων ErbB. Yarden Y, Nat Rev Mol Cel Biol 2001; 2: 127-37. Οι οδοί ενδοκυττάριας μεταγωγής σήματος είναι στην πραγματικότητα παρόμοιες για όλες τις οικογένειες αυξητικών παραγόντων. Η πρωταρχικής σημασίας οδός Ras Raf MAP kinase, για παράδειγμα, ενεργοποιείται από όλους τους υποδοχείς της οικογένειας του EGFR. Διαφορετικές όμως αλληλουχίες αντιδράσεων MAP κινάσης ενεργοποιούνται ανάλογα με το διμερές του υποδοχέα που έχει ενεργοποιηθεί. Αυτές οι αλληλουχίες αντιδράσεων ΜΑΡ κινάσης έχουν ως αποτέλεσμα τη μεταγωγή του βιολογικού σήματος στο εσωτερικό του πυρήνα του κυττάρου, 33

μέσω της ενεργοποίησης ποικίλων μεταγραφικών παραγόντων όπως οι Fos, Jun, Myc, Ets, Elk και CREB. Η ειδκότητα του μηνύματος εξασφαλίζεται από το συνδυασμό των θέσεων σύνδεσης, στον προαγωγέα του κάθε γονιδίου, για τους διαφορετικούς αυτούς μεταγραφικούς παράγοντες. Με τον τρόπο αυτό, οι παραπάνω μεταγραφικοί παράγοντες ρυθμίζουν την ενεργοποίηση των γονιδίων που ενέχονται στη ρύθμιση των λειτουργιών της απόπτωσης, της κυτταρικής διαίρεσης, της μετανάστευσης, της προσκόλλησης, της διαφοροποίησης ή και αντίθετα της αποδιαφοροποίησης των κυττάρων, λειτουργίες που ενέχονται σε όλα τα στάδια της καρκινογένεσης.[28] Η οικογένεια πρωτεϊνών STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) είναι μεταγραφικοί παράγοντες που φωσφορυλιώνονται απ τις κινάσες JAK, σε απάντηση στην ενεργοποίηση υποδοχέων με δράση κινάσης της τυροσίνης της κυτταρικής μεμβράνης όπως ο EGFR. Μετά την ενεργοποίησή τους οι πρωτείνες STAT σχηματίζουν δημερή τα οποία μεταφέρονται στον πυρήνα του κυττάρου και ενεργοποιούν τη μεταγραφή εξαρτώμενων από αυτά γονιδίων (Εικόνα 6).[28] Έχουν περιγραφεί τουλάχιστον 3 κινάσες τύπου JAK ενώ τουλάχισον 6 πρωτείνες STAT συμμετέχουν σ αυτό το πολύπλοκο μονοπάτι μεταγωγής σήματος. Η πρωτείνη STAT3 καθώς και η STAT5, σηματοδοτούν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, αναστέλλουν την απόπτωση και αυξάνουν την έκφραση ογκογονιδίων, όπως τα c-myc και bcl-x, τα οποία ενέχονται στην καρκινογένεση.[30,31] Μία άλλη πρωταρχικής σημασίας οδός είναι αυτή της πρωτείνης κινάσης Akt, η οποία όταν ενεργοποιηθεί αναστέλλει την απόπτωση του κυττάρου. Αυτή η οδός μπορεί να ενεργοποιηθεί είτε μέσω της βασικής λιπιδιακής κινάσης phosphatidyl-inositol-3 kinase ή PI3K, η οποία συνδέεται σ ένα φωσφορυλιωμένο υπόλειμμα τυροσίνης των υποδοχέων EGFR, ή μέσω της ενεργοποίησης της μονομερούς GTP-άσης Ras. Ανάλογα με το ετεροδιμερές που ενεργοποιείται έχουμε είτε αναστολή των προ-αποπτοπτωτικών πρωτεϊνών όπως η Bad, ή ενεργοποίηση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως οι BclXL, Bcl2 και IAP, με τελικό απότέλεσμα την αναστολή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου.[32] 34

Είναι απαραίτητο να τονιστεί η σημασία των διασυνδέσεων μεταξύ των διαφορετικών οδών μεταγωγής σήματος. Είναι προφανές ότι η οικογένεια των υποδοχέων EGFR δεν είναι η μοναδική παρούσα στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι υποδοχείς αυτοί συνυπάρχουν με άλλες ομάδες υποδοχέων, όπως οι υποδοχείς των εφρινών, των λεμφοκινών, των κυτταροκινών, των νευροδιαβιβαστών και διαφόρων ορμονών καθώς και υποδοχείς που δεν είναι ακόμα καλά γνωστοί όπως οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από διάφορους στρεσσογόνους παράγοντες. Ο κάθε τύπος υποδοχέα ενεργοποιεί μία ή και περισσότερες γενικές ή ειδικές γι αυτόν οδούς σηματοδότησης, με αποτέλεσμα να υπάρχει ένα δίκτυο αλληλένδετων κυκλωμάτων θετικής ή αρνητικής ρύθμισης, τη λειτουργία των οποίων μόλις αρχίζουμε να αντιλαμβανόμαστε. Μία από τις πρώτες διασυνδέσεις ανάμεσα στους υποδοχείς EGFR και μια άλλη οικογένεια υποδοχέων που έχει μελετηθεί αφορά στους υποδοχείς τους εξαρτώμενους από τις πρωτείνες G, (G protein coupled receptors, GPCR), που μεταδίδουν ένα μιτογενετικό μήνυμα μέσω της ενεργοποίησης των διμερών EGFR. Δύο τύποι διασύνδεσης έχουν μέχρι τώρα μελετηθεί: Ένας ενδοκυττάριος μηχανισμός: μία πρωτείνη G (ετεροτριμερής GTPase) ενεργοποιημένη απο έναν υποδοχέα GPCR με 7 διαμεμβρανικές περιοχές, προκαλεί μία αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου, η οποία ενεργοποιεί μία κυτταροπλασματική πρωτείνη κινάση, την Pyk2, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί την Src, την πρωτείνη κινάση του κυτταροπλάσματος που βρίσκεται στο σταυροδρόμι πολλών οδών μεταγωγής σήματος. Η φωσφορυλίωση του EGFR από την Src ολοκληρώνει αυτό το κύκλωμα έμμεσης ενεργοποίησης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ο οποίος θα ενεργοποιήσει με τη σειρά του την κλασσική οδό σηματοδότησής του. Ένας εξωκυττάριος μηχανισμός: ο υποδοχέας GPCR μπορεί να ενεργοποιήσει τη δραστηριότητα της μεταλλοπρωτεάσης του στρώματος ΜΜΡ (matrix metalloproteinase), η οποία διασπά τον ΗΒ-EGF που είναι η φυ- 35

σική δεξαμενή του επδερμικού αυξητικού παράγοντα EGF, ο οποίος απελευθερωμένος ενεργοποιεί τον υποδοχέα του. Οι διάφορες ετερόλογες οδοί ενεργοποίησης, δεν έχουν σαν ρόλο μόνο την ενίσχυση των αυξητικών σημάτων που μεταδίδονται από τον EGFR, αλλά συμμετέχουν επίσης στη διατήρηση της ενίσχυσης του σήματος με την παραγωγή μορίων συνδετών των υποδοχέων EGFR, οι οποίοι με την έκλυσή τους επιτρέπουν τη διατήρηση της αυξημένης σηματοδότησης μέσω των οδών αυτών. Τέλος εκτός από τον κλασσικό ρόλο μεμβρανικού υποδοχέα με δραστηριότητα κινάσης της τυροσίνης, σύγχρονες μελέτες εστιάζονται στη σημασία της εντόπισης του EGFR στον πυρήνα των κυττάρων όπου φαίνεται ότι δρα σαν μεταγραφικός παράγοντας. Συγκεκριμένα έχει δειχθεί ότι ο EGFR σε συνεργασία με την πρωτείνη STAT3 του πυρήνα μπορεί να ενεργοποιεί τη μεταγραφή της επαγόμενης συνθάσης του νιτρικού οξέος γεγονός που σημαίνει ότι η μεταγραφή μιας πληθώρας γονιδίων μπορεί να ενεργοποιείται απευθείας από τον EGFR ανεξαρτητα από την ενεργοποίηση της οδού μεταγωγής σήματός του. Τα δεδομένα αυτά μπορούν να οδηγήσουν σε ένα νέο μοντέλο δράσης αυξητικού παράγοντα ενώ συμβαδίζουν με τα αποτελέσματα μελετών που τονίζουν την πιθανή προγνωστική σημασία της ανίχνευσης της πυρηνικής υπερέκφρασης του EGFR. [33] 36

6) ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΚΕΦΑΛΗΣ ΚΑΙ ΤΡΑΧΗΛΟΥ Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα έχει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου. Υπερέκφραση του mrna του EGFR και του συνδέτη του, μεταμορφωτικού αυξητικού παράγοντα άλφα (TGF-α) ανευρίσκεται σε ποσοστό 92% και 87% των περιπτώσεων αντίστοιχα, ενώ υπερέκφραση της πρωτεΐνης του EGFR ανευρίσκεται σε ποσοστό 38-47% των όγκων αυτών και ιδιαίτερα των επιδερμοειδών καρκινωμάτων από πλακώδες επιθήλιο του φάρυγγα και της στοματικής κοιλότητας, ενώ τα επίπεδα του EGFR βρίσκονται αυξημένα σε όγκους χαμηλής διαφοροποίησης και προχωρημένου σταδίου.[34] Επιπρόσθετα υπερέκφραση του EGFR παρατηρείται στο φυσιολογικό επιθήλιο σε γειτονία με τον όγκο, εύρημα που υποστηρίζει τη θεωρία του πεδίου καρκινογένεσης, ενώ δραματική αύξηση του EGFR παρατηρείται κατά τη μετάβαση από τη δυσπλασία στο επιδερμοειδές καρκίνωμα. H έκφραση του EGFR μπορεί να διαφέρει ανάλογα με την εντόπιση του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου. Έτσι έχει παρατηρηθεί χαμηλή έκφραση του EGFR στους λαρυγγικούς καρκίνους σε αντίθεση με την υ- ψηλή έκφραση στους καρκίνους του φάρυγγα και της στοματικής κοιλότητας.[35] Εκτός από τον EGFR παρατηρείται υπερέκφραση και των άλλων υποδοχέων της οικογένειας ErbB (ErbB2, 3% ως 29%; ErbB3, 21%; ErbB4, 26%). Οι EGFR, ErbB2, και ErbB4 υπερεκφράζονταν σε διηθητικά αλλά και in situ καρκινώματα ενώ ο ErbB3 υπερεκφραζόταν μόνο σε διηθητικούς καρκίνους. Στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις 2 ή περισσότεροι από αυτούς τους υποδοχείς υπερεκφράζονται συγχρόνως υποδηλώνοντας τον σχηματισμό ετεροδιμερών. [36] Υπερέκφραση του EGFR μπορεί να παρατηρείται είτε ως αποτέλεσμα αυξημένης σύνθεσης του mrna του, είτε ως αποτέλεσμα διαταραχής της αρνητικής του ρύθμισης (decreased downregulation). Παράγοντες που αυξάνουν την σύνθεση του mrna του EGFR περιλαμβάνουν την απορρύθμιση του p53, πολυμορφισμούς στα επαναλαμβανόμενα δινουκλεοτίδια 37

του ιντρονίου 1 του γονιδίου του EGFR και σε μικρότερο βαθμό υπερέκφραση του γονιδίου του EGFR. Η αρνητική ρύθμιση του EGFR πιθανών ελέγχεται μέσω πρωτεϊνών όπως η κορτακτίνη (cortactin) που κωδικοποιείται από το γονίδιο EMS1. H αναστολή της κορτακτίνης σε μία κυτταρική σειρά καρκίνου κεφαλής και τραχήλου με υπερέκφραση του 11q13, είχε ως αποτέλεσμα την επιτάχυνση της αρνητικής ρύθμισης του EGFR.[37] O EGFR εκτός από το κυτταρόπλασμα, έχει επίσης ανιχνευθεί στον πυρήνα κυττάρων καρκίνου του στοματοφάρυγγα, γεγονός συμβατό με τον αποδιδόμενο σ αυτόν ρόλο μεταγραφικού παράγοντα. Στη συγκεκριμένη μελέτη οι ασθενείς που είχαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του EGFR, και ιδιαίτερα οι ασθενείς που είχαν αυξημένη πυρηνική έκφραση του EGFR, είχαν αυξημένο ποσοστό τοπικής υποτροπής και χειρότερη επιβίωση χωρίς νόσο.[38] Σε αντίθεση με τον καρκίνο του πνεύμονα, δεν υπάρχουν παρά ελάχιστες αναφορές ενεργοποιητικών μεταλλάξεων του EGFR στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου. Παρά την έλλειψη τέτοιων μεταλλάξεων που θα σήμαιναν εξαιρετική ευαισθησία στον EGFR, ένα ποσοστό ασθενών απαντούν σε θεραπείες που στοχεύουν τον EGFR και σύγχρονες μελέτες επιχειρούν να επισημάνουν τους ασθενείς, που θα ήταν ευαίσθητοι σε τέτοιου είδους θεραπείες.[27] Ένας σημαντικός μηχανισμός ενεργοποίησης του EGFR στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου είναι η αυτοκρινής ή παρακρινής ενεργοποίηση του EGFR από τους μοριακούς συνδέτες του. mrnas για τους 6 σημαντικότερους συνδέτες του EGFR EGF, συνδέων την ηπαρίνη EGF, TGF-α, αμφιρεγκουλίνη, βητασελλουλίνη και ερεγκουλίνη ανιχνεύονται στις περισσότερες κυτταρικές σειρές HNSCC.[39] Ο EGFR αποτελεί και έναν σημαντικό σύνδεσμο ανάμεσα στο κάπνισμα, σημαντικό παράγοντα κινδύνου για τον στοματοφαρυγγικό καρκίνο και την αυξημένη σύνθεση προσταγλνδίνης Ε2 (PGE2), αγωνιστή GPCR με ιδιότητες αυξητικού παράγοντα.. Το κάπνισμα αυξάνει τα επίπεδα των συνδετών του EGFR, αμφιρεγκουλίνη και TGF-α στα επιθηλιακά κύτταρα του στοματικού βλεννογόνου των καπνιστών.[40] Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση της οδού μεταγωγής σήματος του EGFR και σε αυξημένη σύνθεση PGE2 μέσω της κυκλοοξυγενάσης 2 (COX2). H PGE2 με τη σειρά 38

της ενεργοποιεί τον EGFR δημιουργώντας έτσι ένα κύκλωμα θετικής ανατροφοδότησης που προωθεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.[41] O EGFR παίζει σημαντικό ρόλο όχι μόνο στα καρκινικά κύτταρα αλλά και στα κύτταρα του στρώματος του όγκου, προσφέροντας ένα περιβάλλον επιτρεπτικό και υποστηρικτικό της ανάπτυξης του όγκου. Ο ρόλος του EGFR στην διαδικασία της αγγειογένεσης, υποστηρίζεται από την έκφρασή του στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων που πολλαπλασιάζονται σε απάντηση στην ενεργοποίηση από τον EGF. Ο δε ρόλος του EGFR στον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων αποκτά ιδιαίτερη σημασία σε συνθήκες περιορισμένης έκφρασης του VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor).[42] Εκτός από τον EGFR, έχει παρατηρηθεί στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου και αυξημένη έκφραση των μεσολαβητών της οδού μεταγωγής σήματος του EGFR, όπως των ERK1/-2, Akt, STAT3 και STAT5. Οι Albanell et al. έδειξαν ότι ή υπερέκφραση της ενεργοποιημένης ERK συσχετιζόταν με την υπερέκφραση των EGFR και TGFα στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου. Επιπρόσθετα η υπερέκφραση της ενεργοποιημένης ERK συσχετιζόταν με μεγαλύτερο δείκτη πολλαπλασιασμού και καρκίνο προχωρημένου σταδίου ενώ ήταν ανιχνεύσιμη και στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων. [43] Η αυτοκρινής ενεργοποίηση του EGFR από τον TGF-α ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα STAT3. Παράλληλα με τον EGFR, παρατηρείται υπερέκφραση και σταθερά αυξημένη ενεργότητα και του STAT3 τόσο στα καρκινικά κύτταρα όσο και στον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο ασθενών με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου ενώ η φαρμακολογική στόχευση του STAT3 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Οι Xi et al. έδειξαν ότι υπάρχει επίσης υπερέκφραση και του παράγοντα STAT5b ενώ αναστολή του είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου.[30,31] Ένας άλλος μεσολαβητής της οδού μεταγωγής σήματος του EGFR που μεταφέρει σήμα επιβίωσης, η φωσφορυλιωμένη Akt, βρίσκεται επίσης σε υπερέκφραση σε ποσοστό 57 ως 81% των περιπτώσεων καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Η Akt, μια κινάση σερίνης θρεονίνης που αποτελεί υπόστρωμα της φωσφατιδυλινοσιτόλης 3 -κινάσης (PI3K) είναι ρυθμιστής 39

τόσο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όσο και του κυτταρικού «πεπρωμένου», είτε ως διαφοροποίησης και επιβίωσης, είτε ως κυτταρικού θανάτου μέσω απόπτωσης.[44] Η ενεργοποίηση του EGFR οδηγεί στην προσέλκυση και φωσφορυλίωση του υποτμήματος με δράση κινάσης p85 της PI3K, με αποτέλεσμα την ενεργοποίησή της και την φωσφορυλίωση της Akt στο υπόλειμμα θρεονίνης 308. Η ενεργοποίηση της Akt έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του mtor ο οποίος με τη σειρά του φωσφορυλιώνει την Akt στο υπόλειμμα σερίνης 473. Η διπλή αυτή φωσφορυλίωση είναι απαραίτητη για την πλήρη ενεργοποίηση της κινάσης της Akt. [45] Με τον τρόπο αυτό ο EGFR μεταφέρει τόσο αυξητικά όσο και μηνύματα επιβίωσης μέσα από την ενεργοποίηση των οδών μεταγωγής σήματός του ενώ παράλληλα ενεργοποιεί και άλλες οδούς οι οποίες προωθούν την κυτταρική αύξηση, όπως αυτή της κυκλοοξυγενάσης 2 (COX2), ενισχύοντας και αυξάνοντας τα αποτελέσματα της ενεργοποίησής του. Οι αναστολείς του EGFR σε συνδυασμό με τους αναστολείς της COX2, έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικοί στην αναστολή της αγγειογένεσης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε προκλινικές μελέτες στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου γεγονός που δείχνει ένα σημαντικό ρόλο του EGFR στην αγγειογένεση του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου.[46] Οι αναστολείς του EGFR πιθανόν να μειώνουν την αγγειογένεση μέσω της άμεσης αναστολής της δημιουργίας νέων τριχοειδών αγγείων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και μέσω της αναστολής της έκλυσης του VEGF τόσο από τα καρκινικά κύτταρα όσο και από τα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων.[47] Η έκφραση του EGFR στο επίπεδο του αγγειακού δικτύου του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου δεν έχει μελετηθεί προς το παρόν ενώ δεν έχει επίσης μελετηθεί η ύπαρξη σωματικών μεταλλάξεων του EGFR στα κύτταρα του στρώματος. Είναι αξιοσημείωτο ότι 57 ως 72% των μεταλλάξεων του EGFR που έχουν παρατηρηθεί στον καρκίνο του μαστού, έχουν ανιχνευτεί αποκλειστικά σε κύτταρα του στρώματος του όγκου γεγονός που προβάλλει την ανάγκη διενέργειας μια παρόμοιας μελέτης στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου.[48] 40

Η ενεργοποίηση του EGFR μέσω του EGF, ενεργοποιεί τη μετανάστευση σε κύτταρα καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυρίως μέσω της ε- νεργοποίησης της φωσφολιπάσης C-γ (PLCγ) γεγονός που προβάλλει την PLCγ σαν έναν πιθανό θεραπευτικό στόχο αναστολής της μετάστασης στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου με υπερέκφραση του EGFR και των μεσολαβητών του.[49] Επιπρόσθετα στην αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα ο EGFR προσδίδει και ένα πλεονέκτημα επιβίωσης στα μεταστατικά κύτταρα. Για παράδειγμα σε κύτταρα επιδερμοειδούς καρκίνου της στοματικής κοιλότητας, ο κυτταρικός θάνατος σαν αποτέλεσμα της αποκόλλησης του κυττάρου, αναστέλλεται μέσω μηχανισμού εξαρτώμενου από τον EGFR. Συγκεκριμένα κατά το μηχανισμό αυτό, μετά την αποκόλληση των κυττάρων από το γειτονικό στρώμα, η προσκόλληση σε γειτονικά καρκινικά κύτταρα ενεργοποιεί το σχηματισμό συμπλόκων E-cadherin-EGFR, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του EGFR και στη συνέχεια την ενεργοποίηση της οδού της ERK και την αύξηση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. O μηχανισμός αυτός πιθανότατα ευνοεί τα πρώιμα στάδια μετάστασης πριν από την απώλεια της Ε-cadherin στα μεταγενέστερα στάδια λεμφαδενικής μετάστασης.[50] Τέλος πρέπει να σημειωθεί ότι παρά την υπερέκφραση του EGFR και τον σημαντικό του ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου, οι αναστολείς του EGFR είχαν περιορισμένη επιτυχία σαν μονοθεραπεία σ αυτόν τον τύπο καρκίνου. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει την ύπαρξη παράλληλων και ανεξάρτητων από τον EGFR οδών μεταγωγής σημάτων επιβίωσης τα οποία θα πρέπει να ανασταλούν συγχρόνως με τον EGFR, για τη μεγιστοποίηση του θεραπευτικού αποτελέσματος. 41

7) ΚΥΚΛΙΝΗ D1 Οι κυκλίνες οφείλουν την ονομασία τους στον περιοδικό και σαφώς εξαρτώμενο από τον κυτταρικό κύκλο τρόπο έκφρασής τους. Η έκφρασή τους είναι συχνά απορρυθμισμένη στον καρκίνο και αποτελούν βιοδείκτες (biomarkers) του καρκινικού φαινότυπου αλλά και της προόδου της νόσου.[51] Η κυκλίνη D1 είναι μια πρωτείνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο CCND1 (PRAD-1) το οποίο βρίσκεται στο μακρύ σκέλος του χρωμοσώματος 11 (11q13) και υπερεκφράζεται ή βρίσκεται σε πολλαπλά αντίγραφα σε πάνω από 80% των περιπτώσεων HPV αρνητικών καρκίνων κεφαλής και τραχήλου.[52] Πρόκειται για έναν σημαντικό ρυθμιστή της προόδου του κυτταρικού κύκλου από τη φάση G1 στη φάση S και μπορεί να δρα σαν μεταφραστικός συρρυθμιστής σε πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Μαζί με τους εξαρτώμενους από αυτή συνδέτες της, τις κινάσες CDK4 και CDK6 (cyclin dependent kinases) σχηματίζει ενεργά σύμπλοκα τα οποία προωθούν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μέσα από τη φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση της πρωτεϊνης του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος Rb (retinoblastoma protein). Η υπερφωσφορυλίωση της πρωτείνης Rb έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση του δεσμευμένων από την Rb μεταγραφικών παραγόντων E2F και την επακόλουθη έκφραση γονιδίων που είναι απαραίτητα για την πρόοδο στη φάση S του κυτταρικού κύκλου (Εικόνα 7).[53] Είναι ασταθής πρωτεΐνη με μικρό χρόνο ημίσειας ζωής (~24min) και η αποδόμησή της γίνεται κυρίως μέσω του πρωτεασώματος 26S με εξαρτώμενο από την ουμπικιτίνη μηχανισμό. Έχουν περιγραφεί περισσότερες από 100 πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την κυκλίνη D1. 42

Εικόνα 7. Σχηματική αναπαράσταση του κεντρικού ρόλου της κυκλίνης D1 και της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2007; 8, 667-670 Η πρωταρχική και καλύτερα μελετημένη δράση της κυκλίνης D1 είναι η ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από τις κυκλίνες κινασών (cyclin dependent kinases) CDK4 και CDK6 και η φωσφορυλίωση της πρωτείνης του ρετινοβλαστώματος (που αποτελεί ανασταλτικό «φρένο» του κυτταρικού κύκλου), αλλά και συγγενών πρωτεϊνών όπως οι p107 και p130 με αποτέλεσμα την απελευθέρωση μεταγραφικών παραγόντων E2F.[54] Αυτοί οδηγούν στην έκφραση γονιδίων απαραίτητων για την σύνθεση του DNA, αλλά και στην έκφραση άλλων κυκλινών όπως οι κυκλίνες Ε και Α που οδηγούν σε περεταίρω φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος ενεργοποιώντας την CDK2. Τα σύμπλοκα κυκλίνη D1-CDK4/ CDK6 ενεργοποιούν το σύμπλοκο κυκλίνη Ε-CDK2 μέσω της δεσμευσης των ανασταλτικών των CDK πρωτεινών p21 (CDKN1A) και p27 (CDKN1B) γνωστών και ως πρωτείνες CIP και KIP. Η πρωτείνη του ρετινοβλαστώματος επηρεάζει και άλλες κυτταρικές λειτουργίες εκτός από 43

τον κυτταρικό κύκλο, όπως π.χ. τον διπλασιασμό του κεντρομεριδίου και η απενεργοποίησή της οδηγεί σε γενωμική αστάθεια. Τέλος τα σύμπλοκα κυκλίνη D1-CDK4/CDK6 φωσφορυλιώνουν ποικιλία άλλων υποστρωμάτων και έτσι έχουν «ρυθμιστικό» ρόλο σε πολλές άλλες λειτουργίες όπως η διαφοροποίηση, η μετανάστευση, η επιδιόρθωση βλάβών του DNA και η λειτουργία των μιτοχονδρίων μεταξύ άλλων (Εικόνα 8).[51] Η κυκλίνη D1 όμως έχει και πολλές δράσεις ανεξάρτητες από τη φωσφορυλίωση μέσω των κινασών CDK4 και CDK6. Μπορεί να συνδέεται απευθείας με τις πρωτείνες p27 και p21 με ρυθμιστικό ρόλο στη μετανάστευση και την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA αντίστοιχα, μέσω αλληλεπίδρασης με τις πρωτείνες BRCA2 και RAD51.[55] Αλληλεπιδρά άμεσα με πολλούς μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι ορμονικοί υποδοχείς, υποδοχέας οιστρογόνων ΕRa και υποδοχέας ανδρογόνων AR, καθώς και ο ενεργοποιημένος υποδοχέας-γ πολλαπλασιαστής του περοξισώματος PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ) και οι ενεργοποιητές αυτών, SRC1, GRIP1 και AIB1. Άλλοι μεταγραφικοί ρυθμιστές που ενεργοποιούνται άμεσα από την κυκλίνη D1 είναι οι ΒΜΥΒ και DMP1, STAT3, TAF250, ο παράγοντας νευρογενούς διαφοροποίησης NEUROD1 (neurogenic differentiation factor), οι MYOD και C/EBPβ [51,56,57] (Εικόνα 9). Τέλος η κυκλίνη D1 συνδέει και ρυθμίζει τροποποιητικά της χρωματίνης ένζυμα όπως οι ακετυλτρανσφεράσες των ιστονών ΗΑTs (histone acetyltransferases) P/CAF και P300-CBP, και οι αποακετυλάσες των ιστονών HDACs (histone deacetylases) και έτσι φαίνεται ότι αποτελεί «γέφυρα» για την αλληλεπίδραση των μεταγραφικών παραγόντων με τις αντίστοιχες περιοχές του DNA αλλά και με το μεταγραφικό μηχανισμό, ρυθμίζοντας έτσι τόσο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό αλλά και την κυτταρική διαφοροποίηση (Εικόνα 9).[51,58,59] 44