ΒΙΟΣΥΜΒΑΤΟΤΗΤΑ ΒΙΟΫΛΙΚΩΝ: Η ΑΣΒΕΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΒΙΟΫΛΙΚΩΝ

ΒΙΟΣΥΜΒΑΤΟΤΗΤΑ ΒΙΟΫΛΙΚΩΝ: Η ΑΣΒΕΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΒΙΟΫΛΙΚΩΝ Στ. Ροκίδη, Π.Κουτσούκος Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημικών Μηχανικών και ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ, Πάτρα Δημ. Μαυρίλας Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών και Αεροναυπηγών, Πάτρα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η χρήση συνθετικών μοσχευμάτων για την αποκατάσταση των σκληρών ιστών προϋποθέτει την ευνοϊκή πρόσφυση των αλάτων του φωσφορικού ασβεστίου, το οποίο και είναι το ανόργανο συστατικό των αλάτων βιολογικής προέλευσης. Απεναντίας, προκειμένου για αντικατάσταση μαλακών ιστών, όπως οι βαλβίδες καρδιάς, τα αντίστοιχα βιοϋλικά, δεν θα πρέπει να ευνοούν την ανάπτυξη αντίστοιχων αλάτων. Ως εκ τούτου, έχει αναπτυχθεί τεράστιο ενδιαφέρον για την διαλεύκανση του μηχανισμού σχηματισμού των κρυσταλλικών αυτών αλάτων, ιδιαίτερα σε ετερογενείς επιφάνειες οι οποίες μπορεί να είναι μεταλλικές, πολυμερικές κεραμικές ή παρασκευασμένες από σύνθετα υλικά. Παρά το γεγονός ότι ο υδροξυαπατίτης (Ca 5 (PO 4 ) 3 OH, HAP), είναι η ένωσηπρότυπο για τους βιοαπατίτες, ο σχηματισμός πρόδρομων κρυσταλλικών φάσεων του φωσφορικού ασβεστίου, θερμοδυναμικώς ασταθών (άμορφο φωσφορικό ασβέστιο, ΑCP, φωσφορικό οκτασβέστιο, Ca 8 H 2 (PO 4 ) 6 5H 2 O, OCP) Καθοριστικός παράγοντας σε όλες τις περιπτώσεις είναι ο υπερκορεσμός ως προς τις αντίστοιχες κρυσταλλικές φάσεις, που είναι η θερμοδυναμική κινούσα δύναμη για τον σχηματισμό τους και ο οποίος καθορίζεται από τα αντίστοιχα ιοντικά γινόμενα. H μελέτη της συμβατότητας μιας επιφάνειας με τις κρυσταλλικές φάσεις, απαιτεί την θερμοδυναμική ανάλυση των ρευστών με τα οποία έρχεται σε επαφή και ακριβείς μετρήσεις του ρυθμού σχηματισμού των κρυσταλλικών φάσεων. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται παραδείγματα μελέτης της κινητικής της κρυσταλλικής ανάπτυξης τόσο της σταθεράς θερμοδυναμικώς φάσεως του ΗΑΡ, όσο και του ασταθέστερου OCP σε πολυμερικά και ανόργανα (βιοτσιμέντα) υποστρώματα Οι μετρήσεις της κινητικής της κρυσταλλικής ανάπτυξης, οι οποίες έγιναν σε συνθήκες μόνιμης κατάστασης ως προς τον υπερκορεσμό, έδειξαν ότι το βραδύ στάδιο κατά την ανάπτυξη των κρυσταλλικών φάσεων, είναι η διάχυση των αντίστοιχων δομικών μονάδων στην επιφάνεια. Το προφανές λοιπόν συμπέρασμα είναι ότι κατά την ανάπτυξη στα βιοϋλικά, δομών συμβατών με τους σκληρούς ιστούς, η επιφάνεια διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, τόσο από χημική όσο και από τοπολογική άποψη διότι η δεύτερη συνδέεται με την κατανομή των ενεργών κέντρων κρυστάλλωσης, ενώ η πρώτη με την δομική συμβατότητα. Η κινητική της ασβεστοποίησης σε κατεργασμένες με γλουταραλδεύδη γλωχίνες αορτικών καρδιακών βαλβίδων, αορτικά τοιχώματα και βόειο περικάρδιο καθώς και σε εμπορικά βιοϋλικά βασισμένα σε επεξεργασμένο περικάρδιο, έδειξε, ότι ο μηχανισμός κρυσταλλικής ανάπτυξης τόσο του ΗΑΡ όσο και του OCP παρέμεινε ο αυτός, διαφοροποιήθηκε όμως σημαντικά η τιμή της σταθεράς ταχύτητας, η οποία και εξαρτάται από το είδος και την κατανομή των ενεργών κέντρων στην επιφάνεια. Για ορισμένη τιμή του υπερκορεσμού, ο ρυθμός ασβεστοποίησης ήταν πολύ μεγαλύτερος για τις γλωχίνες, μικρότερος για τα αορτικά τοιχώματα, ενώ ήταν σημαντικά βραδύτερος τόσο για το βόειο περικάρδιο και για τα παρασκευάσματα τα οποία ήσαν βασισμένα στο υλικό αυτό.. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Με τον όρο βιολογική ασβεστοποίηση, υποδηλώνεται η κρυσταλλική ανάπτυξη αλάτων φωσφορικού ασβεστίου. Παρότι το ανόργανο συστατικό των σκληρών ιστών των ανώτερων θηλαστικών αποτελείται κυρίως από βιολογικό απατίτη (μη στοιχειομετρικό υδροξυαπατίτη) είναι δυνατή η συμμετοχή και των υπολοίπων πρόδρομων κρυσταλλικών φάσεων του φωσφορικού ασβεστίου στο σχηματισμό τους [1]. Λόγω της συμβατότητας των αλάτων φωσφορικού ασβεστίου με τους βιολογικούς απατίτες, έχει αναπτυχθεί μεγάλος αριθμός

σύνθετων υλικών με συνδυασμό διαφορετικών φάσεων φωσφορικού ασβεστίου, τα οποία και λόγω των ιδιοτήτων πήξης την οποία διαθέτουν είναι γνωστά ως βιοτσιμέντα και χρησιμοποιούνται ευρέως ως οστικά μοσχεύματα [2,3]. Βασικά χαρακτηριστικά των βιοϋλικών οστικής αποκατάστασης, εκτός από την βιοσυμβατότητα, αποτελούν: η οστεοενσωμάτωση, η οστεοαγωγιμότητα,η οστεοεπαγωγή, δηλαδή η ικανότητα να διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων από τους ιστούς και η οστεογένεση [4]. Για τα βιοτσιμέντα φωσφορικού ασβεστίου, όπως ο υδροξυαπατίτης (Ca 5 (PO 4 ) 3 OH, ΗΑΡ) και το φωσφορικό τριασβέστιο (βca 3 (PO 4 ) 2, βτcp), τα οποία χρησιμοποιούνται ως οστικά υποκατάστατα, έχει αναφερθεί ότι αποτελούν βιοσυμβατά υλικά με ικανότητα οστεοαγωγιμότητας, χωρίς να εμποδίζουν την οστεοβλαστική διαφοροποίηση των κυττάρων [5,6]. Συμπληρωματικά προς τα παραπάνω ανόργανα υποστρώματα, διερευνήθηκε η κινητική της ασβεστοποίησης in vitro σε χοίρειες αορτικές βαλβίδες καρδιάς και σε βόειο περικάρδιο, υλικά τα οποία χρησιμοποιούνται σε επεμβάσεις για την αποκατάσταση της λειτουργίας της καρδιάς σε παθολογικές καταστάσεις. Στην παρούσα μελέτη, παρασκευάστηκαν βιοτσιμέντα φωσφορικού ασβεστίου με ανάμειξη αφωσφορικού τριασβεστίου (αca 3 (PO 4 ) 2, αtcp) με υδατικό διάλυμα Na 2 HPO 4. Έγινε φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των στερεών και διερευνήθηκε η κινητική της κρυστάλλωσης του HAP στα απατιτικά βιοτσιμέντα σε υπέρκορα διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, στους 37 o C, σε ph 7.40 τόσο σε υδατικά διαλύματα ιοντικής ισχύος 0.15 Μ σε NaCl όσο και σε διαλύματα προσομοιωμένων βιολογικών ρευστών (msbf). Επιπλέον, μετρήθηκε και η κινητική της κρυστάλλωσης φωσφορικού ασβεστίου σε κρυστάλλους HAP, οι οποίοι είχαν παρασκευασθεί συνθετικά και είχαν χαρακτηρισθεί. Η μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκε ως σύστημα αναφοράς για την σύγκριση των αποτελεσμάτων με τα νέα υλικά. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στην παρούσα εργασία, για τις μετρήσεις της κινητικής της κρυσταλλικής ανάπτυξης του φωσφορικού ασβεστίου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος κρυστάλλωσης με εισαγωγή φύτρων, η οποία συνίσταται στην εισαγωγή στερεών υποστρωμάτων (κρυσταλλικών ή μη) με γνωστά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά [7]. Η μελέτη της κινητικής της κρυστάλλωσης του φωσφορικού ασβεστίου στηρίχθηκε στην μεταβολή του ph και στη γνώση της στοιχειομετρίας του καταβυθιζόμενου στερεού στα αντίστοιχα υπέρκορα διαλύματα. Οι δύο αυτές παράμετροι δίνουν την δυνατότητα διατήρησης σταθερού υπερκορεσμού με την προσθήκη αντιδραστηρίων κατάλληλων τόσο για την εξουδετέρωση των απελευθερούμενων πρωτονίων όσο και για την αναπλήρωση των ιόντων τα οποία καταβυθίζονται [8]. Στα πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής, η οποία είναι γνωστή ως μέθοδος διατήρησης σταθερού υπερκορεσμού, περιλαμβάνονται η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα στην μέτρηση των ρυθμών της καταβύθισης, σε ευρύτατη περιοχή τιμών υπερκορεσμού, η οποία περιλαμβάνει και τιμές πολύ κοντά στην κατάσταση ισορροπίας, όπου δεν είναι δυνατόν να γίνουν μετρήσεις με άλλες μεθόδους. Ο ρυθμός ανάπτυξης των κρυστάλλων με τη μέθοδο σταθερού υπερκορεσμού υπολογίζεται από τον ρυθμό προσθήκης των διαλυμάτων τιτλοδότησης (titrants) στα υπέρκορα διαλύματα, προκειμένου να διατηρηθεί σταθερός ο υπερκορεσμός. Επίσης, σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, επιτυγχάνεται η συνεχής παραγωγή της καταβυθιζόμενης φάσης σε ποσότητες επαρκείς για τον λεπτομερή της χαρακτηρισμό. Η μέθοδος σταθερού υπερκορεσμού, προσφέρεται και για τη μελέτη της καταβύθισης μετασταθών κρυσταλλικών φάσεων η κινητική σταθεροποίηση των οποίων

εξαρτάται σε πολύ μεγάλο βαθμό από τον υπερκορεσμό των διαλυμάτων [9,10]. Επιπλέον, μπορεί να εφαρμοστεί επιτυχώς για τη μελέτη της επίδρασης ξένων ιόντων στο διάλυμα εργασίας χωρίς να μεταβάλλεται η σύσταση με την εξέλιξη της αντίδρασης καθώς και για τη μελέτη της συνεισφοράς διαφορετικών παραμέτρων ξεχωριστά. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η πειραματική διάταξη που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κρυστάλλωσης σε διάφορα υποστρώματα(τσιμέντων ή ιστών) με τη μέθοδο της σταθερής σύστασης παρουσιάζεται στο σχήμα 1. Σχήμα 1: Πειραματική διάταξη για πειράματα κρυστάλλωσης φωσφορικού ασβεστίου με τη μέθοδο σταθερού υπερκορεσμού. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ένα θερμοστατούμενο γυάλινο διπλότοιχο αντιδραστήρα, συνολικού όγκου 0.5L. Η θερμοκρασία στο εσωτερικό του αντιδραστήρα διατηρείτο σταθερή στους 37 ± 0.5 o C με την κυκλοφορία νερού μεταξύ των τοιχωμάτων του αντιδραστήρα από υδατόλουτρο. Με τη βοήθεια του αισθητήρα, ο οποίος ήταν ένα συνδυασμένο ηλεκτρόδιο υάλου/ag/agcl γινόταν η μέτρηση του ph στα υπέρκορα διαλύματα και ελεγχόταν η προσθήκη των αντιδραστηρίων από τις μηχανικά συζευγμένες προχοΐδες. Από τη συλλογή των δεδομένων στον ηλεκτρονικό υπολογιστή, με την βοήθεια της ψηφιακής κάρτας συλλογής (A/D, D/A Advantech PCL 812) καταγράφονταν η μεταβολή του ph του διαλύματος και η αντίστοιχη του όγκου των διαλυμάτων τιτλοδότησης συναρτήσει του χρόνου. Από το διάγραμμα της μεταβολής του ph με τον χρόνο επιβεβαιωνόταν η σταθερότητα του ph του διαλύματος εργασίας, ενώ από τα γραφήματα προσθήκης αντιδραστηρίων συναρτήσει του χρόνου υπολογίζονταν οι ρυθμοί κρυσταλλικής ανάπτυξης[11]. Οι συγκεντρώσεις των χημικών ειδών του διαλύματος και ο υπερκορεσμός ως προς τις φάσεις του φωσφορικού ασβεστίου υπολογίσθηκαν με την βοήθεια του λογισμικού MINEQL+ [12], λαμβάνοντας υπ όψη όλες τις δυνατές χημικές ισορροπίες στα υπέρκορα διαλύματα σε συνδυασμό με τις εξισώσεις ισοζυγίου μάζας και φορτίου. Τα αποτελέσματα των υπολογισμών είναι ενδεικτικά για το τι μπορεί να συμβεί από θερμοδυναμική άποψη. Στον πίνακα 2 συνοψίζονται οι πειραματικές συνθήκες και τα αποτελέσματα των μετρήσεων της κινητικής στα πειράματα κρυστάλλωσης του OCP σε

κρυσταλλικά φύτρα ανθρακικού ασβεστίου (μίγμα αραγωνίτηασβεστίτη και ασβεστίτη) σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού. Τα υλικά αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως πρώτες ύλες για την παρασκευή των βιοτσιμέντων. Πίνακας 2 Πειραματικές συνθήκες και αποτελέσματα μετρήσεων της κινητικής της κρυσταλλικής ανάπτυξης: ολική συγκέντρωση ασβεστίου, C Ca, υπερκορεσμός ως προς OCP, Ω ΟCP, σχετικοί υπερκορεσμοί ως προς OCP και HAP, σ OCP και σ HAP, χρόνος επαγωγής, τ, και αρχικοί ρυθμοί κρυσταλλικής ανάπτυξης, R g, για την κρυστάλλωση του φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) στα διάφορα υποστρώματα ανθρακικού ασβεστίου (CaCO 3 ) σε υπέρκορα διαλύματα και σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, ph 7.40, θ = 37.0 ± 0.1 o C και C Ca /C P = 1.33, όπου C P η ολική συγκέντρωση των φωσφορικών. C Ca / 10 3 M Ω OCP σ OCP σ HAP τ /s Υπόστρωμα R g / 10 5 mol min 1 m 2 1.6 1.6 2.0 2.0 2.2 2.2 2.4 2.4 1626 1626 3778 3778 9212 9212 18716 18716 1.52 1.52 2.13 2.13 2.42 2.42 10.80 10.80 11.40 11.40 13.23 13.23 14.81 14.81 1200 1200 600 600 480 480 360 360 αραγωνίτηςασβεστίτης ασβεστίτης αραγωνίτηςασβεστίτης ασβεστίτης αραγωνίτηςασβεστίτης ασβεστίτης αραγωνίτηςασβεστίτης ασβεστίτης 1.7 22.0 2.2 29.0 2.6 34.0 2.9 37.0 Όπως φαίνεται από τα στοιχεία του πίνακα 2, σε όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, παρότι τα διαλύματα ήσαν υπέρκορα και ως προς ΗΑΡ, δεν παρατηρήθηκε ο σχηματισμός της φάσης αυτής. Θα πρέπει να αναφερθεί πως τα πειράματα επεκτάθηκαν και σε χαμηλότερες τιμές υπερκορεσμού από αυτές που παρουσιάζονται στον πίνακα 2 (σ OCP = 0.67 1.45).Σε αυτές τις συνθήκες ωστόσο, δεν έλαβε χώρα κρυσταλλική ανάπτυξη OCP για χρονικές περιόδους μεγαλύτερες των 72 ωρών. Η κρυστάλλωση του OCP στα υποστρώματα του ανθρακικού ασβεστίου έλαβε χώρα μετά την πάροδο χρόνου επαγωγής, τ, ο οποίος ήταν αντιστρόφως ανάλογος του σχετικού υπερκορεσμού του διαλύματος, όπως φαίνεται και στο σχήμα 2. Kαι για τους δύο τύπους κρυσταλλικών φύτρων ανθρακικού ασβεστίου, που χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα κρυσταλλικής ανάπτυξης OCP, μετρήθηκαν οι ίδιοι χρόνοι επαγωγής, στην ίδια τιμή σχετικού υπερκορεσμού. 1500 Χρόνος Επαγωγής, τ/ s 1000 500 0 0 8000 16000 24000 Υπερκορεσμός, Ω OCP Σχήμα 2: Μεταβολή του χρόνου επαγωγής, τ, συναρτήσει του υπερκορεσμού ως προς OCP, Ω, για την κρυστάλλωση ΟCP σε φύτρα κρυστάλλων ανθρακικού ασβεστίου (CaCO 3 ) σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, ph 7.40, 37 C, 0.15 M NaCl: ( ) μίγμα αραγωνίτηασβεστίτη; ( ) φύτρα ασβεστίτη.

Από την εξάρτηση του χρόνου επαγωγής από το αντίστροφο του τετραγώνου του υπερκορεσμού σύμφωνα με την κλασσική θεωρία της πυρηνογένεσης [13], υπολογίστηκε η τιμή της επιφανειακής ενέργειας, γ s, του OCP και βρέθηκε ίση με 10 mj m 2. Η χαμηλή τιμή της επιφανειακής ενέργειας του OCP ήταν αναμενόμενη λόγω της ετερογενούς πυρηνογένεσης, όμως, είναι σε καλή συμφωνία με αντίστοιχες τιμές από μελέτες για την κρυσταλλική ανάπτυξη OCP σε σωματίδια TiO 2 (14 mj m 2 ) [14] και σε TCP (17 mj m 2 ) [15]. Οι πειραματικές συνθήκες και τα αποτελέσματα των μετρήσεων για τη μελέτη της κινητικής της κρυστάλλωσης του OCP σε κρυσταλλικά φύτρα βιοτσιμέντων (παρασκευή από ανάμιξη ανθρακικού ασβεστίου με φωσφορικό ασβέστιο), OCP και ΗΑΡ, παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στον πίνακα 2. Όπως φαίνεται και στον πίνακα, το διάλυμα εργασίας ήταν υπέρκορο και ως προς ΗΑΡ, ενώ στην περίπτωση των βιοτσιμέντων, η κρυσταλλική ανάπτυξη ξεκίνησε μετά την πάροδο χρόνου επαγωγής, τ, ο οποίος και μετρήθηκε από τον χρόνο που μεσολάβησε μεταξύ της παρασκευής των υπέρκορων διαλυμάτων και της έναρξης της προσθήκης αντιδραστηρίων. Για την ίδια τιμή σχετικού υπερκορεσμού, μετρήθηκαν μεγαλύτεροι χρόνοι επαγωγής για το βιοτσιμέντο Β. Η κρυστάλλωση του OCP στα υποστρώματα ανθρακικούφωσφορικού ασβεστίου (βιοτσιμέντο Α και Β) έλαβε χώρα μετά την πάροδο χρόνου επαγωγής, τ, ο οποίος ήταν αντιστρόφως ανάλογος του σχετικού υπερκορεσμού του διαλύματος, όπως φαίνεται και στο σχήμα 3, στο οποίο παρίσταται γραφικά η εξάρτηση του χρόνου επαγωγής που μετρήθηκε, συναρτήσει του σχετικού υπερκορεσμού του διαλύματος ως προς OCP (καμπύλη σχηματισμού). Στο σχήμα 4, φαίνεται η λογαριθμική εξάρτηση των αρχικών ρυθμών κρυσταλλικής ανάπτυξης από τον σχετικό υπερκορεσμό. Από την κλίση της κάθε ευθείας, η οποία προέκυψε από την προσαρμογή των δεδομένων με την μέθοδο της γραμμικής παλινδρόμησης των ελαχίστων τετραγώνων και από την τεταγμένη επί την αρχή, υπολογίστηκαν οι τιμές της φαινόμενης τάξης της καταβύθισης, n, και της σταθεράς της ταχύτητας κρυσταλλικής ανάπτυξης, k g, αντιστοίχως, και οι οποίες συνοψίζονται στον πίνακα 3.Οι τιμές της φαινόμενης τάξης σε συνδυασμό με την ανεξαρτησία της από την υδροδυναμική, δείχνουν ότι ο μηχανισμός είναι ο ίδιος και το καθορίζον την ταχύτητα στάδιο είναι η επιφανειακή διάχυση. Πίνακας 2 Πειραματικές συνθήκες και αποτελέσματα μετρήσεων της κινητικής της κρυσταλλικής ανάπτυξης: ολική συγκέντρωση ασβεστίου, C Ca, υπερκορεσμός ως προς OCP, Ω ΟCP, σχετικοί υπερκορεσμοί ως προς OCP και HAP, σ OCP και σ HAP, χρόνος επαγωγής, τ, και αρχικοί ρυθμοί κρυσταλλικής ανάπτυξης, R g, για την κρυστάλλωση του φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) στα διάφορα υποστρώματα κρυσταλλικών φύτρων σε υπέρκορα διαλύματα και σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, ph 7.40, θ = 37.0 ± 0.1 o C και C Ca /C P = 1.33, όπου C P η ολική συγκέντρωση των φωσφορικών. C Ca Ω OCP σ OCP σ HAP τ Υπόστρωμα R g / 10 3 M s / 10 5 mol min 1 m 2 1.33 277 1.02 8.54 OCP 3.50 1.33 277 1.02 8.54 HAP 0.90 1.33 277 1.02 8.54 4200 Βιοτσιμέντο Α 0.49 1.33 277 1.02 8.54 4800 Βιοτσιμέντο Β 0.42 1.50 549 1.20 9.56 OCP 4.20 1.50 549 1.20 9.56 HAP 1.00 1.50 549 1.20 9.56 1400 Βιοτσιμέντο Α 0.54

1.50 549 1.20 9.56 1720 Βιοτσιμέντο Β 0.50 2820 1.70 11.32 OCP 5.90 2820 1.70 11.32 HAP 1.50 2820 1.70 11.32 420 Βιοτσιμέντο Α 0.78 2820 1.70 11.32 605 Βιοτσιμέντο Β 0.74 2.00 5890 1.96 12.47 OCP 7.00 2.00 5890 1.96 12.47 HAP 1.90 2.00 5890 1.96 12.47 240 Βιοτσιμέντο Α 0.98 2.00 5890 1.96 12.47 430 Βιοτσιμέντο Β 0.90 6000 5000 Χρόνος Επαγωγής, τ/s 4000 3000 2000 1000 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Υπερκορεσμός, Ω OCP Σχήμα 3: Μεταβολή του χρόνου επαγωγής, τ, συναρτήσει του υπερκορεσμού, Ω, για την κρυστάλλωση του ΟCP σε υποστρώματα φωσφορικούανθρακικού ασβεστίου σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, ph 7.40, 37 C, 0.15 M NaCl: ( ) φύτρα κρυστάλλων βιοτσιμέντου A ; ( ) φύτρα κρυστάλλων βιοτσιμέντου B. Πίνακας 3 Τιμές της φαινόμενης τάξης και της φαινόμενης σταθεράς κρυσταλλικής ανάπτυξης του φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) στους διάφορους τύπους κρυσταλλικών φύτρων σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, ph 7.40, θερμοκρασία θ = 37.0 ± 0.1 o C, ΝaCl 0.15 M Κρυσταλλικά φύτρα Φαινόμενη Τάξη n Φαινόμενη Σταθερά Ταχύτητας k g / 10 7 mol min 1 m 2 Βιοτσιμέντο Α 1.06 ± 0.10 4.7 ± 0.2 Βιοτσιμέντο Β 1.13 ± 0.05 4.0 ± 0.1 ΗΑΡ 1.15 ± 0.10 9.0 ± 0.5 OCP 1.05 ± 0.05 35.0 ± 0.4

5,0 log (R g / mol OCP min 1 m 2 ) 5,5 6,0 6,5 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 logσ OCP Σχήμα 4: Κινητική της κρυστάλλωσης του OCP σε διάφορα υποστρώματα σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού. Διαγράμματα του λογαρίθμου του αρχικού ρυθμού κρυσταλλικής ανάπτυξης OCP συναρτήσει του λογαρίθμου του αντίστοιχου σχετικού υπερκορεσμού. θ= 37 C, ph 7.40, 0.15 M NaCl: ( ) κρυσταλλικά φύτρα OCP; ( ) κρυσταλλικά φύτρα ΗΑΡ; ( ) κρυσταλλικά φύτρα βιοτσιμέντου A; ( ) κρυσταλλικά φύτρα βιοτσιμέντου B. Στο σχήμα 5, παρουσιάζεται γραφικά, η σύγκριση των ρυθμών κρυσταλλικής ανάπτυξης του OCP στα διάφορα κρυσταλλικά υποστρώματα, σε μια τιμή σχετικού υπερκορεσμού σ OCP = 1.70. 6,0x10 6 5,0x10 6 R g / mol OCP min 1 m 2 4,0x10 6 3,0x10 6 2,0x10 6 1,0x10 6 δ γ β α σ OCP = 1.70 Σχήμα 5: Γραφική απεικόνιση του ρυθμού κρυσταλλικής ανάπτυξης OCP σε διάφορα υποστρώματα σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού: 37 C, ph 7.40, 0.15 M NaCl, σ OCP = 1.70. (α) κρυσταλλικά φύτρα OCP; (β) κρυσταλλικά φύτρα ΗΑΡ; (γ) κρυσταλλικά φύτρα βιοτσιμέντου A; (δ) κρυσταλλικά φύτρα βιοτσιμέντου B. Από το διάγραμμα του σχ. 5, φαίνεται ότι ταχύτεροι ρυθμοί προέκυψαν κατά την κρυστάλλωση OCP σε κρυστάλλους OCP, ενώ σχεδόν μία τάξη μεγέθους μικρότερη, ήσαν οι

ρυθμοί κρυστάλλωσης του OCP στα βιοτσιμέντα (CaCO 3 CaP) και επιπλέον, ο ρυθμός κρυστάλλωσής του σε φύτρα HAP, βρέθηκε ότι ήταν σχεδόν διπλάσιος από τον αντίστοιχο στα βιοτσιμέντα. Η παρουσία ανθρακικών ιόντων έδειξε πως επηρεάζει το ρυθμό κρυστάλλωσης και όσο μεγαλύτερη ήταν η περιεκτικότητα του στερεού σε ανθρακικά, τόσο βραδύτερη έδειξε να είναι η κρυστάλλωση. Η επιβράδυνση της κρυσταλλικής ανάπτυξης του OCP στην περίπτωση των βιοτσιμέντων (CaCO 3 CaP) προφανώς οφείλεται στην παρουσία των ανθρακικών ιόντων ισορροπίας που υπάρχουν στα υπέρκορα διαλύματα και τα οποία, όπως έχει ήδη αναφερθεί, προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των κρυστάλλων [16]. Στον πίνακα 4 που ακολουθεί συνοψίζονται οι αρχικές πειραματικές συνθήκες και τα αποτελέσματα των μετρήσεων της κινητικής στα πειράματα κρυστάλλωσης του OCP στα διάφορα υποστρώματα χημικά επεξεργασμένων ιστών που δοκιμάσθηκαν σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού. Εξ αυτών, οι χοίριες καρδιακές βαλβίδες και το βοειο περικάρδιο είχαν επεξεργαστεί με γλουταραλδεύδη, ενώ τα επορικά διαθέσιμα Supple PeriGuard και Veritas Collagen Matrix (Synovis Surgical Innovations, S.A., USA) προέρχονταν από περικαρδιακό ιστό μονιμοποιημένο (το πρώτο) ή αποκυτταροποιημένο χωρίς μονιμοποίηση (το δεύτερο). Από το συγκριτικό διάγραμμα των ρυθμών κρυσταλλικής ανάπτυξης του OCP στα διάφορα υποστρώματα ιστών, ενδεικτικά σε μια τιμή σχετικού υπερκορεσμού σ OCP = 1.38 (σχήμα 6), φαίνεται ότι ταχύτεροι ρυθμοί προέκυψαν κατά την κρυστάλλωση OCP στις γλωχίνες και στα αορτικά τοιχώματα. Το βόειο περικάρδιο έδειξε, ότι σε αντίστοιχα υπέρκορα διαλύματα ασβεστοποιείται με μικρότερους ρυθμούς (μια τάξης μεγέθους) σε σχέση με τις αορτικές βαλβίδες. Παρόμοια συμπεριφορά έχει παρατηρηθεί και κατά την ασβεστοποίηση αορτικών βαλβίδων και βοείου περικαρδίου τόσο in vitro όσο και in vivo [17]. Αξιοσημείωτη, είναι η διαφορά των ρυθμών κρυστάλλωσης OCP μεταξύ των δύο υποστρωμάτων βοείου περικαρδίου, Supple PeriGuard και Veritas Collagen Matrix, τα οποία έχουν υποστεί διαφορετική χημική επεξεργασία. Υπάρχουν αρκετές τόσο in vitro όσο και in vivo μελέτες που αναφέρονται στον επιβαρυντικό ρόλο της γλουταραλδεΰδης κατά την ασβεστοποίηση των βιοπροσθετικών βαλβίδων. Βόειο περικάρδιο το οποίο δεν είχε προηγουμένως υποστεί επεξεργασία με γλουταραλδεΰδη, έδειξε ότι ασβεστοποιήθηκε σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με αντίστοιχο ιστό ο οποίος είχε υποβληθεί σε επεξεργασία με γλουταραλδεΰδη. Επιπλέον, έχουν γίνει μελέτες που αναφέρουν τη χρήση άλλων μεθόδων επεξεργασίας βιοπροσθετικών βαλβίδων, πέρα από αυτή με γλουταραλδεΰδη, οι οποίες έχουν δώσει ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στο μειωμένο βαθμό ασβεστοποίησής τους. 5,0x10 4 4,0x10 4 R g / mol OCP min 1 m 2 3,0x10 4 2,0x10 4 1,0x10 4 1,0x105 α β γ σ OCP = 1.38 δ ε Σχήμα 6: Γραφική απεικόνιση του ρυθμού κρυσταλλικής ανάπτυξης OCP σε διάφορα υποστρώματα ιστών συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού σε 37 C, ph 7.40, 0.15 M NaCl σ OCP = 1.38: (α) γλωχίνες; (β) αορτικά τοιχώματα; (γ) βόειο περικάρδιο; (δ) βόειο περικάρδιο Supple Peri Guard; (ε) βόειο περικάρδιο Veritas Collagen Matrix.

Πίνακας 4. Πειραματικές συνθήκες και αποτελέσματα μετρήσεων της κινητικής της κρυσταλλικής ανάπτυξης: ολική συγκέντρωση ασβεστίου, C Ca, σχετικός υπερκορεσμός ως προς OCP, σ OCP, και αρχικοί ρυθμοί κρυσταλλικής ανάπτυξης R g, για την κρυστάλλωση του φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) σε διάφορους τύπους ιστών (υποστρώματα) σε υπέρκορα διαλύματα και σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού, ph 7.40, θερμοκρασία, θ = 37.0 ± 0.1 o C και C Ca /C P = 1.33, όπου C P η ολική συγκέντρωση των φωσφορικών. Υπόστρωμα C Ca / 10 3 M σ OCP σ HAP R g / 10 5 mol OCP min 1 m 2 Γλωχίνες 1.00 0,69 6,35 21,0 1,33 1,16 8,65 37,0 1,50 1,38 9,71 46,0 1,60 1,51 10,80 54,0 1,80 1,77 11,40 64,0 2,0 2,03 12,56 72,0 Αορτικά Τοιχώματα Βόειο Περικάρδιο Βόειο Περικάρδιο Supple Peri Guard Βόειο Περικάρδιo Veritas Collagen Matrix 1,00 0,69 6,35 17,0 1,33 1,16 8,65 30,0 1,50 1,38 9,71 38,0 1,60 1,51 10,80 45,0 1,80 1,77 11,40 54,0 2,00 2,03 12,56 63,0 1,00 0,69 6,35 2,3 1,33 1,16 8,65 3,9 1,50 1,38 9,71 5,1 1,60 1,51 10,80 6,0 1,80 1,77 11,40 7,1 2,00 2,03 12,56 8,0 1,00 0,69 6,35 1,9 1,33 1,16 8,65 3,2 1,50 1,38 9,71 4,1 1,60 1,51 10,80 5,0 1,80 1,77 11,40 5,9 2,00 2,03 12,56 6,8 1,00 0,69 6,35 0,9 5 1,33 1,16 8,65 1,6 1,50 1,38 9,71 1,9 1,60 1,51 10,80 2,3 1,80 1,77 11,40 2,7 2,00 2,03 12,56 3,2

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ανάπτυξη τόσο του θερμοδυναμικά σταθερού ΗΑΡ όσο και του μετασταθούς OCP λαμβάνει χώρα τόσο σε υποστρώματα βιοτσιμέντων φωσφορικούανθρακικού ασβεστίου όσο και σε ιστούς. Στην περίπτωση των ιστών, η προκατεργασία τους με αντιδραστήρια όπως η γλουταραλδεΰδη, ώστε να αυξάνονται οι σταυροδεσμοί, ευνοεί την ασβεστοποίησή τους. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Οι συγγραφείς ευχαριστούν το ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ και το έργο DELTAMIN, ITN MARIECURIE, FP7 για μερική οικονομική υποστήριξη. Επίσης ευχαριστούν την εταιρία Διοφαρ Α.Ε. καθώς και την Synovis Surgical Innovations S.A (USA) για την χορήγηση των βιοϋλικών Peri Guard και Veritas. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Nancollas G.H., Biological Mineralization and Demineralization, SpringerVerlag: Heidelberg, (1982) [2] Dorozhkin S.V. J. Funct. Biomater., 1: 22 (2010). [3] LeGeros R.Z., Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine, Monographs in Oral Sciences, 15, Myers H. (ed), Karger: Basel, (1991) [4] Khan S.N., Cammisa F.P., Sandhu H.S., Diwan A.D., Girardi F.P., Lane J.M.,, J Am Acad Orthop Surg, 13, : 77 (2005). [5] Heise U., Osborn J.F., Duwe F., Int Orthop, 14: 329 (1990). [6] LeGeros R.Z, Clin. Orthop. Relat. Res., 395: 81 (2002). [7] Nancollas G.H. and Mohan M.S., Arch. Oral Biol., 15:731 (1970). [8] Tomson M.B., Nancollas G.H. Science, 200:1059,(1978). [9] Koutsoukos P.G., Amjad Z., Tomson M.B., Nancollas G.H., J. Am. Chem. Soc., 102: 1553 (1980). [10] Spanos N, Koutsoukos P.G., J Phys.Chem.Β 102:6679(1998). [11] Rokidi S, Koutsoukos P.G., Crystal Growth & Design,11:1683(2011). [12] Schecher, W.D., 1998. MINEQL+: A Chemical Equilibrium Modeling System. Version 4.5. Environmental Research Software, Inc., Hallowell, ME [13] Garside J., Precipitation, Butterworth, 1989 [14] Wu W., Nancollas G.HLangmuir, 13: 861 (1997). [15] Heughebaert J.C., Zawacki S.J., Nancollas G.H., J. Crystal Growth, 63:83 (1983). [16] Kapolos J., Koutsoukos P.G., Langmuir, 15: 6557 (1999). [17] Mavrilas D., Kapolos J., Koutsoukos P.G., Dougenis D, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 15: 699(2004).