cobas KRAS Mutation Test KRAS

cobas KRAS Mutation Test ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: 05985536190 cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 Tests P/N: 05852170190 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η αγορά του παρόντος προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για ενίσχυση και ανίχνευση αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και σχετικές διαδικασίες για in vitro διάγνωση σε δείγματα ανθρώπινης προέλευσης. Διά του παρόντος δεν παρέχεται κανένα δικαίωμα ευρεσιτεχνίας γενικού τύπου ή άλλη άδεια οποιουδήποτε τύπου εκτός από το παρόν ειδικό δικαίωμα χρήσης από την αγορά του προϊόντος. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ To cobas KRAS Mutation Test, για χρήση με το cobas 4800 Σύστημα, είμαι μια εξέταση PCR πραγματικού χρόνου που προορίζεται για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12, 13 και 61 του γονιδίου KRAS, σε DNA που προέρχεται από ανθρώπινο ιστό ορθοκολικού καρκίνου (CRC) μονιμοποιημένο σε φορμόλη και εγκλεισμένο σε παραφίνη. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η κετουξιμάμπη και η πανιτουμουμάμπη είναι μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και έχουν εγκριθεί για χρήση σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο. Παρόλο που το 50% έως το 80% των ορθοκολικών όγκων παρουσιάζει υπερέκφραση του EGFR, η έκφραση της πρωτεΐνης EGFR και η ενίσχυση του γονιδίου έχουν περιορισμένη προγνωστική αξία στον προσδιορισμό της πιθανότητας ανταπόκρισης στην κετουξιμάμπη ή την πανιτουμουμάμπη. 1 Ωστόσο, υπάρχουν πλέον σημαντικά στοιχεία που υποδεικνύουν ότι η παρουσία μεταλλάξεων KRAS σχετίζεται με την έλλειψη ανταπόκρισης στη στοχευμένη θεραπεία με αντι-egfr αντισώματα σε ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο και ότι, σε ορισμένες περιπτώσεις, η χρήση της στοχευμένης θεραπείας με αντι-egfr αντισώματα σε αυτή την υποομάδα ασθενών μπορεί να αποδειχθεί επιζήμια. 2,3 Οι αποδείξεις για αυτά τα ευρήματα προέρχονται από: Αναδρομικές αναλύσεις μελετών μονού σκέλους 4,5 Αναδρομικές αναλύσεις τυχαιοποιημένων μελετών 6,7 Τυχαιοποιημένες προοπτικές μελέτες. 8 Ως συνέπεια αυτών των μελετών, η δοκιμή μετάλλαξης KRAS συνιστάται για την επιλογή των ασθενών που θα λάβουν θεραπεία με αντι-egfr αντισώματα από μεγάλους ογκολογικούς οργανισμούς στις Η.Π.Α. (ASCO, NCCN) 9-10 και στην Ευρώπη (ESMO). 11 Επίσης, οι ρυθμιστικές αρχές στις Η.Π.Α. και στην Ευρώπη περιορίζουν τη χρήση αυτών των παραγόντων σε ασθενείς με όγκους KRAS άγριου τύπου (wild-type). 12,13 Η πρωτεΐνη KRAS είναι ένα μέλος της διευρυμένης οικογένειας των μικρών πρωτεϊνών G. Η KRAS ενεργεί ως διακόπτης που ελέγχεται από τα GDP/GTP για τη μεταφορά εξωκυττάριων σημάτων που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τα αμινοξέα 12, 13 ή 61, που εμφανίζονται σε διάφορες κακοήθειες σε ανθρώπους, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού καρκίνου (CRC) και του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC), κλειδώνουν το ένζυμο σε ενεργοποιημένη μορφή, δεσμευμένο στο GTP, με αποτέλεσμα τη συστατική ενεργοποίηση και συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στην ογκογόνο διαδικασία. 14 Οι μεταλλάξεις KRAS παρατηρούνται σε ποσοστό 24%-43% των ορθοκολικών όγκων. 15-16 Παρόλο που έχουν ταυτοποιηθεί περισσότερες από 3000 σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου KRAS, οι περισσότερες εμφανίζονται στα κωδικόνια 12 ή 13 (~82% στο κωδικόνιο 12 και ~17% στο κωδικόνιο 13). Οι μεταλλάξεις KRAS σε άλλα κωδικόνια (π.χ., κωδικόνιο 61) είναι λιγότερο συχνές (1%-4% των μεταλλάξεων). Παρόλο που οι μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 61 είναι σπάνιες, έχει αποδειχθεί ότι προκαλούν συστατική ενεργοποίηση του KRAS, όπως συμβαίνει με τις μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13, 17 ενώ δημοσιευμένα δεδομένα υποδεικνύουν ότι σε περίπτωση μεταλλάξεων στο κωδικόνιο 61 προβλέπεται μη ανταπόκριση στη θεραπεία με μονοκλωνικά αντι-egfr αντισώματα. 18-19 Το cobas KRAS Mutation Test είναι μια ανάλυση που βασίζεται στην PCR και έχει σχεδιαστεί για την ταυτοποίηση της παρουσίας σωματικών μεταλλάξεων που περιλαμβάνουν τα κωδικόνια 12, 13 και 61 του πρωτο-ογκογονιδίου KRAS και, κατά συνέπεια, για την ταυτοποίηση των ασθενών με CRC σε προχωρημένο στάδιο που δεν είναι πιθανό να ωφεληθούν από τη θεραπεία με μονοκλωνικά αντι-egfr αντισώματα. Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου. 06322379001-01EL 1 Doc Rev. 1.0

ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το cobas KRAS Mutation Test βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων για τη λήψη γονιδιωματικού DNA από μονιμοποιημένο σε φορμόλη, εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό (FFPET) και (2) ενίσχυση PCR του DNAστόχου με χρήση ζευγών συμπληρωματικών εκκινητών και δύο ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών επισημασμένων με φθορίζουσα χρωστική. Ο ένας ιχνηθέτης έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση της αλληλουχίας κωδικονίων 12/13 του KRAS στο εξώνιο 2 και ο άλλος για την ανίχνευση της αλληλουχίας κωδικονίου 61 του KRAS στο εξώνιο 3 του γονιδίου KRAS. Η ανίχνευση μετάλλαξης επιτυγχάνεται μέσω ανάλυσης της καμπύλης τήξης από τον cobas z 480 αναλυτή. Κάθε ανάλυση συμπεριλαμβάνει έναν ορό ελέγχου μετάλλαξης, έναν αρνητικό ορό ελέγχου και ένα βαθμονομητή για επιβεβαίωση της εγκυρότητας της ανάλυσης. Προετοιμασία Δειγμάτων Τα δείγματα FFPET υποβάλλονται σε επεξεργασία και το γονιδιωματικό DNA απομονώνεται χρησιμοποιώντας το cobas Κιτ Προετοιμασίας Δειγμάτων DNA, για γενική χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων με βάση τη δέσμευση του νουκλεϊκού οξέος σε ίνες υάλου. Πραγματοποιείται λύση ενός αποπαραφινωμένου τμήματος 5μm δείγματος FFPET μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο γονιδιωματικό DNA από DNase. Έπειτα, προστίθεται ισοπροπανόλη στο μίγμα λύσης, το οποίο στη συνέχεια υποβάλλεται σε φυγοκέντριση μέσω στήλης με ένθετο φίλτρο από ίνες υάλου. Κατά τη φυγοκέντριση, το γονιδιωματικό DNA δεσμεύεται στην επιφάνεια του φίλτρου από ίνες υάλου. Οι μη δεσμευμένες ουσίες, όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με τη φυγοκέντριση. Τα νουκλεϊκά οξέα που έχουν προσροφηθεί υποβάλλονται σε πλύση και, στη συνέχεια, σε έκλουση με υδατικό διάλυμα. Η ποσότητα γονιδιωματικού DNA προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά και προσαρμόζεται σε μια σταθερή συγκέντρωση για προσθήκη στο μίγμα ενίσχυσης/ανίχνευσης. Το DNA-στόχος υποβάλλεται, στη συνέχεια, σε ενίσχυση και ανίχνευση στον cobas z 480 αναλυτή χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια ενίσχυσης και ανίχνευσης που παρέχονται στο κιτ του cobas KRAS Mutation Test. Ενίσχυση PCR Επιλογή Στόχου Στο κιτ του cobas KRAS Mutation Test χρησιμοποιούνται εκκινητές που ορίζουν μια αλληλουχία 85 ζευγών βάσεων για το εξώνιο 2 που περιέχει κωδικόνια 12 και 13 του KRAS και μια αλληλουχία 75 ζευγών βάσεων για το εξώνιο 3 που περιέχει το κωδικόνιο 61 του KRAS, σε γονιδιωματικό DNA ανθρώπινης προέλευσης. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στις περιοχές του γονιδίου KRAS μεταξύ των εκκινητών. Δεν ενισχύεται ολόκληρο το γονίδιο KRAS. Ενίσχυση Στόχου Για την ενίσχυση στόχου χρησιμοποιείται ένα παράγωγο της Thermus species Z05 DNA πολυμεράσης. Αρχικά, το μίγμα αντίδρασης PCR θερμαίνεται για την αποδιάταξη του γονιδιωματικού DNA και την έκθεση των αλληλουχιών-στόχων του εκκινητή. Κατά την ψύξη του μίγματος, οι νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές υβριδίζονται στις αλληλουχίες DNA στόχου. Η Z05 DNA πολυμεράση, παρουσία του δισθενούς μεταλλικού ιόντος και του πλεονάσματος dntp, επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές, συνθέτοντας με αυτόν τον τρόπο ένα δεύτερο κλώνο DNA. Με τον τρόπο αυτόν ολοκληρώνεται ο πρώτος κύκλος της PCR, με τη δημιουργία ενός δίκλωνου αντιγράφου DNA, το οποίο περιλαμβάνει τις στοχευμένες περιοχές 85 ζευγών βάσεων και 75 ζευγών βάσεων του γονιδίου KRAS. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν αριθμό κύκλων, σε καθέναν από τους οποίους διπλασιάζεται ο αριθμός των DNA κλώνων (amplicon). Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στις περιοχές του γονιδίου KRAS μεταξύ των ζευγών εκκινητών. Δεν ενισχύεται ολόκληρο το γονίδιο KRAS. Αυτόματη Ανίχνευση Μετάλλαξης σε Πραγματικό Χρόνο Ο cobas z 480 αναλυτής έχει τη δυνατότητα μέτρησης, σε πραγματικό χρόνο, της ποσότητας φθορισμού που δημιουργείται από ειδικά προϊόντα PCR. Μετά την ενίσχυση, κάθε κλώνος (amplicon) που δημιουργείται με χρήση του cobas KRAS Mutation Test υποβάλλεται σε ένα πρόγραμμα τήξης, στο οποίο η θερμοκρασία αυξάνεται σταδιακά από τους 40 C έως τους 95 C (TaqMelt). Ο ειδικός ιχνηθέτης άγριου τύπου (wild-type) δεσμεύεται στον κλώνο (amplicon) άγριου τύπου (wild-type) και στο μεταλλαγμένο κλώνο (amplicon) σε χαμηλές θερμοκρασίες. Στην κατάσταση δέσμευσης, η χρωστική αναφοράς (reporter) φλουορεσκίνης στο άκρο 5' του ιχνηθέτη είναι αρκετά μακριά από τη χρωστική παρεμποδιστή (quencher) του άκρου 3', επιτρέποντας στη φθορίζουσα χρωστική να εκπέμπει φως σε καθορισμένο μήκος κύματος. Καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία, ο ιχνηθέτης διαχωρίζεται από τον κλώνο (amplicon), επιτρέποντας στη χρωστική παρεμποδιστή (quencher) να έρθει κοντά στη φθορίζουσα χρωστική, μειώνοντας το μετρήσιμο φθορισμό. Οι κλώνοι (amplicon) με τέλεια αντιστοιχία με τον ιχνηθέτη άγριου τύπου (wildtype) τήκονται σε υψηλότερη θερμοκρασία από τους κλώνους (amplicon) με μία ή περισσότερες αναντιστοιχίες (μεταλλαγμένοι). Μετράται ο φθορισμός σε κάθε προσαύξηση της θερμοκρασίας και υπολογίζονται οι θερμοκρασίες τήξης. Η παρουσία μιας μεταλλαγμένης αλληλουχίας του KRAS στο εξώνιο 2, κωδικόνια 12 και 13, και στο εξώνιο 3, κωδικόνιο 61, μπορεί να ανιχνευτεί όταν οι θερμοκρασίες τήξης είναι εντός του καθορισμένου εύρους. Για την αποφυγή της ανίχνευσης σιωπηλών μεταλλάξεων στα κωδικόνια 12 και 13 (καμία αλλαγή αμινοξέος), μια τροποποιημένη βάση λειτουργεί ως γενική βάση και δημιουργεί μια θερμοκρασία τήξης εντός του εύρους άγριου τύπου (wild-type). 06322379001-01EL 2 Doc Rev. 1.0

Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος-στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται στο cobas KRAS Mutation Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp) 20. Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει την αποδόμηση των κλώνων του DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει θυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης dutp, αντί της τριφωσφορικής θυμιδίνης, ως ενός από τα τριφωσφορικά νουκλεοτίδια του αντιδραστηρίου Μίγματος Αντίδρασης. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Μίγματος Αντίδρασης, καταλύει την απομάκρυνση των καταλοίπων δεοξυουριδίνης από το DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης σε αλκαλικό ph, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από τους 55 C, δηλαδή σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης, και επομένως δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon)-στόχο. Το cobas KRAS Mutation Test έχει αποδειχτεί ότι αδρανοποιεί τουλάχιστον 10 3 αντίγραφα μεταλλαγμένου κλώνου (amplicon) KRAS που περιέχει δεοξυουριδίνη σε κάθε PCR. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ cobas DNA Sample Preparation Kit Κιτ Προετοιμασίας Δειγμάτων DNA cobas (P/N: 05985536190) DNA TLB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης Ιστού DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI Χλωριούχο κάλιο 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% Αζίδιο του νατρίου PK (Πρωτεϊνάση K) Πρωτεϊνάση K (λυοφιλοποιημένη) Xn Πρωτεϊνάση K DNA SP 24 Εξετάσεις 1 x 10 ml 1 x 100 mg Επιβλαβές DNA PBB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Δέσμευσης DNA σε Παραφίνη) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 49,6% Υδροχλωρική γουανιδίνη 0,05% Ουρία 17,3% Triton X-100 Xn 49,6% (w/w) Γουανιδίνη HCl 1 x 10 ml Επιβλαβές WB I (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης DNA Ι) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 64% Υδροχλωρική γουανιδίνη Xn 64% (w/w) Γουανιδίνη HCl 1 x 25 ml Επιβλαβές WB II (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης DNA ΙΙ) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI Χλωριούχο νάτριο 1 x 12,5 ml 06322379001-01EL 3 Doc Rev. 1.0

DNA EB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 0,09% Αζίδιο του νατρίου FT (Σωληνάρια φίλτρου με πώματα) CT (Σωληνάρια συλλογής) cobas KRAS Mutation Test (P/N: 05852170190) KRAS 1 x 6 ml 1 x 25 τεμ. 3 x 25 τεμ. 24 Εξετάσεις KRAS MIX (Μίγμα Αντίδρασης KRAS) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου Γλυκερόλη 4,76% Διμεθυλοσουλφοξείδιο 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 < 0,9% dntp < 0,1% Z05 DNA πολυμεράσης (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) MGAC (Οξικό μαγνήσιο) Οξικό μαγνήσιο 0,09% Αζίδιο του νατρίου KRAS 12/13 OM (Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων με Κωδικόνια 12/13 του KRAS) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA Poly-rA RNA (συνθετικό) 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 < 0,01% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές KRAS < 0,01% Ιχνηθέτης KRAS με φθορίζουσα επισήμανση KRAS 61 OM (Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων με Κωδικόνιο 61 του KRAS) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA Poly-rA RNA (συνθετικό) 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 < 0,01% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές KRAS < 0,01% Ιχνηθέτης KRAS με φθορίζουσα επισήμανση KRAS MC (Ορός ελέγχου μετάλλαξης KRAS) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA Poly-rA RNA (συνθετικό) 0,05% Αζίδιο του νατρίου < 0,001% πλασμιδιακό DNA που περιέχει αλληλουχίες εξωνίων 2 και 3 του KRAS (μικροβιακό) < 0,001% DNA άγριου τύπου (wild-type) KRAS (καλλιέργεια κυττάρων) 4 x 0,3 ml 4 x 0,2 ml 2 x 0,3 ml 2 x 0,3 ml 4 x 0,1 ml 06322379001-01EL 4 Doc Rev. 1.0

KRAS CAL (Βαθμονομητής KRAS) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA Poly-rA RNA (συνθετικό) 0,05% Αζίδιο του νατρίου < 0,001% DNA άγριου τύπου (wild-type) KRAS (καλλιέργεια κυττάρων) DNA SD (Αραιωτικό Δείγματος DNA) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI 0,09% Αζίδιο του νατρίου 4 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με δείγματα ιστού ορθοκολικού καρκίνου (CRC) μονιμοποιημένου σε φορμόλη και εγκλεισμένου σε παραφίνη. Γ. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. Δ. Απαγορεύεται η κατανάλωση τροφίμων και ποτών και το κάπνισμα στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και DNA. ΣΤ. Η απόρριψη μη χρησιμοποιημένων αντιδραστηρίων και απορριμμάτων πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Ζ. Μη χρησιμοποιείτε τα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης τους. H. Μη συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ ή παρτίδες. Θ. Πρέπει να φοράτε γάντια και να τα αλλάζετε πριν από το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων, ώστε να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση. Ι. Για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση του Κύριου Μίγματος εργασίας (working MMX) με δείγματα DNA, η Ενίσχυση και η Ανίχνευση θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε ξεχωριστό χώρο από εκείνο στον οποίο πραγματοποιείται η Απομόνωση του DNA. Καθαρίζετε καλά το χώρο εργασίας για την ενίσχυση και ανίχνευση πριν από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος εργασίας. Για σωστό καθαρισμό, θα πρέπει να σκουπίζετε καλά όλες τις επιφάνειες, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων και των συσκευών πιπέτας, με διάλυμα υποχλωριώδους* νατρίου 0,5% και, στη συνέχεια, με διάλυμα αιθανόλης 70%. ΙΑ. Τα DNA PBB και WB I περιέχουν υδροχλωρική γουανιδίνη. Σε περίπτωση διαρροής του υγρού που περιέχει αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα, καθαρίστε με κατάλληλο εργαστηριακό απορρυπαντικό και νερό. Αν η διαρροή περιέχει δυνητικά μολυσματικούς παράγοντες, καθαρίστε αρχικά τη μολυσμένη περιοχή με εργαστηριακό απορρυπαντικό και νερό και, στη συνέχεια, με διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου. Σε περίπτωση διαρροής πάνω στον cobas z 480 αναλυτή, ακολουθήστε τις οδηγίες στο εγχειρίδιο οργάνου του cobas z 480 αναλυτή. *ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά του εμπορίου περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. ΙΒ. Τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 22. ΙΓ. Τα DNA TLB και DNA PBB περιέχουν Triton X-100, το οποίο είναι ερεθιστικό για τους βλεννογόνους. Αποφεύγετε την επαφή με τα μάτια, το δέρμα και τους βλεννογόνους. ΙΔ. Τα DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL και DNA SD περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Κατά την απόρριψη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα κρύου νερού για να αποφευχθεί η συσσώρευση αζιδίου. 06322379001-01EL 5 Doc Rev. 1.0

ΙΕ. Το ξυλένιο είναι επικίνδυνη χημική ουσία και θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε απαγωγό εστία. Θα πρέπει να απορρίπτεται σε χημικά απόβλητα σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. ΙΣΤ. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης κατά το χειρισμό αντιδραστηρίων. Αποφεύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Αν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Σε περίπτωση διαρροής αντιδραστηρίου, αραιώστε με νερό πριν το σκουπίσετε. ΙΖ. Όλα τα αναλώσιμα στοιχεία προορίζονται για μία χρήση. Μην τα επαναχρησιμοποιείτε. ΙΗ. Μη χρησιμοποιείτε τα αναλώσιμα στοιχεία μετά την ημερομηνία λήξης τους. ΙΘ. Μη χρησιμοποιείτε διάλυμα υποχλωριούχου νατρίου (λευκαντικό) για τον καθαρισμό του cobas z 480 αναλυτή. Καθαρίζετε τον cobas z 480 αναλυτή σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται στο εγχειρίδιο οργάνου του cobas z 480 αναλυτή. Κ. Για επιπλέον προειδοποιήσεις, προφυλάξεις και διαδικασίες σχετικά με τη μείωση του κινδύνου μόλυνσης για τον cobas z 480 αναλυτή, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο οργάνου του cobas z 480 αναλυτή. ΚΑ. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μίας χρήσης και ακροφυσίων συσκευής πιπέτας χωρίς DNase. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια. B. Αποθηκεύετε τα DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT και CT στους 15 C έως 30 C. Μετά το άνοιγμα, τα DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB και PK παραμένουν σταθερά για έως και 8 χρήσεις για 90 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Γ. Μετά την προσθήκη αποστειρωμένου νερού χωρίς νουκλεάση στο PK, αποθηκεύετε το ανασυσταμένο PK που δεν έχει χρησιμοποιηθεί σε μερίδες των 450 µl στους -20 C. Μετά την ανασύσταση, το PK πρέπει να χρησιμοποιηθεί εντός 90 ημερών ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Δ. Μετά την προσθήκη απόλυτης αιθανόλης, αποθηκεύετε τα WB I και WB II στους 15 C έως 30 C. Αυτά τα διαλύματα εργασίας παραμένουν σταθερά για 90 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. E. Αποθηκεύετε τα KRAS MIX, MGAC, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM, KRAS MC, KRAS CAL και DNA SD στους 2 C έως 8 C. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για 4 χρήσεις για 60 ημέρες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. ΣΤ. Τα KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM και το Κύριο Μίγμα Εργασίας (το οποίο προετοιμάζεται με προσθήκη KRAS 12/13 OM ή KRAS 61 OM και MGAC στο KRAS MIX) θα πρέπει να προστατεύονται από την παρατεταμένη έκθεση στο φως. Ζ. Το Κύριο Μίγμα εργασίας θα πρέπει να αποθηκεύεται στους 2 C έως 8 C στο σκοτάδι. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν προετοιμαστεί πρέπει να προστίθενται εντός 1 ώρας από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος εργασίας. H. Τα επεξεργασμένα δείγματα (εκχυλισμένο DNA) παραμένουν σταθερά για έως και 24 ώρες στους 20 C έως 30 C, για έως και 14 ημέρες στους 2 C έως 8 C ή για έως και 60 ημέρες στους -20 C. Τα επεξεργασμένα δείγματα παραμένουν, επίσης, σταθερά στους -15 C έως -25 C μετά από 4 καταψύξεις-αποψύξεις. Θ. Η ενίσχυση πρέπει να ξεκινήσει εντός 1 ώρας από την προσθήκη των επεξεργασμένων δειγμάτων και ορών ελέγχου στο Κύριο Μίγμα εργασίας (το οποίο προετοιμάζεται με προσθήκη KRAS 12/13 OM ή KRAS 61 OM και MGAC στο KRAS MIX). 06322379001-01EL 6 Doc Rev. 1.0

ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Εξετάσεις> Κιτ Προετοιμασίας Δειγμάτων DNA cobas (P/N: 05985536190) DNA TLB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης Ιστού DNA) PK (Πρωτεϊνάση K) DNA PBB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Δέσμευσης DNA σε Παραφίνη) WB I (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης DNA Ι) WB II (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης DNA ΙΙ) DNA EB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης DNA) FT (Σωληνάρια φίλτρου με πώματα) CT (Σωληνάρια συλλογής) B. cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 Εξετάσεις (P/N: 05852170190) KRAS MIX (Μίγμα Αντίδρασης) (Πώμα με κουμπί σε ουδέτερο χρώμα) MGAC (Οξικό μαγνήσιο) (Πώμα με κίτρινο κουμπί) KRAS 12/13 OM (Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων με Κωδικόνια 12/13 του KRAS) (Πώμα με λευκό κουμπί) KRAS 61 OM (Μίγμα Ολιγονουκλεοτιδίων με Κωδικόνιο 61 του KRAS) (Πώμα με χρυσαφί κουμπί) KRAS MC (Ορός ελέγχου μετάλλαξης KRAS) (Πώμα με κόκκινο κουμπί) KRAS CAL (Βαθμονομητής KRAS) (Πώμα με μοβ κουμπί) DNA SD (Αραιωτικό Δείγματος DNA) ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Ξυλένιο (Sigma, Αρ. Κατ. 247642 ή Fisher Scientific, Αρ. Κατ. X5-4) Απόλυτη αιθανόλη (Sigma, Αρ. Κατ. E7023 ή Fisher Scientific, Αρ. Κατ. BP2818-500) Ισοπροπανόλη (Sigma, Αρ. Κατ. 190764 ή Fisher Scientific, Αρ. Κατ. A451-1) Αποστειρωμένο νερό, χωρίς νουκλεάση (Applied Biosystems PCR Grade Water, Αρ. Κατ. AM9937 ή Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, Αρ. Κατ. SH-3053801) Αποστειρωμένες ορολογικές πιπέτες μίας χρήσης: 5 και 25 ml Πλάκα Μικροβυθισμάτων (Πλάκα AD) και Μεμβράνη Σφράγισης cobas 4800 Συστήματος (Roche P/N 05232724001) Ρυθμιζόμενες Συσκευές Πιπέτας* (χωρητικότητα 10μL, 20 µl, 200 µl και 1000 µl) με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς DNase Βοήθημα πιπέτας (Drummond P/N: 4-000-100 ή αντίστοιχο) Επιτραπέζια μικροφυγόκεντρος με απόδοση 8.000 x g και 16.000 έως 20.000 x g (Eppendorf 5417C ή αντίστοιχη)** 06322379001-01EL 7 Doc Rev. 1.0

Δύο (2) μονάδες ξηρής θερμότητας με δυνατότητα θέρμανσης των σωληναρίων μικροφυγόκεντρου στους 56 C και 90 C** Safe-Lock σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml, αποστειρωμένα, χωρίς RNase/DNase, τύπου PCR (Eppendorf, Αρ. Κατ. 022363212) Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) Nanodrop (Thermo Scientific ND-1000 ή ND-2000)** Αναδευτήρας τύπου Vortex** Υποδοχείς σωληναρίων μικροφυγόκεντρου Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Βαθμονομημένα θερμόμετρα για μονάδα ξηρής θερμότητας** Υδατόλουτρο** με δυνατότητα διατήρησης της θερμοκρασίας στους 37 C Λεπίδα μονής κόψης ή παρόμοια * Οι συσκευές πιπέτας θα πρέπει να συντηρούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση, χωρίς DNase, πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου ορίζεται, για την αποφυγή της αποδόμησης και της διασταυρούμενης μόλυνσης των δειγμάτων. ** Όλα τα στοιχεία εξοπλισμού θα πρέπει να συντηρούνται κατάλληλα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή Όργανα και Λογισμικό cobas z 480 αναλυτής Μονάδα Ελέγχου cobas 4800 SR2 Συστήματος με προεγκατεστημένο λειτουργικό σύστημα Windows XP Λογισμικό cobas 4800 SR2 Συστήματος, έκδοση 2.0 Λογισμικό Πακέτου Ανάλυσης KRAS, έκδοση 1.0 Συσκευή Ανάγνωσης Γραμμωτού Κώδικα, εξωτερική με USB Εκτυπωτής HP P2055d ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγματα πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να είναι ανάλογος. A. Συλλογή Δειγμάτων Τα δείγματα FFPET ορθοκολικού καρκίνου έχουν εγκριθεί για χρήση με το cobas KRAS Mutation Test. B. Μεταφορά Δειγμάτων Η μεταφορά των δειγμάτων FFPET πρέπει να πραγματοποιείται στους 15 C έως 30 C και να πληροί τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς σχετικά με τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων. 23 Γ. Αποθήκευση Δειγμάτων Τα δείγματα FFPET ορθοκολικού καρκίνου μπορούν να αποθηκευτούν στους 15 C έως 30 C για έως και 12 μήνες μετά την ημερομηνία συλλογής του ιστού. Τα τμήματα 5 μm που είναι τοποθετημένα σε αντικειμενοφόρους πλάκες μπορούν να αποθηκευτούν στους 15 C έως 30 C για έως και 60 ημέρες. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Στο cobas KRAS Mutation Test μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο τμήματα FFPET CRC πάχους 5 μm με τουλάχιστον 10% καρκινικά κύτταρα. Οποιοδήποτε δείγμα διαθέτει κάτω από 10% καρκινικά κύτταρα θα πρέπει να υποβάλλεται σε μακροεκτομή πριν από την αποπαραφίνωση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο οργάνου του cobas z 480 αναλυτή για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας σχετικά με τον cobas z 480 αναλυτή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι μονάδες ξηρής θερμότητας με δυνατότητα θέρμανσης των σωληναρίων μικροφυγόκεντρου θα πρέπει να ενεργοποιούνται και να ρυθμίζονται σε θερμοκρασία 56 C και 90 C. 06322379001-01EL 8 Doc Rev. 1.0

Αριθμός Αναλύσεων Μια μεμονωμένη ανάλυση μπορεί να περιλαμβάνει από 1 έως 45 δείγματα (συν τους ορούς ελέγχου και το βαθμονομητή) ανά πλάκα μικροβυθισμάτων 96 βυθισμάτων. Όταν αναλύονται περισσότερα από 24 δείγματα, απαιτούνται περισσότερα κιτ cobas KRAS Mutation Test. Το cobas KRAS Mutation Test περιέχει επαρκή αντιδραστήρια για 8 αναλύσεις 3 δειγμάτων (συν τους ορούς ελέγχου και το βαθμονομητή) για μέγιστο αριθμό 24 δειγμάτων ανά κιτ. Ροή Εργασιών Η διαδικασία εξέτασης με το cobas KRAS Mutation Test περιλαμβάνει χειροκίνητη προετοιμασία δειγμάτων χρησιμοποιώντας το cobas Κιτ Προετοιμασίας Δειγμάτων DNA και, στη συνέχεια, ενίσχυση/ανίχνευση στον cobas z 480 αναλυτή χρησιμοποιώντας το κιτ του cobas KRAS Mutation Test kit. Προετοιμασία Αντιδραστηρίου 1. Εκτελέστε ανασύσταση της Πρωτεϊνάσης K (PK) προσθέτοντας 4,5 ml αποστειρωμένου νερού χωρίς νουκλεάση (τύπου PCR) στο φιαλίδιο χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη ορολογική πιπέτα μίας χρήσης 5 ml. Αναμίξτε αναστρέφοντας το φιαλίδιο 5 έως 10 φορές. Κατανέμετε 450 µl ανασυσταμένου PK σε Safe-Lock σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml και αποθηκεύστε στους -20 C. Εάν η Πρωτεϊνάση Κ έχει ήδη ανασυσταθεί και καταψυχθεί, αποψύξτε όσες μερίδες απαιτούνται για την επεξεργασία των δειγμάτων που πρόκειται να υποβληθούν σε ανάλυση πριν από την αποπαραφίνωση (για κάθε δείγμα απαιτούνται 70 µl ανασυσταμένου PK). 2. Όλα τα διαλύματα που αποθηκεύονται στους 15-30 C θα πρέπει να είναι διαυγή. Εάν υπάρχει κατακρήμνισμα σε κάποιο αντιδραστήριο, θερμάνετε το διάλυμα σε υδατόλουτρο στους 37 C μέχρι να διαλυθεί το κατακρήμνισμα. Μη χρησιμοποιήσετε το αντιδραστήριο εάν δεν έχει διαλυθεί εντελώς το κατακρήμνισμα. 3. Προετοιμάστε το Διάλυμα Πλύσης DNA I (WB I) προσθέτοντας 15 ml απόλυτης αιθανόλης στη φιάλη του WB I. Αναμίξτε αναστρέφοντας τη φιάλη 5 έως 10 φορές. Σημειώστε στη φιάλη ότι έχει προστεθεί αιθανόλη και την ημερομηνία. Αποθηκεύστε το διάλυμα εργασίας WB I στους 15 C έως 30 C. 4. Προετοιμάστε το Διάλυμα Πλύσης DNA IΙ (WB II) προσθέτοντας 50 ml απόλυτης αιθανόλης στη φιάλη του WB II. Αναμίξτε αναστρέφοντας τη φιάλη 5 έως 10 φορές. Σημειώστε στη φιάλη ότι έχει προστεθεί αιθανόλη και την ημερομηνία. Αποθηκεύστε το διάλυμα εργασίας WB II στους 15 C έως 30 C. Αποπαραφίνωση των τμημάτων FFPET που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειμενοφόρους πλάκες ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το ξυλένιο είναι επικίνδυνη χημική ουσία. Όλα τα βήματα αποπαραφίνωσης θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε απαγωγό εστία. Βλέπε Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις. A. Τοποθετήστε μια αντικειμενοφόρο πλάκα με τμήμα FFPET 5 µm σε δοχείο με επαρκή ποσότητα ξυλενίου, ώστε να καλύπτει τον ιστό. Αφήστε να εμποτιστεί για 5 λεπτά. B. Μεταφέρετε την αντικειμενοφόρο πλάκα σε δοχείο με επαρκή ποσότητα απόλυτης αιθανόλης ώστε να καλύπτει τον ιστό. Αφήστε να εμποτιστεί για 5 λεπτά. C. Αφαιρέστε την αντικειμενοφόρο πλάκα από την αιθανόλη και αφήστε το τμήμα να στεγνώσει εντελώς στον αέρα (5 έως 10 λεπτά). D. Εκτελέστε μακροεκτομή εάν το δείγμα περιέχει < 10% καρκινικά κύτταρα. E. Επικολλήστε μια ετικέτα με τα αναγνωριστικά στοιχεία δείγματος σε ένα Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml για κάθε δείγμα. F. Προσθέστε 180 µl DNA TLB στο Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5-mL. G. Προσθέστε 70 µl ανασυσταμένου PK στο Safe-Lock σωληνάριο που περιέχει DNA TLB. H. Αποξέστε τον ιστό από την αντικειμενοφόρο πλάκα και εισάγετέ τον στο Safe-Lock σωληνάριο. Εμβαπτίστε τον ιστό στο μίγμα DNA TLB/PK. I. Προχωρήστε στο Βήμα Α της διαδικασίας απομόνωσης DNA. 06322379001-01EL 9 Doc Rev. 1.0

Αποπαραφίνωση των τμημάτων FFPET που δεν έχουν τοποθετηθεί σε αντικειμενοφόρους πλάκες ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το ξυλένιο είναι επικίνδυνη χημική ουσία. Όλα τα βήματα αποπαραφίνωσης θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε απαγωγό εστία. Βλέπε Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις. A. Τοποθετήστε ένα τμήμα FFPET 5 μm σε ένα Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml με ετικέτα με τα αναγνωριστικά στοιχεία για κάθε δείγμα. B. Προσθέστε 500 µl ξυλενίου στο Safe-Lock σωληνάριο που περιέχει το τμήμα FFPET. C. Αναμίξτε καλά στροβιλίζοντας για 10 δευτερόλεπτα. D. Αφήστε το σωληνάριο για 5 λεπτά στους 15 C έως 30 C. E. Προσθέστε 500 µl απόλυτης αιθανόλης και αναμίξτε στροβιλίζοντας για 10 δευτερόλεπτα. F. Αφήστε το σωληνάριο για 5 λεπτά στους 15 C έως 30 C. G. Φυγοκεντρίστε στα 16.000 x g έως 20.000 x g για 2 λεπτά. Αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό, χωρίς να διασπάσετε το ίζημα. Απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό σε χημικά απόβλητα. H. Προσθέστε 1 ml απόλυτης αιθανόλης και στροβιλίστε για 10 δευτερόλεπτα. I. Φυγοκεντρίστε στα 16.000 x g έως 20.000 x g για 2 λεπτά. Αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό, χωρίς να διασπάσετε το ίζημα. Απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό σε χημικά απόβλητα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το ίζημα επιπλέει στο υπολειπόμενο υπερκείμενο υγρό, περιστρέψτε ξανά για 1 λεπτό στα 16.000 x g έως 20.000 x g. Αφαιρέστε το υπολειπόμενο υπερκείμενο υγρό. J. Αποξηράνετε το ίζημα ιστού για 10 λεπτά στους 56 C σε μονάδα θέρμανσης με το σωληνάριο ανοικτό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Βεβαιωθείτε ότι η αιθανόλη έχει εξατμιστεί πλήρως και το ίζημα είναι στεγνό πριν προχωρήσετε στο επόμενο βήμα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν είναι απαραίτητο, τα αποξηραμένα ιζήματα μπορούν να αποθηκευτούν έως και 24 ώρες στους 2 C έως 8 C. K. Εκτελέστε επαναιώρηση του ιζήματος ιστού σε 180 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Λύσης Ιστού DNA (DNA TLB). L. Προσθέστε 70 µl ανασυσταμένου PK. M. Προχωρήστε στο Βήμα Α της διαδικασίας απομόνωσης DNA. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Διαδικασία Απομόνωσης DNA ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Επεξεργαστείτε έναν αρνητικό ορό ελέγχου παράλληλα με τα δείγματα. Προετοιμάστε τον αρνητικό ορό ελέγχου συνδυάζοντας 180 µl Ρυθμιστικού Διαλύματος Λύσης Ιστού DNA (DNA TLB) και 70 µl διαλύματος PK σε Safe-Lock σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml επισημασμένο ως NEG CT. Ο αρνητικός ορός ελέγχου θα πρέπει να υποβάλλεται σε επεξεργασία με την ίδια διαδικασία όπως τα δείγματα. A. Στροβιλίστε τα σωληνάρια που περιέχουν το μίγμα δείγματος/dna TLB/PK και το μίγμα αρνητικού ορού ελέγχου (NEG CT) για 30 δευτερόλεπτα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο ιστός θα πρέπει να εμβαπτίζεται πλήρως στο μίγμα DNA TLB/PK. B. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στη μονάδα ξηρής θερμότητας 56 C και επωάστε για 60 λεπτά. C. Στροβιλίστε τα σωληνάρια για 10 δευτερόλεπτα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο ιστός θα πρέπει να εμβαπτίζεται πλήρως στο μίγμα DNA TLB/PK. 06322379001-01EL 10 Doc Rev. 1.0

D. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στη μονάδα ξηρής θερμότητας 90 C και επωάστε για 60 λεπτά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά την επώαση, προετοιμάστε τον απαιτούμενο αριθμό σωληναρίων με φίλτρο (FT) με πώματα με μεντεσέ τοποθετώντας κάθε FT σε ένα σωληνάριο συλλογής (CT) και επισημαίνοντας κάθε πώμα FT με την κατάλληλη σήμανση δείγματος ή ορού ελέγχου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε δείγμα απαιτούνται 1 FT, 3 CT και ένα σωληνάριο έκλουσης 1 (σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά την επώαση, επισημάνετε τον απαιτούμενο αριθμό σωληναρίων έκλουσης (σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml) με την κατάλληλη σήμανση δείγματος ή ορού ελέγχου. E. Αφήστε τα σωληνάρια να κρυώσουν σε θερμοκρασία 15 C έως 30 C. Μετά την ψύξη, φυγοκεντρίστε για σύντομο χρονικό διάστημα τα σωληνάρια για τη συλλογή υγρού από τα πώματα. F. Προσθέστε 200 µl DNA PBB σε κάθε σωληνάριο. Αναμίξτε εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα 3 φορές. G. Επωάστε τα σωληνάρια στους 15 C έως 30 C για 10 λεπτά. H. Προσθέστε 100 µl ισοπροπανόλης σε κάθε σωληνάριο. Αναμίξτε το προϊόν της λύσης εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα 3 φορές. I. Μεταφέρετε κάθε προϊόν λύσης στην κατάλληλα επισημασμένη μονάδα FT/CT. J. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα 8.000 x g για 1 λεπτό. K. Τοποθετήστε κάθε FT σε νέο CT. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό από το παλιό CT σε χημικά απόβλητα και απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο CT. L. Προσθέστε 500 µl WB I εργασίας σε κάθε FT. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η προετοιμασία του WB I εργασίας περιγράφεται στην ενότητα «Προετοιμασία Αντιδραστηρίου». M. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα 8.000 x g για 1 λεπτό. N. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό σε κάθε CT σε χημικά απόβλητα. Τοποθετήστε το FT ξανά στο ίδιο CT. O. Προσθέστε 500 µl WB II εργασίας σε κάθε FT. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η προετοιμασία του WB II εργασίας περιγράφεται στην ενότητα «Προετοιμασία Αντιδραστηρίου». P. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα 8.000 x g για 1 λεπτό. Q. Τοποθετήστε κάθε FT σε νέο CT. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό από το παλιό CT σε χημικά απόβλητα και απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο CT. R. Φυγοκεντρίστε τις μονάδες FT/CT στα 16.000 x g έως 20.000 x g για 1 λεπτό για να στεγνώσετε τις μεμβράνες φίλτρου. S. Τοποθετήστε κάθε FT σε ένα σωληνάριο έκλουσης (σωληνάριο μικροφυγόκεντρου 1,5 ml) το οποίο είναι ήδη επισημασμένο με την ταυτότητα δείγματος ή ορού ελέγχου. Απορρίψτε το επεξεργασμένο υγρό από το παλιό CT σε χημικά απόβλητα και απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο CT. T. Προσθέστε 100 µl DNA EB στο κέντρο κάθε μεμβράνης FT χωρίς να αγγίξετε τη μεμβράνη FT. U. Επωάστε το FT με σωληνάριο έκλουσης στους 15 C έως 30 C για 5 λεπτά. V. Φυγοκεντρίστε το FT με σωληνάριο έκλουσης στα 8.000 x g για 1 λεπτό, ώστε να συγκεντρωθεί το έκλουσμα στο σωληνάριο έκλουσης. Απορρίψτε κατάλληλα το χρησιμοποιημένο FT. W. Κλείστε το πώμα στο σωληνάριο έκλουσης. Το σωληνάριο έκλουσης περιέχει το αρχικό δείγμα DNA. Προχωρήστε στο βήμα A στην ενότητα Ποσοτικοποίηση DNA. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η μέτρηση της συγκέντρωσης DNA θα πρέπει να πραγματοποιείται αμέσως μετά τη διαδικασία απομόνωσης DNA και πριν από την αποθήκευση. 06322379001-01EL 11 Doc Rev. 1.0

Ποσοτικοποίηση DNA: A. Αναμίξτε κάθε αρχικό δείγμα DNA στροβιλίζοντας για 5 δευτερόλεπτα. B. Εκτελέστε ποσοτικοποίηση DNA χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού Nanodrop (ND-1000 ή ND-2000) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήστε DNA EB ως τυφλό για το όργανο. Απαιτείται ο μέσος όρος δύο κοντινών μεταξύ τους τιμών. Η απόκλιση μεταξύ των δύο μετρήσεων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 10% όταν οι τιμές συγκέντρωσης DNA είναι 20,0 ng/µl. Για τιμές συγκέντρωσης DNA < 20,0 ng/µl, η απόκλιση μεταξύ των δύο μετρήσεων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα ± 2 ng/µl. Εάν η απόκλιση μεταξύ των δύο μετρήσεων υπερβαίνει το ± 10%, όταν οι τιμές συγκέντρωσης DNA είναι 20,0 ng/µl, ή το ± 2 ng/µl όταν οι τιμές συγκέντρωσης DNA είναι < 20,0 ng/µl, θα πρέπει να ληφθούν επιπλέον 2 τιμές μέχρι να πληρούνται οι προϋποθέσεις. Στη συνέχεια, θα πρέπει να υπολογιστεί ο μέσος όρος αυτών των δύο νέων μετρήσεων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Δεν απαιτείται μέτρηση του αρχικού δείγματος DNA από τον επεξεργασμένο αρνητικό ορό ελέγχου (NEG CT). C. Η συγκέντρωση στο αρχικό δείγμα DNA από τα δείγματα πρέπει να είναι 4 ng/µl για να είναι δυνατή η εκτέλεση του cobas KRAS Mutation Test. Για κάθε δείγμα εκτελούνται δύο ενισχύσεις/ανιχνεύσεις, χρησιμοποιώντας 25 µl αραίωσης 2 ng/µl αρχικού δείγματος DNA (συνολικά 50 ng DNA) για κάθε ενίσχυση/ανίχνευση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κάθε αρχικό δείγμα DNA πρέπει να διαθέτει ελάχιστη συγκέντρωση 4 ng/µl για να είναι δυνατή η εκτέλεση του cobas KRAS Mutation Test. Εάν η συγκέντρωση σε ένα αρχικό δείγμα DNA είναι < 4 ng/µl, επαναλάβετε τις διαδικασίες αποπαραφίνωσης, απομόνωσης DNA και ποσοτικοποίησης DNA για το δείγμα αυτό χρησιμοποιώντας δύο τμήματα FFPET 5 µm. Για δείγματα που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειμενοφόρο πλάκα, μετά την αποπαραφίνωση, συνδυάστε τον ιστό και από τα δύο τμήματα σε ένα σωληνάριο, εμβαπτίστε τον ιστό σε DNA TLB + PK και εκτελέστε απομόνωση και ποσοτικοποίηση DNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Για δείγματα που δεν έχουν τοποθετηθεί σε αντικειμενοφόρο πλάκα, συνδυάστε δύο τμήματα σε ένα σωληνάριο, εμβαπτίστε τον ιστό σε DNA TLB + PK και εκτελέστε απομόνωση και ποσοτικοποίηση DNA όπως περιγράφεται παραπάνω. Εάν η συγκέντρωση στο αρχικό δείγμα DNA εξακολουθεί να είναι < 4 ng/µl, ζητήστε ένα άλλο δείγμα FFPET από το παραπέμπον κλινικό τμήμα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αποθηκεύστε το αρχικό δείγμα DNA (επεξεργασμένο δείγμα και αρνητικός ορός ελέγχου) στους 2 C - 8 C για έως και 2 εβδομάδες ή στους -20 C για 60 ημέρες. ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση του Κύριου Μίγματος εργασίας με δείγματα DNA, η Ενίσχυση και η Ανίχνευση θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε ξεχωριστό χώρο από εκείνο στον οποίο πραγματοποιείται η Απομόνωση του DNA. Καθαρίζετε καλά το χώρο εργασίας για την ενίσχυση και ανίχνευση πριν από την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος εργασίας. Για σωστό καθαρισμό, θα πρέπει να σκουπίζετε καλά όλες τις επιφάνειες, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων και των συσκευών πιπέτας, με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5% και, στη συνέχεια, με διάλυμα αιθανόλης 70%. Τα οικιακά υγρά λευκαντικά που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. Ρύθμιση Οργάνου: Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο οργάνου του cobas z 480 αναλυτή για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τη ρύθμιση του cobas z 480. Ρύθμιση Εντολής Εξέτασης: Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas 4800 συστήματος, Έκδοση Λογισμικού 2.0, για το cobas KRAS Mutation Test (Εγχειρίδιο Χειριστή cobas KRAS) για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τα βήματα της ροής εργασιών KRAS. 06322379001-01EL 12 Doc Rev. 1.0

Υπολογισμός Αραίωσης του Αρχικού Δείγματος DNA: Υπολογισμός Αραίωσης για Συγκεντρώσεις Αρχικού Δείγματος DNA από 4 ng/µl έως 28 ng/µl ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αρχικά δείγματα DNA θα πρέπει να αραιώνονται αμέσως πριν από την ενίσχυση και ανίχνευση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε δείγμα εκτελούνται δύο (2) ενισχύσεις/ανιχνεύσεις, για τις οποίες απαιτείται συνολικός όγκος 50 µl (25 µl για κάθε κωδικόνιο 12/13 και για το κωδικόνιο 61) αραίωσης 2 ng/µl αρχικού δείγματος DNA (συνολικά 100 ng DNA). A. Για κάθε δείγμα, υπολογίστε τον απαιτούμενο όγκο (µl) αρχικού δείγματος DNA: µl αρχικού δείγματος DNA = (70 µl x 2 ng/µl) συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA [ng/µl] B. Για κάθε δείγμα, υπολογίστε τον απαιτούμενο όγκο (µl) αραιωτικού δείγματος DNA (DNA SD): µl DNA SD = 70 µl µl αρχικού δείγματος DNA Παράδειγμα: Συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA = 6,5 ng/µl A. µl αρχικού δείγματος DNA = (70 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 21,5 µl B. µl DNA SD = (70 µl 21,5 µl) = 48,5 µl Υπολογισμός αραίωσης για συγκεντρώσεις αρχικού δείγματος DNA > 28 ng/µl ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα Αρχικά δείγματα DNA θα πρέπει να αραιώνονται αμέσως πριν από την ενίσχυση και ανίχνευση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε δείγμα εκτελούνται δύο (2) ενισχύσεις/ανιχνεύσεις, για τις οποίες απαιτείται συνολικός όγκος 50 µl (25 µl για κάθε κωδικόνιο 12/13 και για το κωδικόνιο 61) αραίωσης 2 ng/µl αρχικού δείγματος DNA (συνολικά 100 ng DNA). Α. Για συγκεντρώσεις Αρχικού δείγματος DNA > 28 ng/µl, χρησιμοποιήστε τον παρακάτω τύπο για να υπολογίσετε την ποσότητα αραιωτικού δείγματος DNA (DNA SD) που απαιτείται για την προετοιμασία τουλάχιστον 70 µl αραιωμένου αρχικού δείγματος DNA. Με τον τρόπο αυτό διασφαλίζεται ότι για κάθε δείγμα χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 5 µl αρχικού δείγματος DNA. B. Για κάθε δείγμα, υπολογίστε τον όγκο (µl) of DNA SD που απαιτείται για την αραίωση 5 µl αρχικού δείγματος DNA στα 2 ng/µl: Όγκος DNA SD που απαιτείται σε µl = [(5 µl αρχικού δείγματος DNA x συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA σε ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl Παράδειγμα: Συγκέντρωση αρχικού δείγματος DNA = 31,7 ng/µl A. Όγκος DNA SD που απαιτείται σε µl = [(5 µl x 31,7 ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl = 74,3 µl B. Χρησιμοποιήστε την υπολογισμένη τιμή όγκου DNA SD για να αραιώσετε 5 µl αρχικού δείγματος DNA. Αραίωση Δειγμάτων A. Προετοιμάστε τον κατάλληλο αριθμό Safe-Lock σωληναρίων μικροφυγόκεντρου 1,5 ml για αραιώσεις DNA επισημαίνοντάς τα με την κατάλληλη επισήμανση δείγματος. B. Χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο ανθεκτικό στα αερολύματα, εκτελέστε έγχυση των όγκων DNA SD στα σωληνάρια με την αντίστοιχη επισήμανση. Εκτελέστε έγχυση 35 µl DNA SD σε ένα Safe-Lock σωληνάριο με την επισήμανση NEG CT. C. Στροβιλίστε κάθε αρχικό δείγμα DNA και τον αρνητικό ορό ελέγχου για 5 έως 10 δευτερόλεπτα. D. Χρησιμοποιώντας μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο πιπέτας ανθεκτικό στα αερολύματα (νέο ακροφύσιο για κάθε έγχυση με πιπέτα), εκτελέστε σταδιακά έγχυση του υπολογισμένου όγκου για κάθε αρχικό δείγμα DNA στο αντίστοιχο σωληνάριο που περιέχει DNA SD. Εκτελέστε έγχυση 35 µl αρνητικού ορού ελέγχου (εκχυλισμένο έκλουσμα) στο σωληνάριο NEG CT. E. Πωματίστε τα σωληνάρια και στροβιλίστε το καθένα για 5 έως 10 δευτερόλεπτα. F. Αλλάξτε γάντια. 06322379001-01EL 13 Doc Rev. 1.0

Προετοιμασία των Κύριων Μιγμάτων Εργασίας (MMX 12/13 και MMX 61) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM και το Κύριο Μίγμα εργασίας είναι ευαίσθητα στο φως και πρέπει να προστατεύονται από παρατεταμένη έκθεση στο φως. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Λόγω του ιξώδους του KRAS MIX και του Κύριου Μίγματος εργασίας, η έγχυση με πιπέτα θα πρέπει να πραγματοποιείται αργά, ώστε να διοχετεύεται ολόκληρη η ποσότητα μίγματος από το ακροφύσιο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα KRAS MIX, KRAS 12/13 OM και KRAS 61 OM μπορεί να είναι διαυγή ή κίτρινα. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του αντιδραστηρίου. Προετοιμάστε δύο κύριες ποσότητες Κύριου Μίγματος εργασίας, μία με KRAS 12/13 OM και μία με KRAS 61 OM σε ξεχωριστά Safe-Lock σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml. A. Υπολογίστε τον όγκο του KRAS MIX που απαιτείται για κάθε Κύριο Μίγμα εργασίας χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος KRAS MIX που απαιτείται = (αριθμός δειγμάτων + 2 οροί ελέγχου +1 βαθμονομητής +1) x 10 µl B. Υπολογίστε τον όγκο KRAS 12/13 OM ή KRAS 61 OM που απαιτείται για κάθε Κύριο Μίγμα εργασίας χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος KRAS 12/13 OM ή KRAS 61 OM που απαιτείται = (αριθμός δειγμάτων + 2 οροί ελέγχου +1 βαθμονομητής +1) x 10 µl C. Υπολογίστε τον όγκο MGAC που απαιτείται για κάθε Κύριο Μίγμα εργασίας χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: Όγκος MGAC που απαιτείται = (αριθμός δειγμάτων + 2 οροί ελέγχου +1 βαθμονομητής +1) x 6 µl Χρησιμοποιήστε τον Πίνακα 1 για να καθορίσετε τον όγκο κάθε αντιδραστηρίου που απαιτείται για την προετοιμασία του Κύριου Μίγματος εργασίας βάσει του αριθμού δειγμάτων που περιλαμβάνονται στην ανάλυση. Πίνακας 1 Απαιτούμενοι Όγκοι Αντιδραστηρίων για τα Κύρια Μίγματα εργασίας MMX 12/13 και MMX 61 Όγκοι Αντιδραστηρίων που απαιτούνται για το Κύριο Μίγμα Εργασίας Αριθµός δειγµάτων* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 KRAS MIX 10 µl KRAS 12/13 OM ή KRAS 61 OM 10 µl MGAC 6 µl Συνολικός Όγκος σε μl 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 130 156 182 208 234 260 286 312 338 364 * Περιλαμβάνονται επαρκείς όγκοι για 1 σωληνάριο ανά δείγμα, 2 σωληνάρια ορού ελέγχου, 1 σωληνάριο βαθμονομητή και 1 επιπλέον σωληνάριο D. Αφαιρέστε τον απαιτούμενο αριθμό φιαλιδίων KRAS MIX, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM και MGAC από το χώρο αποθήκευσής στους 2 C έως 8 C. Στροβιλίστε κάθε αντιδραστήριο για 5 δευτερόλεπτα και συγκεντρώστε το υγρό στον πυθμένα του σωληναρίου πριν από τη χρήση. Επισημάνετε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου για το μίγμα εργασίας MMX 12/13 και το μίγμα εργασίας MMX 61. E. Προσθέστε τον υπολογισμένο όγκο KRAS MIX στα σωληνάρια Κύριου Μίγματος εργασίας. F. Προσθέστε τον υπολογισμένο όγκο KRAS 12/13 OM ή KRAS 16 OM στο αντίστοιχο σωληνάριο Κύριου Μίγματος εργασίας. G. Προσθέστε τον υπολογισμένο όγκο MGAC στα σωληνάρια Κύριου Μίγματος εργασίας. H. Στροβιλίστε τα σωληνάρια για 3 έως 5 δευτερόλεπτα, για να διασφαλίσετε επαρκή ανάμιξη. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα δείγματα, οι οροί ελέγχου και ο βαθμονομητής θα πρέπει να προστίθενται στην πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) εντός 1 ώρας μετά την προετοιμασία των Κύριων Μιγμάτων εργασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρησιμοποιείτε μόνο Πλάκα Μικροβυθισμάτων (Πλάκα AD) και Μεμβράνη Σφράγισης cobas 4800 Συστήματος (Roche P/N 05232724001). 06322379001-01EL 14 Doc Rev. 1.0

Σχήμα 1 Ενδεικτική Διάταξη Πλάκας Ενδεικτική Διάταξη Πλάκας 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H KRAS MC 12/13 NEG CTL 12/13 KRAS CAL 12/13 KRAS MC Δείγμα 6 Δείγμα 6 Δείγμα 14 Δείγμα 14 Δείγμα 22 Δείγμα 22 61 12/13 61 12/13 61 12/13 61 NEG CTL Δείγμα 7 Δείγμα 7 Δείγμα 15 Δείγμα 15 Δείγμα 23 Δείγμα 23 61 12/13 61 12/13 61 12/13 61 KRAS CAL Δείγμα 8 Δείγμα 8 Δείγμα 16 Δείγμα 16 Δείγμα 24 Δείγμα 24 61 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Δείγμα 1 Δείγμα 1 Δείγμα 9 Δείγμα 9 Δείγμα 17 Δείγμα 17 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Δείγμα 2 Δείγμα 2 Δείγμα 10 Δείγμα 10 Δείγμα 18 Δείγμα 18 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Δείγμα 3 Δείγμα 3 Δείγμα 11 Δείγμα 11 Δείγμα 19 Δείγμα 19 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Δείγμα 4 Δείγμα 4 Δείγμα 12 Δείγμα 12 Δείγμα 20 Δείγμα 20 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Δείγμα 5 Δείγμα 5 Δείγμα 13 Δείγμα 13 Δείγμα 21 Δείγμα 21 12/13 61 12/13 61 12/13 61 A. Εκτελέστε έγχυση 25 µl Κύριου Μίγματος εργασίας σε κάθε μικροβύθισμα αντίδρασης της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) το οποίο απαιτείται για την ανάλυση. Μην αφήνετε το ακροφύσιο της συσκευής πιπέτας να έρθει σε επαφή με την πλάκα εκτός του βυθίσματος. Προσθέστε μίγμα εργασίας MMX12/13 (που περιέχει KRAS 12/13 OM) στα βυθίσματα της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD), στις στήλες με περιττό αριθμό (1, 3, 5 κ.λπ.). Προσθέστε μίγμα εργασίας MMX 61 (που περιέχει KRAS 61 OM) στα βυθίσματα της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD), στις στήλες με άρτιο αριθμό (2, 4, 6 κ.λπ.) B. Εκτελέστε έγχυση 25 µl KRAS MC στα βυθίσματα A1 και A2 της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). Αναμίξτε καλά χρησιμοποιώντας την πιπέτα για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. C. Χρησιμοποιώντας νέο ακροφύσιο συσκευής πιπέτας, εκτελέστε έγχυση 25 µl NEG CT στα βυθίσματα Β1 και B2 της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). Αναμίξτε καλά χρησιμοποιώντας την πιπέτα για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. D. Χρησιμοποιώντας νέο ακροφύσιο συσκευής πιπέτας, εκτελέστε έγχυση 25 µl KRAS CAL στα βυθίσματα C1 και C2 της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). Αναμίξτε καλά χρησιμοποιώντας την πιπέτα για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κάθε ανάλυση πρέπει να περιλαμβάνει θετικό ορό ελέγχου (KRAS MC) στα βυθίσματα A1 και A2, αρνητικό ορό ελέγχου (NEG CT) στα βυθίσματα B1 και Β2 και βαθμονομητή (KRAS CAL) στα βυθίσματα C1 και C2, καθώς διαφορετικά η ανάλυση θα θεωρηθεί άκυρη από τον cobas z 480 αναλυτή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάζετε γάντια, όπως απαιτείται, για προστασία έναντι της μόλυνσης από δείγμα σε δείγμα και της μόλυνσης από την εξωτερική πλευρά του σωληναρίου αντίδρασης PCR. E. Χρησιμοποιώντας νέα ακροφύσια συσκευής πιπέτας για κάθε αραιωμένο DNA δείγματος, προσθέστε 25 µl από το DNA του πρώτου δείγματος στα βυθίσματα D1 και D2 της πλάκας μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). Αναμίξτε καλά χρησιμοποιώντας την πιπέτα για να εκτελέσετε αναρρόφηση και διοχέτευση εντός του βυθίσματος τουλάχιστον δύο φορές. Επαναλάβετε τη διαδικασία αυτή για το αραιωμένο DNA από το δεύτερο δείγμα (βυθίσματα E1 και E2). Ακολουθήστε το πρότυπο στο Σχήμα 1 μέχρι να φορτώσετε όλες τις αραιώσεις DNA δειγμάτων στην πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD). Βεβαιωθείτε ότι όλο το υγρό έχει συγκεντρωθεί στον πυθμένα των βυθισμάτων. F. Καλύψτε την πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) με μεμβράνη σφράγισης (παρέχεται μαζί με τις πλάκες). Χρησιμοποιήστε τη συσκευή τοποθέτησης μεμβράνης σφράγισης για να σφραγίσετε σταθερά την πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) με τη μεμβράνη. G. Βεβαιωθείτε ότι όλο το υγρό έχει συγκεντρωθεί στον πυθμένα κάθε βυθίσματος πριν από την έναρξη της διαδικασίας PCR. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ενίσχυση και η ανίχνευση θα πρέπει να ξεκινήσουν εντός 1 ώρας μετά την προσθήκη της πρώτης αραίωσης DNA δείγματος στο Κύριο Μίγμα εργασίας. 06322379001-01EL 15 Doc Rev. 1.0

Έναρξη διαδικασίας PCR Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas KRAS για λεπτομερείς οδηγίες σχετικά με τα βήματα της ροής εργασιών KRAS. ΕΡΜΗΝΕΊΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΆΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η επαλήθευση όλων των αναλύσεων και δειγμάτων πραγματοποιείται από το cobas 4800 λογισμικό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μια έγκυρη ανάλυση εξέτασης μπορεί να περιλαμβάνει έγκυρα και μη έγκυρα αποτελέσματα δειγμάτων. Για μια έγκυρη ανάλυση, τα αποτελέσματα δειγμάτων ερμηνεύονται όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Αποτέλεσμα Εξέτασης Mutation Detected Mutation Not Detected* Πίνακας 2 Ερμηνεία Αποτελεσμάτων για το cobas KRAS Mutation Test Αποτέλεσμα Μετάλλαξης Κωδικόνια 12/13 ή Κωδικόνιο 61 (μπορεί να υπάρχουν και τα δύο) Ερμηνεία Ανιχνεύτηκε μετάλλαξη στα κωδικόνια 12/13 ή στο κωδικόνιο 61 του KRAS ή και στα δύο. Μ.Δ. Δεν ανιχνεύτηκε μετάλλαξη στα κωδικόνια 12/13 και 61 του KRAS. Invalid Μ.Δ. Το αποτέλεσμα δείγματος είναι άκυρο. Επαναλάβετε την εξέταση των δειγμάτων με μη έγκυρα αποτελέσματα ακολουθώντας τις οδηγίες που παρατίθενται στην ενότητα Επανεξέταση δειγμάτων με μη έγκυρα αποτελέσματα παρακάτω. Failed Μ.Δ. Η ανάλυση απέτυχε λόγω σφάλματος υλικού εξοπλισμού ή λογισμικού. Επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης * Ένα αποτέλεσμα «Mutation Not Detected» δεν αποκλείει την παρουσία μετάλλαξης στις περιοχές κωδικονίων 12/13 ή 61 του KRAS, καθώς τα αποτελέσματα εξαρτώνται από το ποσοστό μεταλλαγμένων αλληλουχιών, την επαρκή ακεραιότητα δείγματος, την απουσία αναστολέων και την επαρκή ποσότητα DNA για ανίχνευση. Επανεξέταση δειγμάτων με μη έγκυρα αποτελέσματα A. Επαναλάβετε την αραίωση του μη έγκυρου αρχικού δείγματος DNA ξεκινώντας από τις διαδικασίες Υπολογισμός Αραίωσης του Αρχικού Δείγματος DNA και Αραίωση Δειγμάτων στην ενότητα ΕΝΙΣΧΥΣΗ και ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ. B. Μετά την εκτέλεση της αραίωσης αρχικού δείγματος DNA στα 2 ng/µl που περιγράφεται στην ενότητα Αραίωση Δειγμάτων συνεχίστε με τη διαδικασία Προετοιμασία των Κύριων Μιγμάτων Εργασίας (MMX 12/13 και MMX 61) και ακολουθήστε την υπόλοιπη διαδικασία ενίσχυσης και ανίχνευσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το δείγμα παραμείνει μη έγκυρο μετά την επανεξέταση ή εάν δεν υπάρχει επαρκής ποσότητα αρχικού δείγματος DNA για την προετοιμασία άλλης αραίωσης στη διαδικασία «Επανεξέταση δειγμάτων με μη έγκυρα αποτελέσματα», βήμα A, επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία εξέτασης για αυτό το δείγμα, ξεκινώντας με την αποπαραφίνωση και απομόνωση DNA χρησιμοποιώντας νέο τμήμα FFPET 5 μm. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Σε κάθε ανάλυση περιλαμβάνεται ένας cobas Ορός Ελέγχου Μετάλλαξης Εξέτασης KRAS (KRAS MC), αρνητικός ορός ελέγχου (NEG CT) και Βαθμονομητής KRAS (KRAS CAL) για τα μίγματα εργασίας MMX 12/13 και MMX 61. Μια ανάλυση είναι έγκυρη εάν είναι έγκυρα τα βυθίσματα με ορό ελέγχου μετάλλαξης KRAS (KRAS MC) (A1 και A2), τα βυθίσματα με αρνητικό ορό ελέγχου (NEG CT) (B1 και B2) και τα βυθίσματα με Βαθμονομητή KRAS (KRAS CAL) (C1 και C2). Εάν τα βυθίσματα με Ορό Ελέγχου Μετάλλαξης KRAS (KRAS MC), αρνητικό ορό ελέγχου (NEG CT) ή Βαθμονομητή KRAS (KRAS CAL) για τα μίγματα εργασίας MMX 12/13 ή MMX 61 είναι μη έγκυρα, θεωρείται μη έγκυρη ολόκληρη η ανάλυση και πρέπει να επαναληφθεί. Προετοιμάστε μια νέα αραίωση του Αρχικού δείγματος DNA του δείγματος που έχει ήδη απομονωθεί, για να ετοιμάσετε μια νέα πλάκα μικροβυθισμάτων (πλάκα AD) με ορούς ελέγχου για ενίσχυση και ανίχνευση. 06322379001-01EL 16 Doc Rev. 1.0