ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2013. Χρήση βακτηρίων και σκουληκιών στη μάχη κατά της νόσου Alzheimer

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ 2013 Χρήση βακτηρίων και σκουληκιών στη μάχη κατά της νόσου Alzheimer Νίκη Χονδρογιάννη, Ερευνήτρια Β, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, συντονίστρια Γεώργιος Σκρέτας, Ερευνητής Γ, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Δεκέμβριος 2013

RESEARCH PROJECTS 2013 Using bacteria and worms in the battle against Alzheimer s disease Niki Chondrogianni, Research Associate Professor, Institute of Biology, Medicinal Chemistry and Biotechnology, National Hellenic Research Foundation, coordinator Georgios Skretas, Research Assistant Professor, Institute of Biology, Medicinal Chemistry and Biotechnology, National Hellenic Research Foundation... December 2013

ΧΡΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΣΚΟΥΛΗΚΙΩΝ ΣΤΗ ΜΑΧΗ ΚΑΤΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ALZHEIMER ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ (ΕΛΛΗΝΙΚΑ) Η νόσος Alzheimer (AD) είναι η πιο συχνή μορφή άνοιας με τεράστιες κοινωνικοοικονομικές επιπτώσεις για την οποία δεν υπάρχουν θεραπευτικές/προληπτικές αγωγές. Στόχος του προγράμματος είναι η ανακάλυψη θεραπευτικών ενώσεων κατά της AD. Αντικείμενο του έργου είναι η εφαρμογή μεθόδων μοριακής εξέλιξης για την ανίχνευση ενώσεων που αποτρέπουν τη νευτοτοξικότητα των συσσωματωμάτων της αμυλοειδικής β πρωτεΐνης (Αβ). Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε μια καινοτόμος διαδικασία, όπου μεγάλες βιβλιοθήκες μικρών μορίων βιοσυντέθηκαν σε γενετικά τροποποιημένα βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli και κάποια βιοδραστικά μόρια ανιχνεύτηκαν ταχέως δίδοντας τα βακτήρια αυτά απευθείας ως τροφή σε διαγονιδιακά στελέχη του σκώληκα Caenorhabditis elegans που λειτουργούν ως μοντέλα της ανθρώπινης AD. Οι ενώσεις που βρέθηκαν να αναστέλλουν το φαινότυπο της AD, ελέγθηκαν στη συνέχεια για την ικανότητά τους να αναστέλλουν την κυτταροτοξικότητα ολιγομερών της Aβ σε νευρωνικά κύτταρα. Συνοπτικά, τα μέχρι τώρα αποτελέσματά μας δείχνουν πως η πειραματική προσέγγισή μας ήταν σωστή και τα πρώιμα αποτελέσματά μας αν και χρήζουν βελτιστοποίησης δείχνουν πως κάποια από τα απομονωμένα βιοδραστικά μόρια μπορεί να είναι εν δυνάμει θεραπευτικές ενώσεις κατά της AD. (ΑΓΓΛΙΚΑ) Alzheimer s disease (AD) is the most common form of dementia, a condition with a tremendous socioeconomic impact that remains incurable. The aim of this project is the discovery of therapeutic compounds against AD. By taking advantage of methods of molecular evolution, we attempted to identify compounds that inhibit the neurotoxicity caused by the formation of oligomers/aggregates of the amyloid β (Αβ) peptide. For this, we implemented an innovative approach, where large libraries of small molecules were biosynthesized rapidly in genetically modified Escherichia coli cells and then screened for bioactivity by feeding them directly to transgenic strains of Caenorhabditis elegans that serve as models of human AD. The compounds that were identified to inhibit or reverse the AD phenotype were subsequently examined for

their ability to prevent cytotoxicity due to Αβ oligomerization/aggregation in human neurons. The obtained results so far reveal that our approach was correct and our preliminary results, although they have to be optimized, suggest that some of the identified bioactive molecules might become potential therapeutic compounds against AD. ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η νόσος Alzheimer (AD) είναι η πιο συχνή μορφή άνοιας, από την οποία πάσχουν σήμερα 28.000.000 ασθενείς παγκοσμίως. Εξαιτίας της αύξησης του προσδόκιμου ζωής, ο αριθμός των ανοϊκών ασθενών αναμένεται να τριπλασιαστεί στα επόμενα 40 χρόνια, προκαλώντας παγκόσμια επιδημία. Εκτός από τις επιπτώσεις στην υγεία, υπάρχουν και τεράστιες επιπτώσεις στην παγκόσμια οικονομία, καθώς το συνολικό κόστος περίθαλψης των ανοϊκών ασθενών ανέρχεται στα 430 δισεκατομμύρια ευρώ ετησίως (1). Παρόλα αυτά, οι διαθέσιμες φαρμακευτικές αγωγές στοχεύουν απλά στην καταπράυνση των συμπτωμάτων της ασθένειας και όχι στην πρόληψη ή θεραπεία. Η αιτία(ες) της AD δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένες, ωστόσο υποστηρίζεται ότι διάφοροι παράγοντες (γήρανση, γενετικές μεταλλαγές κ.α.) οδηγούν στη συσσώρευση της αμυλοειδικής β πρωτεΐνης (Αβ) στον εγκέφαλο των ασθενών, η οποία είναι νευροτοξική (αμυλοειδική υπόθεση) (2). Οι επικρατέστερες θεωρίες υποστηρίζουν ότι τα διαλυτά ολιγομερή της Αβ αποτελούν τα κύρια νευροτοξικά είδη που οδηγούν στον εκφυλισμό των νευρώνων (3, 4). Η παρούσα πρόταση περιγράφει μια καινοτόμο προσέγγιση για την ανακάλυψη ενώσεων με εν δυνάμει θεραπευτικές ιδιότητες κατά της AD. Στόχος της μελέτης είναι η εφαρμογή τεχνικών μοριακής εξέλιξης για την ανακάλυψη μικρών μορίων με την ικανότητα να αναστέλλουν τη νευροτοξικότητα των συσσωματωμάτων της Αβ, αποτρέποντας έτσι τις παθογόνους δράσεις αυτών και την εξέλιξη της νόσου. ΟΜΑΔΑ ΜΕΛΕΤΗΣ Νίκη Χονδρογιάννη, Ερευνήτρια Β, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, συντονίστρια Γεώργιος Σκρέτας, Ερευνητής Γ, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Νικολέττα Παπαευγενίου, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια της ομάδας της Δρ. Χονδρογιάννη

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Η μεθοδολογία που εφαρμόστηκε υπόκειται σε κατάθεση διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Κατά συνέπεια, αιτούμαστε να μην δημοσιευτεί η έκθεση αυτή έως ότου κατατεθεί η αίτηση μας. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε είναι η κάτωθι: 1. Κατασκευή πλασμιδίων που κωδικοποιούν συνδυαστικές βιβλιοθήκες κυκλικών τετραπεπτιδίων σε κύτταρα E. coli. Για την παραγωγή των συνδυαστικών βιβλιοθηκών τυχαίων κυκλικών τετραπεπτιδίων χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία SICLOPPS (split intein circular ligation of peptides and proteins) (5). Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί ιντεΐνες (πρωτεϊνικά ανάλογα των αυτο-ματιζόμενων ιντρονίων του RNA), οι οποίες λειτουργούν ως πρωτεϊνικές λιγάσες και συνδέουν τα Ν- και C- τελικά άκρα ενός πεπτιδίου με σταθερό πεπτιδικό δεσμό μέσω μιας αυτοκαταλυόμενης αντίδρασης που ονομάζεται μάτισμα πρωτεϊνών οδηγώντας στο σχηματισμό κυκλικού προϊόντος (6). Προϋπόθεση για την κυκλοποίηση είναι η ύπαρξη πυρηνόφιλου αμινοξέως [κυστεΐνη (C), σερίνη (S), θρεονίνη (T)] στο Ν- τελικό άκρο του προς κυκλοποίηση πεπτιδίου. Ο γενικός τύπος των πεπτιδίων προς μελέτη είναι NuΧΧΧ, όπου Nu = C, S ή T και Χ = οποιοδήποτε από τα 20 φυσικά αμινοξέα. Το θεωρητικό μέγεθος της βιβλιοθήκης αυτής είναι 3x20 3 =24.000 διαφορετικά πεπτίδια. Οι βιβλιοθήκες των γονιδίων που κωδικοποιούν τα τυχαία τετραπεπτίδια NuXXX κατασκευάστηκαν με τη χρήση εκκινητών PCR που περιλαμβάνουν αλληλουχίες τυχαίων κωδικονίων NNS, όπου το Ν=A, T, G, C και S=G ή C. Η αλληλουχία NNS συνιστά 32 πιθανά κωδικόνια και κωδικοποιεί και τα 20 φυσικά αμινοξέα, χωρίς να περιλαμβάνει κωδικόνια τερματισμού UAA και UGA (6). Οι τυχαίες αυτές βιβλιοθήκες κλωνοποιήθηκαν σε βακτηριακά πλασμίδια και εκφράστηκαν υπό τον έλεγχο του υποκινητή p BAD (6). 2. Σάρωση των βιβλιοθηκών κυκλικών πεπτιδίων και επιλογή των μορίων που καταστέλλουν τη νευροτοξικότητα της Αβ στον σκώληκα C. elegans. Οι βιβλιοθήκες των τετραπεπτιδίων σαρώθηκαν και τα λειτουργικά μόρια εντοπίστηκαν μέσω γενετικής επιλογής στο C. elegans, χρησιμοποιώντας το στέλεχος CL2006 (7). Πρόκειται για ένα διαγονιδιακό ζώο που εκφράζει την ανθρώπινη Αβ συνεχώς υπό τον υποκινητή του γονιδίου unc-54 (γονίδιο μυοσίνης). Το στέλεχος αυτό χρησιμοποιείται ευρέως ως ζωικό πρότυπο της AD (8, 9), καθώς παρουσιάζει την ικανότητα να συσσωρεύει ολιγομερή/συσσωματώματα της Αβ στο μυϊκό του

σύστημα, τα οποία μπορούν να ανιχνευτούν με τη βοήθεια χρωστικών και μικροσκοπίας, ενώ η συσσώρευση αυτή οδηγεί σε ορατό φαινότυπο σταδιακής παράλυσης. Δεδομένου ότι οι σκώληκες τρέφονται με E. coli, τα τροποποιημένα βακτηριακά κύτταρα που παράγουν κυκλικά πεπτίδια χορηγήθηκαν ως τροφή στα ζώα. Οι βιβλιοθήκες χωρίστηκαν τυχαία σε μικρότερες υποβιβλιοθήκες (~100 διαφορετικές πεπτιδικές αλληλουχίες/υποβιβλιοθήκη) και τα βακτήρια που εξέφραζαν τα κυκλικά πεπτίδια της κάθε υποβιβλιοθήκης δόθηκαν ως τροφή στο παραπάνω στέλεχος. Σε οποιαδήποτε υποβιβλιοθήκη ανιχνεύτηκε θετικός φαινότυπος σε σχέση με ζώα-μάρτυρες, πραγματοποιήθηκε περαιτέρω κατάτμηση σε μικρότερες υποβιβλιοθήκες (~10 διαφορετικές πεπτιδικές αλληλουχίες/υποβιβλιοθήκη) κ.ο.κ., με τελικό στόχο την απομόνωση των συγκεκριμένων αλληλουχιών που ευθύνονται για το θετικό φαινότυπο. 3. Αποτίμηση της ικανότητας των επιλεγμένων πεπτιδίων να αναστέλλουν τις παθογόνους δράσεις των ολιγομεών της Αβ σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος. Η ικανότητα των βιοδραστικών ενώσεων να καταστέλλουν την τοξικότητα της Αβ αποτιμήθηκε με in vitro πειράματα σε κυτταροκαλλιέργειες κυττάρων νευροβλαστώματος που εκτέθηκαν σε ολιγομερή της Αβ απουσία και παρουσία των επιλεγμένων πεπτιδίων, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αποτίμησης Live/Dead (10). Πιο συγκεκριμένα, καταμετρήθηκαν τόσο τα ζωντανά κύτταρα όσο και τα νεκρά/επιπλέοντα κύτταρα στις παρακάτω καλλιέργειες: 1. Κύτταρα νευροβλαστώματος που εκτέθηκαν σε ολιγομερή Αβ αλλά όχι σε επιλεγμένα πεπτίδια 2. Κύτταρα νευροβλαστώματος που εκτέθηκαν σε ολιγομερή Αβ και σε επιλεγμένα πεπτίδια Επιπλέον από τα ζωντανά κύτταρα απομονώθηκαν πρωτεΐνες προκειμένου να αποκαλυφθούν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα Αβ αλλά και τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των τοξικών ολιγομερών Αβ. ΑΠΡΟΒΛΕΠΤΑ ΕΜΠΟΔΙΑ/ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΤΗΚΑΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΕΚΠΟΝΗΣΗ Κατά την εκπόνηση της μελέτης πραγματοποιήθηκαν κάποιες πειραματικές αλλαγές αλλά και προσθήκες σε σχέση με το αρχικό πλάνο είτε γιατί παρουσιάστηκαν απρόβλεπτα προβλήματα είτε γιατί κρίθηκαν απαραίτητες για καλύτερη αποσαφήνιση των εμπλεκόμενων μηχανισμών. Πιο συγκεκριμένα:

1. Στο αρχικό πλάνο είχε προταθεί η σάρωση τετραπεπτιδίων αλλά δεδομένου ότι όταν έπρεπε να ξεκινήσει η σάρωση είχαμε και έτοιμες συνδυαστικές βιβλιοθήκες πεντα- και εξα- πεπτιδίων, αποφασίσαμε να αυξήσουμε ακόμα περισσότερο την πολυπλοκότητα της σάρωσης των βιβλιοθηκών αυτών. Έτσι, συνδυάσαμε όλες τις βιβλιοθήκες μαζί και έγινε μια αρχική σάρωση της υπερβιβλιοθήκης αυτής με τη βοήθεια βακτηρίων. Πιο συγκεκριμένα, εφαρμόστηκε ένα πρώτο γενετικό σύστημα σάρωσης υψηλής απόδοσης (high-throughput genetic screen) που εντοπίζει ενώσεις με την ικανότητα να αποτρέπουν τη συσσωμάτωση της Αβ σε βακτηριακά κύτταρα E. coli (11). Από αυτή τη διαδικασία σάρωσης με τη βοήθεια βακτηρίων, ξεκινήσαμε από περίπου 10 7 διαφορετικές ενώσεις και καταλήξαμε σε ένα σύνολο της τάξεως των 1000, οι οποίες είναι εν δυνάμει αναστολείς της συσσωμάτωσης της Αβ. 2. Στο αρχικό πλάνο είχε προταθεί η χρήση νευρώνων για την αποτίμηση της ικανότητας των επιλεγμένων ενώσεων να αναστέλλουν τις παθογόνους δράσεις των ολιγομερών της Αβ. Η απομόνωση αυτών και η περεταίρω χρήση τους αποδείχθηκε εξαιρετικά δύσκολη και ο αριθμός των κυττάρων που λαμβάναμε δεν μας επέτρεπε την πολλαπλή επανάληψη των πειραμάτων. Κατά συνέπεια, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε κύτταρα νευροβλαστώματος (SH-SY5Y κυτταρική σειρά) αντί για νευρώνες τα οποία πολλαπλασιάζονται και έτσι μας δίνουν τη δυνατότητα πολλαπλών επαναλήψεων ενώ ταυτόχρονα με βάση τη βιβλιογραφία είναι κύτταρα που κατά κύριο λόγο χρησιμοποιούνται σε παρόμοιου είδους πειράματα. 3. Στο αρχικό πλάνο είχε προταθεί η χρήση δύο στελεχών που αποτελούν μοντέλα για τη νόσο του Alzheimer στο σκουλήκι, το CL2006 (7) το οποίο και χρησιμοποιήθηκε και το CL4176 (12). Το στέλεχος CL4176 εκφράζει την Αβ υπό συνθήκες μεταβολής της θερμοκρασίας επώασης. Η παράλυση εμφανίζεται μέσα σε 24 ώρες από την επαγωγή της έκφρασης της Αβ υπό τον υποκινητή του γονιδίου myo- 3 (γονίδιο μυϊκής πρωτεΐνης). Όταν χρησιμοποιήσαμε το στέλεχος αυτό βρήκαμε πως η παράλυση επέρχεται τόσο σύντομα μετά την αλλαγή της θερμοκρασίας επώασης των σκωλήκων που το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί ίσως να μην ήταν αρκετό για να δράσουν οι ενώσεις μας (δεδομένου ότι πρώτα περνούν μέσω του πεπτικού συστήματος). Έτσι αποφασίσαμε να συνεχίσουμε τη σάρωση μόνο με το στέλεχος CL2006 στο οποίο η παράλυση επέρχεται σταδιακά κατά τη γήρανσή του, δίνοντας έτσι αρκετό χρόνο για να δράσουν οι ενώσεις μας ακόμα και από τα πρώτα στάδια συσσωμάτωσης.

4. Στο αρχικό πλάνο είχε προταθεί η αποτίμηση της ικανότητας των επιλεγμένων ενώσεων να αναστέλλουν τις παθογόνους δράσεις των ολιγομερών της Αβ σε κύτταρα νευροβλαστώματος να γίνει με τη μέθοδο καταμέτρησης των νεκρών και ζωντανών κυττάρων. Επιπλέον αυτής της μεθόδου, εμείς απομονώσαμε πρωτεΐνες από τα κύτταρα αυτά προκειμένου να αποκαλυφθούν στα ζωντανά κύτταρα τα ενδοκυτταρικά επίπεδα Αβ αλλά και τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των τοξικών ολιγομερών Αβ. ΤΕΛΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ/ΠΑΡΑΔΟΤΕΑ Τα παραδοτέα που είχαν προβλεφθεί ήταν χωρισμένα ανά πακέτο εργασίας ως εξής: ΠΑΚΕΤΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 1: Κατασκευή πλασμιδίων που κωδικοποιούν συνδυαστικές βιβλιοθήκες κυκλικών τετραπεπτιδίων σε κύτταρα E. coli. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παρήχθησαν συνδυαστικές βιβλιοθήκες κυκλικών τετραπεπτιδίων όπως είχε προταθεί στην αρχική πρόταση και παράλληλα παρήχθησαν και συνδυαστικές βιβλιοθήκες ενώσεων πεντα- και εξα- πεπτιδίων (παραδοτέο 1.1). ΠΑΚΕΤΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 2: Σάρωση των βιβλιοθηκών κυκλικών πεπτιδίων και επιλογή των μορίων που καταστέλλουν τη νευροτοξικότητα της Αβ στον σκώληκα C. elegans. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι βιβλιοθήκες που παρήχθησαν στο πακέτο εργασίας 1 συνδυάστηκαν και έγινε μια αρχική σάρωση της υπερβιβλιοθήκης αυτής με τη βοήθεια βακτηρίων. Πιο συγκεκριμένα, εφαρμόστηκε ένα πρώτο γενετικό σύστημα σάρωσης υψηλής απόδοσης (high-throughput genetic screen) που εντοπίζει ενώσεις με την ικανότητα να αποτρέπουν τη συσσωμάτωση της Αβ σε βακτηριακά κύτταρα E. coli (11). Από αυτή τη διαδικασία σάρωσης με τη βοήθεια βακτηρίων, ξεκινήσαμε από περίπου 10 7 διαφορετικές ενώσεις και καταλήξαμε σε ένα σύνολο της τάξεως των 1000, οι οποίες είναι εν δυνάμει αναστολείς της συσσωμάτωσης της Αβ. Το σύνολο αυτό των 1000 περίπου ενώσεων που απομονώθηκε το ονομάσαμε βιβλιοθήκη 1 (library). Όταν χορηγήθηκε η βιβλιοθήκη 1 ως τροφή στο στέλεχος CL2006, ανιχνεύτηκε θετικός

φαινότυπος που εμφανίζεται ως καθυστέρηση της παράλυσης κατά μερικές μέρες με μεγάλη στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες που τρέφονται με βακτηριακά κύτταρα παρουσία μιας τυχαίας πεπτιδικής αλληλουχίας (control) (Εικόνα 1). Πιο συγκεκριμένα, ο πληθυσμός που τρέφονταν με τη βιβλιοθήκη 1 παρέλυσε κατά μέσο όρο 3 μέρες αργότερα από τον πληθυσμό-μάρτυρα (p-value<0,0001). Εικόνα 1: Ποσοστά παράλυσης του στελέχους CL2006 σε καλλιέργειες που χορηγήθηκε η βιβλιοθήκη 1 των ενώσεων (library) και στις καλλιέργειες-μάρτυρες (control). Στη συνέχεια, έγινε κατάτμηση της βιβλιοθήκης 1 σε διαφορετικές υποβιβλιοθήκες που περιέχουν περίπου 20 διαφορετικά πεπτίδια η καθεμιά. Κατά τη δοκιμή των υποβιβλιοθηκών αυτών, εντοπίστηκε θετικός φαινότυπος στην υποβιβλιοθήκη 2 (sublibrary 2) (Εικόνα 2). Πιο συγκεκριμένα, ο πληθυσμός που τρέφονταν με την υποβιβλιοθήκη 2 παρέλυσε κατά μέσο όρο 2 μέρες αργότερα από τον πληθυσμόμάρτυρα (p-value=0,0002). Εικόνα 2: Ποσοστά παράλυσης του στελέχους CL2006 σε καλλιέργειες που χορηγήθηκε η υποβιβλιοθήκη 2 (sublibrary 2). Εμφανίζονται και τα ποσοστά παράλυσης σε καλλιέργειες που χορηγήθηκε η βιβλιοθήκη 1 των κυκλικών πεπτιδίων (library) και στις καλλιέργειεςμάρτυρες (control).

Η υποβιβλιοθήκη αυτή διαχωρίστηκε περεταίρω και μελετήθηκε η δράση όλων των πεπτιδίων που περιείχε. Ταυτοποιήθηκε ένα πεπτίδιο (compound 1) που όταν χορηγήθηκε ως τροφή στο στέλεχος CL2006, ανιχνεύτηκε θετικός φαινότυπος που εμφανίζεται ως καθυστέρηση της παράλυσης κατά μερικές μέρες με μεγάλη στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες που τρέφονται με βακτηριακά κύτταρα παρουσία μιας τυχαίας πεπτιδικής αλληλουχίας (control) (Εικόνα 3) (παραδοτέο 2.1). Πιο συγκεκριμένα, ο πληθυσμός που τρέφονταν με το πεπτίδιο παρέλυσε κατά μέσο όρο 2 μέρες αργότερα από τον πληθυσμό-μάρτυρα (pvalue=0,0002). Εικόνα 3: Ποσοστά παράλυσης του στελέχους CL2006 σε καλλιέργειες που χορηγήθηκε το πεπτίδιο 1 (compound 1). Εμφανίζονται και τα ποσοστά παράλυσης σε καλλιέργειες που χορηγήθηκε η βιβλιοθήκη 1 των κυκλικών πεπτιδίων (library) και στις καλλιέργειες-μάρτυρες (control). Προκειμένου να ανιχνεύσουμε και τα εν δυνάμει μειωμένα επίπεδα συσσωματωμάτων Αβ στο μυϊκό σύστημα των σκωλήκων, βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες χρώσης των συσσωματωμάτων της Αβ ώστε να είναι εμφανή με τη βοήθεια μικροσκοπίας. Παρά ταύτα, οι εικόνες δεν ήταν τόσο καθαρές λόγω του αυτοφθορισμού που παρατηρείται κυρίως στο έντερο των ζώων κατά τη γήρανση τους με αποτέλεσμα να καλύπτεται πολλές φορές το σήμα που θα έπρεπε να λαμβάνεται από τη χρώση των συσσωματωμάτων της Αβ ή να εμφανίζεται φθορισμός που δεν ήταν εύκολο να διαχωριστεί αν οφείλεται στο σήμα από το έντερο ή από πιθανά συσσωματώματα. Έτσι προχωρήσαμε στη βελτιστοποίηση συνθηκών για ανίχνευση των συσσωματωμάτων της Αβ μέσω αντισωμάτων που αναγνωρίζουν ειδικά τα συσσωματώματα αυτά (παραδοτέο 2.2). Οι συνθήκες αυτές

βελτιστοποιήθηκαν και τα πρώτα μας αποτελέσματα δείχνουν μειωμένα επίπεδα τοξικών ολιγομερών της Αβ στο μυικό σύστημα των ζώων στα οποία χορηγήθηκε η ένωση που ταυτοποιήσαμε να καθυστερεί την παράλυση των ζώων. Προκειμένου, να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες ανίχνευσης των συσσωματωμάτων της Αβ μέσω αντισωμάτων, τα πειράματα αυτά θα συνεχιστούν και μετά τη λήξη της παρούσας μελέτης, ώστε να ληφθούν οι κατάλληλες προς δημοσίευση φωτογραφίες. ΠΑΚΕΤΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 3: Αποτίμηση της ικανότητας των επιλεγμένων πεπτιδίων να αναστέλλουν τις παθογόνους δράσεις των ολιγομερών της Αβ σε ανθρώπινα νευρωνικά κύτταρα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το πεπτίδιο που ταυτοποιήθηκε να καθυστερεί την παράλυση των ζώων αγοράστηκε σε καθαρή μορφή. Καλλιεργήθηκαν ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος (SH- SY5Y κυτταρική σειρά) και στρώθηκαν σε τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας ώστε να καλύπτουν το 70-80% της επιφάνειας. Υπήρχαν δύο πληθυσμοί, ένας που αποτελούνταν από κύτταρα νευροβλαστώματος που εκτέθηκαν σε ολιγομερή Αβ αλλά όχι στο υπό μελέτη πεπτίδιο και ένας πληθυσμός που αποτελούνταν από κύτταρα νευροβλαστώματος που εκτέθηκαν σε ολιγομερή Αβ και στο υπό μελέτη πεπτίδιο. Τα Αβ ολιγομερή που προστέθηκαν στις καλλιέργειες αυτές παρήχθησαν υπό τη μορφή κατά συνθήκη μέσου (conditional medium). Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη APP και κατά συνέπεια εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες Αβ ολιγομερών στο μέσο καλλιέργειας τους [CHO-7PA2 κυτταρική σειρά (13, 14)]. Τα κύτταρα αυτά στρώθηκαν σε τρυβλία ώστε να καλύπτουν το 90% της επιφάνειας και διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας απουσία ορού για 16 ώρες απουσία ή παρουσία της υπό μελέτης ουσίας. Τα μέσα αυτά απομονώθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν ώστε να απομακρυνθούν τα ενδεχομένως νεκρά κύτταρα και στη συνέχεια προστέθηκαν επάνω στις αντίστοιχες καλλιέργειες νευροβλαστώματος SH-SY5Y για μία ώρα. Σε αυτές τις καλλιέργειες καταμετρήθηκε ο αριθμός των νεκρών και ζωντανών κυττάρων. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν πως παρουσία της ουσίας παρατηρείται μικρότερος αριθμός νεκρών κυττάρων (pvalue=0,003) και μεγαλύτερος αριθμός ζωντανών κυττάρων (p-value=0,0003) κάτι το οποίο προτείνει πως η υπό μελέτη απομονωμένη ένωση δρα προστατευτικά απέναντι στην τοξική δράση των Αβ ολιγομερών (Εικόνα 4) (παραδοτέο 3.1).

Εικόνα 4: Ποσοστά νεκρών και ζωντανών κυττάρων νευροβλαστώματος SH-SY5Y ύστερα από επίδραση κατά συνθήκη μέσου που περιέχει ολιγομερή Αβ παρουσία (7PA2+) ή απουσία (7PA2-) του πεπτιδίου 1 για 1 ώρα. Ως 100% έχει οριστεί ο αριθμός των κυττάρων SH-SY5Y στις καλλιέργειες απουσία του πεπτιδίου (7PA2-) αντίστοιχα στα κλάσματα νεκρών και ζωντανών κυττάρων. Τα πειράματα αυτά θα συνεχιστούν και πέραν της παρούσης μελέτης καθώς χρήζουν βελτιστοποίησης που θα περιλαμβάνει: (α) την προσθήκη διαφόρων συγκεντρώσεων Αβ ολιγομερών, (β) την προσθήκη διαφόρων συγκεντρώσεων της καθαρής ένωσης για διάφορα χρονικά διαστήματα, (γ) την προσθήκη της καθαρής ένωσης απευθείας στα κύτταρα νευροβλαστώματος και όχι στα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή του μέσου κατά συνθήκη. Παράλληλα, απομονώθηκαν πρωτεϊνες από τα ζωντανά κύτταρα και ανιχνεύτηκαν τα επίπεδα ενδοκυτταρικών Αβ ολιγομερών. Τα πρώτα μας αποτελέσματα δείχνουν πως τα ενδοκυτταρικά επίπεδα τοξικών Αβ ολιγομερών είναι χαμηλότερα στα κύτταρα που δέχθηκαν την επίδραση της υπό μελέτης ουσίας σε σχέση με τα αντίστοιχα κύτταρα-μάρτυρες. Τα πειράματα αυτά θα επαναληφθούν και σε όλα τα δείγματα που όπως αναφέρθηκε παραπάνω θα ελεγχθούν κατά τη βελτιστοποίηση των συνθηκών. Συμπερασματικά, τα μέχρι τώρα αποτελέσματά μας δείχνουν πως η πειραματική προσέγγισή μας ήταν σωστή και πως το μοντέλο που προτείνουμε μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη σάρωση των διαφόρων βιβλιοθηκών κυκλικών πεπτιδίων. Τα πρώτα αποτελέσματά μας αν και χρήζουν βελτιστοποίησης δείχνουν πως έχουμε απομονώσει τουλάχιστον ένα κυκλικό πεπτίδιο που φαίνεται να δρα

κυτταροπροστατευτικά έναντι της τοξικότητας των Αβ ολιγομερών. Κατά συνέπεια, το πεπτίδιο αυτό μπορεί να είναι εν δυνάμει θεραπευτική ένωση κατά της AD. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. Abbott, A. Dementia: A problem for our age. Nature 475, S2-4. 2. Selkoe, D.J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81, 741-66 (2001). 3. Forman, M.S., Trojanowski, J.Q. & Lee, V.M.Y. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nature Medicine 10, 1055-1063 (2004). 4. Chiti, F. & Dobson, C.M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu Rev Biochem 75, 333-66 (2006). 5. Scott, C.P., Abel-Santos, E., Wall, M., Wahnon, D.C. & Benkovic, S.J. Production of cyclic peptides and proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13638-43 (1999). 6. Scott, C.P., Abel-Santos, E., Jones, A.D. & Benkovic, S.J. Structural requirements for the biosynthesis of backbone cyclic peptide libraries. Chem Biol 8, 801-15 (2001). 7. Link, C.D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 9368-72 (1995). 8. Wu, Y. & Luo, Y. Transgenic C. elegans as a model in Alzheimer's research. Curr Alzheimer Res 2, 37-45 (2005). 9. Link, C.D. C. elegans models of age-associated neurodegenerative diseases: lessons from transgenic worm models of Alzheimer's disease. Exp Gerontol 41, 1007-13 (2006). 10. De Felice, F.G. et al. Abeta oligomers induce neuronal oxidative stress through an N-methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism that is blocked by the Alzheimer drug memantine. J Biol Chem 282, 11590-601 (2007). 11. Wurth C, Guimard NK, Hecht MH. Mutations that reduce aggregation of the Alzheimer's Abeta42 peptide: an unbiased search for the sequence determinants of Abeta amyloidogenesis. J Mol Biol. 319, 1279-90 (2002). 12. Link, C.D. et al. Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model. Neurobiol Aging 24, 397-413 (2003).

13. Podlisny, M. B. et al. Aggregation of secreted amyloid b-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. J. Biol. Chem. 270, 9564 9570 (1995). 14. Walsh, D. M., Tseng, B. P., Rydel, R. E., Podlisny, M. B. & Selkoe, D. J. Detection of intracellular oligomers of amyloid b-protein in cells derived from human brain. Biochemistry 39, 10831 10839 (2000). ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε θερμά το Κοινωφελές Ιωάννη Σ. Λάτση για την επιχορήγηση της παρούσας ερευνητικής μελέτης στα πλαίσια των ερευνητικών μελετών 2013. Η επιχορήγηση αυτή έπαιξε καταλυτικό ρόλο στην έναρξη και επιτάχυνση της μελέτης μας και συνέβαλε στην αποτίμηση του νέου μοντέλου σάρωσης βιβλιοθηκών που ελπίζουμε να καθιερώσουμε. Σκοπεύουμε να συνεχίσουμε τη μελέτη αυτή αναζητώντας επιπλέον χρηματοδότηση που θα μας δώσει τη δυνατότητα να εξετάσουμε τη δυνατότητα εφαρμογής του μοντέλου μας και σε άλλες νευροεκφυλιστικές ασθένειες/πρωτεϊνοπάθειες.