ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΕΥΤΕΡΗΣ ΙΣΟΜΟΡΦΗΣ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ PPARα ΤΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ (Sparus aurata) 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Μπουκουβάλα Ε., Favre-Κρέη L., Κρέη Γ. Εθνικό Ίδρυμα Αγροτικών Ερευνών, Ινστιτούτο Αλιευτικής Έρευνας, Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, krey@otenet.gr, eboukouv@inale.gr Περίληψη Οι PPARs είναι μεταγραφικοί παράγοντες που ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων και διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση της ομοιόστασης των λιπιδίων. Εμφανίζονται σε τρεις τύπους: α, β και γ. Σε προηγούμενη μελέτη κλωνοποιήσαμε τα γονίδια και τα cdnas των τριών τύπων PPAR της τσιπούρας και μελετήσαμε τις ιδιότητές τους. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η ταυτοποίηση του cdna και τμήμα του γονιδίου μιας δεύτερης ισομορφής του PPARα της τσιπούρας. Η βασική διαφοροποίηση στη δομή των γονιδίων και των cdna των δυο ισομορφών του PPARα εστιάζεται στο 3 άκρο τους. Με την εφαρμογή της ποσοτικής PCR (Quantitive PCR) προσδιορίστηκε το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης των δυο ισομορφών του PPARα της τσιπούρας σε δέκα ιστούς του ψαριού. Ακόμη, παρουσιάζεται η επίδραση της διατροφικής κατάστασης στην έκφραση των mrna των δυο ισομορφών του υποδοχέα στο ήπαρ της τσιπούρας. Λέξεις κλειδιά: ποσοτική PCR, ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης, διατροφική κατάσταση. CHARACTERIZATION OF A SECOND ISOFORM OF THE NUCLEAR RECEPTOR PPARα FROM GILTHEAD SEA BREAM (Sparus aurata) Boukouvala E., Favre-Krey L., Krey G. National Agricultural Research Foundation, Fisheries Research Institute, Molecular Biology Laboratory, krey@otenet.gr, eboukouv@inale.gr Abstract PPARs are transcription factors belonging to the nuclear hormone receptors superfamily. They play an important role in lipid homeostasis regulation. They occur in three subtypes α, β and γ. In previous work we have identified the three PPAR subtypes from sea bream. In this work, we report the identification of a cdna and partial genomic sequence for a second of PPARα isoform from gilthead sea bream. The major structural differences between the two PPARα isoforms at the gene and cdna level are localized at the 3 region. Using QPCR (Quantitative real-time PCR) we determined the tissue expression profile of the two PPARα isoforms in ten sea bream tissues. Furthermore, we show that the nutritional status of sea bream affects the mrna expression levels of both PPARα isoforms in the liver. Keywords: Quantitive PCR, tissue expression profile, nutritional status. 1. Εισαγωγή Οι PPARs (Peroxisome Proliferator - Activated Receptors) είναι μεταγραφικοί παράγοντες που ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων. Στα ανώτερα σπονδυλωτά έχουν αναγνωριστεί τρεις τύποι: α, β και γ, με διαφορετικούς και διακριτούς ρόλους ο καθένας τους (Desvergne and Wahli, 1999). Οι τρεις τύποι PPAR έχουν αναγνωριστεί και στην τσιπούρα, Sparus aurata, (Leaver et al., 2005) και σε πολλά άλλα είδη ψαριών όπως το λαβράκι, Dicentrarchus labrax, (Boukouvala et al., 2004), το Takifugu rubripes (Kondo et al., 2007), το φασί του Ατλαντικού, Pleuronectus platessa, (Leaver et al., 2005) κ.ά.. Σε πολλά είδη ψαριών έχει αναφερθεί και η ύπαρξη περισσότερων ισομορφών για κάθε τύπο PPAR. Συγκεκριμένα, αναγνωρίστηκαν δυο ισομορφές του PPARα στο Fugu rubripes (Maglich et al., 2003) και δυο λειτουργικές ισομορφές για τον PPARβ στο σολομό του Ατλαντικού (Leaver et al., 2007). Η δομή των πρωτεϊνών των PPARs είναι παρόμοια με των υπολοίπων μελών της υπεροικογένει- -1172-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ας, αποτελούμενη από τέσσερις λειτουργικές περιοχές: την Α/Β περιοχή, την περιοχή C ή DBD, την περιοχή D και την LBD. Η κωδικοποιούμενη περιοχή των γονιδίων των PPARs των θηλαστικών και των αμφιβίων συνίσταται από έξι εξώνια, από τα οποία τα δύο τελευταία κωδικοποιούν την LBD περιοχή (Gottlicher et al., 1992;Krey et al., 1993; Green et al., 1995). Στην τσιπούρα, όπως και στο φασί του Ατλαντικού ο αριθμός των εξωνίων που κωδικοποιούν τους PPAR α και β, αυξάνεται σε επτά και στον PPARγ σε οκτώ, καθώς η LBD κωδικοποιείται από τρία εξώνια και τέσσερα εξώνια αντίστοιχα (Leaver et al., 2005). Οι τρεις τύποι των PPARs διαφοροποιούνται στους ιστούς των οργανισμών που εκφράζονται και στις φυσιολογικές λειτουργίες που εμπλέκονται. Ο PPARα διαδραματίζει βασικό ρόλο στον καταβολισμό των λιπαρών οξέων. Μελέτες σε διάφορα είδη σπονδυλωτών ανίχνευσαν την έκφρασή του κυρίως στους ιστούς που παρουσιάζουν υψηλή δραστικότητα της μιτοχονδριακής και υπεροξειδιοσωματικής β-οξείδωσης, όπως τα καρδιομυοκύτταρα και τα ηπατικά κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιούν τα λιπαρά οξέα ως πηγή ενέργειας (Desvergne & Wahli, 1999). Ο PPARα από την τσιπούρα και το φασί του Ατλαντικού παρουσίασε παρόμοιο πρότυπο έκφρασης με αυτό που παρατηρήθηκε στα θηλαστικά και στα αμφίβια, εκφραζόμενος κυρίως στο ήπαρ, στην καρδιά και στον ερυθρό μυ (Leaver et al., 2005). Η διατροφική κατάσταση του οργανισμού και ιδιαίτερα η νηστεία επηρεάζει την έκφραση των PPAR. Η νηστεία και η καταπόνηση (στρες) αντιπροσωπεύουν τυπικές καταστάσεις στις οποίες στο ήπαρ επάγεται η έκφραση και η μεταγραφική δραστικότητα του PPARα έχοντας ως αποτέλεσμα την επαγωγή της αποικοδόμησης των λιπαρών οξέων σε μονάδες υψηλής ενέργειας (Escher et al., 2001; Kersten et al.,1999; Leaver et al., 2005). Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται η κλωνοποίηση της LBD περιοχής του γονιδίου μιας δεύτερης ισομορφής του PPARα, καθώς και ολόκληρου του cdna του συγκεκριμένου υποδοχέα. Ακόμη, δίνονται τα αποτελέσματα της μελέτης της έκφρασης των δυο ισομορφών του PPARα σε δέκα ιστούς της τσιπούρας και της επίδρασης της διατροφικής κατάστασης στην έκφρασή τους στο ήπαρ. Διατηρώντας την ονομασία που δόθηκε στις δύο ισομορφές του PPARα στο Fugu rubripes (Maglich et al., 2003), η ισομορφή του PPARα της τσιπούρας που περιγράφεται στην παρούσα εργασία θα ονομάζεται PPARα1, ενώ αυτή που προηγούμενα περιγράψαμε (Leaver et al., 2005) PPARα2. 2.Υλικά και Μέθοδοι Γενωμικό DNA της τσιπούρας απομονώθηκε από μυϊκό ιστό με τη βοήθεια του DNeasy Tissue kit (QIAGEN). Τμήμα της LBD περιοχής του PPARα1 της τσιπούρας απομονώθηκε με PCR, με απευθείας ενίσχυσή της από το γενωμικό DNA. Στις αντιδράσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES). Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές που σχεδιάστηκαν βάση των εξελικτικά συντηρημένων αλληλουχιών των γονιδίων του PPARα1 από άλλα είδη. Το ολικό RNA που απομονώθηκε από το ήπαρ της τσιπούρας με τη βοήθεια του RNeasy Mini kit (QIAGEN), μεταγράφηκε αντίστροφα με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης Expand Reverse Transcriptase (Applied Science Roche). Το παραγόμενο cdna χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την ενίσχυση της κωδικοποιούμενης περιοχής του PPARα1, με τη βοήθεια εξειδικευμένων εκκινητών που σχεδιάστηκαν βάση των αλληλουχιών του τμήματος του γονιδίου του PPARα1 της τσιπούρας που ενισχύθηκε και του cdna του PPARα2 (GenBank/AF184170). Στις αντιδράσεις αυτές χρησιμοποιήθηκε η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση υψηλής πιστότητας Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES). Οι ενισχυμένες ακολουθίες του τμήματος του γονιδίου καθώς και του cdna του PPARα1 κλω- -1173-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ νοποιήθηκαν στο πλασμίδιο ppcr Script (Stratagene) και ακολούθησε η ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων τους. Για τη μελέτη του ιστοειδικού προτύπου των γονιδίων των δύο ισομορφών του PPARα απομονώθηκε ολικό RNA από δέκα ιστούς της τσιπούρας με τη βοήθεια της μεθόδου Single-step Guanidine Method (Chomczynski and Makey, 1995). Με την ίδια μέθοδο απομονώθηκε ολικό RNA από το ήπαρ ψαριών που διατηρούνταν στις δεξαμενές του Ινστιτούτου Αλιευτικής Έρευνας για τη μελέτη της επίδρασης της διατροφικής κατάστασης των ψαριών στην έκφραση των PPARα1 και PPARα2. Στις τσιπούρες δε χορηγήθηκε τροφή για 24h. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν τουλάχιστον τρία ψάρια από κάθε χρονική στιγμή: 1h, 3h, 5h, 8h, 12h, 24h και 72h μετά τη χορήγηση της τροφής, από τα οποία αφαιρέθηκε το ήπαρ. Ολικό RNA (1μg) από κάθε ιστό και δείγμα ήπατος μεταγράφηκε αντίστροφα με τη βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης Expand Reverse Transcriptase (Applied Science Roche). Τα παραγόμενα cdnas αραιώθηκαν σε 200μl με νερό. Η ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε 20μl τελικού όγκου, η οποία περιλάμβανε 10μl Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene) 75nM από κάθε εξειδικευμένο εκκινητή και 2μl του αραιωμένου cdna κάθε δείγματος. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στο θερμοκυκλοποιητή Mx3000P QPCR Systems (Stratagene). Η σύνθεση των εξειδικευμένων ανιχνευτών στηρίχθηκε στις αλληλουχίες των cdna του PPARα2 (GenBank /AY590299) και του PPARα1 που ενισχύθηκε. Ενισχύθηκε και τμήμα του cdna του EF1Α (GenBank /AF184170) της τσιπούρας, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως το γονίδιο μάρτυρας για τον υπολογισμό της σχετικής έκφρασης των PPARα1 και PPARα2. Μετά την πραγματοποίηση των QPCRs έγινε η αλληλούχηση των δειγμάτων με την οποία επιβεβαιώθηκε η ενίσχυση των συγκεκριμένων γονιδίων. Η σχετική έκφραση των γονιδίων υπολογίστηκε είτε με τη βοήθεια της μεθόδου «2 -ΔΔCt» (Pfaffl 2001), είτε με τη βοήθεια του λογισμικού του θερμοκυκλοποιητή στις περιπτώσεις που χρησιμοποιήθηκε ένα δείγμα που χαρακτηρίζεται ως «ρυθμιστής» (calibrator) (Livak and Schmittgen, 2001). Το «ρυθμιστή» για το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης αποτελούσε το μείγμα των cdnas που συντέθηκαν από όλους τους ιστούς της τσιπούρας που μελετήθηκαν. 3. Αποτελέσματα Αποτέλεσμα της PCR που πραγματοποιήθηκε στο γενωμικό DNA της τσιπούρας ήταν η ενίσχυση της LBD περιοχής του υποδοχέα PPARα1, μεγέθους 700bp. Η αλληλουχία αυτού του τμήματος παρουσίασε πολύ μεγάλη ομοιότητα (93%) με τις ακολουθίες της LBD περιοχής του PPARα1 του Tetraodon nigroviridis και του Fugu rubripes (η ομοπαράθεση δεν παρουσιάζεται). Διαπιστώθηκε ότι η LBD περιοχή του PPARα1 κωδικοποιείται από δύο εξώνια, σε αντίθεση με αυτή του PPARα2 που κωδικοποιείται από τρία. Συνεπώς, η δομή της LBD περιοχής του PPARα1 της τσιπούρας είναι όμοια με αυτή των θηλαστικών (Εικ.1). Εικ. 1 : Σχηματική απεικόνιση της δομής της LBD περιοχής των γονιδίων των δυο ισομορφών του υποδοχέα PPARα της τσιπούρας (SaPPARα1 και SaPPARα2) και του αρουραίου (RnPPARα). Το διάγραμμα είναι σχεδιασμένο σύμφωνα με την κλίμακα των 100ζβ που δίνεται. Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν τα εξώνια, σύμφωνα με την ακολουθία των περιοχών των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. Οι γραμμές αντιπροσωπεύουν τα ιντρόνια. -1174-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Χρησιμοποιώντας ως μήτρα το cdna που συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA από το ήπαρ της τσιπούρας, ενισχύθηκε η κωδικοποιούμενη περιοχή του PPARα1, αποτελούμενη από 1400bp. Η ομοπαράθεση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των δυο ισομορφών του PPARα της τσιπούρας έδειξε 88% ομοιότητα, παρουσιάζοντας τις μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στο 3 άκρο των γονιδίων (η ομοπαράθεση δεν παρουσιάζεται). Το πρότυπο της ιστοειδικής έκφρασης των δυο ισομορφών του υποδοχέα PPARα της τσιπούρας καθορίστηκε με QPCR. Η επιλογή των ιστών που χρησιμοποιήθηκαν βασίστηκε στα αποτελέσματα προηγούμενων εργασιών μας που είχαν καθορίσει την έκφραση των PPAR στην τσιπούρα και στο λαβράκι με τη μέθοδο RNase Protection (Boukouvala et al., 2004, Leaver et al,., 2005). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι δυο ισομορφές του PPARα στην τσιπούρα, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 2, εκφράζονται σε όλους σχεδόν τους ιστούς που εξετάστηκαν. Ο PPARα2 εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στο ήπαρ, στην καρδιά, στον ερυθρό μυ, στα βράγχια και στον εγκέφαλο, ενώ ο PPARα1 στο λεπτό έντερο και στο λίπος. Εικ. 2: Πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης των δυο ισομορφών του υποδοχέα PPARα στην τσιπούρα, όπως καθορίστηκε με QPCR. Οι ιστοί που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: Η: ήπαρ, K: καρδιά, ΛΜ: λευκός μυς, ΕΜ: ερυθρός μυς, Β: βράγχια, Ν: νεφρά, Ε: εγκέφαλος, Σ: σπλήνα, ΛΕ: λεπτό έντερο (κοντά στο τυφλό έντερο) και Λ: λίπος (μεσεντέριο). Στο διάγραμμα φαίνεται η σχετική έκφραση του κάθε υποδοχέα ως προς την έκφραση του γονιδίου μάρτυρα (EF1A) σε κάθε ιστό, όπως υπολογίστηκε τελικά βάση της σχετικής έκφρασης του «ρυθμιστή» δείγματος (calibrator) το οποίο αποτελούσε το μείγμα των cdnas από τους δέκα ιστούς της τσιπούρας που μελετήθηκαν. Ο αστερίσκος υποδηλώνει τις στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0.05) στην έκφραση των δυο ισομορφών του PPARα στους ιστούς, όπως υπολογίστηκε με t-test. Οι PPARs διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων γι αυτό είναι σημαντική και η μελέτη της επίδρασης της διατροφής στην έκφρασή τους και ιδιαίτερα σε ιστούς που σχετίζονται άμεσα με τη διατροφή, όπως το ήπαρ (Escher et al., 2001; Kersten et al., 1999). Ο PPARα2, όπως φαίνεται στην Εικόνα 3 Α, παρουσιάζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης την 1h μετά τη χορήγηση της τροφής, τα οποία σταδιακά μειώνονται μέχρι τις 12h. Η έκφραση του επανέρχεται στα αρχικά επίπεδα στις 24h. Η έκφραση του PPARα1 (Εικ.3 Β) φαίνεται να είναι σχετικά χαμηλή την 1h μετά τη χορήγηση της τροφής, η οποία τείνει να αυξάνεται και στη συνέχει να παρουσιάζει μια κάμψη, αλλά τελικά να σταθεροποιείται σε επίπεδα υψηλότερα από αυτά της 1h. -1175-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 3: Επίδραση της διατροφικής κατάστασης στην έκφραση Α: του PPARα2 και Β: του PPARα1 στο ήπαρ της τσιπούρας, όπως καθορίστηκε με QPCR. Στα διαγράμματα φαίνεται η σχετική έκφραση του κάθε υποδοχέα στις διαφορετικές ώρες μετά τη χορήγηση της τροφής. Η έκφραση των υποδοχέων που δίνεται στα διαγράμματα είναι σχετική ως προς την έκφραση του γονιδίου μάρτυρα (EF1A). Η τιμή 1 έχει δοθεί στη σχετική έκφραση που παρουσίασε κάθε ισομορφή του υποδοχέα κατά την 1h. Ο αστερίσκος υποδηλώνει ποιες χρονικές στιγμές παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05) από την έκφραση που παρουσίασε κατά την 1h κάθε ισομορφή του PPARα, όπως υπολογίστηκε με t-test. 4. Συζήτηση Η δομή της LBD περιοχής του PPARα1 της τσιπούρας διαφοροποιείται από αυτή του PPARα2. Η LBD περιοχή του PPARα1 παρουσιάζει παρόμοια δομή με αυτή των θηλαστικών και των αμφιβίων (Gottlicher et al., 1992; Krey et al., 1993; Green et al., 1995), κωδικοποιούμενη από δύο εξώνια. Ο αριθμός των εξωνίων που κωδικοποιούν την LBD περιοχή φαίνεται να αποτελεί χαρακτηριστικό στοιχείο της διαφοροποίησης των δυο ισομορφών του PPARα στα ψάρια, καθώς και οι LBD περιοχές του PPARα1 από το Tetraodon nigroviridis (emb.scaf13731) και το Fugu rubripes (fr087148 και fr074673) επίσης κωδικοποιούνται από δύο εξώνια σε αντίθεση με την LBD περιοχή του PPARα2. Η σύγκρισης της αμινοξικής ακολουθίας της LBD περιοχής του PPARα1 της τσιπούρας, με τις αντίστοιχες αλληλουχίες που έχουν απομονωθεί από άλλα είδη ψαριών, όπως το λαβράκι, το Tetraodon nigroviridis και το Fugu rubripes έδειξε υψηλό ποσοστό ομοιότητας (>90%). Η σύγκριση των αλληλουχιών της LBD περιοχής του PPARα1 των παραπάνω ειδών με την αλληλουχία της LBD περιοχής του PPARα2 από τη τσιπούρα έδειξε 79% ομολογία. Η βασική διαφοροποίηση τους εντοπίζεται στην έλλειψη 19 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο της LBD περιοχής του PPARα1 σε όλα τα είδη που εξετάστηκαν (αποτελέσματα δεν παρουσιάζονται). Η μελέτη της έκφρασης του PPARα1 στους ιστούς της τσιπούρας έδειξε ότι εκφράζεται σε όλους τους ιστούς που μελετήθηκαν και ιδιαίτερα στο λεπτό έντερο, στο ήπαρ, στην καρδιά, στα βράγχια και στον εγκέφαλο. Τα επίπεδα της σχετικής έκφρασης του, όπως φαίνεται και στην Ειόνα.2 είναι γενικά χαμηλότερα από αυτά του PPARα2, με εξαίρεση αυτή που παρατηρήθηκε στο λεπτό έντερο και στο λίπος. Στην τσιπούρα η στέρηση της τροφής έχει σαν αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του PPARα2 στο ήπαρ (Leaver et al., 2005). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνεται και με τη χρησιμοποίηση QPCR αντιδράσεων στην παρούσα εργασία, όπου η έκφραση του PPARα2 είναι ιδιαίτερα αυξημένη στην 1h και στις 24h μετά τη χορήγηση της τροφής. Βάση αυτών φαίνεται ότι και στα ψάρια, όπως και στα θηλαστικά, ο PPARα2 παίζει ρόλο στη ρύθμιση του καταβολισμού των λιπαρών οξέων, ελέγχοντας την οξείδωσή τους στο ήπαρ (Kersten et al., 1999). Το πρότυπο έκφρασης του PPARα1 φαίνεται να διαφοροποιείται, καθώς η έκφραση του τείνει να αυξάνεται κατά τις πρώτες ώρες μετά τη χορήγηση τροφής. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα σε συνδυασμό με την ιδιαίτερα αυξημένη έκφραση του υποδοχέα στο λεπτό έντερο (Εικ.2), πιθανόν να υποδεικνύουν την εμπλοκή του PPARα1-1176-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ στη διαδικασία της πέψης. Περαιτέρω μελέτες των δυο λειτουργικών περιοχών του PPARα1 θα συμβάλλουν στη διασαφήνιση του ρόλου του στη φυσιολογία της τσιπούρας. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Booukouvala, E., Antonopoulou, E., Favre-Krey, L., Diez, A., Bautista, J.M., Leaver, M.J., Tocher, D.R. & Krey G., 2004. Molecular characterization of three peroxisome proliferator-activated receptors from the sea bass (Dicentrarchus labrax). Lipids, 39 (11): 1085-1092. Chomczynski, P., Makey, K., 1995. Substitution of chloroform by bromochloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem., 225:163-164. Desvergne, B. & Wahli, W., 1999. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: Nuclear Control of Metabolism. Endocrine Rev., 20 (5): 649-688. Escher, P., Braissant, O., Basu, M.S., Michalik, L., Wahli, W. & Desvergne, B., 2001. Rat PPARs: Quantitative Analysis in Adult Rat Tissues and Regulation in Fasting and Refeeding. Endocrinology, 142 (10): 4195-4202. Gottlicher, M., Widmark, E., Li, Q. & Gustafsson, J.A., 1992. Fatty acids activate a chimera of the clofibric acid-activated receptor and the glucocorticoid receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 4653-4657. Greene, M.E., Blumberg, B., McBride, O.W., Yi, H.F., Kronquist, K., Kwan, K., Hsieh, L., Green, G. & Nimer, S.D., 1995. Isolation of the human peroxisome proliferator activated receptor gamma cdna: expression in hematopoietic cells and chromosomal mapping. Gene Expr., 4: 281-299. Kersten, S., Seydoux, J., Peters, J.M. & Gonzalez, F.J., Desvergne B., Wahli W., 1999. Peroxisome proliferator-activated receptor α mediates the adaptive response to fasting. J. Clin. Invest., 103 (11): 1489-1498. Kondo, h., Misaki, R., Gelman, L. & Watabe, S., 2007. Ligand dependend transcriptional activities of four torafugu pufferfish Takifugu rubripes peroxisome proliferator-activated receptors. General and Comparative Endocrinology, 154Q120-127. Krey, G., Keller, H., Mahfoudi, A., Medin, J., Ozato, K., Dreyer, C. & Wahli, W., 1993. Xenopus peroxisome proliferator activated receptors: genomic organization, response element recognition, heterodimers formation with retinoid X receptor and activation by fatty acids. J Steroid Biochem Mol Biol., 47 (1-6): 65-73. Leaver, M.J., Boukovala, E., Antonopoulou, E., Diez, A., Favre-Krey, L., Ezaz, M.T., Bautista, J.M., Tocher, D.R. & Krey, G., 2005, Endocrinology, Three peroxisome proliferator-activated receptor isotypes from each of two species of marine fish. 146 (7): 3150-3162. Leaver, M.J., Tariq Ezaz, M., Fontagne, S., Tocher, D.R., Boukouvala, E. & Krey, G., 2007. Multiple peroxisome proliferatoractivated receptor β subtypes from Atlantic salmon (Salmo salar). Journal of Molecular Endocrinology, 38: 391-400. Livak, K.J. & Schmittgen, T.D., 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 -ΔΔCt method. Methods, 25: 402-408. Maglich, J.M., Caravella, J.A., Lambert, M.H., Willson, T.M., Moore, J.T. & Ramamurthy, L., 2003. The first completed genome sequence from a teleost fish (Fugu rubripes) adds significant diversity to the nuclear receptor superfamily. Nucleic Acids Res, 31 (14): 4051-4058. Pfaffl, M,W., 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acid Research, 29: E45. -1177-