Ιστολυτική αμοιβάδα (Entamoeba Histolytica) IgG ELISA

Ιστολυτική αμοιβάδα (Entamoeba Histolytica) IgG ELISA Ανοσοενζυμικός ποιοτικός προσδιορισμός ΙgG αντισωμάτων έναντι Entamoeba histolytica στον ανθρώπινο ορό Μόνο για την in-vitro διαγνωστική χρήση Αριθμός προϊόντων: ENTG0140 (96 προσδιορισμοί) 1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝA 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΦΑΛΜΑ! ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΟΡΙΣΤΕΙ ΣΕΛΙΔΟΔΕΙΚΤΗΣ. 2. ΠΡΟΟΡΙΣΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 3 3. ΑΡΧΗ ΤΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 3 4. ΥΛΙΚΑ 3 4.1. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΉΡΙΑ 3 4.2. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ 3 4.3. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΕΞΟΠΛΙΣΜΌΣ 4 5. ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ 4 6. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 4 6.1. ΕΠΙΣΤΡΩΜΕΝΕΣ ΑΠΟΣΠΩΜΕΝΕΣ ΛΟΥΡΙΔΕΣ (SNAP-OFF STRIPS) 4 6.2. ΕΝΖΥΜΙΚΟΣ ΙΧΝΗΘΕΤΗΣ ΙGG ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ENTAMOEBA HISTOLYTICA 4 6.3. ΕΛΕΓΧΟΙ 4 6.4. ΑΡΑΙΩΤΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ IGG 4 6.5. ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΣΗΣ (20XCONC.) 4 6.6. ΔΙΑΛΥΜΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΆΤΩΝ TMB 4 6.7. ΔΙΑΛΥΜΑ ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΥ 4 7. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ 4 7.1. ΑΡΑΙΩΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ 4 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 4 8.1. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΊΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 4 8.2. ΜΈΤΡΗΣΗ 5 9. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5 9.1. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΠΟΔΕΚΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 5 9.2. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΌΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΆΤΩΝ 5 9.3. ΕΡΜΗΝΕΊΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΆΤΩΝ 5 9.3.1. ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ ΣΕ ΜΟΝΑΔΕΣ NOVATEC 5 10. ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ 6 10.1. ΑΚΡΊΒΕΙΑ 6 10.2. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ 6 10.3. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΊΑ 6 11, ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 6 12. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ 6 13. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 6 14. ΚΩΔΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΓΕΛΙΑΣ ΣΦΑΛΜΑ! ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΟΡΙΣΤΕΙ ΣΕΛΙΔΟΔΕΙΚΤΗΣ. 2

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ H Entamoeba histolytica είναι ένα παράσιτο αναερόβιων οργανισμών, το οποίο δημιουργεί κύστεις με τέσσερις μικρούς πυρήνες και διάμετρο 10-15 µm. Οι κύστεις είναι εξαιρετκά ανθεκτικές και αντέχουν σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες. Μετά την κατάποση από ένα ξενιστή (ασπόνδυλα και σπονδυλωτά συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων), το τοίχωμα του διακόπτεται από το σχηματισμό ενός μικρού ανοίγματος μέσω του οποίου προκύπτει η αμοιβάδα ( amoeba). H Amoeba διαιρείται σε τρεις κύκλους και δημιουργεί τελικά οκτώ μονοπυρηνικούς τροφοζωιτές (uninucleate trophozoites) από μια κινητή κύστη με διάμετρο 20-30 µm. Μερικοί από τους τροφοζωιτές εισβάλλουν αργότερα στους ιστούς του παχέως εντέρου και μπορούν να το διαβρώσουν τόσο πολύ έτσι ώστε να εισχωρήσουν στην κυκλοφορία του αίματος. Κατά συνέπεια, οι αμοιβάδες μπορούν να φτάσουν σε όλα τα μέρη του σώματος. Η μόλυνση με την ιστολυτική αμοιβάδα έχει παγκόσμια κατανομή. Είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της αμοιβάδωσης (aemobiasis) και της αμοιβαδικής δυσεντερίας (amoebic dysentery) και εποικεί τον αυλό και τη βλενογόνο του παχέως εντέρου και κυρίως το εγκάρσιο κόλο και το τυφλό. Η εξωεντερική αμοιβάδωση μπορεί να εισχωρήσει σε οποιοδήποτε όργανο ή ιστό. Η πλειοψηφία των μολυσμένων ατόμων είναι χωρίς συμπτώματα έτσι ώστε αυτή η υψηλή συχνότητα των ασυμπτωματικών φορέων περιπλέκει την κατάσταση. Εκείνα τα άτομα, τα οποία είναι συμπτωματικά υφίστανται ένα ευρύ φάσμα εκδηλώσεων της λοίμωξης. Η ιστολυτική αμοιβάδα μολύνει τα άτομα ανεξάρτητα ηλικίας και φύλου. Ο κίνδυνος μόλυνσης αυξάνεται με τις ανεπαρκείς υγειονομικές συνθήκες. Η αμοιβάδωση εμφανίζεται με αυξανόμενο ρυθμό στους ανθρώπους με γεωργικά επαγγέλματα, στους ομοφυλοφίλους και σε όλα τα άλλα άτομα με υψηλό κίνδυνο έκθεσης στην ασθένεια.. Είδη Ασθένεια Συμπτώματα Μηχανισμός της λοίμωξης Ιστολυτική Αμοιβάδα (Entamoeba Histolytica) Aμοιβάδωση Δυσεντερία Αμοιβαδικό απόστημα ήπατος, Απόστημα εγκεφάλου Ηπατική αμοιβάδωση Καρκίνωμα παχέως εντέρου Διάρροια ελκώδη κολίτιδα κοιλιακές κράμπες, κόπρανα με αίμα, δυσεντερία Μετάδοση μέσω κοπράνων ή των μολυσμένων τροφίμων/νερού από στοματική κατάποση των κύστεων Σεξουαλική μετάδοση μεταξύ ομοφυλόφιλων Η μόλυνση μπορεί να προσδιοριστεί με: Μικροσκόπηση εξέταση : iron haematoxylin method, merthiolat iod formol concentration (MIFC) Serology : ανίχνευση αντισωμάτων μέσω CF., CIE, ELISA 2. ΠΡΟΟΡΙΣΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το NovaTec Entamoeba histolytica IgG ELISA προορίζεται για τον ποιοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων IgG έναντι αντιγόνων Entamoeba histolytica στον ανθρώπινο ορό. Ιδιαίτερα, μπορούν να προσδιοριστούν οι ασυμτωματικοί φορείς και οι περιπτώσεις μιας προηγούμενης μη-εισβάλουσας αμοιβάδωσης. 3. ΑΡΧΗ ΤΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ Ο ανοσοενζυμικός ποιοτικός προσδιορισμός των αντισωμάτων IgG έναντι Entamoeba histolytica βασίζεται στη τεχνική ELISA (Enzyme-linkedimmunosorbent assay). Μέσω αυτής της διαδικασίας μπορουν να ανιχνευθούν ιδιαίτερα ασυμπτωματικοί φορείς καθώς και περιπτώσεις προηγούμενων λοιμώξεων με ιστολυτική αμοιβάδα. Tα βυθίσματα των λουρίδων (microtiter strips) είναι επιστρωμένα με αντιγόνα Entamoeba histolytica για να δεσμεύσουν τα αντίστοιχα αντισώματα του δείγματος. Μετά την έκπλυση των βυθισμάτων, έτσι ώστε να αφαιρεθούν τα μη δεσμευμένα δείγματα, προστίθεται ενζυμικός ιχνηθέτης IgG αντισωμάτων συνεζευγμένος με horseradish peroxidase (HRP). Ο ενζυμικός ιχνηθέτης δεσμεύει τα συνεζευγμένα αντισώματα.έναντι Entamoeba histolytica. Στη συνέχεια το άνοσο σύμπλεγμα γίνεται ορατό με την προσθήκη του υποστρώματος τετραμέθυλοβενζινιδίνης (Tetramethylbenzidine-TMB) που δίνει ένα προϊόν αντίδρασης μπλε χρώματος. Η ένταση του χρώματος του προϊόντος αντίδρασης είναι ανάλογη προς το ποσό των αντισωμάτων IgG έναντι Entamoeba histolytica στο δείγμα. Το θειικό οξύ προστίθεται για να τερματίσει την αντίδραση και παράγει τελικώς κίτρινο χρώμα. Η απορροφητικότητα στα 450 nm μετριέται χρησιμοποιώντας το ELISA Microwell Reader. 4. ΥΛΙΚΑ 4.1. Παρεχόμενα αντιδραστήρια Βυθίσματα επιστρωμένα με Entamoeba histolytica (IgG): 12 αποσπώμενα strips των 8 βυθισμάτων επιστρωμένα με το αντιγόνο του Entamoeba histolytica, στεγανοποιημένα σε κενό αέρος, με επανασφαλιζόμενο σκεύασμα αλουμινίου. Αραιωτικό δειγμάτων IgG***: 1 φιαλίδιο περιέχει 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος (buffer) για την αραίωση του δείγματος. ph 7,2 ± 0,2, χρώμα κίτρινο, έτοιμο για χρήση, άσπρο καπάκι. Διάλυμα τερματισμού: 1 φιαλίδιο περιέχει 15 ml. θειικού οξέος, 0,2 mol/l, έτοιμο για χρήση, κόκκινο καπάκι. Διαλυμα έκπλυσης (20x συμπυκνωμένο.) *: 1 φιαλίδιο περιέχει 50 ml. ενός 20 φορές συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος (ph 7,2 ± 0.2) για την έκπλυση των βυθισμάτων, άσπρo καπάκι. Ενζυμικός ιχνηθέτης Protein A αντισωμάτων- igg έναντι Entamoeba histolytica**: 1 φιαλίδιο περιέχει 20 ml. Perixidase protein A. χρώμα κόκκινο, έτοιμο για χρήση, μαύρο καπάκι. Διάλυμα υποστρωμάτων TMB: 1 φιαλίδιο περιέχει 15 ml. 3,3',5,5'-τετραμέθυλοβενζινιδίνη (TMB) έτοιμο για χρήση, κίτρινο καπάκι. Θετικός ορός ελέγχου αντισωμάτων IgG έναντι Entamoeba histolytica ***: 1 φιαλίδιο περιέχει 2 ml. χρώμα κίτρινο, έτοιμο για χρήση κόκκινο καπάκι. Αρνητικός ορός ελέγχου αντισωμάτων IgG έναντι Entamoeba histolytica ***: 1 φιαλίδιο περιέχει 2 ml. χρώμα κίτρινο, έτοιμο για χρήση, μπλε καπάκι. * περιέχει 0,01% Thimerosal μετά την αραίωση ** περιέχει 0,5% Thimerosal *** περιέχει 0.02% Thimerosal 4.2. Παρεχόμενα υλικά 1 Βάση των strips 2 αυτοκόλλητες διαφάνειες ως κάλυμα 1 Πρωτόκολλο εξέτασης 1 σχέδιο κατανομής και προσδιορισμού 3

4.3. Απαιτούμενα υλικά και εξοπλισμός ELISA Microwell Plate Reader, για τη μέτρηση της απορροφητικότητας στα 450/620nm Επωαστικός θάλαμος στους 37 C Χειρωνακτικός ή αυτόματος εξοπλισμός για τις εκπλύσεις των βυθισμάτων Πιπέτες (10 και 1000 µl) Μίξερ για ανακάτεμα των διαλυμάτων (Vortex) Απεσταγμένο νερό Σωληνάρια μίας χρήσης Χρονόμετρο 5. ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Τα αντιδραστήρια είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που δηλώνεται στην ετικέτα όταν αποθηκεύονται στους 2... 8 C. 6. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Είναι πολύ σημαντικό να τοποθετηθούν όλα τα αντιδραστήρια, τα δείγματα και οι οροί ελέγχου σε θερμοκρασία δωματίου (20... 25 C) πρίν αρχίσει η δοκιμαστική διαδικασία! 6.1. Επιστρωμένα αποσπώμενα strips Τα έτοιμα για χρήση αποσπώμενα strips είναι επιστρωμένα με αντιγόνο Entamoeba histolytica. Αποθήκευση στους 2... 8 C. Τα strips είναι στεγανοποιημένα. Αμέσως μετά την αφαίρεση των strips, τα υπόλοιπα strips πρέπει να ξανασφραγιστούν στο σκεύασμα αλουμινίου μαζί με το υλικό ξύρανσης (disseccant) και να αποθηκευτούν στους 2... 8 C. Σταθερότητα: μέχρι την ημερομηνία λήξης. Σταθερότητα μετά την πρώτη χρήση: μέχρι την ημερομηνία λήξης με την προυπόθεση οτι αποθηκεύονται στους 2... 8 C. 6.2. Ενζυματικός ιχνηθέτης Protein A αντισωμάτων IgG έναντι Entamoeba histolytica Το φιαλίδιο περιέχει 20ml ενός διαλύματος Protein A συνεζευγμένων με horseradish peroxidase, ρυθμιστικό διάλυμα, τους σταθεροποιητές, τα συντηρητικά και μια αδρανής κόκκινη χρωστική ουσία. Το διάλυμα είναι έτοιμο για χρήση. Αποθήκευση στους 2... 8 C. Σταθερότητα μετά την πρώτη χρήση: μέχρι την ημερομηνία λήξης με την προυπόθεση οτι αποθηκεύεται στους 2... 8 C. 6.3. Οροί ελέγχου Τα φιαλίδια ονομαζόμενα ως θετικός και αρνητικός ορός έλεγχου περιέχουν ένα διάλυμα ελέγχου έτοιμο για χρήση με 0,1% Kathon και πρέπει να αποθηκευτούν στους 2... 8 C. Σταθερότητα μετά την πρώτη χρήση: μέχρι την ημερομηνία λήξης με την προυπόθεση οτι αποθηκεύοται στους 2... 8 C. 6.4. Αραιωτικό δειγμάτων IgG Το φιαλίδιο περιέχει 100ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού οξέος (phosphatebuffer), τους σταθεροποιητές, τα συντηρητικά και μια αδρανής κίτρινη χρωστική ουσία. Το περιεχόμενο αυτού του φιαλιδίου χρησιμοποιείται για τη διάλυση του δείγματος του ασθενούς. Το έτοιμο για χρήση διάλυμα πρέπει να αποθηκευτεί στους 2... 8 C. Σταθερότητα μετά την πρώτη χρήση: μέχρι την ημερομηνία λήξης με την προυπόθεση οτι αποθηκεύεται στους 2... 8 C. 6.5. Διάλυμα έκπλυσης (20xconc.) Το φιαλίδιο περιέχει 50ml ενός συγκεντρωμένου ρυθμιστικού διαλύματος, καθαριστικά (detergents), σταθεροποιητές και συντηρητικά. Αραίωση του διαλύματος έκπλυσης 1+19, π.χ. 10 ml. διαλύματος έκπλυσης + 190 ml. απεσταγμένου νερού. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διαλύμα θα κρατήσει για τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες εάν αποθηκεύτει στους 2...8 C. Θερμαίνοντας στους 37 C με χλιαρό νερό μπορούν να εξαφανιστούν ενδεχόμενοι εμφανιζόμενοι κρύσταλλοι. 6.6. Διάλυμα υποστρωμάτων TMB Το φιαλίδιο περιέχει 15ml ενός συστήματος τετραμεθυλοβενζινιδίνης/υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το αντιδραστήριο είναι έτοιμο για χρήση και πρέπει να αποθηκευτεί στους 2... 8 C, μακρυά από το φως. Το διάλυμα θα πρέπει να είναι άχρωμο ή να έχει μια απαλή γαλάζια απόχρωση. Εάν το διάλυμα αποκτήσει έντονο μπλε χρώμα, τότε υπάρχει περίπτωση να έχει επιμολυνθεί και δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί, οπότε και αντικαθίσταται. Σταθερότητα μετά την πρώτη χρήση: μέχρι την ημερομηνία λήξης με την προυπόθεση οτι αποθηκεύεται στους 2... 8 C. 6.7. Διάλυμα τερματισμού Το φιαλίδιο περιέχει 15ml 0,2 δια;λύματος θειικού οξέος (R 36/38, S 26). Το έτοιμο για χρήση διάλυμα πρέπει να αποθηκευτεί στους 2... 8 C. Σταθερότητα μετά την πρώτη χρήση: μέχρι την ημερομηνία λήξης με την προυπόθεση οτι αποθηκεύεται στους 2... 8 C. 7. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Χρήση δειγμάτων aνθρώπινου ορού: Εάν ο προσδιορισμός πραγματοποιηθεί μέσα σε 24 ώρες μετά από τη συλλογή των δειγμάτων, το δείγμα πρέπει να κρατηθεί στους 2... 8 C διαφορετικά πρέπει να αποθηκευτούν σε χαμηλή θερμοκρασία (-20 σε -70 C). Εάν τα δείγματα αποθηκευτούν σε χαμηλή θερμοκρασία, τότε θα πρέπει πριν τον προσδιορισμό να ξεπαγώσουν και να ανακατευτούν καλά. Αποφύγετε το επαναλαμβανόμενο πάγωμα και ξεπάγωμα. 7.1. Αραίωση δειγμάτων Πρίν τον προσδιορισμό, όλα τα δείγματα πρέπει να αραιωθούν 1+63 με αραιωτικό δειγμάτων IgG. Αραιώστε 5µl δείγμα και 315μl αραιωτικό δειγμάτων IgG στα σωληνάρια για να δημιουργήσετε μια αραίωση 1+63 και αναμίξτε με το Vortex. Οι θετικοί και αρνητικοί oροί ελέγχου είναι έτοιμοι για χρήση και δε χρειάζονται αραίωση. 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 8.1. Προετοιμασία εξέτασης Παρακαλώ διαβάστε το πρωτόκολλο εξέτασης προσεκτικά πρίν πραγματοποιήσετε τον προσδιορισμό. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από την ακριβή εφαρμογή των όσων περιγράφονται στο πρωτόκολλο εξέτασης. Πριν την πραγματοποίηση του προσδιορισμού, πρέπει το σχέδιο κατανομής και προσδιορισμού για όλα τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου να σημειωθεί προσεκτικά στο φύλλο αποτελεσμάτων που παρέχεται στο kit. Επιλέξτε τον απαραίτητο αριθμό microtiter strips ή βυθισμάτων και τοποθετήστε τα στη βάση. Παρακαλώ χρησιμοποιήστε τουλάχιστον: 1 βύθισμα (π.χ. Α1) ως το τυφλό βύθισμα (blank well) στο οποίο θα μπει μόνο το υπόστρωμα (substrate blank) 2 βυθίσματα (π.χ. B1+C1) για τον αρνητικό έλεγχο και 4

1 βύθισμα (π.χ. D1) για το θετικό έλεγχο. Συνιστάται να καθοριστούν οι έλεγχοι και τα δείγματα των ασθενών εις διπλούν, εάν είναι απαραίτητο. Εκτελέστε όλα τα βήματα του προσδιορισμού με τη σειρά στην οποία δίνονται χωρίς οποιεσδήποτε καθυστερήσεις μεταξύ των βημάτων. Ένα καθαρό, μίας χρήσης ρύγχος πιπέτας ( pipette tip) πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την κατανομή κάθε ελέγχου και δείγματος. Ρυθμίστε τον επωαστήρα στους 37 ± 1 C. 1. Κατανέμετε από 100µl ορού ελέγχου και αραιωμένου δείγματος στα αντίστοιχα βυθίσματα τους. Αφήστε το βύθισμα Α1 για να χρησιμοποιηθεί ως το τυφλό βύθισμα, στο οποίο θα μπει μόνο το υπόστρωμα.. 2. Καλύψτε τα βυθίσματα με τις αυτοκόλλητες διαφάνειες που παρέχονται στο kit. 3. Επωάστε για 1 ώρα ± 5 λεπ. στους 37±1 C. 4. Όταν ολοκληρωθεί η επώαση, αφαιρέστε τη διαφάνεια και αναρροφήστε το περιεχόμενο των βυθισμάτων. Στη συνέχεια πραγματοποιήστε έκπλυση κάθε βυθίσματος τρεις φορές με 300µl του διαλύματος έκπλυσης. Αποφύγετε την υπερχείλιση των διαλυμάτων στα βυθίσματα. Το χρονικό διάστημα μεταξύ δύο κύκλων έκπλυσης πρέπει να είναι > 5sec. Μετά τις εκπλύσεις αναποδογυρίστε τα βυθίσματα με το χείλος προς τα κάτω σε απορροφητικό χαρτί και τινάξτε τα απαλά έτσι ώστε οποιαδήποτε περίσσεια υγρού να απορροφηθεί. Σημείωση: Το στάδιο της έκπλυσης είναι κρίσιμο! Η ανεπαρκής έκπλυση οδηγεί σε ανακρίβεια και λανθασμένες υψωμένες τιμές απορροφητικότητας. 5. Κατανέμετε 100µl ενζυμικού ιχνηθέτη σε όλα τα βυθίσματα εκτός του τυφλού βυθίσματος (π.χ. Α1). Καλύψτε με αυτοκόλλητη διαφάνεια. 6. Επωάστε για 30 λεπ. σε θερμοκρασία δωματίου. Μην εκθέσετε στο άμεσο ηλιακό φως. 7. Επαναλάβετε το βήμα 4. 8. Κατανέμετε 100µl διαλύματος υποστρωμάτων TMB σε όλα τα βυθίσματα 9. Επωάστε για ακριβώς 15 λεπ. σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. 10. Κατανέμετε 100µl διαλύματος τερματισμού σε όλα τα βυθίσματα, με την ίδια σειρά και τον ίδιο ρυθμό κατανομής όπως και για τα διαλύματα υποστρωμάτων TMB. Οποιάδήποτε μπλε απόχρωση που αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια της επώασης μετατρέπεται σε κίτρινο χρώμα. Σημείωση: τα ιδιαίτερα θετικά δείγματα ασθενών μπορούν να προκαλέσουν την εμφάνιση σκούρων χρωμογόνων ιζημάτων! Αυτά τα ιζήματα μπορούν να επηρεάσουν την ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας.έτσι, στην περίπτωση αυτή συνιστάται αραίωση του δείγματος με φυσιολογικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου, παραδείγματος χάριν 1+1 καθώς και αραίωση του δείγματος 1+63 με ρυθμιστικό διάλυμα. Στο τέλος πολλαπλασιάζετε το αποτέλεσμα σε μονάδες ΝovaTec (ΝΤU) με τον παράγοντα 2. 11 Μετρήστε την απορροφητικότητα του δείγματος στα 450/620nm μέσα σε 30 λεπ. μετά την προσθήκη του διαλύματος τερματισμού. 8.2. Μέτρηση Μηδενίστε το ELISA Microwell Plate Reader χρησιμοποιώντας το τυφλό υπόστρωμa στο βύθισμα Α1. Εάν - λόγω τεχνικών λόγων -το ELISA Reader δεν μπορέσει να μηδενιστεί χρησιμοποιώντας το τυφλό υπόστρωμα στο βύθισμα Α1, αφαιρέστε την τιμή απορροφητικότητας του βυθίσματος Α1 από τις υπόλοιπες μετρήσεις απορροφητικότητας προκειμένου να επιτευχθούν αξιόπιστα αποτελέσματα! Μετρήστε την απορροφητικότητα όλων των βυθισμάτων στα 450 nm και καταγράψτε τις τιμές απορροφητικότητας για κάθε έλεγχο και δείγμα ασθενούς στο σχέδιο κατανομής και προσδιορισμού. Ως μήκος κύματος αναφοράς συστήνεται να χρησιμοποιηθούν τα 620 nm. (Διχρωματική Μέτρηση) Σε περίπτωση πολλαπλών μετρήσεων χρησιμοποιήστε τις μέσες τιμές απορροφητικότητας των τιμών που καταγράφηκαν. 9. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 9.1. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Για να θεωρηθεί ένας προσδιορισμός έγκυρος, θα πρέπει να πληρούνται τα ακόλουθα κριτήρια: Τυφλό υπόστρωμα στο Α1: τιμή απορροφητικότητας μικρότερη από 0.100. Αρνητικός έλεγχος στο B1 και C1: τιμή απορροφητικότητας μικρότερη από 0.300. Θετικός έλεγχος στο D1: τιμή απορροφητικότητας ίση ή μεγαλύτερη από την τιμή cut-off.. 9.2. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων Η τιμή cut-off υπολογίζεται από την πρόσθεση 0,30 μονάδων απορροφητικότητας στην κατεγραμένη μέση τιμή απορρόφησης των δύο αρνητικών ελέγχων. Παράδειγμα: 0,12 OD αρνητικός έλεγχος. + 0,14 OD αρνητικός έλεγχος. = 0,26 2 = 0,13 Cut-off = μέση τιμή απορροφητικότητας των αρνητικών ελέγχων + 0,30 Cut-off = 0,13 + 0,30 = 0,43 9.3. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Τα δείγματα θεωρούνται ΘΕΤΙΚΑ εάν η τιμή απορροφητικότητας είναι μεγαλύτερη από το 10% του cut-off. Τα δείγματα με μια τιμή απορροφητικότητας 10% πάνω ή κάτω από τo cut-off δεν πρέπει να θεωρηθούν ως σαφώς θετικά ή αρνητικά. γκρίζα ζώνη Συστήνεται να επαναληφθεί η εξέταση 2-4 εβδομάδες αργότερα με φρέσκα δείγματα. Εάν τα αποτελέσματα στη δεύτερη εξέταση είναι πάλι στην γκρίζα ζώνη το δείγμα πρέπει να θεωρηθεί ΑΡΝΗΤΙΚΟ. Τα δείγματα θεωρούνται ΑΡΝΗΤΙΚΑ εάν η τιμή απορροφητικότητας είναι μικρότερη από 10% κάτω από το cut-off. 9.3.1. Αποτελέσματα σε μονάδες NovaTec (NovaTec Units) Μέση τιμή απορροφητικότητας ασθενούς x 10 = [ NovaTec-Units = NTU ] Cut-off Παράδειγμα: 1.376 X 10 = 32 NTU (μονάδες NovaTec) 0,43 Cut-off: 10 NTU Γκρίζα ζώνη: 9-11 NTU Αρνητικό: < 9 NTU Θετικό: > 11 NTU 5

10. ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΗΚΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ 10.1. Ακρίβεια Interassay n Μέση τιμή CV(%) Θετικός ορός 6 0,604 3,9 Intraassay n Μέση τιμή CV (%) Θετικός. ορός 7 0,609 2,1 10.2. Κλινική ειδικότητα Η κλινική ειδικότητα ορίζεται ως η πιθανότητα της εξέτασης να παρουσιαστεί αρνητικό αποτέλεσμα ελλείψει του συγκεκριμένου αναλυτή. ( >95%) 10.3. Κλινική ευαισθησία. Η κλινική ευαισθησία ορίζεται ως η πιθανότητα της εξέτασης να παρουσιαστεί θετικό αποτέλεσμα υπό την παρουσία του συγκεκριμένου αναλυτή. ( >95%) 11. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η βακτηριδιακή μόλυνση ή οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι παγώματος-ξεπαγώματος του δείγματος μπορεί να έχουν επιπτώσεις στις τιμές απορροφητικότητας. Η διάγνωση μιας λοιμώδους ασθένειας δεν πρέπει να βασιστεί σε ένα μόνο αποτέλεσμα της εξέτασης. Μια ακριβής διάγνωση βασίζεται επίσης στο ιστορικό του ασθενούς, στη συμπτωματολογία όπως και στα εργαστηριακά αποτελέσματα. Η εξέταση έχει περιορισμένη αξία σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς και σε νεογέννητα. 12. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ Μόνο για την in-vitro διαγνωστική χρήση. Όλα τα συστατικά ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αυτών των αντιδραστηρίων έχουν ελεγθεί για την ενδεχόμενη παρουσία αντισωμάτων anti-hiv, αντισωμάτων anti-hcv και HBsAg και έχουν βρεθεί αρνητικά Εντούτοις, όλα τα υλικά πρέπει να θεωρούνται και να αντιμετωπίζονται ως ενδεχομένως μολυσματικά. Μη μπερδέψετε τα αντιδραστήρια ή τα strips των διαφορετικών kits. Κανένα αντιδραστήριο άλλων κατασκευαστών δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί με τα αντιδραστήρια των συγκεκριμένων kits. Μην χρησιμοποιήσετε τα αντιδραστήρια μετά από την ημερομηνία λήξης που δηλώνεται στην ετικέτα. Χρησιμοποιήστε καθαρά ρύγχοι πιπετών, καθαρούς κατανομείς (dispensers), και επίσης καθαρά υλικά εργαστηρίων. Μη μπερδέψετε τα βιδωτά καπάκια των φιαλιδίων των διάφορων αντιδραστηρίων έτσι ώστε να αποφύγετε ενδεχόμενη μόλυνση. Κλείστε τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων αμέσως μετά τη χρήση για να αποφύγετε την εξάτμιση και τη μικροβιακή μόλυνση. Μετά το πρώτο άνοιγμα και την επακόλουθη αποθήκευση ελέγξτε πριν την επόμενη χρήση τα φιαλίδια του ενζυμικού ιχνηθέτη και τους ορούς ελέγχου για ενδεχόμενη μικροβιακή μόλυνση. Για να αποφευχθούν μόλυνση και λανθασμένα, υψηλά αποτελέσματα πιπετάρετε τα δείγματα των ασθενών και κατανέμετε τον ενζυμικό ιχνηθέτη ακριβώς στο κατώτατο σημείο των βυθισμάτων. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Το Bronidox L δεν εμφανίζει κανένα τοξικολογικό κίνδυνο κατά την επαφή με το δέρμα και τις βλεννογόνους στις συγκεντρώσεις, στις οποίες χρησιμοποιείται! ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Το θειικό οξύ μπορεί να έχει επιπτώσεις σε μάτια και δέρμα. Κρατήστε το μακριά απο παιδιά. Κατά την επαφή με τα μάτια, ξεπλύνετε με νερό και συμβουλευτείτε ένα γιατρό! 13. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Patterson, M. et al. Serologic Testing of Amebiasis. Gastroenterology. 78:136, 1980 Healy, G. Laboratory Diagnosis of Amebiasis. Bull NY Acad Med. 47:478, 1971 Healy,G. Immunologic Tools in the Diagnosis of Amebiasis: Epidemiology in the united states. Rev Infect Diseases. Vol.8, 2:228, 1986 Walsh, J. Problems in Recognition and Diagnosis of Amebiasis: Estimation of the Global Magnitude of Morbidity and Mortality. Rev Infect Diseases. Vol.8, 2:228, 1986 14. ΚΩΔΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΓΕΛΙΑΣ Prod. No.: ENTG0140 Entamoeba histolytica IgG-ELISA (96 Determinations) 6

ΣΧΕΔΙΟ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Entamoeba histolytica IgG- Elisa Προετοιμασία εξέτασης Προετοιμάστε τα αντιδραστήρια και τα δείγματα όπως περιγράφεται. Δημιουργήστε το σχέδιο κατανομής και προσδιορισμού για όλα τα δείγματα και τους ελέγχους στο φύλλο αποτελέσματος που παρέχεται στο kit. Επιλέξτε τον απαραίτητο αριθμό microtiter strips ή βυθισμάτων και τοποθετήστε τα στη βάση. Αρνητικός ορός ελέγχου Θετικός ορός ελέγχου Δείγμα (αραιωμένο 1+ 63) Τυφλό υπόστρωμα (π.χ. Α1) Διαδικασία προσδιορισμού Αρνητικός έλεγχος Θετικός έλεγχος Δείγμα (αραιωμένο 1+100) - 100µl - - - - 100µl - - - - 100µl Καλύψτε τα βυθίσματα με τις αυτοκόλλητες διαφάνειες που παρέχονται στο kit Επωάστε για 1 ώρα στους 37 C Πραγματοποιήστε έκπλυση τρεις φορές με 300µl του διαλύματος έκπλυσης Ενζυμικός ιχνηθέτης - 100µl 100µl 100µl Καλύψτε τα βυθίσματα με τις αυτοκόλλητες διαφάνειες που παρέχονται στο kit Επωάστε για 30 λεπ. σε θερμοκρασία δωματίου Πραγματοποιήστε έκπλυση τρεις φορές με 300µl του διαλύματος έκπλυσης Υπόστρωμα TMB 100µl 100µl 100µl 100µl Επωάστε για ακριβώς 15 λεπ. στη θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι Διάλυμα τερματισμού 100µl 100µl 100µl 100µl Φωτομετρική μέτρηση στα 450 nm (μήκος κύματος αναφοράς: 620 nm) NovaTec Immundiagnostica GmbH Technologie & Waldpark Waldstr. 23 A6 D-63128 Dietzenbach, Germany Tel.: +49 (0) 6074-48760 Fax: +49 (0) 6074-487629 Email : info@novatec-id.com Internet: www.novatec-id.com E-0140G-8/2002-BMT 7