ΠΕΡΙΠΛΟΚΕΣ ΣΤΗΝ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ

ΠΕΡΙΠΛΟΚΕΣ ΣΤΗΝ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ

ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΟΤΗΤΑ E +S ES E +P από τα ισοζύγια μάζας και χρησιμοποιώντας την υπόθεση ψευδομόνιμης κατάστασης για το ενδιάμεσο σύμπλοκο v ds dt dp dt v ms s v mp p K s K p 1+ s + p K s K p

v ds dt dp dt v ms s v mp p K s K p 1+ s + p K s K p Η εξίσωση ανάγεται στην έκφραση Michaelis-Menten για s=0 ή για p=0. Οι κινητικές σταθερές v ms, K s και v mp, Κ p δεν είναι παρά ο μέγιστος ρυθμός αντίδρασης και η σταθερά κορεσμού των δύο μεταξύ τους αντίστροφων ενζυμικών αντιδράσεων S P και P S, αντίστοιχα. Για τον προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων διεξάγουμε δύο σετ από πειράματα προσδιορισμού του αρχικού ρυθμού, αρχίζοντας με p=0 για το ένα σετ και με s=0 για το άλλο.

ΠΟΛΛΑΠΛΑ ΕΝΔΙΑΜΕΣΑ E +S (ES) 1 (ES) 2... (ES) n E +P Ισχύει η Michaelis-Menten με: v max k e 2 0 n 1 1 k i 2 i K m k k 1 2 n 1 1 k 1 k i 2 i Οι παραπάνω σχέσεις περιπλέκονται σημαντικά αν οι πιο πάνω αντιδράσεις είναι επί πλέον και αντιστρεπτές.

ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΔΥΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ Οι περισσότερες αντιδράσεις στην πραγματικότητα ανήκουν σ' αυτή την κατηγορία, αλλά λόγω του ότι το ένα από τα δύο υποστρώματα συνήθως είναι το νερό, που βρίσκεται σε περίσσεια, μπορούμε με ασφάλεια να τις θεωρήσουμε ως απλές αντιδράσεις. Το 1963 ο Clealand εισήγαγε μία γενική διαδικασία για την εύρεση της κατάλληλης κινητικής έκφρασης για ένα σύστημα ενζυμικών αντιδράσεων με πολλαπλά υποστρώματα και ένα κομψό τρόπο παράστασης των διαφόρων δικτύων. 4 μηχανισμοί

Clealand S P E ES E

Μηχανισμός Πινγκ-Πονγκ: A P B Q E EA EA EA B E v v m a 0 b 0 K m,b a 0 K m,a b 0 a 0 b 0

Μηχανισμός Διαδοχής: A B P Q E EA EAB EPQ EQ E v v m a 0 b 0 K m,a K m,b K m,b a 0 K m,a b 0 a 0 b 0

Μηχανισμός Thorell-Chance : A B P Q E EA EQ E v v m a 0 b 0 K m,a K m,b K m,b a 0 K m,a b 0 a 0 b 0

Μηχανισμός Τυχαίας Γρήγορης Ισορροπίας: A B P Q EA EQ E EAB EPQ E EB EP B A Q P v v m a 0 b 0 K A K B K B a 0 K A b 0 a 0 b 0

Προσδιορισμός μηχανισμού Οι εκφράσεις των ρυθμών για τους τρεις τελευταίους μηχανισμούς είναι ουσιαστικά οι ίδιες. Άρα είναι αδύνατο να προσδιορίσει κανείς τον μηχανισμό με βάση τα αρχικά δεδομένα και μόνο Η χρήση ισοτόπων έχει καταστήσει δυνατή τον προσδιορισμό του ακριβούς μηχανισμού γι' αυτές τις περιπτώσεις.

ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΥΝΕΝΖΥΜΟΥ το ένζυμο δεν βρίσκεται σε ενεργό μορφή, αλλά απαιτεί την παρουσία άλλης ουσίας που ονομάζεται συνένζυμο. Ο μηχανισμός που θεωρούμε είναι ως εξής: A +C AC E E +S ES E +P Τότε: v ke 0 cs cs K s (c K c )

ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΑΠΟ ΤΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ η εξάρτηση του ρυθμού της ενζυμικής αντίδρασης από τη συγκέντρωση του υποστρώματος δεν είναι πάντα όπως προβλέπεται από την έκφραση Michaelis-Menten αλλά ενός εκ των δύο τύπων: v v v max v max ( ) s ( ) s ενεργοποίηση παρεμπόδιση

Τόσο η ενεργοποίηση όσο και η παρεμπόδιση παρατηρούνται συνήθως όταν το ένζυμο έχει πάνω από ένα σημείο προσκόλλησης για το υπόστρωμα οπότε η προσκόλληση του δεύτερου μορίου είναι ευκολότερη ή δυσκολότερη από του πρώτου. Αυτή την κατάσταση την περιγράφουμε με την ακόλουθη σειρά αντιδράσεων: S +E (ES) 1 E +P (ES) 1 +S (ES) 2 (ES) 1 +P

Ο ρυθμός της συνολικής ενζυμικής αντίδρασης παίρνει την μορφή: v k 1 s K 1 k 2 s 2 K 1 K 2 s2 1 s K 1 K 1 K 2 e 0 όπου τα k 1 και k 2 είναι οι κινητικές σταθερές των δύο αντιδράσεων που παράγουν προϊόν και Κ 1 και Κ 2 είναι οι σταθερές ισορροπίας των δύο αντιδράσεων συμπλοκοποίησης.

v k 1 s K 1 k 2 s 2 K 1 K 2 1 s K 1 s2 K 1 K 2 e 0 k 1 και k 2 είναι οι κινητικές σταθερές των δύο αντιδράσεων που παράγουν προϊόν Κ 1 και Κ 2 είναι οι σταθερές ισορροπίας των δύο αντιδράσεων συμπλοκοποίησης. Όταν k 2 < k 1 η έκφραση παρουσιάζει μέγιστο (παρεμπόδιση), ενεργοποίηση παρατηρείται (σημείο καμπής) όταν k 2 > k 1 και k 2 K 2 k 1 K 1

ΠΟΛΛΑΠΛΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΔΡΩΝΤΑ ΣΕ ΕΝΑ ΕΝΖΥΜΟ Όταν στο διάλυμα περιέχονται περισσότερα από ένα υποστρώματα συνήθως παρατηρείται ανταγωνισμός για τα μόρια του ενζύμου. Στην πιο απλή περίπτωση ας θεωρήσουμε την ύπαρξη δύο υποστρωμάτων τα οποία αντιδρούν σύμφωνα με τις αντιδράσεις: E +S 1 (ES 1 ) E +S 2 (ES 2 ) (ES 1 ) E +P 1 (ES 2 ) E +P 2

Σ' αυτή την περίπτωση διακρίνουμε δύο συνολικές αντιδράσεις, μία για το κάθε υπόστρωμα με ρυθμό v i όπου: ds i dt v i k i e 0 s i K i 1 s 1 K 1 s 2 K 2 Κ i η σταθερά ισορροπίας της αντίστοιχης αντίδρασης συμπλοκοποίησης k i οι κινητικές σταθερές των αντιδράσεων παραγωγής προϊόντων Αν ορίσουμε s T s 1 s 2

v T ds T dt s k 1 s 1 k 2 2 K 1 K 2 1 s 1 K 1 s 2 K 2 e 0 v max s T K m s T Δεν μπορούμε να θεωρήσουμε το άθροισμα των δύο υποστρωμάτων ως ένα μοναδικό υπόστρωμα. Κλασσικό παράδειγμα οι αντιδράσεις αποπολυμερισμού (αποδόμησης πολυμερών)

ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Παρεμποδιστής: ένωση που επηρεάζει είτε παροδικά είτε μόνιμα την ενεργότητα των ενζύμων Η αντιστρεπτή παρεμπόδιση αποτελεί και τον βασικό μηχανισμό ρύθμισης της ενζυμικής ενεργότητας των μεταβολικών αντιδράσεων παρεμπόδιση μη ομοιοπολική ομοιοπολική ανταγωνιστική μη ανταγωνιστική ανανταγωνιστική

ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ Το είδος μπορούμε να το προσδιορίσουμε από διάγραμμα Lineweaver-Burk. Ανάλογα με την συγκέντρωση του παρεμποδιστή: ανταγωνιστική παρεμπόδιση: επηρεάζεται μόνο η κλίση της ευθείας μη ανταγωνιστική παρεμπόδιση: επηρεάζεται μόνο η αποτέμνουσα ανανταγωνιστική παρεμπόδιση: επηρεάζονται και η κλίση και η αποτέμνουσα

Aνταγωνιστική παρεμπόδιση Ο παρεμποδιστής αντιδρά μόνο με το ελεύθερο ένζυμο E + S ES E +I EI E + P Θεωρώντας την συγκέντρωση του ΕΙ αμελητέα σε σχέση με την ολική συγκέντρωση i 0 του παρεμποδιστή, και γρήγορη ισορροπία για την αντίδραση συμπλοκοποίησης του παρεμποδιστή έχουμε: K i e i 0 (ei) και τελικά: v v max s s K m 1 i 0 K i

v v max s s K m 1 i 0 K i 1 v 1 s

Mη ανταγωνιστική παρεμπόδιση Ο παρεμποδιστής αντιδρά μόνο με το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος καθιστώντας το ανενεργό σύμφωνα με τον μηχανισμό: E +S ES E +P ES +I ESI Αν οι σταθερές ισορροπίας για τις αντιστρεπτές αντιδράσεις είναι Κ m και Κ I : v v max 1 i 0 /K i s K m 1 i 0 /K i s

v v max 1 i 0 /K i s K m 1 i 0 /K i s 1 v 1 s

Ανανταγωνιστική παρεμπόδιση τόσο το Ε όσο και το ES αντιδρούν με τον παρεμποδιστή I με την ίδια ευχέρεια. το E και το EI αντιδρούν με το υπόστρωμα S με την ίδια ευχέρεια To ESI είναι ανενεργό. E + S ES E + P E +I EI EI +S ESI ES +I ESI v v max 1+ i 0 K i s s+k m

v v max 1+ i 0 K i s s+k m 1 v 1 s

ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ μόνιμοι ομοιοπολικοί δεσμοί με το ένζυμο δεσμεύοντάς το κατ' αυτό τον τρόπο αναντίστρεπτα, σύμφωνα με την αντίδραση: E + I EI η παρουσία του παρεμποδιστή επηρεάζει τον μέγιστο ρυθμό της αντίδρασης και όχι την σταθερά κορεσμού, η παρατηρούμενη επίδραση σε διάγραμμα Lineweaver-Burk δεν διαφέρει από την συμπεριφορά στην περίπτωση της ανανταγωνιστικής παρεμπόδισης. Για να μπορέσουμε να ξεχωρίσουμε τις δύο περιπτώσεις πρέπει να μελετήσουμε την εξάρτηση του μέγιστου ρυθμού από την ολική συγκέντρωση του ενζύμου.

ανανταγωνιστική παρεμπόδιση: η ευθεία στο διάγραμμα v max ως προς e o περνάει πάντοτε από την αρχή των αξόνων ομοιοπολική παρεμπόδιση: μετατοπίζεται παράλληλα με μετατόπιση που εξαρτάται από την συγκέντρωση του παρεμποδιστή, μια και η αρχική ποσότητα ενζύμου αντιδρά με τον παρεμποδιστή αναντίστρεπτα αντί να χρησιμοποιηθεί για την ενζυμική αντίδραση app v max e 0

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph Το ph επηρεάζει την ενεργότητα των ενζύμων λόγω της ύπαρξης πολλών ομάδων που υπόκεινται σε ιοντισμό. Η μεταβολή του ph έχει τρία βασικά αποτελέσματα στα ένζυμα. 1. η (αντιστρεπτή) μεταβολή της στερεομετρίας, που επηρεάζει τον μέγιστο ρυθμό αντίδρασης 2. η μεταβολή στη συγγένεια δέσμευσης μεταξύ υποστρώματος και ενζύμου, που επηρεάζει την σταθερά κορεσμού. 3. η αναντίστρεπτη μεταβολή της ευστάθειας του ενζύμου (μετουσίωση), που συμβαίνει για ακραίες τιμές του ph, είτε πολύ μεγαλύτερες είτε πολύ μικρότερες από το βέλτιστο, και που επηρεάζει και τις δύο κινητικές σταθερές. Η γενική εξάρτηση της ενεργότητας και της ευστάθειας ενός ενζύμου από το ph παρουσιάζουν μέγιστο σε κάποια συγκεκριμένη τιμή που ονομάζεται βέλτιστο ph.

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph ph

Απλοποιημένο σχήμα: H 2 E H 2 ES K 1,e K 1,es S +HE K 2,e E 2 k 1 k 1 HES K 2,es ES 2 HE P το ένζυμο (ανάλογα με το ph) μπορεί να βρίσκεται σε τρεις καταστάσεις ιοντισμού (Η 2 Ε, ΗΕ - και Ε 2- ) από τις οποίες μόνο η ενδιάμεση ΗΕ - θεωρείται ενεργός k 2

v max v max 1 K 2,es [H + ] [H+ ] K 1,es K m K 1 2,e [H + ] [H+ ] K K 1,e m 1 K 2,es [H + ] [H+ ] K 1,es K m K m ph opt log 10 K 1,es K 2,es

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ Kατά τρεις διαφορετικούς τρόπους: 1. στην τιμή της σταθεράς Κ m 2. στην κινητική σταθερά k 2 3. μετουσίωση του ενζύμου

Επίδραση της θερμοκρασίας στην τιμή της σταθεράς Κ m Θεωρώντας την ίση με την σταθερά ισορροπίας της αντίδρασης συμπλοκοποίησης, η επίδραση της θερμοκρασίας εξαρτάται από το αν η συμπλοκοποίηση ενζύμου-υποστρώματος είναι ενδόθερμη ή εξώθερμη. K m e S 0 0 R H RT όπου ΔS 0 η μεταβολή εντροπίας και ΔH 0 ο θερμοτονισμός της αντίδρασης συμπλοκοποίησης. ενδόθερμες αντιδράσεις συμπλοκοποίησης (ΔH 0 >0): αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί σε αύξηση της σταθεράς κορεσμού το αντίθετο συμβαίνει για εξώθερμες αντιδράσεις συμπλοκοποίησης

Επίδραση της θερμοκρασίας στην κινητική σταθερά k 2 k 2 Ae E a RT

Επίδραση της θερμοκρασίας σε μετουσίωση του ενζύμου E E * όπου Ε* είναι μη ενεργός μορφή του ενζύμου. Εάν θεωρήσουμε ότι η αντίδραση αυτή έχει σταθερά ισορροπίας Κ d, και ότι το ολικό ένζυμο είναι e 0, τότε η συγκέντρωση του ενεργού ενζύμου θα δίνεται από την σχέση: Τελικά e 0 e 1 exp S d R H d RT v max Te T 1 e T

v max Te T 1 e T lnv max H R E R 1 T

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΑΠΟ ΤΗΝ ΙΟΝΤΙΚΗ ΙΣΧΥ n 1 2 M i Z i 2 i 1 όπου M i και Z i η μοριακότητα και η απόλυτη τιμή του φορτίου του ιόντος i, αντίστοιχα. Η ιοντική ισχύς Ω μπορεί να επηρεάσει είτε θετικά είτε αρνητικά την ενεργότητα του ενζύμου.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΑΠΟ ΤΗΝ ΔΙΑΤΜΗTIKH ΤΑΣΗ

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Σε ακραίες περιπτώσεις τα ένζυμα μετουσιώνονται χάνοντας την στερεομετρία τους με αναντίστρεπτο τρόπο. E a E i Θεωρώντας αντίδραση πρώτης τάξης με σταθερά k d, η συγκέντρωση του ενεργού ενζύμου E a σε κλειστό σύστημα θα μεταβάλλεται σύμφωνα με την σχέση: e a (t) e a (0)e k d t Για ένα σύστημα ενζυμικής αντίδρασης στο οποίο παρατηρείται αναντίστρεπτη απενεργοποίηση του ενζύμου έχουμε τις εξής ταυτόχρονες αντιδράσεις: E a +S E a S E a +P E a E i

v k 2 e a,tot s K m s όπου e a,tot e a (e a s) είναι το ολικό ενεργό ένζυμο το οποίο μεταβάλλεται χρονικά σύμφωνα με την σχέση: de a,tot dt k d e a,tot 1 s K m Άρα η ενζυμική μετατροπή του υποστρώματος και η απενεργοποίηση του ενζύμου είναι στενά αλληλοεξαρτώμενες.