ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ : ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Γεώργιος Θ. Τσάγκαρης, PhD Ερευνητική Μονάδα Πρωτεωµικής
Γένωµα v/s Πρωτέωµα κ.λ.π. Γέν-ωµα (γίνοµαι + -ωµα) Μεταγράφηµα (transcriptome) Πρωτέ-ωµα (πρωτεΐνη + -ωµα) Μεταβόλ-ηµα (µεταβολίτης + -ωµα) κ.λ.π. Το µεταγράφηµα, το πρωτέωµα, το µεταβόληµα κ.λ.π. είναι δυναµικά και µεταβάλλονται κάθε στιγµή σαν αποτέλεσµα της αλληλεπίδρασης των βιολογικών συστηµάτων µε το περιβάλλον τους, λόγω της επίδρασης εξωγενών παραγόντων ή παθολογικών καταστάσεων.
Genomics vs. Proteomics Same genome......different proteomes
Proteome (protein + genome) Total protein complement of a genome. Πρωτέ-ωµα (πρωτεΐνη + -ωµα = σύνολο) Πρωτεωµική-Proteomics Αναφέρεται στο σύνολο των τεχνολογιών της µελέτης των πρωτεϊνών, των µετα-µεταφραστικών τους αλλαγών και των αλληλεπιδράσεων τους µε απώτερο στόχο την κατανόηση πολύπλοκων βιολογικών φαινοµένων.
The Human Proteome The human genome comprises about 30 000 genes The proteome of an individual at a given time point may comprise about 100 000 gene products The proteome of an individual during the entire life may comprise about 1 000 000 gene products The proteome of all human species may comprise up to about 10 000 000 gene products
Πρωτεωµική Ανάλυση πολύπλοκων µιγµάτων πρωτεϊνών Ταυτοποίηση και το χαρακτηρισµό των πρωτεϊνών/ πρωτεωµικού περιεχοµένου Τη διαφορική ανάλυση των πρωτεϊνών σε µεγάλο αριθµό δειγµάτων Ποσοτική µέτρηση των πρωτεϊνών ενός δείγµατος Την ανάλυση και επεξεργασία των αποτελεσµάτων-βιοπληροφορική
Η πρωτεωµική συµπληρώνει τα δεδοµένα από την ανάλυση του γωνιδιώµατος ποιές πρωτεϊνες παράγονται και πού σε τι ποσότητες κάτω από ποιές συνθήκες πως τα επίπεδα των πρωτεϊνών στα βιολογικά υλικά µεταβάλονται σαν αποτέλεσµα παθολογικών καταστάσεων
2D gel electrophoresis (gel dependent) Proteomic Analysis Protein Separation Gel free methods Protein Identification Mass Spectrometry MALDI-TOF-TOF LC-MS/MS Tandem MS (Qq-TOF) SELDI N-terminal Sequencing Amino Acid Composition Analysis Bioinformatics
Workflow in Proteomics 2D GEL DEPENDENT METHODS Sample Preparation (protein extraction, fractionation) Two-dimensional Electrophoresis (isoelectric focusing, SDS-PAGE) Spot excision (manually, automatically) In-gel Digestion Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS, Ion Trap, Qq-TOF) Protein Identification (changes, modifications) Data Storage
Αρχές ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων Ηλεκτρικό φορτίο (Ιsoelectric point) Το µοριακό βάρος (MW) (i) Διαχωρισµό των πρωτεϊνών µε βάση το φορτίο τουςισοηλεκτρική εστίαση (isoelectric focusing). (ii) Διαχωρισµό των εστιασµένων πρωτεϊνών µε βάση το µοριακό τους βάρος.
Proteins carry positively and negatively charged side groups and are amphoteric molecules. The protein charge depends on the ph of the solution. The proteins extracted in a denaturing solution (sample buffer) SAMPLE BUFFER [Urea (7M), Thiourea (2M), CHAPS (4%), DTE (10mM), Protease and Phosphatase inhibitors]
Workflow in Proteomics SAMPLE PREPARATION BIOLOGICAL MATERIALS Solid materials (cells, tissues, biopsies etc) Biological fluids (plasma, serum, urines, amniotic fluid etc) Homogenization (pressure, sonication, liquid nitrogen etc) High protein conc. (plasma, serum) Low protein conc. (urines, amniotic fluid) Subcellular fractionation SAMPLE BUFFER [Urea (7M), Thiourea (2M), CHAPS (4%), DTE (10mM), Protease and Phosphatase inhibitors] Sample concentration (ultra filtration, precipitation) Protein extraction Protein Fractionation Protein Dialysis
Ισοηλεκτική εστίαση - πρώτη διάσταση (Isoelectric focusing, IEF) Η ΙΗΕ είναι µία διαδικασία εξισορόπησης, κατά τη διάρκεια της οποίας κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου υψηλού δυναµικού, οι πρωτεΐνες κινούνται ανάλογα µε το ηλεκτρικό τους φορτίο κατά µήκος ενός διαφορικού ph, ως το σηµείο που αποφορτίζονται και ακινητοποιούνται (ισοηλεκτρικό σηµείο).
ph 3 4 5 6 7 8 9 10
Steps in the preparation of 2D electrophoresis Second Dimension Preparation of gels of the desired acrylamide concentration Reduction and alkylation of proteins on IPG strip (equilibration of strip with reducing and alkylating agents) Application of the strip on the acrylamide gel
Steps in the preparation of 2D electrophoresis Manipulation of the gel Protein fixing and staining (fixation of proteins within the gel and staining with silver or Coomassie blue etc) Strip Acidic region Basic region High MW proteins Acryl. Gel Low MW proteins
Spot excision
Workflow in Proteomics Sample Preparation (protein extraction, fractionation) Two-dimensional Electrophoresis (isoelectric focusing, SDS-PAGE) Spot excision (manually, automatically) In-gel Digestion Enzymatic cleavage (trypsin, chemotrypsin etc) Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS, Ion Trap, Qq-TOF) Peptides Protein Identification (changes, modifications) Data Storage
MALDI TOF-TOF MS-MS
MALDI ToF MS
Spectrum derived from MALDI-MS analysis of a tryptic digest protein spot Intens. [a.u.] x10 4 3.0 A24_45% _23_5_05 R efl 50x\0_A24\1\1S R ef R aw 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 m/z
Πεπτιδικό αποτύπωµα
Peak Identification [Abs. Int. * 1000] 2146.152 339-358 45.0 42.5 40.0 37.5 35.0 32.5 30.0 27.5 25.0 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 1067.503 46-53 1051.500 46-53 947.563 148-155 1172.652 240-251 1094.635 378-386 1251.605 513-524 1242.613 366-377 1206.553 733-741 1329.682 454-465 1540.795 96-109 1446.808 324-336 1645.793 754-766 1629.798 754-766 1556.847 639-651 1578.787 530-543 1711.812 600-614 1695.911 218-231 1815.788 678-693 1810.977 296-312 1799.792 678-693 1823.935 600-615 1923.943 568-584 2109.956 66-83 2318.274 366-386 2272.142 257-277 2185.928 192-210 2171.941 714-732 2170.110 26-45 2162.134 339-358 2518.416 616-638 2498.270 466-487 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 m/z Peptide Mass Fingerprint (PMF) Protein Identification
ph 1 st Dimension IsoElectric Focusing (IEF) Gradient Strips 3 4 5 6 7 8 9 10 broad range ph 4 5 6 7 narrow range ph 5 6 very narrow range Increased Resolution and Detection of More Spots with the Use of Narrow ph IPG Strips
Human Amniotic Fluid analysis on IPG stips 3-10 and 4-7 ph (1 mg total protein) 4 pi 7 3 pi 18cm 18cm 10
High abundant protein depletion (-98%) Enrichment of low abundance proteins
Plasma before Albumin and IgG Removal A S P Plasma after High Abundance Protein Removal with beads A S S P
Πλεονεκτήµατα της ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση εκατοντάδων άγνωστων πρωτεϊνικών µορίων. Εφαρµόζεται σε όλα τα είδη βιολογικών δειγµάτων. Επιτρέπει την ανίχνευση µετα-µεταγραφικών µεταβολών. Επιτρέπει την µέτρηση της ποσότητας και της µεταβολής στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών. Μειονεκτήµατα Ανιχνεύει κυρίως τις υδρόφιλες πρωτεΐνες µε pi 3-10 και µοριακό βάρος 10-180 kda. Ανιχνεύει κυρίως της σχετικά υψηλής αφθονίας πρωτεΐνες.
GEL FREE METHODS Shotgun proteomics, Bottom-UP and Top-Down LC/MS/MS and Multi-dimensional Protein Identification Technology (MudPIT) Protein microarrays
GEL FREE METHODS Principles of LC MS/MS
Mass spectrometer Nano LC Orbitrap
Principles of LC MS/MS
Πρωτεϊνικές Μικροσυστοιχίες (Protein microarrays)
Πρωτεϊνικές Μικροσυστοιχίες (Protein microarrays)
Πλεονεκτήµατα των gel-free µεθόδων Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση εκατοντάδων άγνωστων πρωτεϊνικών µορίων. Εφαρµόζεται σε όλα τα είδη βιολογικών δειγµάτων. Επιτρέπει την ανίχνευση µετα-µεταγραφικών µεταβολών. Μειονεκτήµατα Δυσκολία στη µέτρηση της ποσότητας και της µεταβολής στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών. Τεράστιος όγκος αποτελεσµάτων.
ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ Αναφέρεται στην µελέτη της δράσης οποιασδήποτε διαταραχής σε επίπεδο οργανισµού, ιστού ή κυττάρου που έχει σαν αποτέλεσµα µεταβολή στην πρωτεϊνική έκφραση. Λεπτοµερής ανάλυση του πρωτεϊνικού περιεχόµενου των προς µελέτη δειγµάτων και σύγκρισή τους µε στόχο την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που µεταβάλλονται στο ένα δείγµα σε σχέση µε το άλλο. ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ Προσεγγίσεις Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων Μεθόδους ανεξάρτητες ηλεκτροφόρησης
Διαφορική πρωτεωµική (Differential Proteomics) Ανίχνευση βιολογικών δεικτών Normal Plasma kda Hepatocellular carcinoma in hepatitis C-related cirrhosis kda 70 70 4 50 10 9 8 50 3 2 30 11 7 6 30 1 5 3 pi 10 3 pi 10 2D gels stained with coomasie blue
Differential Proteomics DiGE method Control Treated Samples were stained with Cy3 or Cy5 fluorescent dye, mixed and co-separated with 2Delectrophoresis Cy3 Label Cy5 Cy3 Mix 2-D co-separation Imaging Cy5 Cy3 + Cy5
General idea of gel free labeling methods Sample 1 Sample 2 Labeling Labeling Stable isotope labeling methods Mixing Enzymatic digestion (Trypsin) Isotope-Coded Affinity Tagging (ICAT) Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (itraq) Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC) LC/MS/MS In the LC, labeled and unlabeled peptides co-eluted Relative abundance Normal ( 12 C) Disease ( 13 C) m/z
Stable isotope labeling methods - Isotope-Coded Affinity Tagging (ICAT) - Hydrogen vs deuterium (8 Da separation) - 13 C vs 12 C (9 Da separation) - Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (itraq) - Four isobaric reagents - Compare quantity of reporter molecule in MS/MS - Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC) - Cell growth in stable isotope-enriched media ( 13 C Glucose, 15 N Ammonium, 2 H Water)