ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑΣ Ι. ΠΟΥΛΛΗ ΧΗΜΙΚΟΥ

ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑΣ Ι. ΠΟΥΛΛΗ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΒΡΩΣΙΜΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΚΛΑΣΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ 180 160 140 120.-. 100 d 80 60 40 20 300 400 500 600 700 λ (nm) ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΓΕΝΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΘΗΝΑ 2009

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΓΕΝΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑΣ Ι. ΠΟΥΛΛΗ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΒΡΩΣΙΜΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΑ ΣΥΓΧΡΟΝΗΣ ΣΑΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΚΛΑΣΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κ. ΓΕΩΡΓΙΟΥ (Αναπλ. Καθηγητής Γ.Π.A., Επιβλέπων) Μ. ΠΟΛΥΣΙΟΥ (Καθηγητής Γ.Π.A., Μέλος) Γ. ΜΟΥΣΔΗΣ (Ερευνητής B' E.I.E., Μέλος) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΒΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κ. ΓΕΩΡΓΙΟΥ (Αναπλ. Καθηγητής Γ.Π.A.) Μ. ΠΟΛΥΣΙΟΥ (Καθηγητής Γ.Π.A.) Γ. ΜΟΥΣΔΗΣ (Ερευνητής B' E.I.E.) Σ. ΧΑΡΟΥΤΟΥNΙΑΝ (Καθηγητής Γ.Π.A.) Μ. ΚΩΜΑΙΤΗΣ (Καθηγητής Γ.Π.A.) B. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ (Καθηγήτρια Γ.Π.A.) Π. ΤΑΡΑΝΤΙΛΗΣ (Επικ. Καθηγητής Γ.Π.A.) ΑΘΗΝΑ 2009

ΠΕΡΙΛΗΨΗ H φθορισμομετρία έχει ευρεία εφαρμογή στην ανάλυση οργανικών ενώσεων στον τομέα των φαρμάκων, τροφίμων και τον περιβάλλοντος. Σε αντίθεση με τις δονητικές φασματοσκοπικές τεχνικές και τη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. έχει υψηλή ευαισθησία και χαμηλό όριο ανίχνεύσης. H φθορισμομετρία μειονεκτεί σε περιπτώσεις όπου τα δείγματα περιέχουν πολλές φθορίζονσες ουσίες λόγω αλληλοεπικαλύψεων των φασμάτων διέγερσης και εκπομπής. Στην περίπτωση αυτή απαιτείται διαχωρισμός. Εναλλακτικά είναι δυνατή η χρήση της τεχνικής φθορισμομετρίας σύγχρονης σάρωσης. Στην τεχνική αυτή οι δύο μονοχρωμάτορες διέγερσης και εκπομπής σαρώνονται ταυτόχρονα ενώ διατηρείται σταθερή η διαφορά τον μήκους κύματος διέγερσης και εκπομπής, Δλ. Με την κατάλληλη επιλογή του Δλ επιτυγχάνεται μείωση τον εύρους των κορυφών και απλοποίηση του φάσματος εκπομπής. Με την τεχνική αυτή μειώνονται οι αλληλεπικαλύψεις των φασμάτων και μπορεί να αποφευχθεί το στάδιο του διαχωρισμού. Στη διατριβή αυτή παρουσιάζονται νέες φασματοσκοπικές μέθοδοι εκτίμησης ποιότητας και αυθεντικότητας παρθένου ελαιολάδου με τη βοήθεια χημειομετρικών μεθόδων. Γίνεται επίσης παρακολούθηση διάφορων βρώσιμων ελαίων κατά την θερμική καταπόνηση ή και ακτινοβολία UV και τα αποτελέσματα συγκρίνονται με τις κλασσικές μεθόδους προσδιορισμού οξειδωτικής κατάστασης. H ερευνητική εργασία αποτελείται από τις ακόλουθες ενότητες: (α) Μελέτη αντιοξειδωτικών ουσιών ελαιολάδου (κεφάλαιο 4): Μελετήθηκε η μεταβολή των φασμάτων διέγερσης, εκπομπής και φθορισμού σύγχρονης σάρωσης διαφόρων αντιοξειδωτικών ουσιών (καφεϊκό, πρωτοκατεχουικό, π-κονμαρικό, γαλλικό, φερουλικό οξύ, τυροσόλη, υδροξντυροσόλη και λοντεολίνη) με την αλλαγή τον ph. Παρατηρήθηκε πως οι ταινίες των φασμάτων εκπομπής και φθορισμού σύγχρονης σάρωσης σε βασικό περιβάλλον είναι μετατοπισμένες σε μεγαλύτερα μήκη κύματος ενώ στα φάσματα διέγερσης δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές με το ph. Παρατηρήθηκε πως οι ταινίες φθορισμού στην περιοχή 250-325 nm τον ελαιολάδου οφείλονται στις φαινολικές ουσίες. Με χρήση Δλ 60 nm παρατηρήθηκαν δύο κορυφές στο μίγμα των ουσιών σε αντίθεση με τη κορυφή ισχυρής εντάσεως που παρατηρήθηκε σε Δλ 100 nm. 1

Επίσης παρατηρήθηκε πως με χρήση Δλ 100 nm το φάσμα τον μίγματος των αντιοξειδωτικών στο ελαιόλαδο είναι το άθροισμα των φασμάτων των επιμέρους αντιοξειδωτικών. Ακολούθως κατεγράφησαν τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης 50 εξαιρετικά παρθένων ελαιολάδων 1 % w/v σε εξάνιο σε διάφορα Δλ και προσδιορίστηκε η ολική αντιοξειδωτική ενεργότητα τους με χρήση της ελεύθερης ρίζας DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης συγκρίθηκαν με την ολική αντιοξειδωτική ενεργότητα χωρίς όμως να εξαχθεί κάποια μαθηματική μορφή συσχέτισης. (β) Διαφοροποίηση βρώσιμού από λαμπάντε παρθένο ελαιόλαδο (κεφάλαιο 5): Χρησιμοποιήθηκαν τα τρισδιάστατα φάσματα εκπομπής και τα τρισδιάστατα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης για τη διαφοροποίηση των δειγμάτων. Τα τρισδιάστατα φάσματα εκπομπής ελήφθησαν σαρώνοντας το μονοχρωμάτορα εκπομπής στην περιοχή 350-720 nm στα μήκη κύματος διέγερσης 320-535 nm ενώ τα τρισδιάστατα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης ελήφθησαν με ταυτόχρονη σάρωση των δύο μονοχρωματόρων στην περιοχή 250-750 nm και σε Δλ από 20 μέχρι 180 nm. H ομαδοποίηση των παρθένων ελαιολάδων με βάση τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης σε Δλ 80 nm έγινε με χρήση των χημειομετρικών μεθόδων ανάλυσης κύριων συνιστωσών (principal component analysis) και ανάλυσης κατά συστάδες (cluster analysis) στην περιοχή 429-545 nm. Χρησιμοποιήθηκαν 41 βρώσιμα και 32 λαμπάντε παρθένα ελαιόλαδα. H ανάλυση κύριων συνιστωσών έδωσε καλύτερη διαφοροποίηση μεταξύ των δύο ομάδων, χωρίς σφάλμα, ενώ η ανάλυση κατά συστάδες επέτρεψε 97,3 % σωστή ομαδοποίηση. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν την ικανότητα της φθορισμομετρίας σύγχρονης σάρωσης για διαφοροποίηση παρθένων ελαιολάδων με βάση την ποιότητα τους. (γ) Ανάπτυξη μεθόδου για ποσοτικό προσδιορισμό νοθείας παρθένου ελαιολάδου (κεφάλαιο 6): Το παρθένο ελαιόλαδο διαφοροποιείται από τα πυρηνέλαιο, αραβοσιτέλαιο, ηλιέλαιο, σογιέλαιο, κραμβέλαιο και καρυδέλαιο με χρήση των τρισδιάστατων φασμάτων φθορισμού σύγχρονης σάρωσης. H διαφοροποίηση έγινε με χρήση Δλ 20 nm, στην περιοχή μηκών κύματος διέγερσης 315-400, 315-392, 315-375, 315-365, 315-375 και 315-360 για το πυρηνέλαιο, αραβοσιτέλαιο, ηλιέλαιο, σογιέλαιο, κραμβέλαιιο και καρυδέλαιο, αντίστοιχα. Για κάθε ένα από τα ανωτέρω βρώσιμα έλαια παρασκευάστηκαν 2

τριάντα ένα μίγματα διαφόρων συγκεντρώσεων με παρθένο ελαιόλαδο. Οι τεχνικές της πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης (multiple linear regression, MLR) και των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (partial last squares, PLS) χρησιμοποιήθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισμό της νοθείας. H μέθοδος που αναπτύχθηκε δίνει δυνατότητα ανίχνευσης πυρηνελαίου, αραβοσιτελαίου, ηλιελαίου, σογιελαίου, κραμβελαίον και καρνδελαίον στο παρθένο ελαιόλαδο σε συγκεντρώσεις από 2,6 %, 3,8 %, 4,3 %, 4,2 %, 3,6 %, και 13,8 % (w/w) με χρήση της πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης και σε συγκεντρώσεις από 0,5 %, 1,8 %, 2,6 %, 4,2 %, 1,8 %, και 4,8 % (w/w) με χρήση των μερικών ελαχίστων τετραγώνων, αντίστοιχα. Αναλυτικότερη μελέτη έγινε για τη νοθεία με ηλιέλαιο. Παρασκευάστηκαν εκατό τριάντα έξι μίγματα συγκεντρώσεων ηλιελαίου 0,5-95 % w/w με δεκαπέντε διαφορετικά παρθένα ελαιόλαδα. Με την τεχνική της πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης έγινε ποσοτικός προσδιορισμός της νοθείας χρησιμοποιώντας Δλ 20 και 80 nm ενώ με τη τεχνική των μερικών ελαχίστων τετραγώνων έγινε προσδιορισμός της νοθείας με χρήση Δλ 80 nm. Με τον τρόπο αυτό βελτιώθηκε το όριο ανίχνεύσης νοθείας με ηλιέλαιο. Συγκεκριμένα με χρήση Δλ 80 nm μπορεί να ανιχνευθεί ηλιέλαιο στο παρθένο ελαιόλαδο σε συγκέντρωση από 3,4 % (w/w) σε ελάχιστο χρονικό διάστημα (ένα λεπτό). (δ) Παρακολούθηση οξείδωσης παρθένου ελαιολάδου - εφαρμογή φασματοφωτομετρικής μεθόδου προσδιορισμού αριθμού υπεροξειδίον (κεφάλαιο 7): Μελετήθηκε η οξειδωτική σταθερότητα τον παρθένου ελαιολάδου σε συνθήκες ήπιας και επιταχυνόμενης οξείδωσης. Χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλές πλάκες μικροτιτλοδοτήσεων, περιεκτικότητας 0,550 ml ανά Θέση. Με τον τρόπο αυτό επιτεύχθηκε πηλίκο επιφάνειας επαφής με τον ατμοσφαιρικό αέρα προς όγκο δείγματος 1.00 cm2 mγ1. Εφαρμόστηκε η φωτομετρική μέθοδος της Διεθνούς Ομοσπονδίας Γάλακτος για τον προσδιορισμό αριθμού υπεροξειδίων μετά από τροποποίηση της. Κατά την ήπια οξείδωση τα δείγματα φυλάχτηκαν σε σκοτεινό σφραγισμένο μέρος. Μετά την πάροδο ενός μήνα καμιά αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στον αριθμό νπεροξειδίων και στην ολική αντιοξειδωτική ενεργότητα. Κατά την επιταχυνόμενη οξείδωση σε συνθήκες ακτινοβολίας UV και 80 C παρατηρήθηκε ότι ο αριθμός υπεροξειδίων, αριθμός ανισιδίνης, ΤΟΤΟΧ και η απορρόφηση στα 270 nm (Κ270) αυξάνονται εκθετικά με το χρόνο οξείδωσης τους. Ο 3

ρυθμός αύξησης τον ΤΟΤΟΧ και της σταθεράς Κ270 μειώνεται με την αύξηση τον χρόνου επώασης της μεθόδου Rancimat. (ε) Παρακολούθηση αλλοίωσης ελαιολάδου με Θερμική καταπόνηση και ακτινοβολία UV (κεφάλαιο 8): Τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης χρησιμοποιήθηκαν για την παρακολούθηση αλλοίωσης δειγμάτων εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου, ελαιολάδου και πυρηνελαίου με τη βοήθεια της ανάλυσης κύριων συνιστωσών. Μετά την πάροδο 12 ωρών επιταχυνόμενης οξείδωσης χρησιμοποιώντας 0,95 cm2 m1-1 επιφάνεια επαφής προς όγκο δείγματος γίνεται διαφοροποίηση σε πέντε ομάδες χρησιμοποιώντας την περιοχή των φασμάτων 300-500 nm και Δλ 80 nm: H ομάδα Α περιλαμβάνει το φάσμα τον αρχικού πυρηνελαίου και αυτού που ελήφθη μετά από 2 ώρες καταπόνησης σε ακτινοβολία UV και 80 C. Τα φάσματα τον πυρηνελαίου που ελήφθησαν από τις 4 μέχρι τις 12 ώρες καταπόνησης σχηματίζουν την ομάδα B. H ομάδα Γ περιλαμβάνει τα φάσματα τον εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου και του ελαιολάδου που ελήφθησαν από 4 μέχρι 12 ώρες καταπόνησης. Τα αρχικά φάσματα και αυτά που ελήφθησαν μετά από 2 και 4 ώρες καταπόνησης του εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου και ελαιολάδου σχηματίζουν τις ομάδες Δ και E, αντίστοιχα. Παράλληλη παρακολούθηση του αριθμού υπεροξειδίων, αριθμού ανισιδίνης και ολικού αριθμού οξείδωσης (ΤΟΤΟΧ) έδειξαν ότι το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο είναι το πιο ανθεκτικό στην αλλοίωση ενώ η ταχύτητα αλλοίωσης του πυρηνελαίου είναι η υψηλότερη. Μετά από 12 ώρες καταπόνησης, το ΤΟΤΟΧ αυξάνει 10, 19 και 38 φορές για το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο, ελαιόλαδο και πυρηνέλαιο, αντίστοιχα. Τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου και ελαιολάδου χρησιμοποιήθηκαν για τη πρόβλεψη του αριθμού ανισιδίνης, νπεροξειδίον και ΤΟΤΟΧ με χρήση των μερικών ελαχίστων τετραγώνων. Παρατηρήθηκαν γραμμικές συσχετίσεις μεταξύ των ανωτέρω παραμέτρων και του χρόνου έκθεσης των δειγμάτων σε Θερμική καταπόνηση - ακτινοβολία UV για το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο σε διάφορες Θερμοκρασίες: δωματίου (-20 C), 40, 60 και 80 C. H ταχύτητα αύξησης των παραμέτρων υπολογίστηκε σε 6,3 18,7 37 και 56 μονάδες ΤΟΤΟΧ h4, 2,8 8,3 16,5 και 25,6 meq υπεροξειδίων Κg1 h-1 και 0,84 2,0 3,6 και 4,9 μονάδες αριθμού ανισιδίνης h-1, αντίστοιχα. Οι ταχύτητες αύξησης των παραμέτρων αυξάνονται γραμμικά με τη Θερμοκρασία με κλίσεις 0,84±0,06 μονάδες ΤΟΤΟΧ h"1 C"1, 0,38±0,03 meq υπεροξειδίων Κg Ι h"1 C-1 και 0,070±0,003 μονάδες αριθμού ανισιδίνης h"1 C"1. 4

(στ) Ανάπτυξη ταχείας μεθόδου παρακολούθησης της αλλοίωσης των βρώσιμων ελαίων κατά τη Θέρμανση (κεφάλαιο 9): Χρησιμοποιήθηκαν τα τρισδιάστατα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης για την παρακολούθηση της υποβάθμισης των βρώσιμων ελαίων κατά τη Θέρμανση. Τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης με τη βοήθεια της ανάλυσης κύριων συνιστωσών χρησιμοποιήθηκαν για την ομαδοποίηση τους με βάση το χρόνο καταπόνησης. Χρησιμοποιήθηκαν τα φασματικά χαρακτηριστικά στην περιοχή 300500 nm για το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο, πυρηνέλαιο και σησαμέλαιο και στην περιοχή 320-520 nm για το αραβοσιτέλαιο, σογιέλαιο, ηλιέλαιο και μείγμα ελαίων. Το αποτέλεσμα στις δύο πρώτες κύριες συνιστώσες εξηγεί το 91,09 % της συνολικής πληροφορίας για το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο, πυρηνέλαιο και σησαμέλαιο και το 89,27 % για το αραβοσιτέλαιο, σογιέλαιο, ηλιέλαιο και μίγμα ελαίων. Κατά τη Θέρμανση, το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο και το σησαμέλαιο μετατοπίζονται σε αρνητικές τιμές στην πρώτη κύρια συνιστώσα. Το πυρηνέλαιο μετατοπίζεται σε αρνητικότερες τιμές στην πρώτη και δεύτερη κύρια συνιστώσα. Το αραβοσιτέλαιο, ηλιέλαιο, σογιέλαιο και το μίγμα ελαίων μετατοπίζονται σε Θετικές τιμές στη δεύτερη κύρια συνιστώσα. Τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης χρησιμοποιούνται για πρόβλεψη τον αριθμού ανισιδίνης για το πυρηνέλαιο, σησαμέλαιο, αραβοσιτέλαιο, σογιέλαιο και για το μίγμα τον ελαίων με χρήση των μερικών ελαχίστων τετραγώνων. Οι φασματικές αλλαγές είναι σύμφωνες με την οξειδωτική αλλοίωση όπως υπολογίστηκε με μέτρηση τον αριθμού υπεροξειδίων, αριθμού ανισιδίνης, αριθμού ΤΟΤΟΧ και της ολικής αντιοξειδωτικής ενεργότητας. Από τα φάσματα φθορισμού σύγχρονης σάρωσης με ανάλυση μερικών ελαχίστων τετραγώνων μπορεί να προβλεφθεί ο αριθμός ανισιδίνης.