Προσδιορισµός συγκέντρωσης ορµονών στον ορό

Προσδιορισµός συγκέντρωσης ορµονών στον ορό

70

ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΜΤΡΩΣΗΣ Τ3 ΚΑΙ TSH ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Σκοπός της άσκησης : η χρήση του συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος ως µέσου για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης ενός αντιγόνου ή αντισώµατος σε οποιοδήποτε διάλυµα ή βιολογικό υγρό. ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Ένα συγκεκριµένο αντιγόνο αναγνωρίζει ένα ειδικό (έναντι αυτού) αντίσωµα και δεσµεύεται σ αυτό. Το σύµπλοκο που δηµιουργείται γίνεται µε την πρόσδεση της ειδικής περιοχής του αντιγόνου που ονοµάζεται επίτοπος στην ειδική αµινοτελική περιοχή του αντισώµατος που ονοµάζεται παράτοπος. Η ισχύς πρόσδεσης (affιnity) εξαρτάται από τη στερεοδοµή των δύο περιοχών (που θα επιτρέψει τη στενή τους επαφή), η οποία είναι απόρροια της αµινοξικής τους σύστασης. Οι δεσµοί που αναπτύσσονται είναι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, ιοντικοί δεσµοί, δεσµοί υδρογόνου και δυνάµεις Van der Waals. Εάν το αντίσωµα είναι τύπου lgg (εικόνα 1) τότε µπορεί να δεσµεύσει µέχρι δύο το πολύ αντιγόνα. Εάν είναι τύπου lgm, το οποίο είναι πενταµερές, µπορεί να δεσµεύσει το πολύ δέκα αντιγόνα. ιακρίνουµε λοιπόν στη δηµιουργία του συµπλόκου αντιγόνο-αντίσωµα τις έννοιες ισχύς πρόσδεσης και αριθµός προσκολλώµενων µορίων (avidity). Επίσης σηµαντική είναι η έννοια της ειδικότητας (sρecifιcity) που προσδιορίζει την πρόσδεση του ειδικού αντισώµατος σε παρεµφερείς επιτόπους. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Ανοσολογικές ονοµάζονται οι τεχνικές που βασίζονται στην δηµιουργία του συµπλόκου αντιγόνο-αντίσωµα και χρησιµοποιούνται για τον εντοπισµό µορίων σε έναν ιστό ή σε κάποιο σταθερό υπόστρωµα (πήκτωµα ηλεκτροφόρησης, µεµβράνη PVDF) καθώς και για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης µορίων σε ένα διάλυµα ή βιολογικό υγρό. Η πρώτη εφαρµογή των ιδιοτήτων του συµπλόκου αντιγόνο-αντίσωµα ήταν η ποσοτική ανοσοκατακρήµνιση. 71

Θέση δέσµευσης αντιγόνου Μεταβλητή περιοχή Fab Μεταβλητή περιοχή Fab Θέση δέσµευσης αντιγόνου Υδατανθρακική αλυσίδα Σταθερή περιοχή Fc Εικόνα 1. Σχηµατική τρισδιάστατη απεικόνιση ενός µορίου IgG. Ξεχωρίζουν οι τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, µε τις δύο µεταβλητές (Fab) περιοχές και τη µία σταθερή (Fc) που σχηµατίζονται καθώς και οι θέσεις δέσµευσης του αντιγόνου. Ποσοτική ανοσοκατακρήµνιση Η µέθοδος αυτή ήταν η πρώτη που βασίστηκε στη δηµιουργία συµπλόκου αντιγόνο αντίσωµα για την αποµόνωση συγκεκριµένου αντιγόνου. Η διαδικασία είναι απλή και έχει ως εξής: Σε αριθµό σωληναρίων (έστω 10) προστίθεται ίσος όγκος διαλύµατος αντισώµατος. Στη συνέχεια, προστίθεται αυξανόµενη ποσότητα αντιγόνου, στον ίδιο όµως τελικό όγκο διαλύµατος. Φυγοκεντρούµε τα σωληνάκια και παρατηρούµε ότι µόνο σε 2-3 παρατηρείτε ίζηµα Σε όλα τα σωληνάρια πραγµατοποιείται δέσµευση αντιγόνου-αντισώµατος, αλλά (όπως φαίνεται και στην εικόνα 2, µόνο όταν οι σχετικές ποσότητες είναι σε σωστή αναλογία δηµιουργείται ανοσοϊζηµα. Αυτό, γιατί µόνο όταν διασυνδέονται περισσότερα του ενός µόρια αντιγόνου µε αντισώµατα προκύπτει ανοσοσύµπλοκο τέτοιου µοριακού βάρους ώστε να καταβυθιστεί ως ίζηµα. Όταν το αντίσωµα είναι σε περίσσεια, σ' ένα µόριο αντιγόνου, προσκολλάται ένα ή λίγα 72

µόρια αντισώµατος και το µοριακό βάρος του συµπλέγµατος δεν είναι ικανό να το κάνει να κατακρηµνιστεί. Όταν το αντιγόνο είναι σε περίσσεια, σε ένα µόριο αντισώµατος προσκολλώνται δύο αντιγόνα και το µοριακό βάρος του συµπλέγµατoς δεν είναι ικανό ώστε να καταβυθισθεί ως ίζηµα και τα ανοσοσύµπλοκα που προκύπτουν είναι διαλυτά. Βέβαια, είναι πιθανό περισσότερα µόρια να διασυνδεθούν οπότε δηµιουργούνται µεγαλύτερου µοριακού βάρους συµπλέγµατα, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό ιζήµατος. Όµως το µέγιστο στη δηµιουργία ιζήµατος παρατηρείται στη ζώνη ισοδυναµίας των συγκεντρώσεων αντιγόνου και αντισώµατος. Εικόνα 2. Επίδραση της σχετικής συγκέντρωσης αντιγόνου-αντισώµατος στη δηµιουργία ανοσοϊζήµατος. Στη ζώνη ισοδυναµίας, οι σχετικές ποσότητες αντιγόνου και αντισώµατος είναι τέτοιες ώστε δηµιουργούνται µεγάλου µοριακού βάρους ανοσοσυµπλέγµατα και δεν παραµένουν ελεύθερα αντισώµατα ή αντιγόνα. Όταν υπάρχει περίσσεια αντισώµατος, αυτό δεν αντιδρά και ανιχνεύεται στο υπερκείµενο υγρό. Τέλος, όταν το αντίγονο είναι σε περίσσεια, το σύνολο των αντισωµάτων δεσµεύονται µε αντιγόνα, όµως παραµένει ποσότητα ελεύθερου αντιγόνου και δηµιουργούνται σχετικά µικρότερα µοριακά συµπλέγµατα. Συγκόλληση. Η συγκόλληση είναι µια άλλη τεχνική του βασίζεται στην αντίδραση αντιγόνουαντισώµατος. Η µέθοδος χρησιµοποιεί αντιγόνα που υπάρχουν στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων (αιµατοσυγκόλληση). Εάν το χρησιµοποιούµενο αντίσωµα αναγνωρίζει τα αντιγόνα αυτά, τότε τα κύτταρα συγκολλούνται και δηµιουργούν ορατά συσσωµατώµατα. Εάν τα αντιγόνα που θέλουµε να ελέγξουµε δεν είναι αντιγόνα επιφανείας των 73

ερυθροκυπάρων, µπορούµε να τα προσδέσουµε στην επιφάνεια των κυπάρων παθητικά ή µε οµοιοπολική σύνδεση. Η γλουταραλδεϋδη, το τανικό οξύ και άλλα χηµικά µόρια χρησιµοποιούνται για διασύνδεση (ευαισθητοποιηµένα ερυθροκύπαρα). Με τον τρόπο αυτό µπορεί να προσδιοριστεί σε ορό εξεταζοµένων, η παρουσία αντισωµάτων τα οποία προσδένονται στην επιφάνεια των ερυθροκυπάρων τους (έµµεσος Coombs). Εάν συµβαίνει κάτι τέτοιο, στη συνέχεια λόγω δράσης του συµπληρώµατος που υπάρχει στον ορό, προκαλείται λύση των κυττάρων και αναιµία. Εικόνα 3. Αιµατοσυγκόλληση. Με την τεχνική αυτή γίνεται έλεγχος της παρουσίας σε ορούς, αντισωµάτων που αναγνωρίζουν αντιγόνα επιφαvείας των ερυθροκυπάρων. Τα αντιγόνα µπορούν να είναι φυσικά αντιγόνα επιφανείας των ερυθροκυπάρων ή να έχουν προσδεθεί στην επιφάνεια τους (ευαισθητοποιηµένα ερυθροκύπαρα). Σε κάθε οριζόντια σειρά µικροκυψελίδων τοποθετείται ίσος όγκος αιωρήµατος ερυθρών αιµοσφαιρίων και υποδιπλασιαζόµενες συγκεντρώσεις (στον ίδιο τελικό όγκο) ελεγχόµενου-ορού. Επίσης ελέγχονται ένας θετικός και ένας αρνητικός µάρτυρας. Όταν δεν γίνει αιµατοσυγκόλληση, τα ερυθροκύπαρα συσσωρεύονται στον πυθµένα της µικροκυψελίδας, ενώ σε αντίθετη περίπτωση παρατηρείται µεγάλο συσσωµάτωµα. 74

Άλλος φορέας αντιγόνων µπορεί να είναι µικροσφαιρίδια (beads) από πολυµερές υλικό (Iatex). Τα σφαιρίδια αυτά χρησιµοποιούνται αντί των ευαισθητοποιηµένων ερυθροκυπάρων. Με τέτοιου τύπου τεχνικές γίνεται προσδιορισµός της C αντιδρώσας πρωτεΐνης στον ορό, ο τίτλος αντιστρεπτολυσίνης του ορού, το τεστ για λοιµώδη µονοπυρήνωση, κ.ά. ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης ενός βιοµορίου µε τη χρήση αντισωµάτων, σε ένα βιολογικό υγρό, έγινε για πρώτη φορά σε ορό αίµατος και για το λόγο αυτό τέτοιου είδους αναλύσεις ονοµάστηκαν ορολογικές (serological tests). Τέτοιου είδους αναλύσεις µπορούν να γίνουν και σε οποιοδήποτε άλλο βιολογικό υγρό όπως πλάσµα, ούρα, εγκεφαλονωτιαίο και αρθρικό υγρό. Οι αναλύσεις αυτές περιλαµβάνουν δύο στάδια: τη δηµιουργία συµπλόκων αντιγόνου-αντισώµατος και την ανίχνευση του αριθµού των συµπλόκων αυτών Ο αριθµός των συµπλόκων αντιγόνου-αντισώµατος είναι ανάλογος µε τη συγκέντρωση της ουσίας που θέλουµε να προσδιορίσουµε. Οι ορολογικές αναλύσεις διακρίνονται σε τρεις οµάδες,ανάλογα µε τον τρόπο ανίχνευσης: 1. Ραδιοανασολογικές αναλύσεις RIA (radioimmunoassay), όπου το σύµπλοκο ανιχνεύεται µε τη βοήθεια ενός ραδιενεργού µορίου που είναι δεσµευµένο σε αυτό. 2. Ανοσοενζυµικές αναλύσεις ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), όπου το σύµπλοκο ανιχνεύεται µε τη βοήθεια ενός ενζύµου που προσδένεται σε αυτό και µετά από ενζυµική αντίδραση που δίνει ένα έγχρωµο προϊόν. 3. Αναλύσεις χηµειοφωταύγειας (chemiluminesense assay), όπου το σύµπλοκο ανιχνεύεται µε τη βοήθεια µιας ουσίας που προσδένεται σε αυτό και η οποία εκπέµπει φωτόνια. Ανάλογα µε το µέγεθος του αντιγόνου έχουν αναπτυχθεί δύο µέθοδοι για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης του. Όταν το αντιγόνο είναι µικρού µοριακού βάρους 100-5.000 kda όπως 75

στεροειδείς ορµόνες, οιστρογόνα, τα µικρού ΜΒ πεπτίδια, κ.α. τότε χρησιµοποιείται η συναγωνιστική (competitive) µέθοδος (εικόνα 5α). Όταν το αντιγόνο είναι µεγάλου ΜΒ όπως οι πρωτεΐνες, τότε χρησιµοποιείται η µέθοδος δύο σηµείων (sandwitch) (εικόνα 5β). ELISA Για τον ποσοτικό προσδιορισµό διαφόρων βιοµορίων σε βιολογικά υγρά µε τη µέθοδο ELISA χρησιµοποιούνται πλαστικά πλακίδια που περιέχουν 96 µικροκυψελίδες (wellsπηγαδάκια). Το πλαστικό είναι ειδικής σύνθεσης ή επεξεργασµένο ώστε να προσδένονται προσροφούνται (adsorb) πάνω του οι πρωτεΐνες µε µη ειδικό τρόπο. Στην ELISA η ποσοτικοποίηση του συµπλόκου αντιγόνο-αντίσωµα γίνεται µε τη βοήθεια ενός ενζύµου, της υπεροξειδάσης που δεσµεύεται έµµεσα σε αυτό. Με την προσθήκη υποστρώµατος (Η 2 Ο 2 ) και χρωµογόνου (ΤΜΒ) παράγεται διαλυτό προϊόν χρώµατος µπλέ. Η αντίδραση σταµατά µε την προσθήκη Η 2 SO 4 και το χρώµα µετατρέπεται σε κίτρινο. Η ένταση του χρώµατος είναι ευθέως ανάλογη (αντίδραση δύο σηµείων) ή αντιστρόφως ανάλογη (συναγωνιστική ELISA) της συγκέντρωσης του βιοµορίου που προσδιορίζουµε. Με τη χρήση πρότυπων διαλυµάτων και φωτοµέτρηση στα 450 nm κατασκευάζουµε την πρότυπη καµπύλη και µέσω αυτής βρίσκουµε τη συγκέντρωση του αντιγόνου σε οποιοδήποτε δείγµα. Στο εµπόριο κυκλοφορούν έτοιµα kit για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης βιοµορίων τα οποία περιλαµβάνουν: Μικροκυψελίδες µε προσδεµένο αντίσωµα στα τοιχώµατα τους Σηµασµένο 2 ο αντίσωµα (αντίδραση δύο σηµείων) ή σηµασµένο αντιγόνο (συναγωνισµός) Ρυθµιστικά διαλύµατα για αραιώσεις ιάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος Η 2 SO 4 ιάλυµα πλύσεων 76

α. συναγωνισµός β. δέσµευση δύο σηµείων δεσµευµένο αντίσωµα σηµασµένο αντιγόνο δεσµευµένο αντίσωµα σηµασµένο αντίσωµα αντιγόνο συναγωνισµός αντιγόνων αντιγόνο 1,0 1,0 0,8 0,8 0,6 0,6 O.D. 0,4 O.D. 0,4 0,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0,4 0,8 Συγκέντρωση 0 4 8 12 16 Συγκέντρωση Εικόνα 5. Ποσοτικός προσδιορισµός αντιγόνου µε την µέθοδο ELΙSA και οι αντίστοιχες πρότυπες καµπύλες. Η µέθοδος εµφανίζει γραµµικότητα µέσα σε δεδοµένο εύρος τιµών συγκέντρωσης αντιγόνου. Στην συναγωνιστική, για δεδοµένες θέσεις πρόσδεσης αντισωµάτων, συναγωνίζονται σηµασµένα αντιγόνα που προσθέτουµε, µε φυσικά, µη σηµασµένα αντιγόνα που υπάρχουν στο εξεταζόµενο βιολογικό υγρό. Στη µέθοδο δύο σηµείων, το αντιγόνο δεσµεύεται σε προσδεµένο αντίσωµα. Στο αντιγόνο δεσµεύεται στη συνέχεια άλλο αντίσωµα (σε θέση που δεν παρεµποδίζεται) και ανιχνεύεται µε το σηµασµένο αντίσωµα. 77

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Μικροκυψελίδες ELISA Πιπέτα ρυθµιζόµενου όγκου 10-100 µl Φωτόµετρο ELISA ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ είγµατα ανθρώπινων ορών αίµατος PBS (Phosphate Buffered Saline) NaCl 140 mm, Na 2 HPO 4 16mM, NaH 2 PO 4 4 mm, ph 7,4 ιάλυµα πλύσεων PBS 0,1% Triton X-100 Σηµασµένο 2 ο αντίσωµα (αντίδραση δύο σηµείων) Σηµασµένο αντιγόνο (συναγωνισµός) Ρυθµιστικά διαλύµατα για αραιώσεις ιάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος Η 2 SO 4 2Μ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Προσδιορισµός συγκέντρωσης TSH Σε µια οκτάδα µικροκυψελίδων προσθέστε σε κάθε µία από αυτές από 100 µl πρότυπων διαλυµάτων (standards) θέσεις 1-6 και από 100 µl από τα άγνωστα δείγµατα θέσεις 7-8. Προσθέστε σε όλες τις θέσεις από 50 µl anti-tsh-hrp Επωάστε για 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου Ξεπλύνετε 4 φορές τις µικροκυψελίδες µε PBS 0,1% Tween-20 Προσθέστε 200 µl διάλυµα υποστρώµατος για 15 min Προσθέστε 50 µl H 2 SO 4 Φωτοµετρήστε στα 450 nm 78

Προσδιορισµός συγκέντρωσης Τ3 Σε µια οκτάδα µικροκυψελίδων προσθέστε σε κάθε µία από αυτές από 100 µl πρότυπων διαλυµάτων (standards) θέσεις 1-6 και από 100 µl από τα άγνωστα δείγµατα θέσεις 7-8. Επωάστε για 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου Ξεπλύνετε 4 φορές τις µικροκυψελίδες µε PBS 0,1% Tween-20 Προσθέστε σε όλες τις θέσεις από 50 µl T3-HRP Επωάστε για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου Ξεπλύνετε 4 φορές τις µικροκυψελίδες µε PBS 0,1% Tween-20 Προσθέστε 200 µl διάλυµα υποστρώµατος για 15 min Προσθέστε 50 µl H 2 SO 4 Φωτοµετρήστε στα 450 nm Προσδιορισµός τίτλου C αντιδρώσας πρωτεΐνης Σε µια εξάδα θέσεων αντίδρασης προσθέστε από 20 µl αντιδραστηρίου και από 20 µl άγνωστους ορούς καθώς και αρνητικό και θετικό control Αναµιγνύουµε καλά και επωάζουµε για 3 min σε θερµοκρασία δωµατίου Παρατηρούµε τη δηµιουργία κροκίδωσης στα θετικά δείγµατα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Φτιάξτε τις πρότυπες καµπύλες για τις δύο µεθόδους 2. ικαιολογήστε τις διαφορές της µορφής των δύο πρότυπων καµπυλών 3. Υπολογίστε τη συγκέντρωση των δύο ορµονών στα άγνωστα δείγµατα 79

80