ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σκοπός: Οι γονιδιακές αναδιατάξεις της βαριάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (VHDHJH περιοχή) και του Τ-κυτταρικού υποδοχέα (ΤΟRδ) χρησιμοποιήθηκαν με σκοπό την παρακολούθηση της ελάχιστης υπολειπάμενης νάσου (ΕΥΝ). Η ανίχνευση ΕΥΝ στα τέλος της Θεραπείας εφάδου (28η ημέρα), κατά τη διάρκεια και μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας συσχετίσθηκε με την έκβαση των ασθενών. Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκε νουκλεοτιδική ανάλυση των αναδιατεταγμένωνηdηjη περιοχών, έτσι ώστε να μελετηθεί ο μηχανισμός των γονιδιακών αναδιατάξεων και να διερευνηθούν χαρακτηριστικά της VH DHJH περιοχής που επηρεάζουν την έκβαση. Τέλος. οι συχνότερες χρωμοσωμικές διαταραχές που παρατηρούνται στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (απλ) αξιολογήθηκαν ως επιπλέον προγνωστικοί δείκτες. Ασθενείς και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 91 ασθενείς που διαγνεϊισθηκαν με ΟΝ\ (84 με Β-ΟΛΑ και 7 με Τ-ΟΛΛ) στη Μονάδα Αιματολογίας-Ογκολογίας της A' Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών το διάστημα 112000-12/200β. 0 μέγιστος χρόνος παρακολούθησης των ασθενών ήταν 90 μήνες και ο διάμεσος χρόνος 39.8 μήνες. H ηλικία των ασθενών στη διάγνωση ήταν 2 μηνών-17,1 ετών (μέση τιμή 5.8 έτη). Η μελέτη των γονιδιακών αναδιατάξεων VHDHJIH έγινε με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PGR), ενώ των αναδιατάξεων ΤCRό έγινε με τη φωλεασμένη PCR. Η νουκλεοτιδική ανάλυση των VIHDHJIH αλληλουχιών έγινε χρησιμοποιώντας τα συστήματα πληροφοριών ImΜunvGenetics (IJniversite Montpellier, France. http://imgt.arg) και JoinSolver (http:hjoinsolver.niams.nih.gov). 0ι χρωμοσωμικές μεταθέσεις 1(1 2;21 )(ρι 3;q22) και t(9;22)(g34:gi1) και η αναδιάταξη του MLL (11q23) μελετήθηκαν με την τεχνική του φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH) σε μεσοφασικούς πυρήνες. Αποτελέσματα: Συνολικά, εξετάσθηκαν 792 δείγματα μυελού των οστών (9 δείγματα ανά ασθενή). Στο τέλος της θεραπείας εφόδου_ ΕΥΝ ανιχνεύθηκε σε 12,1% ασθενείς. Αξιοσημείωτη είναι η αύξηση της ΕΥΝ (31,6%) έξι μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Αυξημένη συχνότητα υποτροπής στα 5-έτη, 54,44%± 15%. παρατηρήθηκε στους ασθενείς που είχαν ΕΥΝ στα τέλος της θεραπείας εφόδου, ενεό στις περιπτώσεις με μη ανιχνεύσιμη ΕΥΝ στα τέλος της
εφόδου η συχνότητα υποτροπής ήταν πολύ χαμηλή, 5%± 2.4%. (Ρ να!υe=0,0002). Επιπλέον, υψηλή συχνότητα υποτροπής (38,9%± 2.4%) παρατηρήθηκε στις περιπτώσεις ανίχνευσης ΕΥΝ 8 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας (Ρ value=0,0001). H 5-ετής ελεύθερη νόσου επιβίωση (ΕΝΕ) στους ασθενείς που είχαν ΕΥΝ στα τέλος της θεραπείας εφόδου ήταν 45.45%ά 15%, ενώ στους ασθενείς χωρίς ΕΥΝ στα τέλος της εφόδου ήταν πολύ υψηλότερη, 82,5%± 4,2% (Ρ value=0,0124). Επίσης, σι ασθενείς με ΕΥΝ 6 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας είχαν χαμηλότερη ΕΝΕ στα 5-έτη, β3,15%± 11,1%, σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν είχαν ΕΥΝ, 97.5%± 2,5%, (P vakie=o,0009). Από την νουκλεοτιδική ανάλυση των VHDHJH αναδιατάξεων, παρατηρήθηκε αυξημένη συχνότητα (44.9%) των ΝΗ τμημάτων που βρίσκονται στο 3 άκρο του χρωμοσώματος 14. H πλειοψηφία των τμημάτων ταυ 5' άκρου της DH περιοχής συνδέθηκε με τμήματα που βρίσκονται στο 3' άκρο της JH περιοχής. Επίσης, τα τμήματα ταυ 3' άκρου της DH περιοχής συνδέθηκαν κυρίως με τα γονιδιακά τμήματα ταυ 5' άκρου της JH περιοχής. Το 75,5% των αλληλουχιών που μελετήθηκαν στη διάγνωση ήταν μη παραγωγικές. ενώ παραγωγικές ήταν μόνο το 24,5% των αλληλουχιών, Το ποσοστό επιβίωσης ελεύθερο υποτροπής στα 5-έτη στους ασθενείς που είχαν παραγωγικές αναδιατάξεις στη διάγνωση ήταν 75%± 9%, ενώ στους ασθενείς με μη παραγωγικές αναδιατάξεις ήταν πολύ υψηλότερο 97%± 1,92%, (Ρ value=0,026). Νέες αναδιατάξεις στην υποτροπή χωρίς διατήρηση των αρχικών αλληλουχιών ανιχνεύθηκαν στο 37,5% των περιπτώσεων. Σε μία από τις περιπτώσεις αυτές, διαπιστώθηκε υποκείμενος μοριακός μηχανισμός (νη to DHJH joining). Χρωμοσωμικές ανωμαλίες με FISH ανιχνεύθηκαν στα 76% των περιπτώσεων, ενώ με την κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση ανιχνεύθηκαν διαταραχές μόνο στο 28% των περιπτώσεων. Συχνότερη ήταν η t(12:21)(p13;g22). "Ενας από τους 5 (20%) ασθενείς με t(12;21)(p13:q22) παρουσίασε όψιμη υποτροπή (15 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας), ενώ βρισκόταν σε κλινική και μορφολογική ύφεση. Χρωμόσωμα Philadelphia (minor-bcr/abl) με υποκλώνο διπλασιασμού ταυ χρωμοσώματος Philadelphia ανιχνεύθηκε σε έναν ασθενή στο δείγμα υποτροπής. ενώ αναδιάταξη MLL ανιχνεύθηκε σε 2 βρέφη στη διάγνωση.
Συμπεράσματα: H ανίχνευση ΕΥΝ στο τέλος της θεραπείας εφόδου και 6 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας εϊχε ιδιαίτερα σημαντική προγνωστική αξία. H σύνδεση των διαφορετικών γονιδιακών τμημάτων δεν efvai τυχαία και εξαρτάται από το στάδιο της διαφοροποίησης του 6-κυττάρου όπου συμβαίνει η κακοήθης εξαλλαγή. Όπως διαπιστώθηκε. η παρουσία παραγωγικών αναδιατάξεων αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη και συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής. H ανίχνευση συγκεκριμένων χρωμοσωμικών μεταθέσεων στη διάγνωση αποτελεί σημαντική παράμετρο για την ακριβέστερη ταξινόμηση των ασθενών με ΟΠΠ σε ομάδες κινδύνου. H μελέτη μοριακών και κυτταρογενετικών χαρακτηριστικών με σύγχρονες τεχνικές ολοκληρώνει την παρακολούθηση κάθε ασθενούς και επιτρέπει τη στοχευμένη θεραπεία. με σκοπό την περαιτέρω βελτίωση ταυ ποσοστού ίασης στην ΟΛΛ της παιδικής ηλικίας.
ABSTRACT Purpose: Sequential monitoring of minimal residual disease (MRD) was performed using gene rearrangements of immunoglobulin heavy chain (VHDHJH region) and T-cell receptor (TCRδ). The detection of MRD at the end of induction treatment (28th day), during and after treatment completion was correlated to patients outcome. Furthermore, sequencing analysis of the rearranged VHDHJH regions was carried out in order to study the underlying mechanism of the rearrangement and to evaluate characteristics of the VHDHJH region that influence patients' outcome. Finally, the prognostic significance of the most common chromosomal aberrations found in acute lymphoblastic leukemia (ALL) was evaluated. Patients and Methods: Nifty-one patients diagnosed with ALL (84 with B-ALL and 7 with T-ALL) in the Hematology-Oncology Unit, 1st Department of Pediatrics. University of Athens, during the period 1/2000-12/2006, were studied. The maximum time of patients' follow up was 90 months and the mean time was 39.8 months. Patients' age at diagnosis was 2 months-17.1 years (mean value 5.8 years). The study of clonal VHDHJH rearrangements was done using polymerise chain (FOR), while for TCRδ rearrangements nested FOR was applied. The sequence analysis of VHDHJH rearrangements was performed using the ImMunoGeneTics Information System (University Montpellier, France, http://imgt.org) and the web-based software algorithm JoinSolver (http://joinsolver.niams.nih.gov). The chromosomal aberrations t(12;21)(p13;g22), t(9;22)(g34;q11) and MLL (11q23) were studied with fluorescence in situ hybridization (FISH) in interphase nuclei. Results: A total of 792 bone marrow samples (9 samples per patient) were examined. At the end of induction treatment, 12.1% patients were found MRD positive. Increased frequency of MRD (31.6%) was noted six months after treatment completion. Increased frequency of relapse at 5-years, 54.44%± 15%, was observed in patients with positive MRD at the end of induction treatment, while in cases without MRD the frequency of relapse was very low. 5%± 2.4%, (Ρ value=0.0002). Furthermore, elevated frequency of relapse (389%± 2.4%) was
noted in cases with positive MRD six months after treatment completion (Ρ value=0.0001). The event free survival (EFS) rate at 5-years in patients with MRD at the end of induction was 45.45%± 15%. while in patients without MRD at the end of induction it was significantly higher. 82.5%± 4.2% (Ρ value=0.0124). In addition. the EFS at 5-years was lower in patients with MRD six months after treatment completion, 63.15%± 11.1%, compared to patients without detectable MRD. 97.5%± 2.5%, (Ρ va(ue=0.0009}. Sequencing analysis of the VHDHJH rearrangements revealed increased utilization (44.9%) of VH segments proximal to the 3' end of chromosome 14. The majority of segments at the 5 part of DH region were rearranged with JH segments located at the 3' part of JH region. Moreover, the segments of the 3' part of DH region were mainly rearranged with the segments of the 5' part of JH region. Among the rearranged sequences at diagnosis. 75.5% were non-productive, while productive were only 24.5% of them. The relapse free survival rate at 5-years in patients with productive rearrangements was 75%± 9%, while in patients with non productive rearrangements was significantly higher. 97%± 1.92%, (Ρ νalυe=0.026). New sequences without preservation of the initial sequences were noted in 37% cases at relapse. Among them, in one case molecular mechanism (VH-DHJH joining) was identified. Chromosomal aberrations with FISH were detected in 76% cases, while with classical cytogenetic analysis abnormalities were detected in only 26% of cases. Most common was the t(12;21)(p13;g22). One among the 5 patients (20%) with t(12:21)(p13;g22) presented late relapse (15 months after treatment completion), while he was in clinical and morphological remission. Philadelphia chromosome (minor-bcr/abl) with subclone of duplication was identified in one patient at relapse, while MLL rearrangement was noted in 2 infants at diagnosis. Conclusions: The significance of MRD detection at the end of induction treatment and six months after treatment completion was verified. The pattern of VH, DH and JH segments' rearrangement is not random and it depends on the stage of leukemic transformation during B-cell differentiation. The presence of productive sequences was proved to be an independent risk factor associated with increased incidence of relapse. Detection of specifιc chromosomal
aberrations at diagnosis constitutes an additional parameter for the precise classification of patients with ALL into risk groups. Study of molecular and cytogenetic characteristics with modern techniques is essential for the follow up of each patient and for the decision on targeted treatment. Further improvement of the cure rate in childhood ALL shall be expected.