ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΙΜΩΝ ΠΛΑΣΤΙΚΩΝ ΑΠΟ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΓΛΥΚΕΡΟΛΗ ΜΕΣΩ ΜΙΚΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΠΟΔΟΜΗΣΙΜΩΝ ΠΛΑΣΤΙΚΩΝ ΑΠΟ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΓΛΥΚΕΡΟΛΗ ΜΕΣΩ ΜΙΚΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Ι. Κουμέλης 1, Ι. Ντάικου 1, Γ. Λυμπεράτος 1,3 1 ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ, 2654 Πάτρα, 2 Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ, Πανεπιστημιούπολη, 1578, Ζωγράφου, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, αναπτύχθηκε μια μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια από εδαφόβιους μικροοργανισμούς, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρα άντλησης-πλήρωσης σε συνθήκες περιορισμού αζώτου. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα των πτητικών λιπαρών οξέων οξικό, βουτυρικό και προπιονικό σε αναλογία 1:1:1. Η εγκλιματισμένη και εμπλουτισμένη μικροβιακή καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον εμβολιασμό καλλιεργειών διαλείποντος έργου αλλά και συνεχών, προκειμένου για την διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής ΠΥΑs από α) μίγματα οξέων, β) καθαρή γλυκερόλη, γ) μίγματα γλυκερόλης και οξέων και δ) οξινισμένη βιομηχανική γλυκερόλη. Η οξινισμένη γλυκερόλη είναι ουσιαστικά το ζυμωτικό μίγμα που παράγεται κατά την αναερόβια ζύμωση της γλυκερόλης και αποτελείται από υπολειμματική γλυκερόλη που δεν έχει υποστεί ζύμωση, 1,3 προπανοδιόλη, πτητικά λιπαρά οξέα και αιθανόλη. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια σημαντική ερευνητική δραστηριότητα έχει επικεντρωθεί στην παραγωγή βιοδιασπώμενων βιοπολυμερών, ικανών να αντικαταστήσουν τα συμβατικά πλαστικά, από ανανεώσιμες πηγές. Μεταξύ αυτών ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει προκύψει στο πεδίο παραγωγής πολυυδροξυαλκανοϊκών εστέρων (ΠΥΑ) από διαφορετικούς τύπους αποβλήτων, χρησιμοποιώντας είτε καθαρές είτε μικτές μικροβιακές καλλιέργειες. Προκειμένου για την χρήση μικτών καλλιεργειών απαιτείται ο πρότερος εγκλιματισμός και εμπλουτισμός τους με τη χρήση κάποιου είδους περιορισμού των θρεπτικών συστατικών σε συστήματα περιοδικής λειτουργίας, ενώ είναι επίσης σύνηθες να περιλαμβάνεται ένα πρώτο βήμα οξίνισης των αποβλήτων πριν από την αξιοποίησή τους για παραγωγή των βιοπολυμερών. Οι ΠΥΑ είναι βιοδιασπώμενοι-βιοσυμβατοί πολυεστέρες που έχουν παρόμοιες ιδιότητες με τα πετροχημικά πλαστικά. Η παραγωγή των ΠΥΑ γενικά έχει επιτευχθεί κάνοντας χρήση, είτε καθαρών είτε μικτών καλλιεργειών μικροοργανισμών, μέσω των διεργασιών της ζύμωσης. Ένας βασικός παράγοντας για ενισχυμένες αποδόσεις παραγωγής είναι ο περιορισμός θρεπτικού, που φαίνεται να διεγείρει τον πολυμερισμό και την ενδοκυτταρική συσσώρευση ΠΥΑs από τους μικροοργανισμούς. Η χρήση καθαρών μικροβιακών καλλιεργειών προτείνεται, κατά κύριο λόγο, μέχρι τώρα από τη βιβλιογραφία (Lee et al., 1999) για την παραγωγή ΠΥΑs. Ωστόσο οι μικτές θα μπορούσαν να πλεονεκτήσουν έναντι των καθαρών, όταν σαν υπόστρωμα χρησιμοποιείται κάποιο απόβλητο, που είναι σύνθετη ένωση, μιας και αποτελεί μίγμα πολλών ουσιών. Σε γενικές γραμμές, οι μικτές καλλιέργειες αποτελούν μικροβιακούς πληθυσμούς άγνωστης σύνθεσης, οι οποίοι είναι σε θέση να εκτελέσουν συγκεκριμένες ενδοκυτταρικές και εξωκυτταρικές αντιδράσεις και επιλέγονται/επικρατούν από τις συνθήκες λειτουργίας που επιβάλλονται στο βιολογικό σύστημα. Μικτές καλλιέργειες που επιλέγονται για την παραγωγή ΠΥΑs μπορεί να έχουν υψηλή ικανότητα ενδοκυτταρικής αποθήκευσης λόγω λειτουργικών συνθηκών που περιορίζουν τον πρωτογενή τους μεταβολισμό. Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, αναπτύχθηκε μια μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια από εδαφόβιους μικροοργανισμούς, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρα άντλησης-πλήρωσης σε συνθήκες περιορισμού αζώτου. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα των πτητικών λιπαρών οξέων οξικό, βουτυρικό και προπιονικό σε αναλογία 1:1:1. Η εγκλιματισμένη και εμπλουτισμένη μικροβιακή καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον εμβολιασμό καλλιεργειών διαλείποντος έργου αλλά και συνεχών, προκειμένου για την διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής ΠΥΑs από α) μίγματα οξέων, β) καθαρή γλυκερόλη, γ) μίγματα γλυκερόλης και οξέων και δ) οξινισμένη βιομηχανική γλυκερόλη. Η οξινισμένη γλυκερόλη είναι ουσιαστικά το ζυμωτικό μίγμα που παράγεται κατά την αναερόβια ζύμωση της γλυκερόλης και αποτελείται από υπολειμματική γλυκερόλη που δεν έχει υποστεί ζύμωση, 1,3 προπανοδιόλη, πτητικά λιπαρά οξέα και αιθανόλη. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρες, καλλιέργεια και θρεπτικό μέσο Για την εκκίνηση των βιοαντιδραστήρων χρησιμοποιήθηκε εμπλουτισμένη μικτή καλλιέργεια προερχόμενη από χώμα. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε εναιώρημα εδάφους με αποσταγμένο νερό (1% w/v) και κρατήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος υπό συνεχή ανάδευση (25-3rpm) για δύο ώρες. Μετά από καθίζηση των στερεών το υπερκείμενο υγρό διηθήθηκε μέσω κόσκινου,5 χιλιοστών και προστέθηκε σε αυτό οξικό, βουτυρικό και προπιονικό οξύ, 1g/L το καθένα, 1g/L (NH 4 ) 2 SO 4, 2,5g/L K 2 HPO 4 και 1,5g/L KH 2 PO 4. Ο εμπλουτισμός της μικτής καλλιέργειας σε παραγωγούς ΠΥΑ έγινε σε αντιδραστήρα άντλησης-πλήρωσης, υδραυλικού όγκου μισού λίτρου, υπό διαδοχικό περιορισμό άνθρακα/αζώτου, σε πρόγραμμα είκοσι τριών ωρών συνεχούς ανάδευσης και αερισμού και μιας ώρας ηρεμίας για καθίζηση και τροφοδοσία για δεκαπέντε ημέρες. Για την αρχική διαδικασία εμπλουτισμού, καθώς και για τη λειτουργία των κύριων βιοαντιδραστήρων, χρησιμοποιήθηκε βασικό συνθετικό μέσο (ΒΣΜ) με την ακόλουθη σύνθεση:,2g/l MgSO 4 7H 2 O,,5g/L CaCl 2 2H 2 O, 2.5g/L K 2 HPO 4 και 1,5g/L KH 2 PO 4 και 1ml/L διαλύματος ιχνοστοιχείων. Το διάλυμα ιχνοστοιχείων παρασκευάστηκε χωριστά ως εξής: 1mg/L CuSO 4 2H 2 O, 2g/L FeSO 4 7H 2 O, 3mg/L ΜοΟ 4 2H 2 O, 2mg/L NiCl 2 6H 2 O, 1g/L ZnSO 4 7H 2 O,,2g/L CoCl 2 6H 2 O,.3g/L ΚΙ,.3g/L H 3 BO 3, 3mg/L MnCl 2 4H 2 O και 2,5g/L EDTA Στο ΒΣΜ γινόταν προσθήκη της πηγής άνθρακα ή / και της πηγής αζώτου, δηλ. (ΝΗ 4 ) 2 SO 4 σε όλες τις περιπτώσεις. Για τα πειράματα συσσώρευσης βιοπλαστικού χρησιμοποιήθηκαν δύο τύποι βιοαντιδραστήρων, α) διαλείποντος έργου περιοδικής λειτουργίας (SBR) και β) απλός διαλείποντος έργου (ΔΕ). Ο SBR είχε ενεργό όγκο 1,5 L και λειτούργησε (πηγές άνθρακα και αζώτου δόθηκαν στον αντιδραστήρα χωριστά) ως εξής: 1. Φάση άνθρακα (συσσώρευση), 2. Φάση καθίζησης/απορροής, 3. Φάση επάρκειας αζώτου (ανάπτυξη), 4. Φάση καθίζησης/απορροής. Ο αντιδραστήρας διατηρήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, με μαγνητική ανάδευση 2rpm και συνεχή αερισμό, με ενυδατωμένο αέρα μέσω αποστειρωμένου φίλτρου, με ογκομετρικό ρυθμό,83 έως 1,2L/min. Οι πηγές άνθρακα που δοκιμάστηκαν σε SBR ήταν ένα μίγμα των πτητικών λιπαρών οξέων (VFAs), δηλαδή οξικό, προπιονικό, βουτυρικό και σε αναλογία 1:1:1 (w) και ένα μίγμα των ανωτέρω VFAs με καθαρή γλυκερόλη σε αναλογία 1:1 (w COD). Ο ΔΕ είχε ενεργό όγκο,6 L και λειτούργησε με: α) καθαρή εμπορική γλυκερόλη, 99% καθαρότητας και β) ζυμωμένη ακατέργαστη γλυκερόλη (ΖΑΓ) που στην πράξη ήταν ένα μίγμα προϊόντων ζύμωσης από αναερόβια επεξεργασία ακατέργαστης γλυκερόλης που παράγεται από βιομηχανία παραγωγής βιοντίζελ. Η ακατέργαστη γλυκερόλη παραχωρήθηκε από την εταιρεία παραγωγής βιοντίζελ ΠΕΤΤΑΣ Α.Β.Ε.Ε., και είχε τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: καθαρότητα 92,2±,3%, ph 5.2 και COD Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

1.28±.g O 2 /g. H διαδικασία ζυμώσεως πραγματοποιήθηκε μέσω μικτών οξεογενών καλλιεργειών υπό μεσόφιλες αναερόβιες συνθήκες και ο ζωμός της ζύμωσης ήταν με την ακόλουθη σύνθεση: d-cod, 12±,7g/L, γλυκερόλη, 1,9±,2g/L, 1,3 προπανοδιόλη (PDO), 3.7±.1g/L, εξανοϊκό, 65±25mg/L, βουτυρικό, 535±12mg/L, οξικό, 23±25mg/L, προπιονικό, 2±35mg/L, ρη, 5.45. Αναλυτικές μέθοδοι Τα ολικά και πτητικά αιωρούμενα στερεά (TSS, VSS), το χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (ΧΑΟ) και το αμμωνιακό άζωτο (μέθοδος φαινολικών), προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις τυποποιημένες μεθόδους (APHA, AWWA & WEF, 1995). Τα πτητικά λιπαρά οξέα (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, εξανοϊκό) ποσοτικοποιήθηκαν με αέρια χρωματογραφία GC-FID (Varian CP-38), με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και τριχοειδή στήλη. Πριν από την ανάλυση, τα δείγματα οξινίστηκαν με H 2 SO 4 (.6% ν/ν). Η γλυκερόλη ποσοτικοποιήθηκε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης HPLC (Dionex UltiMate 3) με ανιχνευτή UV-RI. Πριν από την ανάλυση, τα δείγματα φιλτραρίστηκαν με αποστειρωτικά φίλτρα υγρών, πορώδους,45μm (Whatman). Για την ανάκτηση των ΠΥΑ στο τέλος κάθε περιόδου λειτουργίας/πείραμα,.5-1l μικτού ζυμωτικού υγρού απομακρύνθηκε από τον αντιδραστήρα υπό ανάδευση. Το ζυμωτικό υγρό φυγοκεντρήθηκε στις 45 rpm για 15 λεπτά και το μικροβιακό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 95% αιθανόλη, πλύθηκε δύο φορές με αποσταγμένο νερό και στη συνέχεια λυοφιλοποιήθηκε στους -5 o C (CRYODOS-5, Telstar). Οι ΠΥΑ εκχυλίστηκαν από την ξηρά βιομάζα με χλωροφόρμιο (5ml/g βιομάζας) στους 7 o C, για 1 ώρα σε μία συσκευή εκχύλισης SER 148 (Velp). Η ανάκτηση του διαλύτη διεξήχθη μέχρι που ο αρχικός όγκος του μειώθηκε κατά το ήμισυ, και στη συνέχεια προστέθηκε μεθανόλη σε αναλογία 1:6 (ν/ν) για τον καθαρισμό των βιοπλαστικών από λιπίδια και χρωστικές. Οι καταβυθισμένοι ΠΥΑ στη συνέχεια ανακτήθηκαν με διήθηση και η απόδοση τους εκτιμήθηκε βαρομετρικά. Για την περαιτέρω χημική και θερμοδυναμική ανάλυση, χλωροφόρμιο επαναχρησιμοποιήθηκε για την διάλυση των πελλετών ΠΥΑ (2ml/g ΠΥΑs) σε 7 o C επί 15 λεπτά, ώστε καθώς ο διαλύτης εξατμιζόταν βραδέως στα σωστά δοκίμια, να ληφθούν φιλμ ΡΗΑs με πάχος.15-,25mm. Η σύνθεση των ανακτημένων ΠΥΑ προσδιορίστηκε με φασματοσκοπία 1 Η NMR χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Bruker Advance DPX με συχνότητα 4 ΜΗz. Ο διαλύτης που χρησιμοποιήθηκε ήταν δευτεριωμένο χλωροφόρμιο, CDCI 3. Το μοριακό βάρος των πολυμερών μετρήθηκε με τη χρήση χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους (SEC), στους 25 C με χρωματογράφο Polymer Lab που περιλαμβάνει δύο στήλες Pl gel (5μm), ένα ανιχνευτή δείκτη διαθλάσεως (RI) και έναν UV/VIS (254nm). Χλωροφόρμιο χρησιμοποιήθηκε ως μέσο έκλουσης σε ρυθμό ροής 1mL/min. Πρότυπα δείγματα πολυστυρολίου με χαμηλή πολυδιασπορά χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν καμπύλες βαθμονόμησης. Διαλύματα των προϊόντων σε CHCl 3 συγκέντρωσης 4mg/ml παρασκευάσθηκαν. Στα ανωτέρω διαλύματα, μία μικρή ποσότητα τολουολίου προστέθηκε, που χρησιμοποιείται ως δείκτης λήξης του πειράματος. Ο διαλύτης της κινητής φάσης (CHCl 3 ) διηθήθηκε με ηθμό μεγέθους πόρων 5μm ενώ όλα τα προς ανάλυση διαλύματα διηθήθηκαν με φίλτρα διαμέτρου,45μm. Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) διεξήχθη με χρήση του DSC 292 CE, ΤΑ Instruments. Δείγματα 9-1mg ζυγίστηκαν σε αλουμινένιο δισκίο και ένα άδειο χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά. Τα δείγματα αρχικά θερμάνθηκαν από τους -3 o C έως τους 2 o C με ρυθμό θέρμανσης 1 o C min -1 (first run). Στη συνέχεια ακολούθησε ψύξη μέχρι τους -3 o C και τελικά θέρμανση από τους -3 o C έως τους 2 o C με ρυθμό θέρμανσης 1 o C min -1. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν υπό ροή αζώτου 5mL/min. Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Έχει αναφερθεί ότι ΡΗΑs συσσωρεύονται σε μικτούς βακτηριακούς πληθυσμούς, όταν υποβάλλονται σε αερόβια δυναμική σίτιση και μεταβολίζουν οξέα προς ακετυλο-cοα, το οποίο εν μέρει διοχετεύεται στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) για την κυτταρική ανάπτυξη και την παραγωγή NAD(Ρ)Η, και εν μέρη χρησιμοποιείται για την παραγωγή ΠΥΑ ως πηγής ενέργειας και άνθρακα κάτω από στρες συνθήκες (Dias et al., 26). Στα παλίσια της παρούσας εργασίας διαφορετικές πηγές άνθρακα ελέγχθηκαν ως προς την καταλληλότητά τους για την παραγωγή ΠΥΑ. Για την εκκίνηση του SBR συνθετικής τροφοδοσίας σε άνθρακα, που ήταν και ο πρώτος, χρονικά, που λειτούργησε, χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο μια εμπλουτισμένη μικροβιακή καλλιέργεια που προήλθε από χώμα, όπως περιγράφεται παραπάνω. Στη συνέχεια, αυτός ο αντιδραστήρας λειτούργησε ως πηγή εμβολιασμών για όλους τους υπόλοιπους αντιδραστήρες. Η λειτουργία των SBR ως προς την κατανάλωση αζώτου και άνθρακα, με πηγές άνθρακα α) μίγμα οξέων και β) μίγμα οξέων/γλυκερόλης παρουσιάζεται στο σχήμα 1. Και στις δυο περιπτώσεις για τη λειτουργία των αντιδραστήρων ακολουθήθηκε το ίδιο πρόγραμμα τροφοδοσίας, ενώ η οργανική φόρτιση και η φόρτιση σε άζωτο σε κάθε κύκλο ήταν παρόμοιες και συνολικά η λειτουργία φαίνεται αρκετά σταθερή. Ο τελευταίος κύκλος άνθρακα και για τους δυο αντιδραστήρες πραγματοποιήθηκε ως διαλείποντος έργου με συχνή δειγματοληψία προκειμένου να διερευνηθεί η κινητική των μικροοργανισμών που είχαν επικρατήσει σε κάθε περίπτωση. Η κατανάλωση του ΧΑΟ (μετρούμενο, και υπολογιζόμενο βάσει μετρούμενων οξέων και γλυκερόλης) παρουσιάζονται στο σχήμα 2. Όπως φαίνεται και στις δύο περιπτώσεις υπάρχει προτίμηση στην κατανάλωση υποστρωμάτων μιας και δεν καταναλώνονται ταυτόχρονα και επίσης επιβεβαιώνεται ότι αυτή η προτίμηση εξαρτάται από το είδος των βακτηρίων και του υποστρώματος μιας και δεν είναι τα ίδια για τους δύο αντιδραστήρες. Συγκεκριμένα όταν χρησιμοποιήθηκαν VFAs ως πηγή άνθρακα, η εμπλουτισμένη καλλιέργεια φαίνεται να καταναλώνει κατά προτίμηση βουτυρικό πρώτα, και στη συνέχεια, προπιονικό και οξικό με συγκρίσιμους ρυθμούς. Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι οι θεωρητικά εκτιμώμενες τιμές COD του οξικού, προπιονικού και βουτυρικού είναι σχεδόν ταυτόσημες με τις πειραματικά μετρούμενες τιμές καθ 'όλη τη διάρκεια του πειράματος (Σχήμα 2). Όταν ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα γλυκερόλης και οξέων (VFAs), η κατανάλωση γλυκερόλης ξεκίνησε ταυτόχρονα με των οξέων, ενώ η προτίμηση για βουτυρικό έναντι των άλλων δύο οξέων εξακολούθησε να παρατηρείται. Όπως είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία, το βουτυρικό πολυμερίζεται προς P3HB άμεσα και έτσι αναμένεται να καταναλωθεί πρώτα, ενώ οι μεταβολικές οδοί για παραγωγή ΡΗΑs από οξικό και προπιονικό είναι πιο πολύπλοκες (Wang et al., 21). Τα βασικά χαρακτηριστικά και οι αποδόσεις για όλα τα πειράματα διαλείποντος έργου που πραγματοποιήθηκαν με τις βασικές πηγές άνθρακα που ελέγχθηκαν για παραγωγή ΠΥΑ, συνοψίζονται στον πίνακα 1. Όπως φαίνεται στον πίνακα 1, σε όλες τις περιπτώσεις διατηρείται ο λόγος N/C μηδενικός και η διακύμανση του ph κινείται στα ίδια επίπεδα Επίσης φαίνεται ότι οι χαμηλότερες αποδόσεις παραγωγής PHAs, που μετρούνται είτε ως g ΠΥΑ/g ΧΑΟ που καταναλώνονται (Y PHAs/COD ), είτε ως g ΠΥΑ/g VSS (Y PHAs/VSS ), παρουσιάζονται στην περίπτωση που χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα η καθαρή γλυκερόλη η οποία είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (Reinecke και Steinbüchel, 29), ενώ οι υψηλότερες στη μικτή πηγή άνθρακα. Αυτό δικαιολογείται, όπως προαναφέρθηκε και στην εισαγωγή, στο γεγονός ότι οι καλλιέργειες είναι μικτές, με αποτέλεσμα το κάθε είδος μικροοργανισμών που υπάρχει, να δείχνει ιδιαίτερη προτίμηση σε διαφορετικές ουσίες ως θρεπτικά και να αποδίδει έτσι καλύτερα ως προς την παραγωγή βιοπλαστικού, σε σύγκριση με την περίπτωση μιας μόνο ουσίας, που έχει σαν αποτέλεσμα την απόδοση κυρίως αυτών που μπορούν να τη μεταβολίσουν πιο γρήγορα και αποτελεσματικά. Αυτό βέβαια έχει σαν συνέπεια οι υπόλοιποι μικροοργανισμοί να μένουν ανενεργοί ή/και να πεθαίνουν και άρα μειωμένη συνολική παραγωγή βιοπλαστικού. Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

7 N COD (mg O 2 /L) VFAs (mg/l) COD (mg/l) N-NH4 (mg/l) 7 (a) N (b) 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 4 35 3 25 2 15 1 5 COD 5 1 15 2 25 3 35 4 45 time (days) COD (mg O 2 /L) N-NH 4 (mg/l) Σχήμα 1. Μεταβολή του Ν-ΝΗ 4 και ΧΑΟ κατά τη λειτουργία των SBR με, (α) μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων (VFAs), (β) μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων και γλυκερόλης 4 35 3 25 2 15 1 5 COD 5 1 15 2 25 3 35 4 time (days) (a) (b) 4 35 CODmeas COD est 4 35 CODmeas CODglyc COD(VFAs) 3 3 VFAs (mg/l) COD (mg/l) 25 25 2 2 15 15 1 1 5 5 7 6 Acetate Propionate Butyrate 7 6 Acetate Propionate Butyrate 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 Σχήμα 2. Μεταβολή του ΧΑΟ και των VFAs ως προς τον χρόνο σε φάση απουσίας Ν-ΝΗ 4 σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου, (a) Συνθετικής τροφοδοσίας άνθρακα (VFAs), (b) Μικτής τροφοδοσίας άνθρακα (VFAs και γλυκερόλη) Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

COD (mg/l) N-NH 4 (mg/l) N-NH 4 (mg/l) Glycerol (mg/l) OD (A) COD (mg/l) 9 ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά και τελικές αποδόσεις ΠΥΑ από διαφορετικά υποστρώματα N/C (mgn-nh 4 /g COD) COD cons (mg/l) ph Y PHAs/VSS (g/1g VSS) Y PHAs/COD (g /g COD cons) Γλυκερόλη 2177.5±143.5 7.-7.2 24.4±2..1±.1 VFAs 3213 ± 16 7.7-8.7 39.4 ± 2.8.25 ±.1 Μικτή 3281 ± 29 7.7-8.4 35.2 ± 3.6.39 ±.1 ΖΑΓ 3834 ± 76 7.2-7.5 4.6± 3.5.15 ±.1 2,25 2, R1 R2 75 COD R1 COD R2 1,75 6 1,5 45 1,25 1, 3,75 15,5 15 N-R1 N-R2 15 Glycerol R1 Glycerol R2 12 125 1 9 75 6 5 3 25 2 4 6 8 1 2 4 6 8 1 Σχήμα 3. Μεταβολή της βακτηριακής βιομάζας (OD 55 ), του ΧΑΟ, του Ν-ΝΗ 4 και της γλυκερόλης ως προς τον χρόνο χρησιμοποιώντας σαν πηγή άνθρακα ζυμωμένη ακατέργαστη γλυκερόλη σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 PDO Glyc 1 2 3 4 5 6 Σχήμα 4: Κατανάλωση ΧΑΟ και Ν-ΝΗ4 κατά τον έλεγχο παραγωγής ΠΥΑ 1,3 προπανοδιόλη ή γλυκερόλη ως μοναδική πηγή άνθρακα. 5 4 3 2 1 N-PDO N-Glyc Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

Στα πειράματα που έγιναν με τροφοδοσία άνθρακα, τη ζυμωμένη ακατέργαστη γλυκερόλη (ΖΑΓ) (Σχήμα 3), η κατανάλωση του COD δεν ήταν πλήρης, ούτε στην πρώτη ούτε στη δεύτερη φάση τροφοδοσίας. Η μικροβιακή ανάπτυξη (λόγω της αύξησης ή πολυμερισμού) σταμάτησε όταν εξαντλήθηκε το αμμωνιακό άζωτο (σε 4 ώρες και 42 ώρες, για τον αντιδραστήρα 1 και 2, αντίστοιχα). Η κατανάλωση της γλυκερόλης και των πτητικών λιπαρών οξέων ήταν αποτελεσματική, τόσο παρουσία όσο και απουσία του αζώτου, ενώ το υπολειπόμενο COD οφειλόταν στη μη καταναλώσιμη 1.3 προπανοδιόλη που υπήρχε. Πρέπει να σημειωθεί ότι προγενέστερα του πειράματος με ΖΑΓ είχε πραγματοποιηθεί μια δοκιμή με καθαρή 1.3-προπανοδιόλη ως πηγή σε άνθρακα παράλληλα με αυτή της γλυκερόλης όπως φαίνεται στο σχήμα 4. Όπως φαίνεται η βακτηριακή ανάπτυξη είναι εφικτή και από τα δύο υποστρώματα, αφού το COD καταναλώνεται και στις δύο περιπτώσεις ταυτόχρονα για την αφομοίωση του αζώτου. Ωστόσο, όταν το άζωτο εξαντληθεί, η κατανάλωση της 1,3 προπανοδιόλης παύει σε αντίθεση με τη γλυκερόλη που μπορεί ακόμη να καταναλωθεί. Φαίνεται επομένως, ότι η γλυκερόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια τόσο για την ανάπτυξη, όσο και για τον πολυμερισμό προς ΡΗΑs, ενώ η 1,3 προπανοδιόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για την ανάπτυξη. Είναι όντως αλήθεια ότι πολλά βακτήρια έχουν αναφερθεί για την παραγωγή ΡΗΑs από γλυκερόλη (da Silva et al., 29), ενώ η παραγωγή ΡΗΑs από 1,3 προπανοδιόλη έχει μέχρι στιγμής σημειωθεί σε μία μόνο μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μικροοργανισμοί Chromobacterium sp. Στον πίνακα 2, φαίνεται η σύνθεση του παραγόμενου ΡΗΑ για κάθε περίπτωση τροφοδοσίας σε άνθρακα. Εύκολα μπορεί να γίνει αντιληπτό ότι το 3HB είναι το κύριο μονομερές που ανιχνεύθηκε σε όλες τις περιπτώσεις, πράγμα που συνεπάγεται ότι ο άνθρακας κατά κύριο λόγο προωθείται προς το ομοπολυμερές, P3HB ή συμπολυμερή αυτού με άλλα μονομερή. Εντυπωσιακό είναι το γεγονός ότι στην περίπτωση της απλής πηγής άνθρακα (καθαρή γλυκερόλη) έχουμε παραγωγή ομοπολυμερούς ενώ στις περιπτώσεις σύνθετης έχουμε παραγωγή συμπολυμερών, διαφορετικής βέβαια σύνθεσης. Αυτή η διαπίστωση έρχεται σε συμφωνία με τα παραπάνω, αλλά και με τη βιβλιογραφία, μιας και έχει αναφερθεί ότι οι διαφορές στη σύνθεση των ΡΗΑs οφείλονται κυρίως στα είδη της πηγής άνθρακα που χρησιμοποιούνται (Gumel et al., 212). Συγκεκριμένα το οξικό οξύ όταν χρησιμοποιείται ως μόνη πηγή σε άνθρακα μπορεί να μεταβολισθεί σε P3HB αλλά σε περίπτωση που χρησιμοποιείται μαζί με προπιονικό, αυτό έχει σαν αποτέλεσμα και την συμπαραγωγή 3ΗV (3-υδροξυβαλερικό οξύ). Από την άλλη πλευρά, η πρόσληψη γλυκερόλης για την παραγωγή ενώσεων ΡΗΑs δημιουργεί P3HB αποκλειστικά. Συνεπώς, στα πειράματα VFAs και Mixed η παραγωγή συμπολυμερών μονάδων 3HB και 3HV αναμένεται, και επιβεβαιώνεται από την ανάλυση μέσω 1 Η-NMR. Είναι επίσης ενδιαφέρον το γεγονός ότι στην περίπτωση (Mixed), το ποσοστό του 3HB είναι αυξημένο σε σύγκριση με τον πολυεστέρα που προέρχεται από την (VFAs), αλλά όχι αναλογικά με την αρχική αναλογία της γλυκερόλης στο μίγμα. Μπορεί να θεωρηθεί, επομένως, ότι υπό αυτές τις συνθήκες, η γλυκερόλη χρησιμοποιείται κυρίως για τη συντήρηση των κυττάρων, ενώ τα πτητικά λιπαρά οξέα κυρίως για πολυμερισμό. Στο δε πείραμα F.C.G. ο πολυεστέρας που ανακτήθηκε ήταν ένα συν-πολυμερές των 3HB και 3- υδροξυεξανοϊκού οξέος (3HH), ενώ 3HV δεν ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση 1 Η-NMR. Αυτή η συμπεριφορά μπορεί να αποδοθεί στην πολύ χαμηλή περιεκτικότητα της τροφοδοσίας σε προπιονικό και στις σημαντικές ποσότητες σε εξανοϊκό, που είναι ο πρόδρομος της 3HH. Επίσης μπορεί να παρατηρηθεί και μια διακύμανση στα μοριακά βάρη και αριθμούς. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι ανάλογα με τον μικροβιακό πληθυσμό που έχει αναπτυχθεί σε κάθε είδος αντιδραστήρα, υπάρχει και διαφορετική επιλεκτικότητα στο πως θα κατανεμηθεί ο άνθρακας της τροφοδοσίας ανάμεσα στην βακτηριακή ανάπτυξη και στη βιοσυσσώρευση PHAs. Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

Πίνακας 2. Σύνθεση, μέσω ανάλυσης 1 H-NMR, και μοριακά βάρη των ανακτημένων ΠΥΑ από διαφορετικά υποστρώματα. 3ΗΒ 3HV 3HH % % % Mw (1 4 Da) Mn (1 4 Da) Mw/Mn Γλυκερόλη R1 R2 1 1 14.54 149.39 54.19 74.4 2.59 2.1 VFAs 8 2 181.59 113.58 1.59 Μικτή 85 15 87.52 37.71 2.32 ΖΒΓ R1 R2 95 95 5 5 164.25 178.48 12.24 132.24 1.62 1.39 Όπως περαιτέρω αποκαλύπτεται με ανάλυση DSC, τα αποτελέσματα της οποίας παρουσιάζονται στον πίνακα 3 για όλες τις περιπτώσεις, τα δείγματα παρουσιάζουν θερμοκρασίες τήξης (Τ m ), από 154,78 έως 165,8 o C. Οι τιμές αυτές είναι ενδιάμεσα σε αυτές των μονομερών P3HB T m (168-18 o C) και P3HV T m (15-11 o C) (Pereira et al, 28), γεγονός που υποδηλώνει τη συμπολυμερική φύση του παραγόμενου πολυμερούς. Το δε 3ΗΗ βρίσκεται σε πολύ μικρό ποσοστό. Το πολυμερές με την υψηλότερη ποσοστιαία παρουσία σε 3HB παρουσιάζει επίσης την υψηλότερη θερμοκρασία τήξης και πιο κοντινή σε αυτή του καθαρού P3HB (δείγμα F.C.G με 95% 3ΗΒ), ενώ η χαμηλότερη τιμή T m παρατηρήθηκε για το δείγμα VFAs, το οποίο έχει τη χαμηλότερη ποσοστιαία παρουσία σε 3HB (8% 3ΗΒ). Σε γενικές γραμμές, είναι σαφές ότι η μείωση του σημείου τήξης σε σύγκριση με ένα καθαρό δείγμα P3HB οφείλεται στην εισαγωγή των 3HV και 3ΗΗ για να σχηματίσουν ένα συμπολυμερές, το οποίο φέρει μεγαλύτερες πλευρικές αλυσίδες. Οι υψηλότερες τιμές ΔΗ m υποδεικνύουν την ύπαρξη αλυσίδων πολυμερούς στο δείγμα, υψηλής κρυσταλλικότητας. Αυτές οι αλυσίδες είναι μάλλον γραμμικές και με συμμετρική κατανομή. Επιπλέον, είναι προφανές ότι μια υψηλότερη περιεκτικότητα του 3HB οδηγεί σε υψηλότερες τιμές της ΔΗ m, μια παρατήρηση που είναι σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία (Bengtsson et al, 21). Ένα άλλο θερμικό αποτέλεσμα είναι ότι η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης παρατηρείται από -4 o C ως 1,6 o C. Η μετάβαση για το καθαρό P3HB είναι περίπου 3 o C (Pereira et al., 28). Η χαμηλή Tg που παρατηρείται δηλώνει ότι μια άμορφη φάση φαίνεται να συνυπάρχει. Πίνακας 3. Θερμοδυναμικές ιδιότητες των ανακτημένων PHAs από διαφορετικά υποστρώματα T g ( o C) ΔΗ cc (J/g) T cc ( o C) T m ( o C) ΔΗ m (J/g) Γλυκερόλη VFAs 11.6 27.74 71.29 153.93 2.82 Μικτή -4.2 37.87 63.96 156.51 46.4 ΖΒΓ R1 R2 1.63.8 46.79 39.92 57.14 56.44 165.8 161.4 6.58 56.31 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η παραγωγή ΠΥΑ από μικτό πληθυσμό βακτηρίων με χρήση διαφορετικών πηγών άνθρακα, απλών και σύνθετων. Τα βασικά συμπεράσματα είναι ότι α) για μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών οι σύνθετες τροφοδοσίες είναι πιο αποτελεσματικές στην παραγωγή βιοπλαστικών, β) ανάλογα με τον βακτηριακό πληθυσμό που έχει αναπτυχθεί υπάρχει και η ιδιαίτερη προτίμηση προς κατανάλωση συγκεκριμένων θρεπτικών σε άνθρακα, γ) το υπόστρωμα και κυρίως η πηγή σε άνθρακα, καθορίζει το είδος μικροοργανισμών που θα επικρατήσει καθώς και τη σύσταση του βιοπλαστικού που θα παραχθεί, δ) αναλόγως του μικροβιακού πληθυσμού που έχει αναπτυχθεί, υπάρχει και Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213

διαφορετική επιλεκτικότητα στο πως θα κατανεμηθεί ο άνθρακας της τροφοδοσίας ανάμεσα στην βακτηριακή ανάπτυξη και στη βιοσυσσώρευση PHAs, ε) ανεξαρτήτως των πηγών σε άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν, το μονομερές 3ΗΒ ξεκάθαρα είναι επικρατέστερο με αποτέλεσμα τα συμπολυμερή με μεγάλα ποσοστά σε αυτό να έχουν αρκετές ιδιότητες κοντά με αυτές του Ρ3ΗΒ τέλος στ) σε όλα τα συμπολυμερή που παράχθηκαν υπήρχε ενσωματωμένη μια άμορφη φάση. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Οι συγγραφείς ευχαριστούν την ΓΓΕΤ για την χρηματοδότηση της παρούσας εργασίας μέσω του ερευνητικού προγράμματος BIOREF, 9-ΣΥΝ-81-715. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] APHA, AWWA & WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th Ed., Washington, D.C. (1995) [2] Bengtsson, S., Pisco, A.R., Johansson, P., Lemos, P.C., Reis M.A.M. Molecular weight and thermal properties of polyhydroxyalkanoates produced from fermented sugar molasses by open mixed cultures. J. Biotec. 147: 172 179 (21) [3] Chen, G-Q. A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials industry. Chem. Soc. Rev. 38: 2434 2446 (29). [4] da Silva, G.P., Mack, M., Contiero, J. Glycerol: A promising and abundant carbon source for industrial microbiology Biotech. Adv. 27: 3-39 (29). [5] Dionisi, D., Carucci, G., Petrangeli Papini, M., Riccardi, C., Majone, M., Carrasco, F. Olive oil mill effluents as a feedstock for production of biodegradable polymers. Water Research, 39: 276-284 (21). [6] Kimura, H., Yamamoto, T., Iwakura, K. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates from 1,3-propanediol by Chromobacterium sp. Polymer Journal, 34: 659-665 (22). [7] Madden, L.A., Anderson, A.J., Shah, D.T., Asrar, J. Chain termination in polyhydroxyalkanoate synthesis: Involvement of exogenous hydroxy-compounds as chain transfer agents. Int. J. Biol. Macrom. 25: 43 53 (1999). [8] Ntaikou, I., Kourmentza, C., Koutrouli, E.C., Stamatelatou, K., Zampraka, A., Kornaros, M., Lyberatos, G. Exploitation of olive oil mill wastewater for combined biohydrogen and biopolymers production. Biores. Tech.1: 3724-373 (29). [9] Reinecke, F, Steinbuchel A. Ralstonia eutropha strain H16 as model organism for PHA metabolism and for biotechnological production of technically interesting biopolymers. J. Μol. Microb. Biotec. 16: 91 18 (29) [1] Saraphirom, P., Reungsang, A., Plangklang, P. Polyhydroxyalkanoates production from effluent of hydrogen fermentation process by Cupriavidus sp. KKU38. Environ. Techn. (United Kingdom) 34: 477-483 (213). [11] Wang J., Yue Z.-B., Sheng G.-P., Yu H.-Q. Kinetic analysis on the production of polyhydroxyalkanoates from volatile fatty acids by Cupriavidus necator with a consideration of substrate inhibition, cell growth, maintenance, and product formation. Biochemical Engineering Journal, 49: 422-428 (21) [12] Zhu C, Nomura CT, Perrotta JA, Stipanovic AJ, Nakas JP. Production and characterization of poly-3-hydroxybutyrate from biodiesel-glycerol by Burkholderia cepacia ATCC 17759. Biotechnology Progress 26: 424 43 (21). Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Αθήνα 23-25/5/213