Το οπτικό μικροσκόπιο και ο τρόπος χρήσης του

Το οπτικό μικροσκόπιο και ο τρόπος χρήσης του Το ανθρώπινο μάτι μπορεί να διακρίνει λεπτομέρειες της τάξης των 50-200 μm. Ο άνθρωπος με τις πρωτοποριακές εφευρέσεις των Malpighi, Hooke, Van Leeuwenhook και Jensen, κατόρθωσε να δει κάτω από το φράγμα των 50 μm. Από τότε το μικροσκόπιο εξελίχθηκε σε όργανο με πολλές δυνατότητες, με αποτέλεσμα λεπτομέρειες της τάξης του 0,1 μm, να γίνονται πλέον ορατές. Ένα απλό μικροσκόπιο αποτελείται από τέσσερα βασικά μέρη: οπτικό, συγκεντρωτικό, φωτιστικό και μηχανικό. Το φωτονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί φωτεινή πηγή, που με τη συμβολή του συγκεντρωτικού φακού την εστιάζει στο βιολογικό παρασκεύασμα, που βρίσκεται στη τράπεζα του μικροσκοπίου και στη συνέχεια η δέσμη περνάει από τον αντικειμενικό φακό και το προσοφθάλμιο σύστημα και καταλήγει στο μάτι του παρατηρητή. Ταυτόχρονα δίνεται η δυνατότητα στο χειριστή με ένα σύστημα κοχλιών να αυξομειώνει την εστιακή απόσταση και να αλλάζει την ένταση του διερχόμενου φωτισμού. 1

Από τι εξαρτάται η καλή μικροσκόπηση Η καλή μικροσκόπηση εξαρτάται από 3 πράγματα: 1 ο Διακριτική ικανότητα: είναι η ικανότητα του μικροσκοπίου να δείχνει δύο πολύ κοντινά σημεία ως δύο καθαρά ξεχωριστά σημεία. Στα εκπαιδευτικά μικροσκόπια αυτή η ικανότητα είναι περίπου 0,5μm. 2 ο Μεγέθυνση: συνήθως είναι μέχρι 1000Χ. Έχει αποδειχθεί ότι η διακριτική ικανότητα δεν αυξάνεται (δηλαδή δεν μειώνεται το διακριτικό όριο) όταν η ολική μεγέθυνση ξεπερνά το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού πάνω από 1000 φορές. 3 ο Αντίθεση: βασίζεται στη διαφορετική απορρόφηση του φωτός από τα διάφορα μέρη του αντικειμένου. Ενισχύεται με τη χρήση χρωστικών. Ρύθμιση ανοίγματος του διαφράγματος (ίριδα) Το διάφραγμα αυτό είναι προσαρτημένο στον πυκνωτή και σχεδιάστηκε για την ρύθμιση του αριθμητικού ανοίγματος του και όχι για την λαμπρότητα του φωτισμού. Το άνοιγμα του διαφράγματος μπορεί να ρυθμιστεί έτσι ώστε να ταιριάζει με το αριθμητικό άνοιγμα του εκάστοτε χρησιμοποιούμενου αντικειμενικού φακού, με σκοπό την βέλτιστη απόδοση του αντικειμενικού, όπως το βάθος πεδίου, η αντίθεση και η διακριτική ικανότητα. Η ένταση του φωτός είναι επίσης μια πολύ σημαντική παράμετρος στην διαμόρφωση της ποιότητας της εικόνας που επιτυγχάνετε. Υπάρχουν παρασκευάσματα που προκειμένου να παρατηρηθούν, απαιτείται μεγάλης έντασης φωτισμός (παρασκευάσματα τομών μεγάλου πάχους κλπ.). Στην περίπτωση αυτή αυξάνουμε την ένταση του φωτισμού προκειμένου να έχουμε καλή εικόνα. Αντιθέτως υπάρχουν παρασκευάσματα στα οποία το φως δεν απορροφάται σημαντικά (πχ. διαφανή παρασκευάσματα). Εδώ προκειμένου να διακρίνουμε σχήματα και δομές χαμηλώνουμε την ένταση του φωτισμού. Ο κυριότερος από τους φακούς του μικροσκοπίου είναι ο αντικειμενικός φακός, ο οποίος έχει τη ιδιότητα να συγκεντρώνει τις ακτίνες του φωτός από ένα σημείο του παρασκευάσματος, να μεγεθύνει το αντικείμενο και να προβάλλει την εικόνα στη διεύθυνση του προσοφθάλμιου φακού, ο οποίος μεγαλώνει επιπλέον την εικόνα και την προβάλλει στο μάτι του παρατηρητή, σε οθόνη ή φωτογραφική πλάκα. Το μήκος του αντικειμενικού φακού ποικίλει ανάλογα με τη μεγεθυντική του ικανότητα. Φακοί μικρής μεγεθυντικής ικανότητας έχουν μικρότερο μήκος και βρίσκονται σε μεγαλύτερη απόσταση από την τράπεζα του μικροσκοπίου. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να αυξάνει το οπτικό πεδίο και η επιφάνεια παρατήρησης. Όταν ξεκινάμε την παρατήρηση ενός αντικειμένου με το μικροσκόπιο, χρησιμοποιούμε το φακό μικρής μεγέθυνσης. Όταν παρατηρούμε με το φακό μεγάλης μεγέθυνσης, εστιάζουμε με τον μικρομετρικό κοχλία. Στο ρεβόλβερ των φακών είναι βιδωμένοι οι διάφοροι αντικειμενικοί φακοί με μεγεθυντική ικανότητα Χ4, Χ10, Χ40 και ο ελαιοκαταδυτικός Χ100. Στην πραγματικότητα τόσο ο προσοφθάλμιος όσο και ο αντικειμενικός φακός μικροσκοπίου δεν είναι απλοί φακοί, αλλά αποτελούν συστήματα δύο ή και περισσοτέρων φακών ώστε να αίρονται τα σφάλματα των φακών (σφάλμα σφαιρικότητας και χρωματικό σφάλμα) αλλά και για να συγκεντρώνεται το φως προς ευκρινή παρατήρηση του αντικειμένου, 2

Η ολική μεγέθυνση υπολογίζεται αν πολλαπλασιάσουμε τη μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού με αυτή του προσοφθάλμιου φακού (ο οποίος έχει μεγέθυνση Χ10). Προϋπόθεση για την καλή λειτουργία του μικροσκοπίου, είναι η κατά το δυνατόν ευθύγραμμη διαδρομή, χωρίς εκτροπή, της φωτεινής δέσμης από κάποιο σημείο του αντικειμένου ως τον αντικειμενικό φακό. Αυτό σημαίνει ότι ο συμπυκνωτής, το περιβάλλον του αντικειμένου και ο αντικειμενικός φακός πρέπει να έχουν περίπου τον ίδιο δείκτη διάθλασης. Η δίοδος των ακτινών μέσα από στρώμα αέρα αυξάνει την εκτροπή των ακτίνων και εξασθενεί το είδωλο. Γι αυτό κάθε παρασκεύασμα παρατηρείται μέσα σε σταγόνες νερού. Η αναγκαιότητα της καλυπτρίδας Η διόρθωση των σφαλμάτων των αντικειμενικών φακών (σφάλμα σφαιρικότητας και χρωματικό σφάλμα) ισχύει υπό την προϋπόθεση ότι μεταξύ αντικειμένου και φακού παρεμβάλλεται καλυπτρίδα ορισμένου πάχους (0,17 ή 0,18 mm) και από ορισμένο υλικό (με δείκτη διάθλασης 1,52). Αυτό έχει μεγάλη σημασία για τους φακούς μεγάλου αριθμητικού ανοίγματος με τους οποίους πετυχαίνουμε και μεγαλύτερο διακριτικό όριο. Χρήση χρωστικών Τα περισσότερα βιολογικά παρασκευάσματα είναι άχρωμα. Αυτό περιορίζει τη δυνατότητα ευκρινούς παρατήρησης και διάκρισης των διαφόρων λεπτομερειών. Έτσι, τα βιολογικά παρασκευάσματα χρωματίζονται με διάφορες χρωστικές (π.χ. διάλυμα Lugol δηλ. υδατικό διάλυμα στερεού ιωδίου και ιωδιούχου καλίου: 1-2g I 2 και 4g KI σε 100 ml H 2 O) με τρόπο ώστε στα διάφορα κυτταρικά συστατικά να παρατηρούνται διαφορές χρωματικής εντάσεως ή διαφορά χρωματισμού. Αυτό βελτιώνει εντυπωσιακά την εικόνα. Το αντικείμενο παρατήρησης τοποθετείται πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα, μπορεί να χρωματιστεί ανάλογα, καλύπτεται με καλυπτρίδα, μεταφέρεται στη τράπεζα του μικροσκοπίου, στερεώνεται με τα πίεστρα και αρχίζει η παρατήρηση. Χρήση φίλτρων Η αποτελεσματικότητα του μικροσκοπίου αυξάνει παραπέρα με τη χρήση κατάλληλων φίλτρων μπλε ή πράσινου χρώματος (δες λεπτομέρειες παρακάτω στο οπτικό σύστημα του μικροσκοπίου). 3

Για να εκτελέσετε μικροσκοπήσεις με τον Χ100 φακό (φακός με μικρή εστιακή απόσταση και μικρή περιοχή οπτικού πεδίου) θα πρέπει να μην μεσολαβεί αέρας μεταξύ φακού και καλυπτρίδας του παρασκευάσματος. Για τον λόγο αυτό τοποθετούμε μια σταγόνα ελαιοκαταδυτικού υγρού (π.χ. κεδρέλαιο) επί της καλυπτρίδας έτσι ώστε αυτό να παρεμβάλλεται ανάμεσα στο αντικείμενο και τον αντικειμενικό φακό και με αυτόν τον τρόπο να περιορίζεται η εκτροπή των ακτινών (αύξηση διακριτικής ικανότητας). Στην συνέχεια με προσεκτικές και αργές κινήσεις βυθίζουμε τον καταδυτικό φακό 100Χ στην σταγόνα και προσπαθούμε να πετύχουμε την καλύτερη δυνατή εστίαση. Το ελαιοκαταδυτικό υγρό (π.χ. κεδρέλαιο) παρουσιάζει δείκτη διάθλασης παραπλήσιο προς αυτόν του αντικειμενικού φακού (πολύ μεγαλύτερου από τον δείκτη διάθλασης του αέρα), οπότε λόγω του περιορισμού των φαινομένων διάθλασης και ολικής ανάκλασης του φωτός στη γυάλινη επιφάνεια της καλυπτρίδας αυξάνεται τόσο η διαχωριστική ικανότητα του μικροσκοπίου όσο και η φωτεινότητα του τελικού ειδώλου. Το στερεοσκόπιο Στα οπτικά μικροσκόπια παρατηρούμε τα (διαφανείς) αντικείμενα σε δύο διαστάσεις επίπεδες (διαφανείς στο φως) τομές. Με το στερεοσκόπιο είναι δυνατή η τρισδιάστατη παρατήρηση αδιαφανών αντικειμένων/ σωμάτων. 4

Διαφέρει από το οπτικό μικροσκόπιο στο ότι αντί για ένα αντικειμενικό φακό χρησιμοποιούνται δύο αντικειμενικοί φακοί ταυτοχρόνως. Βασικό του ελάττωμα είναι η μικρή μεγέθυνση (Χ300) που προσφέρει. Το οπτικό σύστημα του μικροσκοπίου Το πιο σημαντικό τμήμα του μικροσκοπίου είναι το οπτικό του σύστημα, δηλαδή ένα σύστημα από φακούς κατάλληλα διευθετημένους, και οι ιδιότητες του οργάνου ταυτίζονται κατά κύριο λόγο με τις ιδιότητες των φακών που σχετίζονται με το φαινόμενο της διάθλασης του φωτός. Το οπτικό σύστημα αποτελείται από δύο συγκλίνοντα ομοαξονικά συστήματα φακών που αποτελούν τον αντικειμενικό και τον προσοφθάλμιο φακό. Ο πρώτος έχει μικρή εστιακή απόσταση. Το αντικείμενο τοποθετείται λίγο πέρα από την εστία του φακού και έτσι σχηματίζεται είδωλο πραγματικό και ανεστραμμένο. Ο δεύτερος είναι ο φακός με τον οποίο ο παρατηρητής βλέπει το αντικείμενο και χρησιμεύει για να μεγεθύνει την πραγματική εικόνα που δίνει ο αντικειμενικός. Η απόσταση μεταξύ των δύο φακών πρέπει να είναι μεγαλύτερη από το άθροισμα των εστιακών τους αποστάσεων, ώστε το είδωλο του αντικειμενικού να σχηματίζεται ανάμεσα στο 5

οπτικό κέντρο και την κύρια εστία του προσοφθάλμιου. Κατά συνέπεια προκύπτει φανταστικό είδωλο, μεγεθυσμένο, του πρώτου ειδώλου. Ο κυριότερος οπτικός συντελεστής της διακριτικής ικανότητας του οργάνου είναι το αριθμητικό άνοιγμα (Α). Το αριθμητικό άνοιγμα ορίζεται από την σχέση A=n.ημα (1) όπου n ο δείκτης διάθλασης του μέσου και α το μισό της γωνίας που σχηματίζεται μεταξύ των ακραίων ακτινών που εισέρχονται στον αντικειμενικό φακό και προέρχονται από το αντικείμενο. Εξάλλου, διακριτική ικανότητα οπτικού οργάνου είναι η ελάχιστη απόσταση (d) ανάμεσα σε δύο σημεία που τα είδωλα τους διακρίνονται ξεχωρισμένα μεταξύ τους. Αυτή είναι ανάλογη με το μήκος κύματος της χρησιμοποιούμενης ακτινοβολίας (λ) και αντίστροφη με το αριθμητικό άνοιγμα του φακού, σύμφωνα με τη σχέση d=λ/α=λ/(n.ημα) (2). Κατά συνέπεια όσο μικραίνει το μήκος κύματος και όσο μεγαλώνει το αριθμητικό άνοιγμα τόσο ελαχιστοποιείται το d, δηλαδή τόσο αυξάνεται η διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου. Από τη σχέση (1) φαίνεται ότι δεν μπορεί η αύξηση του αριθμητικού ανοίγματος να είναι απεριόριστη γιατί: η αύξηση του ημίτονου της γωνίας α δεν μπορεί να υπερβεί την μονάδα, ενώ ο δείκτης διάθλασης προσδιορίζεται στην οριακή τιμή 1,4. Με βάση τις παραπάνω προϋποθέσεις η (2) απλοποιείται στην d=0,61.λ. Δηλαδή η διακριτική ικανότητα εξισώνεται περίπου με το μισό του μήκους κύματος της χρησιμοποιούμενης ακτινοβολίας. Επομένως για το μικρότερο μήκος κύματος του ορατού φάσματος που βρίσκεται στα 400nm (μονοχρωματικό ιώδες με την χρήση κατάλληλου φίλτρου) η διακριτική ικανότητα δεν μπορεί να ξεπεράσει την τιμή 200nm. Για το λευκό σύνθετο φως, υπολογίζεται γύρω στα 250nm. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ότι το οπτικό μικροσκόπιο έχει πεπερασμένες δυνατότητες. Κατά συνέπεια η μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα των οργάνων μικροσκοπίας εξασφαλίζεται με τη χρησιμοποίηση άλλων ακτινοβολιών με μικρότερο μήκος κύματος (π.χ. υπεριώδες, δέσμη ηλεκτρονίων κτλ). 6

ΠΗΓΕΣ: 1) Κουγιουμζέλη Περιστεράκη: Στοιχεία Φυσικής ΙΙ,Κυματική, Αθήνα 1967 2) Κ.Δ. Αλεξόπουλου : Γενική Φυσική, τ. 5 ος, Οπτική, Αθήνα 1966 3) Πανεπιστήμιο Κρήτης, Τμήμα Βιολογίας, εργαστήριο Μικροσκοπίας: Οπτικό Μικροσκόπιο 4) ΕΚΦΕ Ομόνοιας: Διαφάνειες Βιολογίας-Μικροσκόπιο 5) Μικροβιολογία Ι, Δημητρακόπουλος Οδ. Γεώργιος, Εκδ. Ίδρυμα Ευγενίδου 1995 7