Βιοκαύσιμα (Biofuels) νοούται τα στερεά, υγρά ή αέρια καύσιμα τα οποία παράγονται από τη βιομάζα

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Δρ. Σεραφείμ Παπανικολάου Επίκουρος Καθηγητής Βιοδιεργασιών Τροφίμων Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Βιομηχανικές Ζυμώσεις προς παραγωγή βιοκαυσίμων και προϊόντων (υψηλής) προστιθέμενης αξίας ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΛΙΠΟΥΣ

Βιοκαύσιμα (Biofuels) νοούται τα στερεά, υγρά ή αέρια καύσιμα τα οποία παράγονται από τη βιομάζα Τα βιοκαύσιμα προέρχονται από μετατροπές της οργανικής ύλης και είναι ανανεώσιμα Κατά την καύση τους τα καύσιμα αυτά εκπέμπουν περίπου ίσες ποσότητες CO 2 με τα αντίστοιχα πετρελαϊκής προελεύσεως Ο άνθρακας τον οποίο περιέχουν είχε δεσμευτεί κατά την δημιουργία της οργανικής ύλης και τούτος επανέρχεται στην ατμόσφαιρα μετά την καύση τους, συνεπώς το ισοζύγιο εκπομπών σε όλο τον κύκλο ζωής του βιοκαυσίμου είναι θεωρητικά μηδενικό Κυριότερα βιοκαύσιμα είναι το βιοντήζελ, η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο

Συνεχόμενη αυξητική τάση της τιμής των καυσίμων τα τελευταία χρόνια

Εφαρμογή αλκοολικής ζύμωσης 1. Παρασκευή αλκοολούχων ποτών Χρήση επιλεγμένων στελεχών της ζύμης Saccharomyces cerevisiae Παραγωγή αλκοόλης (κύριο προϊόν) και τεράστιας πληθώρας δευτερογενών μεταβολικών συστατικών που προσδίδουν γεύση και άρωμα Η αλκοόλη (κυρίως) και το χαμηλό ph συντηρούν το προϊόν

Εφαρμογή αλκοολικής ζύμωσης 2α. Παρασκευή βιοαιθανόλης (ενέργεια) Χρήση επιλεγμένων στελεχών της ζύμης Saccharomyces cerevisiae Χρήση καθαρής αιθανόλης ή μιγμάτων αιθανόλης βανζίνης κάνει «καθαρότερο» τον πλανήτη

Εφαρμογή αλκοολικής ζύμωσης 2β. Παρασκευή βιοαιθανόλης (αύξηση αλκοολικού τίτλου ποτών) Ο αλκοολικός τίτλος στα ποτά δύναται να αυξηθεί με (κλασματική) απόσταξη Σε ποικίλες περιπτώσεις προστίθεται και καθαρή αλκοόλη η οποία πρέπει να είναι πάντοτε βιολογικής προέλευσης

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Σε κάθε περίπτωση η ζύμωση είναι υπό αναεροβίωση και η παραγωγή του προϊόντος (αλκοόλη) είναι συνδεδεμένη με τη μικροβιακή αύξηση Τα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα 1) Σακχαρούχα υποστρώματα: Μελάσες ζαχαροκαλάμου, μελάσες τεύτλων, χυμοί φρούτων, απόβλητα βιομηχανιών πλούσια σε σάκχαρα, τυρόγαλα 2) Αμυλούχα υποστρώματα: Άμυλο σιταριού, καλαμποκιού, πατάτας, cassava Πρωθύστερη επεξεργασία ή SSF 3) Λιγνοκυτταρινούχα υποστρώματα: Προϊόντα ξύλου, απόβλητα βιομηχανιών παραγωγής χάρτου (πλούσια σε λιγνίνη και άλλες πεντόζες) Πρωθύστερη επεξεργασία

Η ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΤΗΣ ΑΛΚΟΟΛΙΚΗΣ ΖΥΜΩΣΗΣ Ι) ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΠΟΥ ΧΩΡΕΙ ΣΤΙΣ ΖΥΜΕΣ Γλυκολυτικό σχήμα Embden-Meyerhof-Parnas Πηγή: Διαμαντίδης 1994 Για κάθε μόριο καταβολιζόμενης γλυκόζης έχομε 2 μόρια παραγόμενου ATP

ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΖΥΜΩΣΗ (ΖΥΜΕΣ) 1. Γλυκόλυση ή μονοπάτι Embden-Meyerhof-Parnas q Μετατροπή γλυκόζης σε πυροσταφυλικό οξύ q Ενεργειακό κέρδος: 2 ΑΤP 2. Αλκοολική ζύμωση q Αποκαρβοξυλίωση πυροσταφυλικού οξέος προς ακεταλδεΰδη q Αναγωγή ακεταλδεΰδης προς αιθανόλη C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2

Παραγωγή γλυκερόλης (γλυκερίνης) κατά την αλκοολική ζύμωση

Η γλυκερόλη αποτελεί για τους ξηρούς οίνους τη τρίτη κατά σειρά ουσία σε μεγάλη αφθονία μετά το νερό και την αιθανόλη (6 10 g/l) Περίπου για 10 μέρη αιθανόλης παράγεται ένα μέρος γλυκερόλης Συνήθως η γλυκερόλη παράγεται στα πρώτα στάδια της ζύμωσης Βελτιώνει την ποιότητα των οίνων γιατί προσδίδει σώμα και ελαφριά γλυκύτητα Στις βιοτεχνολογικές βιομηχανίες παραγωγής βιοαιθανόλης, παράγεται απόβλητο (απόνερο) που περιέχει γλυκερόλη (raw glycerol)

ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ PASTEUR ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Όταν η συγκέντρωση του οξυγόνου στο περιβάλλον αύξησης κατέλθει μιας συγκεκριμένης κριτικής (critical) τιμής (π χ 5 mm Hg), τα πρώτα ένζυμα του κύκλου των τρικαρβοξυλικών οξέων (π χ α-κετογλουταρική αφυδρογονάση), καταστέλλονται ενώ αυξάνει η ενεργότητα κάποιων ενζύμων «κλειδιών» του γλυκολυτικού σχήματος EMP (π χ φωσφοροφρουκτοκινάση) Κατεύθυνση του κυτταρικού μεταβολισμού προς τη ζύμωση Υπάρχουν ζύμες οι οποίες είναι θετικές ή αρνητικές στο φαινόμενο Pasteur

ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ CRABTREE ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ Όταν η συγκέντρωση του σακχάρου στο περιβάλλον αύξησης της ζύμης υπερβαίνει μια συγκεκριμένη κριτική (critical) συγκέντρωση (π. χ. 10 g/l), τα πρώτα ένζυμα του κύκλου των τρικαρβοξυλικών οξέων (π. χ. NAD + -ισοκιτρική αφυδρογονάση), καθώς και ένζυμα των κυτοχρωμάτων της αναπνευστικής αλυσίδας υφίστανται ΚΑΤΑΒΟΛΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ (λόγω της αυξημένης συγκέντρωσης σακχάρου) Ο κυτταρικός μεταβολισμός χωρεί μέσω της ζυμωτικής και όχι της αναπνευστικής οδού

ΙI) ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΠΟΥ ΧΩΡΕΙ ΣΤO ΒΑΚΤΗΡΙΟ Zymomomas mobilis Γλυκολυτικό σχήμα Entner-Dudoroff Για κάθε μόριο καταβολιζόμενης γλυκόζης έχομε 1 μόριο παραγόμενου ATP

C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 Θεωρητική απόδοση Y P/S 0.51 g αλκοόλης ανά g σακχάρου Πάντα η απόδοση είναι μικρότερη αφού: 1) Ύπαρξη βιομάζας (στους σακχαρομύκητες πάντα περισσότερη από ό,τι στο Zymomonas mobilis) 2) Ύπαρξη παραπροϊόντων ζύμωσης - στους σακχαρομύκητες γλυκερόλη (άμεση αναγωγή DHA για ανάκτηση NAD + ) - στο βακτήριο Zymomonas mobilis μαννιτόλη, DHA και λεβάνη

ΆΛΛΕΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΕΙΣ Saccharomyces sp. ΚΑΙ Zymomonas mobilis -Ανάγκη μερικής οξυγόνωσης στην καλλιέργεια της ζύμης για τη βιοσύνθεση ακορέστων λιπαρών οξέων (κυρίως Δ9 C18:1 και Δ9,12 C18:2) και εργοστερόλης (σταθερότητα στην αλκοόλη) -Στις μεμβράνες του βακτηρίου Zymomonas mobilis, παρουσία οπανοειδών (τριτερπενοειδή) (μη εξαρτώμενη βιοσύνθεση από παρουσία οξυγόνου) και Δ11 C18:1 - Πυροσταφυλική αποκαρβοξυλάση του βακτηρίου Zymomonas mobilis ασυνήθης (δεν χρειάζεται ως συμπαράγοντα Tpp)

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ Saccharomyces carlsergensis & Zymomonas mobilis Προσθήκη γονιδίων που κωδικοποιούν για τη σύνθεση πρωτεϊνών: Α) αποικοδόμηση μεγαλομοριακών ενώσεων - α-αμυλάση - αμυλογλυκοσιδάση - ενδο-β-1,4-γλυκανάση - β-γλυκοσιδάση

Β) Αποικοδόμηση ξυλόζης - ισομεράση της ξυλόζης - κινάση της ξυλουλόζης - τρανσκετολάση - τρανσαλδολάση ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ Zymomonas mobilis ΣΕ ΑΛΛΟΥΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ pet operon (πυροσταφυλική αποκαρβοξυλάση & αλκοολική αφυδρογονάση ΙΙ) σε άλλα βακτήρια (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola)

H ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΖΥΜΩΣΗΣ ΣΤΑΔΙΟ Ι: ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΡΩΤΗ ΥΛΗ ΣΤΟ ΖΥΜΟΥΜΕΝΟ ΣΑΚΧΑΡΟ - παραλαβή μη κρυσταλλώσιμου μέρους της μελάσας - προκατεργασία αμυλούχων παραπροϊόντων και ενζυμική ή χημική υδρόλυση - προκατεργασία λιγνοκυτταρινούχων αποβλήτων, θερμική επεξεργασία, όξινη υδρόλυση

ΣΤΑΔΙΟ ΙΙ: Η ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ - Ζυμωτήρες ασυνεχούς λειτουργίας (batch) - Ζυμωτήρες ημισυνεχείς τροφοδοτούμενοι (fed-batch) - Ζυμωτήρες συνεχoύς ροής (continuous) ΣΤΑΔΙΟ ΙΙΙ: Η ANAKTHΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ - Απόσταξη

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ

Κινητική της αύξησης, της κατανάλωσης σακχάρου του υποστρώματος και της παραγωγής αιθανόλης από το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae MAK 1 Φαινόμενο διαύξησης

ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗ ΣΕ «ΜΟΛΥΣΜΕΝΟ» ΓΛΕΥΚΟΣ «Κολλημένες» ή «νωθρές» ζυμώσεις: Ενίοτε παρουσία τοξικών συστατικών (π.χ. μυκητοκτόνων, ζιζανιοκτόνων, κοκ) παρεμποδίζει τη μικροβιακή αύξηση Ο ψεκασμός της σταφυλής θα πρέπει να μη γίνεται τουλάχιστον 2 εβδομάδες (ενδεχομένως και περισσότερο) πριν το φρούτο συγκομιστεί προκειμένου να υποστεί ζύμωση Τούτο σε πολλές περιπτώσεις (ειδικά στα πρωτοβρόχια) δεν καθίσταται δυνατόν (όπου γίνονται ψεκασμοί), αλλά πάντως, σε κάθε περίπτωση, η παρουσία τοξικών συστατικών, βιοκτόνων, κοκ είναι δυνάμενη να δημιουργήσει σοβαρό θέμα στην τεχνολογία παρασκευής οίνων

Βοτρύτης σε σταφυλή

Σε ορισμένες περιπτώσεις (π.χ. χρήση μυκητοκτόνου quinoxyfen) όχι μόνον δεν παρεμποδίζεται η αύξηση και η παραγωγή αιθανόλης X (g/l), quinoxyfen at 0.0 mg/l 12 X (g/l), quinoxyfen at 0.4 mg/l X (g/l), quinoxyfen at 2.4 mg/l 160 Eth (g/l), quinoxyfen at 0.0 g/l Eth (g/l), quinoxyfen at 0.4 mg/l Eth (g/l), quinoxyfen at 2.4 mg/l Biomass, X (g/l) 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 Time (h) Ethanol, Eth (g/l) 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 Time (h)

αλλά επίσης «αποτοξινώνεται και το γλεύκος κατά τη ζύμωση 90 % Removal (w/w) 80 70 60 50 40 30 20 2.4 mg/l Quinoxyfen (blank) 2.4 mg/l Quinoxyfen (fermentation with S.cerevisiae MAK 1) 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Time (h)

I S K S S K S 2 max + + = m m ø ö ç ç ç è æ + + ø ö ç ç è æ - = I S K S S K S P P 2 max m max 1 m Προτυποποίηση ( Προτυποποίηση (Modelling) Modelling) της βιοδιεργασίας της βιοδιεργασίας Andrews Ghose-Tyagi

Σύνθεση βιβλιογραφίας σχετικά με παραγωγή βιοαιθανόλης

1 ης γενιάς αιθανόλη Ανταγωνισμός με την αρόσιμη γή

2 ης γενιάς αιθανόλη Αιθανόλη από λιγνοκυτταρινούχα απόβλητα

2 ης γενιάς αιθανόλη Αιθανόλη από απόβλητα της βιομηχανίας τροφίμων

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΤΟΥ ΚΥΚΛΟΥ KREBS ΚΙΤΡΙΚΟ ΟΞΥ & α-κετογλουταρικο ΟΞΥ ΚΙΤΡΙΚΟ ΟΞΥ ΤΟ ΠΙΟ ΕΥΡΕΩΣ ΔΙΑΔΕΔΟΜΕΝΟ ΟΞΥ ΣΤΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (ΜΕΣΟ ΟΞΥΝΙΣΕΩΣ, ΣΥΝΤΗΡΗΤΙΚΟ), ΜΕ ΣΥΝΕΧΩΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΤΑΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΥΤΟΥ ΒΙΟΧΗΜΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΑΥΤΩΝ ΟΞΕΩΝ ΠΟΛΥ ΠΑΡΕΜΦΕΡΗΣ Η ΣΥΝΗΘΗΣ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΚΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΕΊΝΑΙ ΔΙΑ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΟΔΟΥ ΜΕΣΩ ΑΞΙΟΠΟΙΗΣΕΩΣ ΓΕΩΡΓΟ- ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ

Μικροοργανισμοί Μύκητες Ζύμες Aspergillus niger, Yarrowia (Candida) lipolytica, Aspergillus sp., Candida guillermondii, Candida paralypolytica, Candida oleophila Σε κάθε περίπτωση η ζύμωση είναι υπό αυστηρή αεροβίωση και η παραγωγή του προϊόντος (κιτρικό οξύ) είναι μη-συνδεδεμένη με τη μικροβιακή αύξηση, επισυμβαίνουσα κατόπιν περιορισμού (limitation) του μέσου καλλιέργειας σε άζωτο Η βιοχημεία σύνθεσης κιτρικού οξέος είναι στα πρώτα στάδια της ταυτόσημη με αυτή της σύνθεσης ενδοκυτταρικών λιπιδιακών αποθεμάτων στα μικροβιακά κύτταρα

BIOXHMEIA ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΛΙΠΟΥΣ ΚΑΙ/Η ΚΙΤΡΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ NADPH 2 NADPH 2 NAD NADH 2 Pyruvate NADP ME NADPH 2 MD c -CO 2 Oxaloacetate Malate ADP Citrate ATP ACL CH 3 COSCoA Malonyl-SCoA Glucose EMP NAD NADH 2 Biomass ATP ADP CYTOSOL a b c d MITOCHONDRION Pyruvate Oxaloacetate PD MD m Malate CS Citrate Ac Iso-citrate ICDH a-ketoglutarate CH 3 COSCoA Malate Succinate Succinyl-CoA NADP FFAs FAS ATP ADP Malate CH 3 COSCoA Iso-citrate ICL Glyoxylate + TRSP Succinate PEROXYSOME Citrate EXTRA-CELLULAR MEDIUM

Βιοχημεία Ζύμωσης Παύση της λειτουργίας του κύκλου του Krebs, λόγω περιορισμού σε εξωκυτταρικό (και ενδοκυτταρικό) άζωτο, και συσσώρευση στο μιτοχόνδριο του κιτρικού οξέος Φαινόμενο over-flow metabolism Κινητική Ζύμωσης 100 80 40 35 30 Glol (g.l -1 ) 60 40 25 20 15 X, Cit (g.l -1 ) 20 10 5 0 0 50 100 150 200 250 Time (h) 0

Ένζυμο-κλειδί για τη σύνθεση κιτρικού οξέος, Κιτρική συνθάση Ήδη υπάρχουν στελέχη (Aspergillus niger) που εκφράζουν σε πολύ αυξημένο βαθμό το ένζυμο κιτρική συνθάση ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Τα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα 1) Σακχαρούχα υποστρώματα: Μελάσες ζαχαροκαλάμου, μελάσες τεύτλων, τυρόγαλα, χυμοί φρούτων, απόβλητα βιομηχανιών πλούσια σε σάκχαρα, γλυκόζη και σιρόπια αυτής 2) Αμυλούχα ανανεώσιμα υποστρώματα: Άμυλο σιταριού, καλαμποκιού, πατάτας, cassava (απ ευθείας υδρόλυση από μικροοργανισμούς ή υδρόλυση σε πρωθύστερο στάδιο) ή απόνερα (waste-water) πλούσια σε άμυλο 3) Λίπη και έλαια (συνήθως τα χαμηλής προστιθέμενης αξίας, π.χ. ζωικά λίπη, έλαιο ελαιοκράμβης) ή παράγωγα αυτών (πχ σάπωνες) 4) n-αλκάνια και αντίστοιχα υποπροϊόντα χημικής βιομηχανίας 5) Βιομηχανική γλυκερόλη

Τεχνολογία της Ζύμωσης Καλλιέργεια σε κάθε είδους αντιδραστήρα Χρήση κλειστών, ημισυνεχών τροφοδοτούμενων, συνεχών καθώς και συνεχών με συστήματα ανακύκλωσης κυττάρων βιοαντιδραστήρων Ο συντελεστής απόδοσης ποικίλει αναλόγως με την πηγή άνθρακα καθώς και τον αρχικό λόγο C/N: Για γλυκόζη ή παρόμοια μεταβολιζόμενα συστατικά, είναι 0.35-0.50 g/g Για λίπη ή n-αλκάνια, είναι 0.8-1.2 g/g Μέγιστες Συγκεντρώσεις: 60-130 g/l

Αριθμητικό πρότυπο Ειδικός ρυθμός αύξησης (μ): m = m max N K N + N æ m = m max ç 1- x è x max m = m max N N 0 ö ø Monod Verhlust Williams Ειδικός ρυθμός παραγωγής (q Cit ): β(=σταθερό) καθόσον ο μεταβολίτης είναι μη-συνδεδεμένος με τη μικροβιακή αύξηση

Σύνθεση βιβλιογραφίας σχετικά με βιοτεχνολογική παραγωγή κιτρικού οξέος

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΛΙΠΟΥΣ Διάφοροι μικροοργανισμοί όταν καλλιεργούνται υπό ορισμένες συνθήκες αύξησης είναι δυνατόν να αποθηκεύσουν εντός των κυττάρων τους λίπος μέχρι και 70% (κ β) επί της ξηράς τους ουσίας Οι μικροοργανισμοί αυτοί καλούνται ελαιογόνοι (oleaginous) το δε λίπος μονοκυτταρικό λίπος (single-cell oil - SCO ) ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟ ΛΙΠΟΣ ΓΕΝΙΚΑ ΠΟΛΥΑΚΟΡΕΣΤΟ ΣΥΣΤΑΣΗ ΣΕ ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ ΟΜΟΙΑΖΟΥΣΑ ΑΥΤΗΣ ΦΥΤΩΝ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

Η Βιοτεχνολογία παραγωγής μικροβιακών ελαίων έχει εμπορική και βιομηχανική σημασία μόνο στην περίπτωση κατά την οποία το παραγόμενο μικροβιακό λίπος εμφανίζει σύσταση ή/και δομή η οποία να είναι σπανίως απαντώμενη στα διάφορα λίπη του Φυτικού ή του Ζωικού Βασιλείου 1. ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΤΑ ΕΞΩΤΙΚΩΝ ΛΙΠΩΝ 2. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΛΙΠΟΥΣ ΜΕ ΑΣΥΝΗΘΗ ΠΟΛΥΑΚΟΡΕΣΤΑ ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ (γ-λινολενικο ΟΞΥ, ΑΡΑΧΙΔΟΝΙΚΟ ΟΞΥ κλπ) SCO ΩΣ ΤΡΟΦΙΜΟ Ή ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ

ΕΛΑΙΟΓΟΝΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΠΕΤΡΕΛΑΙΟ (ΒΙΟΝΤΗΖΕΛ) Θεμελιώδους σημασίας είναι επίσης η μετατροπή του λιπαρών υλών σε βιοντήζελ -Πλήρως «ανανεώσιμο» καύσιμο -Απ ευθείας μεθυλίωση των τριγλυκεριδίων με χρήση χαμηλομοριακών αλκοολών (συνηθέστατα μεθανόλη) -Αντίδραση καταλυόμενη χημικώς ή ενζυμικώς

Σχηματικό διάγραμμα παραγωγής βιοντήζελ tallow c a t a l y s t potassium methylate O C H 2 O C R 1 3 C H O O C R 2 + C H 3 O H O C H 2 O C R 3 O C H 2 O C R 1 O C H 2 O C R 2 + O C H 2 O C R 3 crudebiodiesel C H 2 C H C H 2 O H O H O H crude glycerol Κύριο απόβλητο της διεργασίας η βιομηχανική γλυκερόλη (γλυκερίνη)

Συστηματικά αυξανόμενος ο αριθμός των μελετών που σχετίζονται με τις μεθόδους αξιοποίησης της γλυκερίνης Χρήση της ως «τροφής» μικροοργανισμών Χρήση της σε χημικές διεργασίες «HOT TOPIC» στη Χημική Τεχνολογία και Βιοτεχνολογία

«1 ης γενιάς» βιοντήζελ -Προερχόμενο από συμβατικές (εδώδιμες) λιπαρές πρώτες ύλες (π.χ. έλαιο ελαιοκράμβης, πυρηνέλαιο, σογιέλαιο κλπ) -Αύξηση της τιμής των τροφίμων, και δη των λιπαρών υλών της διατροφής -Αδιανόητη η χρήση καλλιεργήσιμης γης για παραγωγή καυσίμων και όχι τροφίμων ΑΝΑΓΚΗ ΕΞΕΥΡΕΣΗΣ «ΜΗ-ΣΥΜΒΑΤΙΚΩΝ» ΕΛΑΙΩΝ

Thomas Robert Malthus Η προβλεπόμενη αύξηση του πληθυσμού ενδέχεται να κάνει πραγματικότητα σε 3 δεκαετίες την προσέγγιση του Malthus, ως εκ τούτου είναι επιτακτική ανάγκη η εξεύρεση «νέων» πηγών βιοκαυσίμων

«2 ης γενιάς» βιοντήζελ -Προερχόμενο από «ψημένα τηγανισμένα- θερμικώς κατεργασμένα» λιπίδια, ακατάλληλα προς βρώση -Προερχόμενο από απόβλητα λιπίδια σφαγείων και συναφών βιομηχανικών και βιοτεχνικών μονάδων (μονάδες παραγωγής κρεατοσκευασμάτων) -Προερχόμενο από SCO το οποίο θα έχει παραχθεί κατά την αύξηση μικροοργανισμών σε υδρολύματα λιγνοκυτταρινών, σε απόβλητα βιομηχανιών τροφίμων (π.χ. τυρόγαλα ), σε γλυκερόλη και σε άλλα αρνητικού κόστους υλικά

«3 ης γενιάς» βιοντήζελ Προερχόμενο από αυτοτρόφως αναπτυσσόμενα ελαιογόνα φύκη -Δέσμευση (sequestration) CO2 -Ταυτόχρονη μείωση αερίων εκπομπών «θερμοκηπίου» και παραγωγή ενός πλήρως «ανανεώσιμου» καυσίμου -Μειωμένη παραγωγή βιομάζας σε σχέση με τα 2 ης γενιάς λιπίδια ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΡΕΥΝΑ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ

Μικροοργανισμοί παραγωγοί SCO Βακτήρια Rhodococcus spp., Nocardia spp., Alteromonas spp. - Ενδεχόμενο παρουσίας αντιδιατροφικών ουσιών στο λίπος - Παραγωγή PHA Ζύμες Rhodotorula spp., Torulopsis spp., Candida spp., Rhodosporidium spp. Μύκητες Mucor spp., Rhizopus spp., Mortierella spp., Aspergillus spp., Cuninghamella spp. Ζύμωση γενικά υπό αεροβίωση

Τα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα 1) Υγροί υδρογονάνθρακες (αλυσίδα > C4) Προβλήματα: α) Συντελεστής μεταφοράς οξυγόνου (K L a) ενίοτε λαμβάνει πολύ χαμηλές τιμές β) Υγροί υδρογονάνθρακες αδιάλυτοι στο νερό γ) Λίπος με ανεπιθύμητες οσμές Σταδιακή μείωση χρήσης αυτού του τύπου των υποστρωμάτων 2) Σακχαρούχα υποστρώματα 2) Σακχαρούχα υποστρώματα Μελάσες ζαχαροκαλάμου, μελάσες τεύτλων, χυμοί φρούτων, υπολείμματα/απόβλητα βιομηχανιών πλούσια σε σάκχαρα, τυρόγαλα

3) Αμυλούχα συστατικά ή απόβλητα 4) Λίπη και έλαια (συνήθως τα χαμηλής προστιθέμενης αξίας, π χ ζωικά λίπη, έλαιο ελαιοκράμβης) ή βιομηχανικά λιπαρά υπολείμματα και απόβλητα (π.χ. σάπωνες, στεαρίνες κλπ) 5) Βιομηχανική Γλυκερόλη Σημειώνεται η αδυναμία παραγωγής λίπους από κυτταρινούχα υλικά ή μεθανόλη

Σύνθεση λίπους από σάκχαρα: 1) Δημιουργία CH 3 CΟSCoA 2) Αντιδράσεις αντιστροφής β-οξείδωσης 3) Σύνθεση TAGs

ΣΤΑΔΙΑ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΛΙΠΟΥΣ NITROGEN LIMITATION AMP DESAMINASE ACTIVATION DECREASE OF AMP CONCENTRATION DECREASE OF THE ACTIVITY OF ISO-CITRATE DEHYDROGENASE CITRATE SYNTHESIS CITRATE TRANSPORT INSIDE THE CYTOPLASM ATP-CITRATE LYASE ACTION

Αντίδραση ΑΤP-κιτρικής λυάσης: Σχηματισμός δομικών μονάδων για σύνθεση λίπους HO COOH CH2 C COOH CH2 HSCoA ATP-CL CH3COSCoA + COOH CO CH2 COOH COOH

Σύνθεση ΤΑG

ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΟΥΣ ΑΠΌ ΣΑΚΧΑΡΑ Ισόρροπη αύξηση Πηγή C Φάση λιπογένεσης 50 40 Βιομάζα, Ν, C (g/l) Πηγή N Λιπίδια Βιομάζα 30 20 10 Λιπίδια (% β/β) 0 Χρόνος (h)

ΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΟΥΣ ΑΠΌ ΛΙΠΑΡΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Η πρώτη κίνηση για τους δυνάμενους να εκκρίνουν λιπολυτικά ένζυμα μικροοργανισμούς είναι η υδρόλυση των TAG του υποστρώματος Απελευθέρωση ελευθέρων λιπαρών οξέων (ΕΛΟ) Είναι προφανές ότι αύξηση μικροοργανισμών μόνο σε ΕΛΟ δεν προϋποθέτει έκκριση λιπασών

2 ο Στάδιο: Είσοδος της γλυκερόλης στο γλυκολυτικό σχήμα Μεταβολισμός γλυκερόλης

3 ο Στάδιο: Ενσωμάτωση (incorporation) των λιπαρών οξέων εντός του μικροβιακού κυττάρου Είσοδος ΛΟ όχι τυχαία (random) Είναι προφανές ότι με την πάροδο του χρόνου δύναται να μεταβληθεί η σύσταση σε ΛΟ του υποστρώματος

4 ο Στάδιο: Αφομοίωση (assimilation) των λιπαρών οξέων εντός του μικροβιακού κυττάρου β-οξείδωση 1. Αφυδρογόνωση από το FAD, μέσω acyl-coa οξειδάσης 2. Ενυδάτωση

3. Οξείδωση μέσω του NAD 4. Θειόλυση

Συνολικό σχήμα β-οξείδωσης

Στα κύτταρα των ζυμών υπάρχουν 6 διαφορετικές acyl-coa οξειδάσες, κωδικοποιούμενες από τα αντίστοιχα γονίδια POX1-POX6 Αυτές οι οξειδάσες έχουν διαφορετική εξειδίκευση στους ενδοκυτταρικούς λιπαρούς εστέρες (π.χ. η POX2 οξειδάση έχει μεγάλη συνάφεια με τα μέσης ανθρακικής αλυσίδας ΛΟ)

Τελικά, λιπίδια με διαφορετική σύσταση σε ΛΟ σε σχέση με το υπόστρωμα θα συντεθούν

Θεμελιώδης βιοχημική διαφορά μεταξύ σύνθεσης λίπους από υποστρώματα i) τύπου «σακχάρου» (λίπος παραγόμενο κατόπιν της εξαλείψεως αζώτου από το μέσο καλλιέργειας) ii) τύπου «λιπαρών υλικών» (λίπος παραγόμενο ταυτόχρονα με την παραγωγή βιομάζας) - Παραγωγή λίπους συνδεδεμένη με τη μικροβιακή αύξηση Βιοτροποποίηση (Biomodification) λίπους

KINHTIKH Lipid-free material; Lipid - (g l -1 ) 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 0 40 80 120 160 200 240 280 Time (h) 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 NAD + - and NADP + -ICDH activity - (U g -1 ) Concentration (g/l) 20 15 10 5 S (g/l) X (g/l) L (g/l) 0 0 20 40 60 80 100 120 Time (h)

Ο συντελεστής απόδοσης βιομάζας ποικίλει αναλόγως με την πηγή άνθρακα: Για γλυκόζη ή παρόμοια μεταβολιζόμενα συστατικά (π. χ. γλυκερόλη, πολυσακχαρίδια) Υ P/S = 0.20 g/g Για λίπη και n-αλκάνια, Υ P/S =0.4-0.6 g/g Η ζύμωση έχει βιομηχανικό ενδιαφέρον για παραγωγή βιομάζας > 30 g/l

Σύνθεση βιβλιογραφίας σχετικά με βιοτεχνολογική παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων