Πληροφορίες παραγγελίας AMPLICOR HCV Specimen HCV PREP 96 Tests P/N: Preparation Kit version 2.0 ART: US: 83126

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 HCV ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. Πληροφορίες παραγγελίας AMPLICOR HCV Specimen HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 Preparation Kit version 2.0 ART: 11 1108 6 US: 83126 AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131 AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Tests P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 US: 83127 COBAS AMPLICOR HCV HCV DK 100 Tests P/N: 21111132 123 Detection Kit,version 2.0 ART: 11 1113 2 US: 83130 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Το κιτ που ακολουθεί μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV που έχει ενισχυθεί με το Κιτ Ενίσχυσης AMPLICOR HCV, έκδοση 2.0. Η ανίχνευση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV αποτελεί συνιστώμενη επιλογή χειριστή. COBAS AMPLICOR IC 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Control Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 1/42 P/N: 03788946-190

Προβλεπόμενη Χρήση Το COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, έκδοση 2.0 (v2.0) είναι μια ποιοτική εξέταση in Vitro για την ανίχνευση του RNA του ιού της Ηπατίτιδας C σε κλινικά δείγματα στον COBAS AMPLICOR Aναλυτή. Η παρουσία RNAHCV είναι ένδειξη της τρέχουσας μόλυνσης HCV σε ασθενείς που παρουσιάζουν κλινικές και /ή βιοχημικές ενδείξεις ηπατικής νόσου. Η εξέταση χρησιμοποιεί αντίστροφη μεταγραφή του RNA-στόχου για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cdna), ενίσχυση του cdna-στόχου με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και υβριδισμό νουκλεϊκού οξέος για την ανίχνευση HCV RNA σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα. Το COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 δεν προορίζεται για χρήση διαγνωστικού ελέγχου 100% σε αίμα ή προϊόντα αίματος για την παρουσία του ιού της Ηπατίτιδας C. Σύνοψη και Επεξήγηση της Εξέτασης Ο ιός της ηπατίτιδας C θεωρείται ότι είναι ο βασικός αιτιολογικός παράγοντας υπεύθυνος για το 90-95% των περιπτώσεων της ηπατίτιδας μη-a και μη-b μετά από μετάγγιση 1,2. Ο HCV είναι ένας RNA ιός με θετικής κατεύθυνσης μονόκλωνο RNA με ένα γονιδίωμα που κωδικοποιεί περίπου 10.000 νουκλεοτίδια για 3.000 αμινοξέα 1. Ως ιός που μεταδίδεται με το αίμα, ο HCV μπορεί να μεταδοθεί με το αίμα και τα προϊόντα αίματος. Η επικράτηση της μόλυνσης HCV είναι υψηλή σε ασθενείς στους οποίους γίνονται μεταμοσχεύσεις οργάνων, μεταγγίσεις αίματος ή υποβάλλονται σε αγωγή με παράγοντες πήξης του εμπορίου, σε ασθενείς με διαδερμική έκθεση μέσω ενδοφλέβιας χρήσης ναρκωτικών και σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση. Η επικράτηση της μόλυνσης HCV, όπως προσδιορίστηκε από την ανοσοορολογία, κυμαίνεται από 0,6% στον Καναδά έως 1,8% στις Ηνωμένες Πολιτείες 3. Η παρουσία των αντισωμάτων anti-hcv σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί με HCV οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοορολογικών εξετάσεων που είναι ειδικές για αυτά τα αντισώματα 4,5. Χάρη στην εφαρμογή των εξετάσεων αυτών έχει ήδη μειωθεί η συχνότητα εμφάνισης της ηπατίτιδας μετά από μετάγγιση σε παγκόσμιο επίπεδο. Έχει εκτελεστεί πρόσθετη συμπληρωματική εξέταση με χρήση της μεθόδου RIBA (δοκιμή ανοσοαποτύπωσης ανασυνδυασμένου αντισώματος) για την περαιτέρω αξιολόγηση των δειγμάτων που αντιδρούν επανειλημμένως στην ανάλυση διαγνωστικού ελέγχου αντισωμάτων. Πρόσφατες αξιολογήσεις έχουν δείξει ότι η ερμηνεία μιας συμπληρωματικής εξέτασης εξαρτάται από την κατάσταση επικινδυνότητας του ασθενή. Για παράδειγμα, σε ένα πληθυσμό δοτών αίματος χαμηλού κινδύνου μόνο το 50% των δειγμάτων που αντέδρασαν στη RIBA επιβεβαιώνονται από μια εξέταση RNA HCV 6,7,8. Επομένως, ένα θετικό αποτέλεσμα RIBA δεν αποτελεί πραγματικό δείκτη ενεργούς μόλυνσης HCV, για το λόγο ότι οι ασθενείς που έχουν ανακάμψει μπορεί να παραμείνουν θετικοί anti-hcv για μεγάλο χρονικό διάστημα 5. Επιπλέον, έχουν παρατηρηθεί αταξινόμητα συμπληρωματικά αποτελέσματα εξετάσεων τόσο σε πρόσφατα μολυσμένα άτομα που βρίσκονται στη διαδικασία ορομετατροπής, καθώς και σε άτομα που παρουσιάζουν χρόνια μόλυνση HCV 9,10. Η ανοσοορολογική εξέταση είναι μια μέτρηση της τρέχουσας και/ή της πριν την έκθεση μόλυνσης HCV, αλλά δεν είναι δυνατός ο μεταξύ τους διαχωρισμός. Επιπλέον, σε περιπτώσεις οξείας μόλυνσης HCV, τα άτομα μπορεί να μην είναι ικανά να παράγουν αντίσωμα HCV 11, καθιστώντας τη διάγνωση της τρέχουσας μόλυνσης HCV αδύνατη με τη χρήση ανοσοορολογικών τεχνικών. Εναλλακτικά, η ανίχνευση του RNA HCV με εξετάσεις νουκλεϊκών οξέων μπορεί να παρέχει στοιχεία για την τρέχουσα μόλυνση. Με τη χρήση εξετάσεων νουκλεϊκού οξέος, είναι δυνατή η ανίχνευση της ιαιμίας HCV πριν την ανοσολογική ορομετατροπή 12,13. Εφόσον είναι δυνατή η άμεση ανίχνευση του RNA HCV με τις εξετάσεις νουκλεϊκού οξέος, δηλ., ανεξαρτήτως της ανοσολογικής κατάστασης του ασθενή, η εξέταση νουκλεϊκού οξέος έχει μεγάλη αξία σε ό,τι αφορά την ανίχνευση RNA HCV σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς 8. 2/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus Βασικές Αρχές της Διαδικασίας Εσωτ. Πρότ. Ελέγχου Προετοιμασία Δειγμάτων Αντίστροφη Μεταγραφή και Ενίσχυση PCR Το COBAS AMPLICOR HCV Test v2.0 βασίζεται σε πέντε κύριες διαδικασίες: προετοιμασία δειγμάτων, αντίστροφη μεταγραφή του RNA-στόχου για τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cdna) 14, ενίσχυση PCR 14 του cdna-στόχου με τη χρήση ειδικών για το HCV συμπληρωματικών εκκινητών, υβριδισμό των ενισχυμένων προϊόντων σε ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες ειδικούς για το στόχο (ους) και ανίχνευση των δεσμευμένων στον ιχνηθέτη ενισχυμένων προϊόντων με χρωματομετρικό προσδιορισμό. Το COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 επιτρέπει την ταυτόχρονη αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση PCR του HCV στόχου και του RNA στόχου του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV. Το αντιδραστήριο Master Mix (κύριο μίγμα) περιέχει ένα ζεύγος εκκινητών ειδικών για HCV και RNA του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNA εκτελείται με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών, ειδικών για το στόχο, που επιτρέπουν τον ανεξάρτητο εντοπισμό του κλώνου (amplicon) του HCV και του κλώνου (amplicon) του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV. Στις διαδικασίες ενίσχυσης βάσει ενζύμων, όπως στην PCR, η αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης μπορεί να μειωθεί από αναστολείς που ενδέχεται να υπάρχουν στο κλινικό δείγμα. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου HCV προστέθηκε στο COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 για τον εντοπισμό των επεξεργασμένων δειγμά-των τα οποία περιέχουν ουσίες που ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν με την ενίσχυση PCR. Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου HCV αποτελεί ένα RNA μετάγραφο με περιοχές δέσμευσης εκκινητή όμοιες με αυτές της αλληλουχίας-στόχου ΗCV, μια τυχαία εσωτερική αλληλουχία παρόμοιου μεγέθους και σύνθεσης βάσης με την αλληλουχία-στόχο HCV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη που διαφοροποιεί το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου HCV από τον κλώνο (amplicon)- στόχο. Τα χαρακτηριστικά αυτά επιλέχθηκαν για να διασφαλίζουν ισοδύναμη ενίσχυση του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV και του RNA-στόχου του HCV. Το HCV RNA απομονώνεται από τον ορό ή το πλάσμα με τη λύση των σωματιδίων του ιού με ένα χαοτροπικό παράγοντα και ακολουθείται από κατακρήμνιση του RNA με αλκοόλη. Το RNA μετατρέπεται σε εναιώρημα στο αραιωτικό δείγματος. Το RNA του Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV εισάγεται σε κάθε δείγμα με το Αντιδραστήριο Λύσης και χρησιμοποιείται ως ορός ελέγχου εκχύλισης, ενίσχυσης και ανίχνευσης για κάθε μεμονωμένο επεξεργασμένο δείγμα. Επιλογή Στόχου Η επιλογή της αλληλουχίας RNA-στόχου για το HCV εξαρτάται από τον εντοπισμό των περιοχών εντός του γονιδιώματος HCV που επιδεικνύουν μέγιστο βαθμό διατήρησης αλληλουχίας μεταξύ των διάφορων γονότυπων HCV 15,16,17. Αντίστοιχα, η ορθή επιλογή εκκινητών και ιχνηθέτη έχει αποφασιστική σημασία για την ικανότητα της εξέτασης να ανιχνεύσει όλους τους γονότυπους (βλέπε κεφάλαιο Μη-Κλινική Αξιολόγηση Απόδοσης, Μελέτη Συμπερίληψης Γονότυπου HCV ). Η 5' -μη κωδικεύουσα περιοχή (UTR) του γονιδιώματος HCV έχει επιδείξει μέγιστη διατήρηση της αλληλουχίας RNA μεταξύ των γνωστών γονότυπων HCV 18,19. Το COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 χρησιμοποιεί τους εκκινητές KY78 και KY80 για να καθορίσει μια αλληλουχία 244 νουκλεοτιδίων μέσα στην υψηλής διατήρησης περιοχή 5'-UTR του γονιδιώματος HCV 13. Η αλληλουχία ιχνηθέτη δέσμευσης και οι αλληλουχίες εκκινητών βρίσκονται στα πιο διατηρημένα πεδία μέσα στην περιοχή 5'-UTR 18. Αντίστροφη Μεταγραφή Οι αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής και ενίσχυσης εκτελούνται με το θερμοσταθερό ανασυνδυασμένο ένζυμο Thermus thermophilus DNA πολυμεράσης (rtth pol). Με την παρουσία μαγγανίου (Mn 2+ ) και με τις κατάλληλες συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος, το rtth pol παρουσιάζει δραστηριότητα αντίστροφης τρανσκριπτάσης καθώς και DNA πολυμεράσης 14. Επομένως καθίσταται δυνατή η 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 3/42

πραγματοποίηση αντίστροφης μεταγραφής και ενίσχυσης PCR στο ίδιο μίγμα αντίδρασης. Τα επεξεργασμένα δείγματα προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης A-tubes, στα οποία πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση PCR. Ο αντινοηματικός εκκινητής (KY78) είναι βιοτινιλυωμένος στα 5' άκρα και ο νοηματικός εκκινητής (KY80) δεν είναι βιοτινιλυωμένος. Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται για να επιτρέψει στον αντινοηματικό εκκινητή να υβριδιστεί ειδικά με το RNA-στόχο του HCV και το RNΑ-στόχο Εσωτερικού Προτύυπου Ελέγχου HCV. Με την παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφο-ρικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), καθώς και τριφωσφορικής δεοξυαδενοσίνης, δεοξυγουανοσίνης, δεοξυκυτιδίνης, δεοξυουριδίνης και δεοξυουριδίνης (στη θέση της θυμιδίνης), το rtth pol επεκτείνει τον υβριδισμένο εκκινητή σχηματίζοντας έναν κλώνο DNA (cdna) συμπληρωματικό προς το RNA-στόχο. Ενίσχυση Στόχου Μετά την αντίστροφη μεταγραφή του HCV στόχου του και του RNA Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV, το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται για την αποδιάταξη του υβριδίου RNA:cDNA και την έκθεση των αλληλουχιών στόχου εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, ο νοηματικός εκκινητής (KY80) υβριδίζεται ειδικά με τον κλώνο cdna, το rtth pol επεκτείνει τον εκκινητή και συντίθεται ένας δεύτερος κλώνος DNA. Έτσι ολοκληρώνεται ο πρώτος κύκλος της PCR, με τη δημιουργία ενός δίκλωνου αντιγράφου DNA της περιοχής στόχου του HCV και του RNA Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV. Το μίγμα αντίδρασης θερμαίνεται και πάλι για το διαχωρισμό του προκύπτοντος δίκλωνου DNA και την έκθεση των αλληλου-χιών στόχου εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές KY78 και KY80 υβριδίζονται στο DNA-στόχο. Το rtth pol, με την παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος dntps, επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος των προτύπων-στόχων, για να δημιουργηθεί ένα μόριο δίκλωνου DNA 244 ζευγών βάσεων, που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα το διπλασιασμό των DNA κλώνων (amplicon) Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στη μεταξύ των εκκινητών περιοχή του γονιδιώματος HCV. Δεν ενισχύεται ολόκληρο το γονιδίωμα. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος-στόχου από το κλινικό δείγμα επιτυγχάνεται στο COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 με τη χρήση AmpErase (ουρακίλη-ν-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων του DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη 20, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης, αντί της τριφωσφορικής θυμιδίνης, ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου Master Mix. Για το λόγο αυτό, μόνο οι κλώνοι (amplicon) περιέχουν δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA-στόχου. To ένζυµο AmpErase, που περιλαµβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγµατος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήµατα της δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης στο αλκαλικό ph του Κύριου Μίγματος, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase είναι αδρανές σε θερμοκρασίες πάνω από τους 55 C, δηλαδή, σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon)- στόχο. Μετά την ενίσχυση, όλα τα υπολειμματικά ένζυμα αποδιατάσσονται με την προσθήκη του Διαλύματος Αποδιάταξης, προλαμβάνοντας έτσι την αποδόμηση 4/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus Αντίδραση Υβριδισμού Αντίδραση Ανίχνευσης Αντιδραστήρια οποιουδήποτε κλώνου (amplion)-στόχου. Το ένζυμο AmpErase στο COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 έχει αποδειχτεί ότι αδρανοποιεί τουλάχιστον 10 3 αντίγραφα κλώνου (amplicon) HCV που περιέχουν δεοξυουριδίνη σε κάθε PCR. Μετά την ενίσχυση PCR, ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής προσθέτει αυτόματα Διάλυμα Αποδιάταξης στα σωληνάρια A-tubes για την χημική αποδιάταξη του κλώνου (amplicon) HCV και του κλώνου (amplicon) Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV για το σχηματισμό μονόκλωνου DNA. Τα κλάσματα του κλώνου (amplicon) αποδιάταξης μεταφέρονται στη συνέχεια σε σωληνάρια ανίχνευσης (Dcups). Ένα εναιώρημα μαγνητικών σωματιδίων ανίχνευσης με επίστρωση ενός ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη ειδικού για HCV (KY150) ή για Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου HCV (SK535) προστίθεται στα μεμονωμένα D-cup. Ο επισημασμένος με βιοτίνη HCV και ο κλώνος (amplicon) Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV υβριδίζονται στους ολιγονουκλεοτιδικούς ειδικούς για το στόχο ιχνηθέτες που είναι δεσμευμένοι στα μαγνητικά σωματίδια. Αυτός ο υβριδισμός του κλώνου (amplicon) στον ειδικό για το στόχο ιχνηθέτη αυξάνει τη συνολική ειδικότητα της εξέτασης. Μετά την αντίδραση υβριδισμού, ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής πραγματοποιεί πλύση των μαγνητικών σωματιδίων στα D-cup για να απομακρυνθούν μη δεσμευμένα υλικά και στη συνέχεια προσθέτει συζεύκτη avidin-υπεροξειδάσης ραφανίδας. Ο συζεύκτης avidin-υπεροξειδάσης ραφανίδας δεσμεύεται στον επισημασμένο με βιοτίνη κλώνο (amplicon) που υβριδίζεται στους ειδικούς για το στόχο (HCV ή Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου) ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες που είναι δεσμευμένοι στα μαγνητικά σωματίδια. Ο COBAS AMPLICOR Αναλυτής απομακρύνει το μη δεσμευμένο συζεύκτη πραγματοποιώντας πλύση των μαγνητικών σωματιδίων και στη συνέχεια σε κάθε D-cup προσθέτει Διάλυμα Υποστρώματος που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και 3,3',5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνη (TMB). Με την παρουσία του υπεροξειδίου του υδρογόνου, η δεσμευμένη στο σωματίδιο υπεροξειδάση ραφανίδας καταλύει την οξείδωση της TMB για το σχηματισμό ενός έγχρωμου συμπλόκου, η απορρόφηση του οποίου μετράται σε μήκος κύματος των 660 nm από τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Εξετ. P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 AMPLICOR HCV US:83126 Κιτ Προετοιμασίας Δειγμάτων, έκδοση 2.0 HCV LYS, v2.0 8 x 6,9 ml (Αντιδραστήριο Λύσης HCV, έκδοση 2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 68% Θειοκυανική γουανιδίνη 3% Διθειεθρυτόλη < 1% Γλυκογόνο + Xn 68% (w/w) Θειοκυανική γουανιδίνη Επιβλαβές HCV DIL, v2.0 (Αραιωτικό δείγματος HCV, έκδοση 2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου 8 x 4,8 ml 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 5/42

HCV IC, v2.0 8 x 0,1 ml (Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου HCV, έκδοση 2.0) < 0,001% μη μολυσματικό (μικροβιακό) RNA με in Vitro μεταγραφή, που περιέχει αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητή HCV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Σετ P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV US: 83131 Κιτ Ορών Ελέγχου, έκδοση 2.0 NHP 8 x 0,6 ml [Αρνητικό Πλάσμα (Ανθρώπινο)] Ανθρώπινο πλάσμα, χωρίς αντίδραση από εγκεκριμένες εξετάσεις από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ για αντίσωμα HCV, αντίσωμα HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA μη ανιχνεύσιμα με μεθόδους PCR. 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 HCV ( ) C, v2.0 [HCV Ορός ελέγχου ( ), έκδοση 2.0] < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Aζίδιο του νατρίου 8 x 0,1 ml HCV (+) C, v2.0 [HCV Ορός ελέγχου (+), έκδοση 2.0] < 0,001% μη μολυσματικό in Vitro RNA (μικροβιακό) από μεταγραφή περιέχει αλληλουχίες HCV < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) EDTA 0,05% Αζίδιο του νατρίου 8 x 0,1 ml AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Εξετ. P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV US: 83127 Κιτ Ενίσχυσης, έκδοση 2.0 HCV MMX, v2.0 (HCV Κύριο Μίγμα, έκδοση 2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα Bicine 16% DMSO Γλυκερόλη < 0,01% rtth DNA πολυμεράση (rtth pol, μικροβιακό) Οξικό κάλιο < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% KY78 και KY80 εκκινητές (ο ένας βιοτινιλυωμένος) < 0,01% AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,05% Αζίδιο του νατρίου 8 x 0,7 ml 6/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus HCV Mn 2+, v2.0 (HCV Διάλυμα Μαγγανίου, έκδοση 2.0) < 2% Μαγγάνιο Οξικό οξύ Χρωστική ύλη αμαράνθης 0,05% Αζίδιο του νατρίου 8 x 0,1 ml COBAS AMPLICOR HCV DK 100 Εξετ. P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 COBAS AMPLICOR US: 83130 Κιτ Ανίχνευσης HCV, έκδοση 2.0 CX PS1, v2.0 1 x 100 Εξετάσεις (Αιώρημα Ιχνηθέτη HCV 1, έκδοση 2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα MES < 0,4% Dynabeads (παραμαγνητικά σωματίδια) επικαλυμμένο με ολιγονουκλεοτιδικό ιχνηθέτη δέσμευσης ειδικού για HCV (KY150) 0,09% Αζίδιο του νατρίου CX4, v2.0 (HCV Αιώρημα Ιχνηθέτη 2, έκδοση 2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου < 0,2% Σταθεροποιητής διαλύματος 42,2% Θειοκυανικό νάτριο Xn 42,2% (w/w) Θειοκυανικό νάτριο + 1 x 100 Εξετάσεις Επιβλαβές COBAS AMPLICOR DK 100 Εξετ. P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR US: 83276 Κιτ Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης DN4 (Διάλυμα Αποδιάταξης) Xi 1,6% Υδροξείδιο του νατρίου EDTA Μπλε θυμόλη + 1,6% (w/w) Υδροξείδιο του νατρίου 1 x 100 Εξετάσεις Ερεθιστικό CN4 1 x 100 Εξετάσεις (Συζεύκτης Υπεροξειδάσης Αvidin-Ραφανίδας) Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,001% Συζεύκτης Avidin-υπεροξειδάσης ραφανίδας Λευκωματίνη βόειου ορού (θηλαστικού) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Φαινόλη 1% Συντηρητικό ProClin 150 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/42

SB3 (Υπόστρωμα A) Διάλυμα κιτρικού άλατος 0,01% Υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,1% Συντηρητικό ProClin 150 SB (Υπόστρωμα B) 0,1% 3,3',5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνη (TMB) 40% Διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) 5 x 75 Εξετάσεις 5 x 5 ml T 40% (w/w) Διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) Τοξικό R: 61-20/21-36 Μπορεί να βλάψει το έµβρυο κατά τη διάρκεια της κύησης. Επιβλαβές όταν εισπνέεται και σε επαφή µε το δέρµα. Ερεθίζει τα µάτια. S: 53-45 Αποφεύγετε την έκθεση - εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. Σε περίπτωση ατυχήµατος ή αν αισθανθείτε αδιαθεσία ζητήστε αµέσως ιατρική συµβουλή (δείξτε την ετικέτα αν είναι δυνατό). COBAS AMPLICOR CN4 200 Εξετ. P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR US: 83305 Αντιδραστήριο Ανίχνευσης Συζεύκτη CN4 (Συζεύκτης υπεροξειδάσης avidin-ραφανίδας) 2 x 100 Εξετάσεις Ρυθμιστικό διάλυμα tris-hci < 0,001% Συζεύκτης Avidin-υπεροξειδάσης ραφανίδας Λευκωματίνη βόειου ορού (θηλαστικού) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Φαινόλη 1% Συντηρητικό ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 Εξετ. P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR US: 83314 Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης WB (10Χ Πυκνό Διάλυμα Πλύσης) 2 x 250 Εξετάσεις < 2% Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα < 9% Χλωριούχο νάτριο EDTA < 2% Καθαριστικό 0,5% Συντηρητικό ProClin 300 8/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις Σημείωση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση μόνο με ανθρώπινο ορό ή πλάσμα που έχει συλλεχτεί σε αντιπηκτικά EDTA ή ACD. Η ηπαρίνη έχει αποδειχτεί ότι αναστέλλει την PCR και δεν πρέπει να χρησιμοποιείται στη συγκεκριμένη διαδικασία. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και ριβονουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα από τις φιάλες αντιδραστηρίων. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μιας χρήσης με ακροφύσια ελεύθερα από RNase. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων και των απορριμμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Μη χρησιμοποιείτε ένα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης του. Διατίθενται Δελτία δεδομένων ασφάλειας υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να εκτελείται σε μονόδρομη κατεύθυνση, αρχίζοντας από την περιοχή προετοιμασίας πριν από την ενίσχυση και προχωρώντας προς την περιοχή προετοιμασίας μετά την ενίσχυση (ενίσχυση/ανίχνευση). Οι δραστηριότητες πριν από την ενίσχυση πρέπει να αρχίζουν με την προετοιμασία του αντιδραστηρίου και να συνεχίζονται με την προετοιμασία του δείγματος. Τα υλικά και ο εξοπλισμός πρέπει να προορίζονται αποκλειστικά για κάθε ενέργεια που προηγείται της ενίσχυσης και όχι για άλλες ενέργειες, ούτε να μεταφέρονται μεταξύ των περιοχών. Πρέπει να φοράτε γάντια σε κάθε περιοχή και να τα αλλάζετε πριν από την έξοδό σας από τη συγκεκριμένη περιοχή. Ο εξοπλισμός και τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία του αντιδραστηρίου δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για ενέργειες προετοιμασίας δειγμάτων ή για το χειρισμό με πιπέτα ή την επεξεργασία ενισχυμένου DNA ή άλλων πηγών DNA-στόχου. Τα υλικά και ο εξοπλισμός που χρησιμοποιούνται μετά την ενίσχυση πρέπει να παραμένουν πάντοτε στον ειδικό χώρο που προορίζεται για την προετοιμασία μετά την ενίσχυση. Τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 22. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό. Τα οικιακά υγρά λευκαντικά του εμπορίου περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Η αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγει διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. ΠΡΟΣΟΧΗ: Αυτό το κιτ περιέχει ένα στοιχείο (ΝΗΡ) που προέρχεται από ανθρώπινο αίμα. Το υλικό προέλευσης έχει αναλυθεί με εγκεκριμένες από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ εξετάσεις και έχει βρεθεί ότι δεν αντιδρά υπό την παρουσία αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV 1/2, HIV p24 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 9/42

αντιγόνου και αντιγόνου επιφανείας ηπατίτιδας Β (HBsAg). Η εξέταση του αρνητικού ανθρώπινου πλάσματος με μεθόδους PCR δεν έδειξε ανιχνεύσιμο HIV-1 RNA, HCV RNA ή HBV DNA. Καμία γνωστή μέθοδος εξέτασης δεν διασφαλίζει απόλυτα ότι τα προϊόντα που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα δεν μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό, όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται δυνάμει μολυσματικά. Τα NHP πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 22. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό. Τα HCV IC, v2.0. HCV DIL, v2.0. HCV MMX, v2.0. HCV Mn 2+, v2.0. HCV ( ) C, v2.0. HCV (+) C, v2.0 και CX PS1, v2.0 περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Όταν απορρίπτετε διαλύματα που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφύγετε το σχηματισμό αζιδίου. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε τα HCV LYS, v2.0, HCV MMX, v2.0, CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB και υπόστρωμα εργασίας (μίγμα αντιδραστηρίου SB3 και SB). Αποφύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. Αποφύγετε την επαφή του δέρματος ή των βλεννογόνων με το SB ή το υπόστρωμα εργασίας. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής με το δέρμα, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Το SB και το υπόστρωμα εργασίας περιέχουν διμεθυλοφορμαμίδιο, το οποίο έχει χαρακτηριστεί ως τοξικό σε υψηλές δόσεις από το στόμα και μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο έμβρυο. Θα πρέπει να αποφεύγεται η επαφή με το δέρμα, η εισπνοή αναθυμιάσεων και η κατάποση. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής με το δέρμα, πλύνετε καλά με σαπούνι και νερό και ζητήστε αμέσως ιατρική βοήθεια. Μην επιτρέπετε την επαφή του HCV LYS, v2.0, που περιέχει θειοκυανική γουανιδίνη ή του CX4, v2.0 που περιέχει θειοκυανικό νάτριο, με διάλυμα υποχλωριούχου νατρίου (λευκαντικό). Το μίγμα αυτό μπορεί να παραγάγει ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Αποθήκευση και Απαιτήσεις Χειρισμού Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια.. Αποθηκεύστε τα HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 και HCV IC, v2.0 στους 2-8 C. Όταν είναι αχρησιμοποίητα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. 10/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus Στο HCV LYS, v2.0 σχηματίζεται κατακρήμνιση κατά την αποθήκευση στους 2-8 C. Πριν από τη χρήση, θερμάνετε στους 25-37 C και ανακατέψτε καλά για να διαλυθεί η κατακρήμνιση. Θερμάνετε το HCV LYS, v2.0 για έως και 30 λεπτά και στη συνέχεια ανακατέψτε καλά μέχρι να διαλυθούν οι κρύσταλλοι. Πριν από τη χρήση, εξετάστε κάθε φιάλη HCV LYS, v2.0 σε λευκό φόντο για να διαπιστώσετε την ύπαρξη τυχόν κίτρινου χρώματος ή ενδείξεων διαρροής. Εάν παρατηρήσετε κίτρινο χρώμα ή ενδείξεις διαρροής, μη χρησιμοποιήσετε τη φιάλη αυτή για σκοπούς εξέτασης. Επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την αντικατάστασή της. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. Το Αντιδραστήριο Λύσης Εργασίας (που προετοιμάζεται με την προσθήκη HCV IC, v2.0 στο HCV LYS, v2.0) πρέπει να αποθηκεύεται σε θερμοκρασία δωματίου και να χρησιμοποιείται μέσα σε 8 ώρες από την προετοιμασία του. Αποθηκεύστε τα HCV MMX, v2.0 και HCV Mn 2+, v2.0 στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. Το Κύριο Μίγμα Εργασίας (που προετοιμάζεται με την προσθήκη του HCV Mn 2+, v2.0 στο HCV MMX, v2.0) πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και να χρησιμοποιείται μέσα σε 4 ώρες από την προετοιμασία. Αποθηκεύστε το NHP, HCV ( ) C, v2.0 και το HCV (+) C, v2.0 στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. Αποθηκεύστε το CX PS1, v2.0 και CX4, v2.0 στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μόλις το CX PS1, v2.0 και το CX4, v2.0 αναμιχθούν, το αντιδραστήριο εργασίας παραμένει σταθερό για 30 ημέρες στους 2-8 C. Το αντιδραστήριο εργασίας μπορεί να χρησιμοποιηθεί έως και για έξι κύκλους του οργάνου (12 ώρες για κάθε κύκλο) και πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων του οργάνου. Αποθηκεύστε το DN4 στους 2-25 C. Το DN4 παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, το DN4 παραμένει σταθερό για 30 ημέρες σε θερμοκρασία 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Το DN4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί έως και για έξι κύκλους οργάνου (12 ώρες ανά κύκλο) και πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων οργάνου. Αποθηκεύστε το CN4 στους 2-8 C Το CN4 παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, το CN4 παραμένει σταθερό για 30 ημέρες στους 2-8 C ή μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την περίπτωση. Το CN4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί έως και για έξι κύκλους οργάνου (12 ώρες ανά κύκλο) και πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων οργάνου. Αποθηκεύστε το SB3 και το SB στους 2-8 C. Όταν είναι αχρησιμοποίητα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Το Υπόστρωμα Εργασίας πρέπει να προετοιμάζεται κάθε μέρα αναμιγνύοντας το SB3 με το SB. Το Υπόστρωμα Εργασίας παραμένει σταθερό στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή για 16 ώρες. Μην εκθέτετε τα SB3, SB ή το Υπόστρωμα Εργασίας σε μέταλλα, οξειδωτικά ή σε άμεση ηλιακή ακτινοβολία. Αποθηκεύστε το WB στους 2-30 C. Το WB παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Εξετάστε το WB πριν την αραίωση και, αν χρειάζεται, θερμάνετε στους 30-37 C για την επαναδιάλυση των κατακρημνίσεων. Το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης εργασίας (1X), του οποίου η προετοιμασία γίνεται με αραίωση του WB 1:10 με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-25 C στο COBAS AMPLICOR Δοχείο Ρυθμιστικού Διαλύματος Πλύσης και παραμένει σταθερό για 2 εβδομάδες από την ημερομηνία προετοιμασίας. Αποθηκεύστε τα μερικώς χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια ανίχνευσης στους 2-8 C μεταξύ των αναλύσεων του οργάνου. Ελέγξτε την ημερομηνία λήξης των ανοιχτών αντιδραστηρίων ή των Αντιδραστηρίων Εργασίας πριν τη φόρτωση στον COBAS AMPLICOR Αναλυτή. 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 11/42

Παρεχόμενα Υλικά AMPLICOR HCV Specimen HCV PREP P/N: 21111086 123 Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 AMPLICOR HCV US: 83126 Κιτ Προετοιμασίας Δειγμάτων, έκδοση 2.0 HCV LYS, v2.0 (HCV Αντιδραστήριο Λύσης, έκδοση 2.0) HCV DIL, v2.0 (HCV Αραιωτικό Δείγματος, έκδοση 2.0) HCV IC, v2.0 (HCV Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου, έκδοση 2.0) AMPLICOR HCV HCV CTL P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV US: 83131 Κιτ Ορών Ελέγχου, έκδοση 2.0 NHP [Αρνητικό Πλάσμα (Ανθρώπινο)] HCV ( ) C, v2.0 [HCV Ορός Ελέγχου ( ), έκδοση 2.0] HCV (+) C, v2.0 [HCV Ορός Ελέγχου (+), έκδοση 2.0] AMPLICOR HCV HCV AMP P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV US: 83127 Κιτ Ενίσχυσης, έκδοση 2.0 HCV MMX, v2.0 (HCV Κύριο Μίγμα, έκδοση 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (HCV Διάλυμα Μαγγανίου, έκδοση 2.0) COBAS AMPLICOR HCV HCV DK P/N: 21111132 123 Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 COBAS AMPLICOR US: 83130 Kιτ Ανίχνευσης HCV, έκδοση 2.0 CX PS1, v2.0 (HCV Αιώρημα Ιχνηθέτη 1, έκδοση 2.0) CX4, v2.0 (HCV Αιώρημα Ιχνηθέτη 2, έκδοση 2.0) COBAS AMPLICOR DK P/N:20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR US: 83276 Κιτ Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης DN4 (Διάλυμα Αποδιάταξης) CN4 (Συζεύκτης Υπεροξειδάσης Αvidin-Ραφανίδας) 12/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus SB3 (Υπόστρωμα A) SB (Υπόστρωμα B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR US: 83305 Αντιδραστήριο Ανίχνευσης Συζεύκτη CN4 (Συζεύκτης Υπεροξειδάσης Αvidin-Ραφανίδας) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR US: 83314 Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης WB (10 Πυκνό Διάλυμα Πλύσης) Απαιτούμενα Μη Παρεχόμενα Υλικά Περιοχή Προετοιμασίας Αντιδραστηρίων πριν από την Ενίσχυση - COBAS AMPLICOR A-ring τοποθετημένος με 12 A-tubes - Συγκρατητής COBAS AMPLICOR A-ring - Πλαστικός επανασφραγιζόμενος σάκος - Πιπέτα Eppendorf Multipette µε Δοχείο 1,25 ml Combitip (αποστειρωμένη, σε μεμονωμένη συσκευασία) - Συσκευές πιπέτας (χωρητικότητα 50 µl και 100 µl)* με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης ελεύθερα από Rnase - Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα Περιοχή Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου πριν από την Ενίσχυση - 1,5 ml σωληνάρια πολυπροπυλενίου με βιδωτό πώμα, αποστειρωμένα, χωρίς σιλικόνη, κωνικά (Sarstedt 72.692.005, ή αντίστοιχα)** - Υποδοχείς σωληναρίων (Sarstedt 93.1428 ή αντίστοιχα) - 95% αιθανόλη, τύπος αντιδραστηρίου για χρήση στον τομέα της μικροβιολογίας ή της ιστολογίας (χρησιμοποιήστε φρέσκο διάλυμα 70% με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό) - Ισοπροπυλική αλκοόλη, τύπος αντιδραστηρίου - Αποστειρωμένες πιπέτες μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο, ελεύθερο από RNase - Μιας χρήσης αποστειρωμένες ορολογικές πιπέτες από πολυστυρένιο (5 ml, 10 ml και 25 ml) - Συσκευές πιπέτας (χωρητικότητα 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl 400 µl, 600 µl και 1000 µl)* με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης ελεύθερα από RNase - Μικροφυγόκεντρος (μέγ. RCF 16.000 x g, ελάχ. RCF 12.500 x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, ή αντίστοιχο - Αναδευτήρας τύπου Vortex - 60 ± 2 μονάδα ξηρής θερμότητας - Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 13/42

Περιοχή Ενίσχυσης/Ανίχνευσης, μετά την Ενίσχυση - Αναλυτής και εκτυπωτής COBAS AMPLICOR Εγχειρίδιο Χρήστη για τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή Προαιρετικά: Λογισμικό AMPLILINK Προαιρετικά: Σταθμός Δεδομένων για το AMPLILINK Λογισμικό, με εκτυπωτή Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή (για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.2), ή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και το cobas p 630 όργανο (για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3). - COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 Εγχειρίδιο Μεθόδου - Υποδοχείς των D-cups - Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό - Ορολογικές πιπέτες 5 ml - Γάντια μιας χρήσης, χωρίς πούδρα * Οι πιπέτες πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ελεύθερα από Rnase ακροφύσια, με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου προδιαγράφεται, για να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). ** Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Συλλογή, Μεταφορά και Αποθήκευση Δειγμάτων Σημείωση Όλα τα δείγματα πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Συλλογή Δείγματος Το COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 προορίζεται αποκλειστικά για χρήση με δείγματα ορού ή πλάσματος. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται αποκλειστικά σε Σωληνάρια Διαχωρισμού Ορού SST ή σε αποστειρωμένα σωληνάρια με τη χρήση αντιπηκτικού EDTA (μοβ πώμα) ή ACD (κίτρινο πώμα). Τα δείγματα, στα οποία έχει χρησιμοποιηθεί ως αντιπηκτικό η ηπαρίνη, δεν ενδείκνυνται για τη συγκεκριμένη εξέταση. Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για διάστημα 6 ωρών το μέγιστο. Διαχωρίστε τον ορό ή το πλάσμα από το ολικό αίμα μέσα σε 6 ώρες από τη συλλογή, με φυγοκέντριση στα 1500 x g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταφέρετε τον ορό ή το πλάσμα σε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. Μεταφορά Δείγματος Αποθήκευση Δείγματος Η μεταφορά του ολικού αίματος, του ορού ή του πλάσματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν στη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 23. Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C και να υφίσταται επεξεργασία μέσα σε 6 ώρες από τη συλλογή. Ο ορός ή το πλάσμα μπορούν να μεταφερθούν στους 2-8 C ή κατεψυγμένα στους -70 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία και η επεξεργασία τους πρέπει να γίνει εντός των ορίων που προδιαγράφονται παρακάτω. Τα δείγματα ορού ή πλάσματος θα πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C έως και για 72 ώρες ή κατεψυγμένα στους -70 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Συνίσταται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των 250-300 µl σε 14/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml με βιδωτό πώμα (όπως Sarstedt 72.692.105). Τα δείγματα πλάσματος ή ορού μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και δύο φορές. Οδηγίες Χρήσης Σημείωση Σημείωση Σημείωση Σημείωση Σημείωση Αριθμός Αναλύσεων Ροή εργασιών Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, την εκτύπωση αποτελεσμάτων και την ερμηνεία ενδείξεων και σχολίων, ανατρέξτε (1) στο Εγχειρίδιο Χειριστή για τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και (2), εάν χρησιμοποιείτε το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση 3.2, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή και τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή, εάν χρησιμοποιείτε το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση 3.3, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και το cobas p 630 όργανο. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Εξετάστε οπτικά τα αντιδραστήρια για να βεβαιωθείτε για τον επαρκή όγκο πριν ξεκινήσετε τη διαδικασία της εξέτασης. Τα δείγματα πλάσματος και ορού πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Όπου προδιαγράφεται, χρησιμοποιείτε συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για τη διασφάλιση της επιλεκτικής ενίσχυσης. Για την προετοιμασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται σωληνάρια με βιδωτό πώμα, έτσι ώστε να αποφεύγεται το πιτσίλισμα και η ενδεχόμενη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων. Μη χρησιμοποιείτε σωληνάρια με ανοιγόμενο πώμα. Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια για οχτώ αναλύσεις 12 εξετάσεων, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν ξεχωριστά ή ταυτόχρονα. Ένα τουλάχιστον αντίγραφο του AMPLICOR HCV ( ) Ορού Ελέγχου και ένα του AMPLICOR HCV (+) Ορού Ελέγχου πρέπει να περιλαμβάνονται σε κάθε ανάλυση εξέτασης (βλέπε ενότητα Ποιοτικός έλεγχος ). Τα αντιδραστήρια προετοιμασίας και ενίσχυσης δειγμάτων είναι συσκευασμένα σε φιάλες μιας χρήσεως για 12 εξετάσεις. Οι οροί ελέγχου HCV ( ) και HCV (+) συσκευάζονται σε φιαλίδια μιας χρήσης. Για την αποτελεσματικότερη χρήση των αντιδραστηρίων, τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να υφίστανται επεξεργασία σε παρτίδες πολλαπλάσιες του 12. Το COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 μπορεί να ολοκληρωθεί σε μία ή σε δύο ημέρες. Εάν η εξέταση πρόκειται να ολοκληρωθεί σε μία μόνο ημέρα εργασίας, ακολουθήστε τις οδηγίες στις ενότητες Προετοιμασία Αντιδραστηρίων, Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου, και Αντίστροφη Μεταγραφή, Ενίσχυση και Ανίχνευση με τη σειρά. Η εξέταση μπορεί να ολοκληρωθεί σε 2 ημέρες αρχίζοντας από την Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου την πρώτη μέρα, που ακολουθείται από την Προετοιμασία Αντιδραστηρίων και την Αντίστροφη Μεταγραφή, Ενίσχυση και Ανίχνευση τη δεύτερη ημέρα ή ξεκινώντας από την Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου, και την Αντίστροφη Μεταγραφή και Ενίσχυση την πρώτη ημέρα και Ανίχνευση τη δεύτερη. Για να εκτελέσετε επεξεργασία δειγμάτων και ορών ελέγχου την πρώτη μέρα, και αντίστροφη μεταγραφή, ενίσχυση και ανίχνευση τη δεύτερη ημέρα, εκτελέστε την Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου, (Βήματα 1 έως 15) και αποθηκεύστε τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου όπως υποδεικνύεται στο βήμα 15. Τη δεύτερη ημέρα, ξεκινήστε με την Προετοιμασία 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 15/42

Προετοιμασία Αντιδραστηρίων Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση Σημείωση Αντιδραστηρίων, στη συνέχεια αποψύξτε τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου σε θερμοκρασία δωματίου και συνεχίστε με την Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου, βήμα 16, μέχρι την Αντίστροφη Μεταγραφή, Ενίσχυση και Ανίχνευση. Για να εκτελέσετε επεξεργασία των δειγμάτων και των ορών ελέγχου καθώς και αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση την πρώτη ημέρα, συνεχίστε με όλα τα βήματα της Προετοιμασίας Αντιδραστηρίων και της Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου. Προγραμματίστε τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή στην παράλληλη λειτουργία και ολοκληρώστε τα βήματα ενίσχυσης. Αποθηκεύστε τον αποδιαταγμένο κλώνο (amplicon) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 2-8 C και συνεχίστε με την ανίχνευση τη δεύτερη ημέρα. Εκτελείται στην: Περιοχή Προετοιμασίας Αντιδραστηρίων πριν από την Ενίσχυση 1. Καθορίστε τον απαιτούμενο αριθμό των A-ring(s) για την εξέταση των δειγμάτων και των ορών ελέγχου του ασθενή. Τοποθετήστε το/τα A-ring στον αντίστοιχο συγκρατητή (-ές). 2. Προετοιμάστε το Κύριο Μίγμα Εργασίας προσθέτοντας 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 σε ένα φιαλίδιο HCV MMX, v2.0. Δεν απαιτείται η μέτρηση του όγκου του Κύριου Μίγματος. Προσθέστε 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 σε όλο το φιαλίδιο HCV MMX, v2.0. Πωματίστε και πάλι το σωληνάριο και ανακατέψτε καλά αναστρέφοντας το σωληνάριο 10-15 φορές. Μην τοποθετείτε το Κύριο Μίγμα Εργασίας στον αναδευτήρα τύπου vortex. Η ροζ χρωστική στο HCV Mn 2+, v2.0 χρησιμοποιείται για οπτική επιβεβαίωση ότι το HCV Mn 2+, v2.0 έχει προστεθεί στο HCV MMX, v2.0. Απορρίψτε το υπολειπόμενο HCV Mn 2+, v2.0. Το Κύριο Μίγμα Εργασίας πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και να χρησιμοποιείται μέσα σε 4 ώρες από την προετοιμασία. 3. Προσθέστε 50 μl Κύριου Μίγματος Εργασίας σε κάθε A-tube χρησιμοποιώντας μια επαναληπτική συσκευή πιπέτας ή μια συσκευή πιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Μην πωματίζετε το/τα Αtube στη φάση αυτή. 4. Τοποθετήστε το/τα Aring που περιέχει Κύριο Μίγμα Εργασίας σε ένα πλαστικό επανασφραγιζόμενο σάκο και σφραγίστε τον καλά. Μεταφέρετε το/τα Aring στην περιοχή προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου πριν από την ενίσχυση. Αποθηκεύστε το/τα Aring που περιέχουν Κύριο Μίγμα Εργασίας στους 2-8 C στην περιοχή προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου πριν από την ενίσχυση μέχρι να ολοκληρωθεί η προετοιμασία δειγμάτων και ορών ελέγχου. Το Κύριο Μίγμα Εργασίας είναι σταθερό για 4 ώρες στους 2-8 C σε Αtubes σφραγισμένα στον πλαστικό σάκο. Εκτελείται στην: Περιοχή Προετοιμασίας Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου πριν από την Ενίσχυση Για την ενίσχυση των δειγμάτων και ορών ελέγχου που είχαν υποστεί επεξεργασία σε προγενέστερο χρόνο, εκτελέστε πρώτα τα βήματα της ενότητας Προετοιμασία Αντιδραστηρίων. Αποψύξτε τα επεξεργασμένα δείγματα και ορούς ελέγχου σε θερμοκρασία δωματίου και συνεχίστε με το Βήμα 16 της ενότητας Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου. Πριν από τη χρήση, εξετάστε κάθε φιάλη HCV LYS, v2.0 σε λευκό φόντο για να διαπιστώσετε την ύπαρξη τυχόν κίτρινου χρώματος ή ενδείξεων διαρροής. Εάν παρατηρήσετε κίτρινο χρώμα ή ενδείξεις διαρροής, μη χρησιμοποιήσετε τη φιάλη αυτή για σκοπούς εξέτασης. Επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την αντικατάστασή της. 16/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0

Hepatitis C Virus Σημείωση Σημείωση Σημείωση Στο HCV LYS v2.0, δημιουργείται κατακρήμνιση κατά την αποθήκευση στους 2-8 C. Πριν από τη χρήση, θερμάνετε στους 25-37 C έως και για 30 λεπτά και ανακατέψτε καλά για να διαλυθεί το υλικό κατακρήμνισης. 1. Προετοιμάστε 70% αιθανόλη. Για 12 εξετάσεις, αναμίξτε 11,0 ml 95% αιθανόλη και 4,0 ml απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό. 2. Επικολλήστε ετικέτα σε ένα σωληνάριο 1,5 ml με βιδωτό πώμα για κάθε δείγμα ασθενή και σε δύο επιπλέον σωληνάρια με την επισήμανση HCV ( ) C και HCV (+) C. 3. Προετοιμάστε Αντιδραστήριο Λύσης Εργασίας. Στροβιλίστε το HCV IC, v2.0 για 5-10 δευτερόλεπτα πριν την χρήση. Για κάθε παρτίδα που περιέχει 12 δείγματα και ορούς ελέγχου, προσθέστε 100 µl HCV IC, v2.0 σε μια φιάλη HCV LYS, v2.0 και ανακατέψτε καλά. Δεν απαιτείται η μέτρηση του όγκου του HCV LYS, v2.0. Το HCV IC, v2.0 πρέπει να προστεθεί στο HCV LYS, v2.0 ακόμη και αν δεν ανιχνευτεί το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου HCV. Απορρίψτε το υπολειπόμενο HCV IC, v2.0. Το Αντιδραστήριο Λύσης Εργασίας είναι σταθερό για 8 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Εάν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα, αποψύξτε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρίστε για 3 έως 5 δευτερόλεπτα. Περιστρέψτε σύντομα το σωληνάριο δείγματος για τη συλλογή του δείγματος στη βάση του σωληναρίου. Κατά το χειρισμό των δειγμάτων, φροντίστε ώστε να μη μολυνθούν τα γάντια. 4. Προσθέστε 400 μl αντιδραστήριο λύσης εργασίας σε κάθε επισημασμένο σωληνάριο και τοποθετήστε τα πώματα στα σωληνάρια. 5. Προετοιμάστε τους Ορούς Ελέγχου ως εξής: Φυγοκεντρίστε το NHP, HCV ( ) C, v2.0 και το HCV (+) C, v2.0 για τουλάχιστον 5-10 δευτερόλεπτα. Προσθέστε 200 µl NHP σε καθένα από τα δύο σωληνάρια ορού ελέγχου. Πωματίστε τα σωληνάρια και φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 3-5 δευτερόλεπτα. Προσθέστε 20 µl HCV ( ) C, v2.0 στο σωληνάριο με την επισήμανση HCV ( ) C που περιέχει Αντιδραστήριο Λύσης Εργασίας και NHP. Πωματίστε τα σωληνάρια και φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 3-5 δευτερόλεπτα. Προσθέστε 20 µl HCV (+) C, v2.0 στο σωληνάριο με την επισήμανση HCV (+) C που περιέχει Αντιδραστήριο Λύσης Εργασίας και NHP. Πωματίστε τα σωληνάρια και φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 3-5 δευτερόλεπτα. 6. Προσθέστε 200 µl από κάθε δείγμα ασθενή στα σωληνάρια με τις αντίστοιχες επισημάνσεις που περιέχουν αντιδραστήριο λύσης εργασίας. Πωματίστε τα σωληνάρια και φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 3-5 δευτερόλεπτα. 7. Επωάστε τα σωληνάρια δείγματος και ορού ελέγχου σε μονάδα ξηρής θερμότητας για 10 λεπτά στους 60 ± 2 C. Φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 10 δευτερόλεπτα. 8. Αφαιρέστε τα πώματα από τα σωληνάρια και προσθέστε 600 µl 100% ισοπροπυλικής αλκοόλης (σε θερμοκρασία δωματίου) σε κάθε σωληνάριο. Πωματίστε τα σωληνάρια ξανά και φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 3-5 δευτερόλεπτα. Επωάστε όλα τα σωληνάρια για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 8/2009, Revision 9.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 17/42

Σημείωση 9. Τοποθετήστε σήμανση προσανατολισμού σε κάθε σωληνάριο και εισαγάγετε τα σωληνάρια στη μικροφυγόκεντρο με τις σημάνσεις προσανατολισμού προς τα έξω, έτσι ώστε τα καθιζήματα να ευθυγραμμίζονται με τις σημάνσεις προσανατολισμού. Φυγοκεντρίστε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου στη μέγιστη ταχύτητα (12.500-16.000 x g) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Χρησιμοποιώντας μια νέα, μιας χρήσεως πιπέτα μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο για κάθε σωληνάριο, αφαιρέστε προσεκτικά και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό από κάθε σωληνάριο, προσέχοντας να μη διασπάσετε το καθίζημα (που μπορεί να μην είναι ορατό). Αφαιρέστε όσο περισσότερο υγρό είναι δυνατόν χωρίς να διασπάσετε το καθίζημα. Αποσύρετε αργά το υπερκείμενο υγρό, επιτρέποντας την πλήρη εκροή του υγρού από τα πλάγια του σωληναρίου. Μη χρησιμοποιείτε αναρρόφηση σε κενό. 11. Προσθέστε σε κάθε σωληνάριο 1,0 ml αιθανόλης 70% (σε θερμοκρασία δωματίου), επαναπωματίστε και φυγοκεντρίστε για τουλάχιστον 3-5 δευτερόλεπτα. 12. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στη μικροφυγόκεντρο με τις σημάνσεις προσανατολισμού να βλέπουν προς τα έξω και φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια για 5 λεπτά στη μέγιστη ταχύτητα (12.500-16.000 x g) σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Χρησιμοποιώντας μια νέα, μιας χρήσεως πιπέτα μεταφοράς με λεπτό ακροφύσιο για κάθε σωληνάριο, αφαιρέστε προσεκτικά και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό από κάθε σωληνάριο, χωρίς να διασπάσετε το καθίζημα. Στο βήμα αυτό, το καθίζημα πρέπει να είναι ορατό. Αφαιρέστε όσο περισσότερο υπερκείμενο υγρό μπορείτε. 14. Πωματίστε ξανά τα σωληνάρια και φυγοκεντρίστε στη μέγιστη ταχύτητα για 3-5 δευτερόλεπτα. Αφαιρέστε προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό χωρίς να διασπάσετε το καθίζημα χρησιμοποιώντας μια πιπέτα χωρητικότητας 200 μl που διαθέτει νέο ακροφύσιο για κάθε σωληνάριο. Στο βήμα αυτό, το καθίζημα πρέπει να είναι ορατό. Αφαιρέστε όσο περισσότερο υπερκείμενο υγρό μπορείτε. Τα υπολείμματα αιθανόλης μπορεί να αναστείλουν την ενίσχυση. 15. Προσθέστε 200 μl HCV DIL,v2.0 σε κάθε σωληνάριο. Διασπάστε το καθίζημα όσο περισσότερο μπορείτε με μια πιπέτα χωρητικότητας 200 µl που διαθέτει ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων. Επαναπωματίστε τα σωληνάρια. Στροβιλίστε έντονα για 10 δευτερόλεπτα. Υπάρχει πιθανότητα να μείνει μια ποσότητα αδιάλυτου υλικού. Ενισχύστε τα επεξεργασμένα δείγματα και τους ορούς ελέγχου εντός τριών ωρών από την προετοιμασία ή αποθηκεύστε τα κατεψυγμένα στους -70 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία για ένα μήνα με όχι περισσότερες από δύο καταψύξεις/αποψύξεις. Περισσότεροι από δύο κύκλοι κατάψυξης/απόψυξης μπορεί να οδηγήσουν σε απώλεια του σήματος HCV ή του σήματος Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου HCV. Εάν τα επεξεργασμένα δείγματα και οι οροί ελέγχου είχαν αποθηκευτεί κατεψυγμένα πριν από την ενίσχυση, αποψύξτε σε θερμοκρασία δωματίου και στροβιλίστε για 5 δευτερόλεπτα πριν προχωρήσετε στο βήμα 16. 16. Προσθέστε 50 μl από κάθε επεξεργασμένο δείγμα και ορό ελέγχου στα A tubes με τις αντίστοιχες επισημάνσεις που περιέχουν κύριο μίγμα εργασίας, χρησιμοποιώντας μια συσκευή μικροπιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης. Χρησιμοποιήστε ένα νέο ακροφύσιο για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Φροντίστε ώστε να αποφύγετε τη μεταφορά τυχόν κατακρημνισμένου υλικού που ενδέχεται να μην έχει επανέλθει στο διάλυμα. Πωματίστε τα A tubes. 17. Καταγράψτε τις θέσεις των ορών ελέγχου και των δειγμάτων στα Α rings. Η ενίσχυση μπορεί να ξεκινήσει μέσα σε 45 λεπτά από το χρόνο προσθήκης των επεξεργασμένων δειγμάτων και ορών ελέγχου στα A tubes 18/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 8/2009, Revision 9.0