(µε παράγοντες ανάπτυξης)

============= i=eéãç=ee~éãçéüáäìëf=fa=nr^a== = (µε παράγοντες ανάπτυξης) Αναθ. 05 εκέµβριος 2006 ΙΑ ΙΚΑΣΙΕΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ I II ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το τρυβλίο Hemo (Haemophilus) ID QUAD προορίζεται για την ταυτοποίηση των ειδών Haemophilus. ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ 1. Ενοφθαλµίστε γραµµωτά αντιπροσωπευτικά δείγµατα µε τις καλλιέργειες που παρατίθενται παρακάτω. 2. Χρησιµοποιήστε καλλιέργειες ζωµού 18 έως 24 hωρών αραιωµένες σε πυκνότητα 10-1. 3. Επωάστε τα τρυβλία στους 35 ± 2 C σε αερόβια ατµόσφαιρα συµπληρωµένη µε διοξείδιο του άνθρακα. 4. Εξετάστε τα τρυβλία µετά από 18 έως 24 ώρεςh για τυχόν ανάπτυξη του Haemophilus. 5. Αναµενόµενα αποτελέσµατα Ανάπτυξη στο τεταρτηµόριο Αιµόλυση I II III IV *Haemophilus influenzae + ATCC 10211 *Haemophilus parahemolyticus + + + ATCC 10014 Για να ελέγξετε το τεταρτηµόριο I για την παρουσία του παράγοντα X, ενοφθαλµίστε µε το H. influenzae ATCC 10211 και προσθέστε µια ταινία ή ένα δίσκο παράγοντα V στο κέντρο του τεταρτηµορίου. Εάν υπάρχει παράγοντας X στο υλικό καλλιέργειας, θα παρουσιαστεί ανάπτυξη. *Συνιστώµενο στέλεχος µικροοργανισµού για ποιοτικό έλεγχο χρήστη. III ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 1. Εξετάστε τα τρυβλία όπως περιγράφεται στην ενότητα Αλλοίωση του προϊόντος. 2. Εξετάστε αντιπροσωπευτικά τρυβλία οπτικώς για να βεβαιωθείτε ότι τυχόν υπάρχοντα φυσικά ελαττώµατα δε θα επηρεάσουν δυσµενώς κατά τη χρήση. 3. Σηµειώστε τη στερεότητα των τρυβλίων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενοφθαλµισµού. 4. Επωάστε µη ενοφθαλµισµένα αντιπροσωπευτικά τρυβλία στους 35 ± 2 C επί 72 h και εξετάστε για τυχόν µικροβιακή µόλυνση. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ IV ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ Το τρυβλίο Hemo (Haemophilus) Identification (ID) QUAD (µε παράγοντες ανάπτυξης) χρησιµοποιείται για τη διαφοροποίηση και την ταυτοποίηση των ειδών Haemophilus µε βάση τις απαιτήσεις για παράγοντες ανάπτυξης X ή/και V, καθώςκαι τις αιµολυτικές αντιδράσεις. V ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Το 1917, ο Davis ανέφερε ότι τα βακτηρίδια της γρίππης χρειάζονταν δύο παράγοντες για in vitro ανάπτυξη, έναν από αιµοσφαιρίνη και έναν άλλο τον οποίο ο µικροοργανισµός ελάµβανε από µια δορυφορική σχέση µε τον Staphylococcus aureus. 1 Το 1921, οι Thjotta και Avery περιέγραψαν τον παράγοντα ανάπτυξης από το αίµα ως παράγοντα X και τον άλλο ως παράγοντα V. 2 Ο παράγοντας X βρέθηκε στην αιµίνη και αργότερα ταυτοποιήθηκε ως πρωτοπορφυρίνη IX ή πρωτοαίµη και ο παράγοντας V ταυτοποιήθηκε ως νικοτιναµιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο (NAD). 3,4 Τα παθογόνα είδη Haemophilus είναι δυνατό να διαφοροποιηθούν και να ταυτοποιηθούν συµπερασµατικά µε προσδιορισµό των απαιτήσεων in vitro για τους παράγοντες X ή/και V, καθώςκαι µε προσδιορισµό των αιµολυτικών αντιδράσεων. 1

VI ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το τρυβλίο Hemo ID QUAD (µε παράγοντες ανάπτυξης) είναι χωρισµένο σε τέσσερις τοµείς και περιέχει Brain Heart Infusion Aar στα τεταρτηµόρια I, II και III και Blood Aar Base στο τεταρτηµόριο IV. Το τεταρτηµόριο I είναι εµπλουτισµένο µε αιµίνη για την παροχή του παράγοντα X. Το τεταρτηµόριο II είναι εµπλουτισµένο µε IsoVitaleX Enrichment για την παροχή του παράγοντα V και άλλων θρεπτικών συστατικών, όπως θειαµίνη και κυστεΐνη, τα οποία διεγείρουν την ανάπτυξη των ειδών Haemophilus. Το τεταρτηµόριο III περιέχει τόσο αιµίνη όσο και IsoVitaleX Enrichment. Το τεταρτηµόριο IV συµπληρώνεται µε NAD για την παροχή του παράγοντα V, καθώς και µε αίµα ίππου για την παροχή του παράγοντα X και την κατάδειξη των αιµολυτικών αντιδράσεων. Ένα αποµονωµένο στέλεχος Haemophilus, που αναπτύσσεται στα τεταρτηµόρια III και IV, αλλά όχι στα τεταρτηµόρια I και II, εµφανίζει απαίτηση για αµφότερους τους παράγοντες X και V. Ένα αποµονωµένο στέλεχος, που δεν αναπτύσσεται στο τεταρτηµόριο I, αλλά αναπτύσσεται στα τεταρτηµόρια II, III και IV, υποδηλώνει απαίτηση µόνο για τον παράγοντα V. Εναλλακτικά, ένα αποµονωµένο στέλεχος που δεν αναπτύσσεται στο τεταρτηµόριο IΙ, αλλά αναπτύσσεται στα τεταρτηµόρια I, III και IV, υποδηλώνει µια απαίτηση µόνο για τον παράγοντα XΧ. VII ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Brain Heart Infusion Aar (BHIA) Προϊόν έγχυσης εγκεφάλου/καρδιάς (στερεά)... 8,0 Πεπτικό αφοµοίωµα ζωικού ιστού... 5,0 Παγκρεατικό αφοµοίωµα καζεΐνης... 16,0 Χλωριούχο νάτριο... 5,0 εξτρόζη... 2,0 Όξινο φωσφορικό νάτριο... 2,5 Άγαρ... 13,5 Blood Aar Base (BAB) Προϊόν έγχυσης καρδιακού µυός (στερεά)... 2,0 Παγκρεατικό αφοµοίωµα καζεΐνης... 13,0 Εκχύλισµα ζυµοµυκήτων... 5,0 Χλωριούχο νάτριο... 5,0 Άγαρ... 15,0 IsoVitaleX Enrichment Βιταµίνη B 12... 0,01 L-γλουταµίνη... 10,0 Αδενίνη... 1,0 Υδροχλωρική γουανίνη... 0,03 π-αµινοβενζοϊκό οξύ... 0,013 Νικοτιναµιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο... 0,25 Πυροφωσφορική θειαµίνη... 0,1 Νιτρικός σίδηρος(ιιι)... 0,02 Υδροχλωρική θειαµίνη... 0,003 Υδροχλωρική L-κυστεΐνη... 25,9 L-κυστίνη... 1,1 εξτρόζη... 100,0 Το τεταρτηµόριο I αποτελείται από BHIA µε περίπου 20,0 m/l αιµίνης. Το τεταρτηµόριο II αποτελείται από BHIA µε περίπου 10,0 ml/l IsoVitaleX Enrichment. Το τεταρτηµόριο III αποτελείται από BHIA µε περίπου 20,0 m/l αιµίνης και 10,0 ml/l IsoVitaleX Enrichment. Το τεταρτηµόριο IV αποτελείται από BAB µε περίπου 10 ml/l IsoVitaleX Enrichment και 5% αίµα αλόγου. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. Εάν παρατηρήσετε υπερβολική υγρασία, τοποθετήστε το κάτω τµήµα του τρυβλίου ανάποδα και έκκεντρα πάνω από ένα καπάκι και αφήστε το να στεγνώσει στον αέρα προκειµένου να αποτραπεί 2

τυχόν σχηµατισµός στεγανοποίησης µεταξύ του άνω και του κάτω τµήµατος του τρυβλίου κατά τη διάρκεια της επώασης. Εφαρµόζετε άσηπτες τεχνικές και καθιερωµένες προφυλάξεις από µικροβιολογικούς κινδύνους καθόλη την πορεία όλων των διαδικασιών. Μετά τη χρήση, τα παρασκευασµένα τρυβλία, τα δοχεία δείγµατος και άλλα µολυσµένα υλικά πρέπει να αποστειρώνονται σε αυτόκαυστο πριν από την απόρριψη. Οδηγίες φύλαξης Κατά την παραλαβή, φυλάσσετε τα τρυβλία στο σκότος στους 2 8 C. Αποφεύγετε την κατάψυξη και την υπερβολική θέρµανση. Μην ανοίγετε παρά µόνον όταν είστε έτοιµοι για χρήση. Ελαχιστοποιήστε την έκθεση στο φως. Τα παρασκευασµένα τρυβλία που φυλάσσονται στο αρχική συσκευασία τους στους 2 έως 8 C έως ακριβώς πριν από τη χρήση, είναι δυνατό να ενοφθαλµιστούν έως την ηµεροµηνία λήξης και να επωαστούν για τους συνιστώµενους χρόνους επώασης. Αφήστε το υλικό καλλιέργειας να θερµανθεί σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τον ενοφθαλµισµό. Αλλοίωση των προϊόντων Μη χρησιµοποιείτε τα τρυβλία εάν παρουσιάζουν ενδείξεις µικροβιακής µόλυνσης, αποχρωµατισµό, ξηρότητα ή άλλα σηµεία αλλοίωσης. VIII ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Για τη συλλογή δειγµάτων, έχει επινοηθεί µια ποικιλία στειλεών και δοχείων. Τα δείγµατα θα πρέπει να λαµβάνονται πριν από τη χορήγηση αντιµικροβιακής θεραπείας. Πρέπει να λαµβάνονται µέτρα για την άµεση µεταφορά στο εργαστήριο. Έχουν επινοηθεί αρκετά µέσα συγκράτησης ή συστήµατα µεταφοράς, όπως προϊόντα συλλογής και µεταφοράς δειγµάτων BBL, για την παράταση της επιβίωσης των µικροοργανισµών όταν αναµένεται σηµαντική καθυστέρηση µεταξύ της συλλογής και της οριστικής καλλιέργειας. Ανατρέξτε στα κατάλληλα κείµενα για λεπτοµέρειες σχετικά µε τις διαδικασίες συλλογής και χειρισµού των δειγµάτων. 5,6 IX ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Παρεχόµενο υλικό Hemo ID QUAD (µε παράγοντες ανάπτυξης) Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Βοηθητικά υλικά καλλιέργειας, αντιδραστήρια, µικροοργανισµοί ποιοτικού ελέγχου και εργαστηριακός εξοπλισµός, όπως απαιτείται. ιαδικασία της εξέτασης Η επιφάνεια του άγαρ θα πρέπει να είναι λεία και υγρή, αλλά χωρίς υπερβολική υγρασία. Τα αρχικά δείγµατα πρέπει να ενοφθαλµίζονται πάνω σε BBL Chocolate II Aar ή άλλο κατάλληλο υλικό καλλιέργειας και να επωάζονται επί 18 έως 24 ώρεhς σε ατµόσφαιρα εµπλουτισµένη µε CO 2. Επιλέξτε µία ή δύο αποικίες που µοιάζουν µε είδη Haemophilus και εκτελέστε χρώση κατά Gram για να επιβεβαιώσετε ότι το αποµονωµένο στέλεχος είναι ram-αρνητικό ραβδίο ή κοκκοβάκιλλος. Για την παρασκευή του ενοφθαλµίσµατος, εναιωρήστε διάφορες καλά αποµονωµένες αποικίες του µικροοργανισµού εξέτασης, από µια καλλιέργεια σε τρυβλίο 18 24 h, σε 5 ml απεσταγµένου νερού ή Trypticase Soy Broth ή άλλου κατάλληλου υλικού καλλιέργειας και κατόπιν ρυθµίστε τη θολερότητα σε πρότυπο θολερότητας McFarland 0,5. Αραιώστε σε πυκνότητα 10-1. Ενοφθαλµίστε κάθε τεταρτηµόριο µε ένα γεµάτο κρίκο του αραιωµένου δείγµατος και επιστρώστε γραµµωτά για να λάβετε αποµονωµένες αποικίες. Για να αποτραπεί τυχόν επιµόλυνση των παραγόντων ανάπτυξης, αποστειρώνετε τον κρίκο µεταξύ των ενοφθαλµισµών κάθε τεταρτηµορίου. Εναλλακτικά, εναιωρήστε µία ή δύο αποικίες σε 5 ml απεσταγµένου νερού ή Trypticase Soy Broth ή άλλου κατάλληλου υλικού καλλιέργειας και υποβάλετε σε περιδίνηση για να αναµείξετε το διάλυµα. Ενοφθαλµίστε κάθε τεταρτηµόριο του τρυβλίου µε ένα γεµάτο κρίκο του αραιωµένου δείγµατος και επιστρώστε γραµµωτά, έτσι ώστε να λάβετε αποµονωµένες αποικίες, αποστειρώνοντας τον κρίκο µεταξύ των ενοφθαλµισµών κάθε τεταρτηµορίου. Μην ενοφθαλµίζετε τρυβλία απευθείας από το σοκολατούχο τρυβλίο. Το ενοφθάλµισµα πρέπει να αραιώνεται όπως περιγράφεται παραπάνω. Αναστρέψτε τα τρυβλία (µε την πλευρά του άγαρ προς τα επάνω), κατόπινεπωάστε τα σε ατµόσφαιρα εµπλουτισµένη µε CO 2 στους 35 C επί 24 ώρεςh και εξετάστε για τυχόν ανάπτυξη. 3

Ποιοτικός έλεγχος χρήστη είτε την ενότητα ιαδικασίες ποιοτικού ελέγχου. Πρέπει να τηρούνται οι απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου σύµφωνα µε τους ισχύοντες τοπικούς, πολιτειακούς ή/και οµοσπονδιακούς κανονισµούς ή τις απαιτήσεις πιστοποίησης και τις πρότυπες διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου του εργαστηρίου σας. Συνιστάται ο χρήστης να ανατρέχει στις σχετικές κατευθυντήριες οδηγίες της CLSI και τους κανονισµούς του CLIA για τις κατάλληλες πρακτικές ποιοτικού ελέγχου. X ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μετά από 24 h επώασης, στα τρυβλία πρέπει να εµφανίζεται ανάπτυξη ή όχι, ανάλογα µε τις απαιτήσεις σε παράγοντες X και V. Το αποµονωµένο στέλεχος πρέπει να αναπτύσσεται στα τεταρτηµόρια III και IV. Στο τεταρτηµόριο IV, οι αποµονωµένες αποικίες ενδέχεται να έχουν ζώνες αιµόλυσης, ανάλογα µε το είδος που αποµονώνεται. Στον ακόλουθο πίνακα παρουσιάζονται τα αναµενόµενα αποτελέσµατα ανάπτυξης για διάφορα είδη Haemophilus: Τεταρτηµόρια (Παράγοντες που υπάρχουν) I(X) II(V) III(XV) Αιµόλυση IV H. influenzae + H. haemolyticus + + H. parainfluenzae + + H. parahaemolyticus + + + Για την επιβεβαίωση των ευρηµάτων, πρέπει να εκτελείται χρώση κατά Gram, βιοχηµικές εξετάσεις ή/και επιπλέον διαδικασίες ταυτοποίησης. XI ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Τα τρυβλία αυτά προορίζονται µόνον για χρήση στα πλαίσια ενός σχήµατος ταυτοποίησης των ειδών Haemophilus. Για πληροφορίες σχετικά µε τηχρώgram, βιοχηµικές εξετάσεις και άλλες διαδικασίες, συµβουλευτείτε τις κατάλληλες βιβλιογραφικές αναφορές. 7-9 Κατά τη µεταφορά ενός πυκνού ενοφθαλµίσµατος ή άµεσου υλικού ανάπτυξης στο τρυβλίο Hemo ID QUAD, ενδέχεται να παρουσιαστεί επιµόλυνση της αιµίνης (παράγοντας X) από το σοκολατούχο άγαρ. Αυτό ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα εσφαλµένη ερµηνεία των απαιτήσεων σε παράγοντες ανάπτυξης και πιθανή εσφαλµένη ταυτοποίηση του µικροοργανισµού. Με παρασκευή εναιωρήµατος ανάπτυξης µε θολερότητα συγκρίσιµη µε το πρότυπο θολερότητας McFarland 0,5 και κατόπιν αραίωση του εναιωρήµατος σε πυκνότητα 10-1, οι απαιτήσεις σε παράγοντες ανάπτυξης είναι δυνατό να προσδιοριστούν µε ακρίβεια. Ίχνη ανάπτυξης στα τεταρτηµόρια I και II, όταν συγκρίνεται µε την ανάπτυξη στα τεταρτηµόρια III και IV, πρέπει να θεωρείται ως απουσία ανάπτυξης. Συγκρίνετε την ανάπτυξη στα τεταρτηµόρια I και II µε την ανάπτυξη στα τεταρτηµόρια III και IV. Εάν είναι συγκρίσιµη ή παρουσιάζεται µεγαλύτερη ανάπτυξη, θεωρήστε το αποτέλεσµα ως θετικό. Εάν εµφανίζεται έντονη ανάπτυξη και στα τέσσερα τεταρτηµόρια, παρασκευάστε µια χρώση κατά Gram για τον προσδιορισµό της καθαρότητας και κατά πόσον τα µορφολογικά χαρακτηριστικά είναι κατάλληλα για τα είδη Haemophilus. XII ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Πριν από τη διάθεσή τους, όλες οι παρτίδες Hemo (Haemophilus) ID QUAD µε παράγοντες ανάπτυξης εξετάζονται ως προς τα χαρακτηριστικά απόδοσης. Αντιπροσωπευτικά δείγµατα της παρτίδας εξετάζονται µε το Haemophilus parahaemolyticus ATCC 10014 και το H. influenzae ATCC 10211, ενοφθαλµίζονται µε χρήση εναιωρηµάτων φυσιολογικού αλατούχου διαλύµατος, έτσι ώστε να επιτευχθεί πυκνότητα 1 x 10 3 έως 1 x 10 4 CFU/τεταρτηµόριο. Στο τεταρτηµόριο Ι τοποθετείται µια ταινία παράγοντα V ενοφθαλµισµένη µε το H. influenzae για την εξέταση παρουσίας του παράγοντα X. Τα τρυβλία επωάζονται στους 35 37 C επί µία ηµέρα σε αερόβια ατµόσφαιρα. Το H. parahemolyticus αναπτύσσεται στα τεταρτηµόρια II, III και IV που περιέχουν τον παράγοντα V. Το H. influenzae αναπτύσσεται στα τεταρτηµόρια I, III και IV, τα οποία έχουν αµφότερους τους παράγοντες X και V. Στο τεταρτηµόριο IV παρατηρείται β-αιµόλυση για το H. parahaemolyticus. XIII ΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ Αρ. κατ. Περιγραφή 297890 BBL Hemo ID QUAD (µε παράγοντες ανάπτυξης), συσκευασία των 10 τρυβλίων 4

XIV ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. Davis, D.J. 1917. Food accessory factors (vitamins) in bacterial culture with especial reference to hemophilic bacilli. J. Infect. Dis. 21:392-403. 2. Thjotta, T., and O.T. Avery. 1921. Studies on bacterial nutrition. II. Growth accessory substances in the cultivation of hemophilic bacilli. J. Exp. Med. 34:97-114. 3. Lwoff, A., and M. Lwoff. 1937. Studies on codehydroenases. I. Nature of rowth factor "V". Proc. Roy. Soc. (London) 122:352-359. 4. Kilian, M. 1991. Haemophilus, p. 463-470. In A. Balows, W.J. Hausler, Jr., K.L. Herrmann, H.D. Isenber, and H.J. Shadomy (ed.), Manual of clinical microbioloy, 5th ed. American Society for Microbioloy, Washinton, D.C. 5. Isenber, H.D., FD. Schoenknecht, and A. von Graevenitz. 1979. Cumitech 9, Collection and processin of bacterioloical specimens. Coordinatin ed.,s.j. Rubin. American Society for Microbioloy, Washinton, D.C. 6. Miller, J.M. and H.T. Holmes. 1999. Specimen collection, transport, and storae, p.33-63. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbioloy, 7th ed. Americn Society for Microbioloy, Washinton, D.C. 7. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scott's dianostic microbioloy, 11th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 8. Holt, J.G., N.R. Krie, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Williams (ed.). 1994. Berey's Manual of determinative bacterioloy, 9th ed. Williams & Wilkins, Baltimore. 9. Campos, J.M. 1999. Haemophilus, p. 604-613. In P.R. Murrray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbioloy, 7th ed. American Society for Microbioloy, Washinton, D.C. _ÉÅíçåI=aáÅâáåëçå=~åÇ=`çãé~åó=================================== _bkbu=iáãáíéç= T=içîÉíçå=`áêÅäÉ= = = _~ó=h=n~lçi=pü~ååçå=fåçìëíêá~ä=bëí~íé= pé~êâëi=j~êóä~åç=onnro=rp^= = pü~ååçåi=`çìåíó=`ä~êéi=fêéä~åç= UMMJSPUJUSSP= = = qéäw=prpjsnjqtjovjom= = = = = = c~ñw=prpjsnjqtjorjqs= ^q``=áë=~=íê~çéã~êâ=çñ=íüé=^ãéêáå~å=qóéé=`ìäíìêé=`çääéåíáçåk== _ai=_a=içöçi= ii=fëçsáí~äéu=~åç=qêóéíáå~ëé=~êé=íê~çéã~êâë=çñ=_éåíçåi=aáåâáåëçå=~åç=`çãé~åók=«omms=_ak 5