LightCycler SeptiFast meca Test MG Για χρήση µε το LightCycler 2.0 Όργανο

ΓΙΑ ΧΡΗΣΗ ΜΕ: LightCycler SeptiFast meca Test MG Για χρήση µε το LightCycler 2.0 Όργανο (σειριακός αριθµός 1415001 και µεγαλύτερος) Για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. LightCycler SeptiFast meca Kit MG 2 x 15 Tests REF : 04 488 814 001 LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : 04 469 046 001 SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : 04 404 432 001 SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : 04 404 459 001 SeptiFast Software Set REF : 04 705 220 001 ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το LightCycler SeptiFast meca Test MG είναι µία in Vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του DNA meca σε ανθρώπινο αίµα µε αντιπηκτικό K-EDTA, µε τη χρήση του LightCycler 2.0 Οργάνου. Χρησιµοποιείται ως βοήθηµα για την ανίχνευση ανθεκτικών στη µεθικιλλίνη στελεχών του Staphylococcus aureus. Η εξέταση χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε την κλινική παρουσίαση, τις καθιερωµένες µικροβιολογικές αναλύσεις και/ή άλλους εργαστηριακούς δείκτες, ως βοήθηµα στην αντιµετώπιση ασθενών µε υποψία βακτηριαιµίας από MRSA (πολυανθεκτικός χρυσίζων σταφυλόκοκκος). Η εξέταση χρησιµοποιείται για ασθενείς, οι οποίοι βγήκαν θετικοί για Staphylococcus aureus µετά από εξέταση µε το LightCycler SeptiFast Test MG. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Ο Staphylococcus aureus είναι ένα από τα πιο συχνά αποµονωµένα παθογόνα βακτηριαιµίας (1). Η συχνότητα εµφάνισης ανθεκτικών στη µεθικιλλίνη νοσοκοµειακών στελεχών, αυξάνεται σταθερά σε πολλές περιοχές (2) και τα νέα εξονοσοκοµειακά στελέχη (3) αποτελούν µια νέα απειλή. Η αντίσταση στη µεθικιλλίνη σχετίζεται µε ένα σηµαντικά υψηλότερο ποσοστό θνησιµότητας από αυτό σε περιπτώσεις βακτηριαιµίας από Staphylococcus aureus ευαίσθητου στη µεθικιλλίνη (4,5) (MSSA). Ο ανθεκτικός στη µεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA) έχει περιγραφεί ότι συνεισφέρει υπεραναλογικά στην ανεπαρκή εµπειρική θεραπεία, π.χ. σε µονάδες εντατικής θεραπείας (6,7), και ότι προκαλεί σηµαντικές πρόσθετες δαπάνες (8). Η λήψη συνετών αποφάσεων, όσον αφορά στις πρόωρες επιλογές αντιβιοτικών, είναι σηµαντική (9). Το LightCycler SeptiFast meca Test MG παρέχει ένα επιπρόσθετο εργαλείο για τη διευκόλυνση της λήψης αποφάσεων σχετικά µε την επιλογή των αντιβιοτικών. Το LightCycler SeptiFast meca Test MG µπορεί να διευκολύνει την έγκαιρη διάγνωση και την επιλογή της κατάλληλης αντιβιοτικής θεραπείας. Η µέθοδος αυτή, που βασίζεται στο νουκλεϊκό οξύ, ανιχνεύει το γονίδιο meca, το οποίο µεσολαβεί στην υψηλού επιπέδου αντίσταση στη µεθικιλλίνη. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Η εξέταση χρησιµοποιείται για την ανίχνευση του DNA meca σε ασθενείς, οι οποίοι βγήκαν θετικοί για Staphylococcus aureus µετά από εξέταση µε το LightCycler SeptiFast Test MG. Η προετοιµασία του δείγµατος περιγράφεται στο ένθετο συσκευασίας για το LightCycler SeptiFast Test MG. Για το LightCycler SeptiFast meca Test MG, χρησιµοποιείται ένα κλάσµα του εκλούµατος του LightCycler SeptiFast Test MG. Η ροή εργασιών του LightCycler SeptiFast Test MG περιλαµβάνει την προετοιµασία του δείγµατος µε µηχανική λύση και καθαρισµό του DNA. Στη συνέχεια, το DNA στόχος ενισχύεται µε PCR πραγµατικού χρόνου σε 3 παράλληλες αντιδράσεις (θετικά κατά Gram βακτήρια, αρνητικά κατά Gram βακτήρια και µύκητες) και ανιχνεύεται από ειδικούς ιχνηθέτες H. Η ταυτοποίηση των ειδών και των ορών ελέγχου πραγµατοποιείται αυτόµατα από το λογισµικό. Για λεπτοµερείς πληροφορίες ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast Test MG (P/N: 04 469 046 001). Επιλογή Στόχου Μια αλληλουχία 314 bp στο γονίδιο meca (10) έχει επιλεγεί ως περιοχή στόχου για την ενίσχυση, ανίχνευση και ταυτοποίηση. Το γονιδιακό προϊόν του γονιδίου meca είναι η πρωτεΐνη PBP2a (ή PBP2'), η οποία είναι µια επιπρόσθετη πενικιλλινοδεσµευτική πρωτεΐνη, που εµφανίζεται σε ανθρώπινα και µη ανθρώπινα, ανθεκτικά στη µεθικιλλίνη στελέχη Staphylococcus, δηλ. S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. cohnii ή S. sciuri. Το γονίδιο meca µεσολαβεί στην υψηλού επιπέδου αντίσταση στη µεθικιλλίνη σε δηλούµενα στελέχη meca. Τα γονίδια meca από διαφορετικά είδη Staphylococcus είναι υψηλής διατήρησης. Εποµένως, τα γονίδια meca από διαφορετικά είδη δεν µπορούν να διαχωριστούν το ένα από το άλλο κατά αλληλουχία. Ενίσχυση και Ανίχνευση PCR σε πραγµατικό χρόνο Ενίσχυση Πριν από την ενίσχυση PCR, µειώνεται ο κίνδυνος µόλυνσης του κλώνου (amplicon), µε τη χρήση του ενζύµου AmpErase (ουρακίλη-νγλυκοζυλάση). Το ένζυµο αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυµιδίνη. Τα επεξεργασµένα δείγµατα προστίθενται στο µίγµα ενίσχυσης που περιέχει Taq πολυµεράση από τη µέθοδο hot start στα LightCycler Τριχοειδή (100 µl) MG, στα οποία πραγµατοποιείται η ενίσχυση PCR. Ο στόχος και το Αντιδραστήριο Ελέγχου (RC) ενισχύονται µε ειδικούς εκκινητές. 1

Ανίχνευση προϊόντων PCR σε πραγµατικό χρόνο µε ιχνηθέτες H Η ανίχνευση του κλώνου (amplicon) γίνεται µε φθορισµό χρησιµοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος ιχνηθετών H. Αυτοί οι επισηµασµένοι µε φθορισµό ιχνηθέτες H υβριδοποιούνται σε µια εσωτερική αλληλουχία του ενισχυµένου θραύσµατος κατά τη φάση υβριδισµού του κύκλου ενίσχυσης. Ο εκπεµπόµενος φθορισµός µετράται από το LightCycler 2.0 Όργανο σε ένα από τα τέσσερα διαφορετικά κανάλια ανίχνευσης. Μετά την ολοκλήρωση της ενίσχυσης, διεξάγεται ανάλυση της καµπύλης τήξης. Η θερµοκρασία τήξης T M εξαρτάται από το µήκος, την αλληλουχία και τον βαθµό οµολογίας µεταξύ του ιχνηθέτη και του DNA-στόχου. Αυτόµατη ταυτοποίηση meca και ορών ελέγχου Οι θερµοκρασίες τήξης (T M ) των δειγµάτων και των ορών ελέγχου αναλύονται από ειδικό λογισµικό ταυτοποίησης (SeptiFast Identification Software) και δηµιουργείται µια αναφορά. ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ LightCycler SeptiFast meca Kit MG P/N: 04 488 814 001 2 x 15 Εξετάσεις [1a] RM 1a (Μίγµα Αντίδρασης 1a) 2 x 58 µl 5,5 U/µL Taq Πολυµεράση από µέθοδο FastStart [1b] RM 1b (Μίγµα Αντίδρασης 1b) 2 x 164 µl Ρυθµιστικό διάλυµα Τris-HCI < 1% Brij < 0,1% ιάλυµα µαγνησίου < 0,001% dntp [2] DM (Μίγµα Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες Ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl < 1% Brij [3] RC (Αντιδραστήριο Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA Ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl < 0,001% RNA µεταφοράς [4] IC (Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου) < 0,001% DNA σε Επεξεργασία Ορού Ελέγχου < 0,001% RNA µεταφοράς Ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl [5] DE (Ένζυµο Απολύµανσης) < 0,1% Ένζυµο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl [6] BU (Ρυθµιστικό ιάλυµα) < 0,5% ιάλυµα µαγνησίου [7] DI (Αραιωτικό) Νερό, τύπου PCR 2 x 193 µl 2 x 275 µl 2 x 39 µl 2 x 20 µl 2 x 1000 µl 2 x 1000 µl ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Γενικές Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις Για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. Η παρούσα εξέταση προορίζεται µόνο για χρήση µε ανθρώπινο αίµα που έχει συλλεχτεί σε K-EDTA. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια χωρίς πούδρα µιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγµατα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας µετά το χειρισµό δειγµάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Μη συνδυάζετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ. Η απόρριψη των αχρησιµοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριµµάτων και των δειγµάτων θα πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε τους κρατικούς και τοπικούς κανονισµούς. Μη χρησιµοποιείτε ένα κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης του. ιατίθενται ελτία εδοµένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τον τοπικό αντιπρόσωπο της Roche. Τα δείγµατα πρέπει να αντιµετωπίζονται ως µολυσµατικά και ο χειρισµός τους να γίνεται µε ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκµηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (11) και στο έγγραφο CLSI M29-A (12). Καθαρίζετε καλά και απολυµαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας και τα γάντια µε ένα αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008 ). Βεβαιωθείτε ότι τα γάντια είναι ανθεκτικά στο αντιδραστήριο απολύµανσης DNA. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια µίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφύγετε την επαφή των αντιδραστηρίων αυτών µε το δέρµα, τα µάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αµέσως µε άφθονη ποσότητα νερού. ιαφορετικά µπορεί να προκληθούν εγκαύµατα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε µε νερό πριν τις σκουπίσετε. Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να εκτελείται σε µονόδροµη κατεύθυνση, αρχίζοντας από την Περιοχή Προετοιµασίας Πριν από την Ενίσχυση και προχωρώντας προς την Περιοχή Προετοιµασίας Μετά την Ενίσχυση (Ενίσχυση/Ανίχνευση). Οι ενέργειες πριν από την ενίσχυση περιλαµβάνουν την προετοιµασία αντιδραστηρίου και την προετοιµασία δείγµατος. Τα υλικά και ο εξοπλισµός πρέπει να προορίζονται αποκλειστικά για κάθε ενέργεια που προηγείται της ενίσχυσης και όχι για άλλες ενέργειες, ούτε να µεταφέρονται µεταξύ των περιοχών. Πρέπει να φοράτε γάντια σε κάθε περιοχή και να τα αλλάζετε πριν από την έξοδό σας από τη συγκεκριµένη περιοχή. Ο εξοπλισµός και τα υλικά που χρησιµοποιούνται για την προετοιµασία του αντιδραστηρίου δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται για ενέργειες χειρισµού δειγµάτων και ορών ελέγχου ή για το χειρισµό µε πιπέτα ή την επεξεργασία ενισχυµένου DNA ή άλλων πηγών DNA-στόχου. Τα υλικά και ο εξοπλισµός που χρησιµοποιούνται µετά την ενίσχυση πρέπει να παραµένουν πάντοτε στον ειδικό χώρο που προορίζεται για την επεξεργασία µετά την ενίσχυση. Η παρουσία του ενζύµου AmpErase στο Κύριο Μίγµα Εργασίας µειώνει τον κίνδυνο µόλυνσης του κλώνου (amplicon). Ωστόσο, η µόλυνση από θετικούς ορούς ελέγχου και θετικά δείγµατα µπορεί να αποφευχθεί µόνο µε τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές και µε την προσεκτική τήρηση των διαδικασιών που περιγράφονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας. 2

Ειδικές Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις κατά τη χρήση του LightCycler SeptiFast meca Test MG Το DNA βακτηρίων βρίσκεται στο περιβάλλον. Για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων από ανίχνευση τέτοιου περιβαλλοντικού DNA (µόλυνση DNA), είναι απαραίτητο να καθιερωθεί µια ροή εργασιών χωρίς µολυσµατικό DNA. Συγκεκριµένα, ο χειριστής µπορεί να αποτελεί πηγή µολυσµατικού DNA, καθώς το ανθρώπινο δέρµα και η άνω αναπνευστική οδός κατοικούνται από µικροοργανισµούς, οι οποίοι µπορεί να περιέχουν το γονίδιο στόχο του LightCycler SeptiFast meca Test MG [π.χ. ανθεκτικό στη µεθικιλλίνηstaphylococcus aureus ή ανθεκτικούς στη µεθικιλλίνη, αρνητικούς στην κοαγκουλάσηstaphylococci]. Οι ακόλουθες αρχές αποτελούν συστάσεις για την αποφυγή µόλυνσης του DNA. Αντιδραστήρια και Αναλώσιµα του LightCycler SeptiFast meca Kit MG Τα αντιδραστήρια και τα αναλώσιµα του LightCycler SeptiFast meca Test Kit MG είναι ποιότητας MG. Τα προϊόντα MG είναι σχεδιασµένα για την ανίχνευση υψηλής ευαισθησίας των βακτηρίων και µηκύτων νουκλεϊκού οξέος. Οι διαδικασίες παρασκευής ιδιοσκευασµάτων αναπτύχθηκαν για να εξαλείψουν τη µόλυνση του DNA που µπορεί να αλληλεπιδράσει µε τέτοιες αναλύσεις. Αποφεύγετε το περιττό άνοιγµα και κλείσιµο των φιαλιδίων αντιδραστηρίων. Ένδυση και Γάντια Φοράτε γάντια χωρίς πούδρα κατά τη διάρκεια ολόκληρης της ροής εργασιών. Αποφεύγετε την έκθεση του δέρµατος, φοράτε γάντια πάνω από τα µανίκια της εργαστηριακής ποδιάς. Αλλάξτε γάντια αµέσως, σε περίπτωση που µολυνθούν ή καθαρίστε τα µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008, τα γάντια πρέπει να είναι ανθεκτικά στο αντιδραστήριο). Όταν βάζετε τα γάντια, µην αγγίζετε την παλάµη και τα δάχτυλα τους. Φροντίδα του σταθµού εργασίας PCR Καθαρίζετε τις εξωτερικές επιφάνειες στο σταθµό εργασίας PCR µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA, µετά από κάθε ρύθµιση της PCR. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Βεβαιωθείτε ότι ο εξοπλισµός είναι ανθεκτικός στο αντιδραστήριο απολύµανσης DNA. Καθαρίζετε όλες τις επιφάνειες µέσα στο σταθµό εργασίας PCR σε τακτά χρονικά διαστήµατα (τοίχους, χώρο κάτω από την πλάκα βάσης, πλάκα δαπέδου). Βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχει DNA στο σταθµό εργασίας PCR, εάν χρησιµοποιείται από πολλούς χειριστές. Ενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εργασία. Απενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV κατά τη διάρκεια της εργασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάξτε τη λάµπα UV του σταθµού εργασίας PCR σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χειρισµός Συσκευών και Αναλώσιµων Αφήνετε, εάν είναι δυνατόν, τα ειδικά αναλώσιµα και τις συσκευές που χρησιµοποιούνται για το LightCycler SeptiFast meca Test MG µέσα στο σταθµό εργασίας PCR. Ακτινοβολείτε όλα τα στοιχεία, για τουλάχιστον 30 λεπτά µε ακτινοβολία UV πριν από την εργασία. Χρησιµοποιείτε µόνο αναλώσιµα χωρίς DNA (π.χ. ποιότητας MG, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast Test MG.) Χρησιµοποιήστε τα µόνο µία φορά. Χρησιµοποιείτε το Εργαλείο Πωµατισµού για να κλείσετε τα τριχοειδή (για οδηγίες χειρισµού ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο). Σε περίπτωση θραύσης τριχοειδούς, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο (κεφάλαιο Συντήρηση ). Προφυλάξεις κατά τη διάρκεια διοχέτευσης µε Πιπέτα Ανοίξτε τα φιαλίδια αντιδραστηρίου,τις θήκες ακροφύσιων πιπέτας και τις θήκες τριχοειδών µόνο κατά τη νηµατική ροή. Μην χρησιµοποιείτε τα ίδια ακροφύσια πιπέτας και τριχοειδή εκτός της νηµατικής ροής. Μην αγγίζετε τη στεφάνη ή το σπειροειδές τµήµα ενός ανοιχτού φιαλιδίου. Κατά τη διοχέτευση µε πιπέτα, κρατήστε το φιαλίδιο κάτω από τη στεφάνη. Μην αγγίζετε τη στεφάνη ενός ανοιχτού τριχοειδούς. Τακτοποιήστε όλα τα στοιχεία που χρησιµοποιούνται κατά τη διάρκεια των διαδικασιών µε νηµατική ροή σε λογική σειρά. Εάν πέσουν σταγόνες, τερµατίστε το τρέχον βήµα εργασίας και καθαρίστε αµέσως το χώρο εργασίας µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008 ) ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ Αποθηκεύστε στους -15 έως -25 C. Αποθηκεύστε σε σκοτεινο χώρο. Αποθηκεύστε το Κύριο Μίγµα (για την προετοιµασία του Κύριου Μίγµατος, βλ. ενότητα Προετοιµασία Αντιδραστηρίου) στους 2 έως 8 C για έως και 72 ώρες. Αποθηκεύστε τα ανοιχτά φιαλίδια για έως και 6 µήνες µετά το πρώτο άνοιγµα. Μη χρησιµοποιείτε το προϊόν µετά την ηµεροµηνία λήξης του. Καταψύξτε και αποψύξτε τα ανοιχτά φιαλίδια έως και 4 φορές µετά το πρώτο άνοιγµα. Μη χρησιµοποιείτε το προϊόν µετά την ηµεροµηνία λήξης του. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Εξετάσεις SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Εξετάσεις LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Εξετάσεις SeptiFast Software Set v1.1 P/N: 04 705 220 001 (παρέχεται µία φορά) LightCycler SeptiFast meca Kit MG P/N: 04 488 814 001 2 x 15 Εξετάσεις ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας για το LightCycler SeptiFast Test MG. ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγµατα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται µολυσµατικά και ο χειρισµός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Συλλογή είγµατος Η συλλογή δείγµατος περιγράφεται στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast Test MG. 3

Μεταφορά και Αποθήκευση ειγµάτων Η µεταφορά και αποθήκευση δείγµατος περιγράφεται στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast Test MG. Αποθήκευση Εκλούµατος Το έκλουσµα µπορεί να αποθηκευτεί έως και για 4 ώρες στους 15 έως 25 C, για έως και 8 ηµέρες στους 2 έως 8 C ή για έως και 30 ηµέρες στους -15 έως -25 C. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Πριν την Εκκίνηση Προετοιµασίας Αντιδραστηρίου Αντιστάθµιση Χρώµατος Η χρήση του LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001) είναι προαπαιτούµενη. Για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας για το LightCycler Multicolor Compensation Set. Εγκατάσταση του SeptiFast Identification Software (SIS) και της SeptiFast meca Μακροεντολής Το SeptiFast Identification Software (SIS) και η SeptiFast meca Μακροεντολή (όνοµα αρχείου: SeptiFast meca_1.0_04488814001 ή νεότερες εκδόσεις) πρέπει να εγκατασταθούν πριν από την εκτέλεση της εξέτασης. Για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας για το LightCycler SeptiFast Test MG. Προετοιµασία Ορού Ελέγχου Το υλικό Θετικού Ορού Ελέγχου µπορεί να αγοραστεί και από άλλες εταιρίες. Για το LightCycler SeptiFast meca Test MG και το LightCycler SeptiFast Test MG µπορεί να χρησιµοποιηθεί, ως Υλικό Θετικού Ορού Ελέγχου, το υλικό ATCC 33592, ένα ανθεκτικό στη µεθικιλλίνη S. aureus Η προετοιµασία περιγράφεται στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast Test MG. Ο Θετικός Ορός Ελέγχου πρέπει να υφίσταται επεξεργασία καθ όλη τη ροή των εργασιών, όπως γίνεται µε κάθε δείγµα. Προετοιµασία Αντιδραστηρίου µε LightCycler SeptiFast meca Kit MG 1. Καθαρίστε και απολυµάνετε καλά τη θήκη νηµατικής ροής και το σταθµό εργασίας PCR (π.χ. µε LTK-008 ). 2. Ενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV και τη ροή του αέρα της θήκης νηµατικής ροής, καθώς και την ακτινοβολία UV του σταθµού εργασίας PCR για τουλάχιστον 30 λεπτά. 3. Απενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV κατά τη διάρκεια της εργασίας. 4. Αποψύξτε τα συστατικά του LightCycler SeptiFast meca Kit MG, προστατεύοντάς τα από το φως, σε θερµοκρασία δωµατίου για περίπου 20 λεπτά. Στροβιλίστε για σύντοµο χρονικό διάστηµα και περιστρέψτε γρήγορα. 5. Ανάλογα µε το συνολικό αριθµό δειγµάτων που πρέπει να αναλυθούν, συν δύο επιπλέον αντιδράσεις για τον Αρνητικό Ορό Ελέγχου και το Αντιδραστήριο Ελέγχου, τοποθετήστε τα LightCycler Τριχοειδή σε προσαρµογείς φυγόκεντρου που έχουν προψυχθεί. 6. Προετοιµάστε το Κύριο Μίγµα πολλαπλασιάζοντας την ποσότητα στη στήλη Όγκος µε τον αριθµό των αντιδράσεων που θα αναλυθούν (εκλούµατα δείγµατος, έκλουµα Αρνητικού Ορού Ελέγχου και έκλουµα Αντιδραστηρίου Ελέγχου), συν µία πρόσθετη αντίδραση για να καταστεί δυνατή η διοχέτευση επαρκούς όγκου µε πιπέτα. Ακολουθήστε τη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω για µία τυπική αντίδραση 100 µl. Βήµα Ενέργεια 1 Προετοιµασία του Κύριου Μίγµατος: Σε ένα σωληνάριο αντίδρασης 1,5 ml στους 2 έως 8 C, προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά µε τη σειρά που αναφέρονται παρακάτω: Στοιχείο Όγκος (µl) DI 13,5 BU 12 DM 10 IC 2 RM 1b 8,5 DE 1 RM 1a 3 Συνολικός όγκος 50 2 Ανακατέψτε προσεκτικά χρησιµοποιώντας την πιπέτα. Μην στροβιλίζετε! ιοχετεύστε µε πιπέτα 50 µl Κύριου Μίγµατος σε κάθε LightCycler Τριχοειδές που έχει προψυχθεί. 3 Προσθέστε 50 µl κάθε εκλούµατος δείγµατος σε ξεχωριστό τριχοειδές και κλείστε το τριχοειδές µε το εργαλείο πωµατισµού. Προσθέστε 50 µl εκλούµατος Αρνητικού Ορού Ελέγχου (NC) σε ένα τριχοειδές. Ο NC δεν αποτελεί µέρος του LightCycler SeptiFast meca Kit MG και προετοιµάζεται µε επεξεργασία του NC από το LightCycler SeptiFast Test MG. Τα δείγµατα από κάθε προετοιµασία δείγµατος και η παρτίδα PCR πρέπει να αναλύονται µαζί µε τον NC που προετοιµάζεται στην ίδια παρτίδα. Μη συνδυάζετε στην ίδια ανάλυση δείγµατα που έχουν προετοιµαστεί σε διαφορετικές παρτίδες. Κλείστε το τριχοειδές µε το εργαλείο πωµατισµού. Προσθέστε 50 µl Αντιδραστηρίου Ελέγχου (RC) σε ένα τριχοειδές. Κλείστε το τριχοειδές µε το εργαλείο πωµατισµού. 4 Μεταφέρετε όλα τα τριχοειδή σύµφωνα µε τη λίστα φόρτωσης δειγµάτων της SeptiFast meca Μακροεντολής (RC, NC, δείγµα 1, δείγµα 2...) στον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο ειγµάτων. 5 Φυγοκεντρίστε τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο ειγµάτων µε τη Φυγόκεντρο Περιστρεφόµενου ίσκου LC 2.0 (ελέγξτε τη στάθµη του υγρού στα τριχοειδή). 6 Τοποθετήστε τον LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο ειγµάτων στο LightCycler 2.0 Όργανο. Φόρτωση και Λειτουργία του LightCycler 2.0 Οργάνου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Συνιστάται το LightCycler 2.0 Όργανο, να λειτουργεί σε χωριστό δωµάτιο από αυτό για τον καθαρισµό του DNA και την προετοιµασία διαλυµάτων εργασίας. 1. Εκκινήστε τη SeptiFast meca Μακροεντολή (όνοµα αρχείου: SeptiFast meca_1.0_04488814001, ή νεότερες εκδόσεις). Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο, κεφάλαιο Εκτέλεση µιας Roche Macro. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην χρησιµοποιείτε το πεδίο <assay lot number>. Εάν θέλετε να προσθέσετε τον αριθµό παρτίδας ανάλυσης στην εξέταση, εισάγετε τις πληροφορίες στο αντίστοιχο πεδίο στον επεξεργαστή δείγµατος. 4

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν αποσυνδεθεί ο χειριστής, µην συνεχίσετε την ανάλυση. Ξεκινήστε νέα ανάλυση µε νέο όνοµα. 2. Αποθηκεύστε την ανάλυση µε ένα όνοµα που θα εξασφαλίζει ακριβή ταυτοποίηση (π.χ. όνοµα χειριστή και ηµεροµηνία). 3. Μειώστε τα δείγµατα από τη λίστα φόρτωσης προεπιλογής, εάν απαιτούνται λιγότερα από 5 δείγµατα. Εάν κατά λάθος διαγραφούν πάρα πολλά τριχοειδή, µην τα προσθέσετε, αλλά ξεκινήστε τη διαδικασία από την αρχή. 4. Εισάγετε τα ειδικά δεδοµένα του ασθενή σε <αγκύλες> (π.χ. meca <Όνοµα-01>) 5. Μόλις προστεθούν όλες οι ειδικές για τα δείγµατα πληροφορίες, συνεχίστε κατά τον οδηγό κιτ και ξεκινήστε την ανάλυση µε το LightCycler 2.0 Όργανο. 6. Μετά τη ολοκλήρωση της ανάλυσης, ελέγξτε τη στάθµη του υγρού στα τριχοειδή (τα αποτελέσµατα δεν είναι έγκυρα για το τριχοειδές, εάν η στάθµη του είναι µεταβλητή). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην αλλάζετε τα προθέµατα των ονοµάτων των δειγµάτων. Μη διαγράφετε τις αγκύλες. Κάθε δείγµα πρέπει να περιέχει το ειδικό για την ανάλυση πρόθεµα (meca) για να εξασφαλιστεί η ταυτοποίηση από το SIS. Μην αλλάζετε το όνοµα του Αντιδραστηρίου Ελέγχου και του Αρνητικού Ορού Ελέγχου. Ανίχνευση Κορυφής και Αυτόµατη Ταυτοποίηση Κορυφής Γενική Επεξήγηση των Μονάδων Ανάλυσης Η χειροκίνητη Εµφάνιση της τιµής T M απαιτεί χειροκίνητο χειρισµό σε δύο αυτόµατες µονάδες Εµφάνισης της τιµής T M. Η µονάδα Απόλυτης Ποσοτικοποίησης, η οποία είναι επίσης αυτόµατη, δεν απαιτεί χειροκίνητους χειρισµούς. Η γραµµή της τιµής T M κάθε τρόπου ανάλυσης είναι προκαθορισµένη στη SeptiFast meca Μακροεντολή. Στο παράθυρο της κορυφής τήξης, εµφανίζονται όλες οι καµπύλες των επιλεγµένων γραφηµάτων. Υπάρχει η δυνατότητα να επιλέξετε ή να αποεπιλέξετε τις γραµµές της τιµής T M. Η τιµή αναφοράς κάθε τρόπου ανάλυσης είναι προκαθορισµένη στη SeptiFast meca Μακροεντολή. Μην αλλάξετε ή αποεπιλέξετε τις τιµές αναφοράς. Εάν αλλάξουν κατά λάθος, πληκτρολογήστε τις σωστές τιµές από τον Πίνακα 2: Τιµές αναφοράς. Εάν ενεργοποιηθούν περισσότερα από ένα τριχοειδή, οι ρυθµίσεις του πρώτου τριχοειδούς εµφανίζονται στο πλαίσιο ελέγχου. Η µετατόπιση των γραµµών επηρεάζει όλα τα ενεργοποιηµένα τριχοειδή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην αλλάξετε τις ρυθµίσεις <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> και <Peak Width>. Οι κορυφές ορίζονται ως οι µέγιστες τιµές πάνω από την τιµή αναφοράς. Οι πλευρές δεν θεωρούνται κορυφές. Οι ολισθητήρες πρέπει να επιλεγούν εντός του ισχύοντος εύρους T M (βλ. Πίνακα 1). Πίνακας 1: Εύρη τιµών T M για έγκυρες κορυφές CH 640 CH 705 Χαµηλή T M ( C) Υψηλή T M ( C) Χαµηλή T M ( C) Υψηλή T M ( C) meca 62,00 69,00 51,50 58,50 Οι τιµές αναφοράς είναι προκαθορισµένες σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα και δεν πρέπει να αλλάξουν. (Εάν αλλάξουν κατά λάθος, πληκτρολογήστε ξανά τις τιµές σύµφωνα µε τη λίστα, διαφορετικά η ανάλυση θα επισηµανθεί). Πίνακας 2: Τιµές αναφοράς CH 640 CH 705 meca 0,021 0,022 Προσαρµογή των γραµµών της τιµής T M 1. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης, ο οδηγός πειράµατος εµφανίζει το παράθυρο <Analyses have been created>. 2. Μετακινήσετε το παράθυρο στο κάτω µέρος (µην πατήσετε το <Finish>). 3. Βεβαιωθείτε ότι οι τιµές T M και η τιµή αναφοράς είναι ορατές. 4. Κάντε κλικ στη µονάδα ανάλυσης (π.χ. Εµφάνιση τιµής T M meca 640). 5. Ενεργοποιήστε όλες τις θέσεις της ανάλυσης για να έχετε µια επισκόπηση. 6. Κάντε κλικ µόνο στη θέση meca #RC#. 7. Ρυθµίστε τη γραµµή της τιµής T M στη µέγιστη κορυφή πάνω από την τιµή αναφοράς και εστιάστε µόνο στο εύρος έγκυρων τιµών T M. Εάν δεν υπάρχει κορυφή πάνω από την τιµή αναφοράς, η γραµµή της τιµής T M πρέπει να διαγραφεί (απενεργοποιήστε το αντίστοιχο πλαίσιο). Στο τέλος της Εµφάνισης της τιµής T M για ένα ειδικό τριχοειδές, πρέπει να υπάρχουν µόνο µέγιστες κορυφές µε γραµµές τιµής T M 8. Ενεργοποιήστε την επόµενη θέση (π.χ. meca #NC#) µαζί µε το meca #RC# για να κάνετε επισκόπηση. (Η αυτόµατη προσαρµογή κλίµακας θα προσαρµοστεί στην υψηλότερη κορυφή). 9. Ενεργοποιήστε µόνο την επιλεγµένη θέση (π.χ. meca #NC#). (Η αυτόµατη προσαρµογή κλίµακας θα προσαρµοστεί στις κορυφές υποβάθρου του NC. Η τιµή αναφοράς µπορεί να µην είναι πλέον ορατή.) 10. Προχωρήστε µε την ανίχνευση κορυφής των δειγµάτων, όπως περιγράφεται στα βήµατα 5-7. 11. Μετά το τέλος της ανάλυσης του πρώτου καναλιού ανίχνευσης (Εµφάνιση T M meca 640), προχωρήστε µε την Εµφάνιση T M meca 705, όπως περιγράφεται στα βήµατα 4-10. Ολοκλήρωση Εµφάνισης της τιµής T M 1. Μετατοπίστε τον οδηγό πειράµατος στο κέντρο της οθόνης και πατήστε <Finish>. 2. Η LightCycler Αναφορά δηµιουργείται αυτόµατα και πρέπει να τυπωθεί. 3. Η ανάλυση αποθηκεύεται αυτόµατα. 4. Εξαγάγετε το αρχείο *.ixo στο <C:\Export to SIS>. 5. Ελέγξτε την αναφορά για ενδείξεις και για το αν εµφανίζεται το µήνυµα <run state: complete>. 6. Εάν προκύψουν ενδείξεις ή αν εµφανιστούν άλλα µηνύµατα για την κατάσταση ανάλυσης, η ανάλυση δεν είναι έγκυρη και πρέπει να επανεξεταστούν όλα τα δείγµατα. Αυτόµατη Ταυτοποίηση Κορυφής µε SeptiFast Identification Software (SIS) 1. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο SIS στην επιφάνεια εργασίας και πατήστε <Start>. 2. Επιλέξτε την ανάλυση από το φάκελο <C:\Export to SIS> και φορτώστε το αρχείο *.ixo. 3. Επιλέξτε Yes ή No για να αποφασίσετε αν η LightCycler Αναφορά περιέχει την ένδειξη <User Developed or Modified Test Method>. 4. Το αρχείο *.ixo θα αναλυθεί αυτόµατα και τα δεδοµένα θα εµφανιστούν σε µια αναφορά. 5. Εκτυπώστε την Αναφορά SIS. 5

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ερµηνεία των Αποτελεσµάτων Οι ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ και τα ΣΧΟΛΙΑ µπορεί να δηµιουργηθούν από το SeptiFast Identification Software (SIS) ως RUN FLAGS, ASSAY FLAGS και FLAGS στο πλαίσιο SPECIMEN (βλ. παρακάτω). Ο χειριστής πρέπει να ελέγξει την εκτύπωση(εις) της ανάλυσης για επισηµάνσεις ή σχόλια στις στήλες FLAGS ή COMMENTS στο πλαίσιο SPECIMEN. Σχήµα 1: Πλαίσιο Specimen Specimen Assay Data Result Flags Comment SeptiFast meca sample 1 meca <CH..., TM..., PH..., CP...> <meca> SeptiFast meca sample 2 meca Επιπλέον πληροφορίες µπορούν να ληφθούν στα πεδία COMMENT των RUN FLAGS και των ASSAY FLAGS. Όλες οι ενδείξεις εµφανίζονται στον Πίνακα 3. Αποτελέσµατα είγµατος Το όνοµα <meca> στο πεδίο RESULT υποδεικνύει ότι το δείγµα βρέθηκε θετικό για meca. Σηµείωση: Ελέγξτε στο πεδίο σχολίων του LightCycler SeptiFast Test MG εάν εµφανίζεται η ένδειξη <for meca resistance testing: Peak for CoNS from SML detected> 1. Ανατρέξτε στην ενότητα Περιορισµοί της ιαδικασίας για περισσότερες πληροφορίες. Τα πρωτογενή δεδοµένα των σχετικών κορυφών εµφανίζονται στο πεδίο DATA και συµπεριλαµβάνουν το κανάλι (CH), το σηµείο τήξης (T M ), το ύψος κορυφής (PH) και το σηµείο επιχιασµού (CP 2 ). Το σύµβολο στο πεδίο RESULT σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αναλύτης µέσα στα καθορισµένα κριτήρια για το meca. 1 Το SML είναι η Κύρια Λίστα του SeptiFast, για λεπτοµέρειες ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast Test MG 2 Το CP εµφανίζεται για το Κανάλι 640 Επαλήθευση Ανάλυσης Η επαλήθευση ανάλυσης διεξάγεται από το SeptiFast Identification Software. Τα µη έγκυρα αποτελέσµατα εµφανίζονται αυτόµατα και επισηµαίνονται µε. Τα σχόλια των ενδείξεων και οι σχετικές ερµηνείες εµφανίζονται σε λίστα παρακάτω. Πίνακας 3: Ενδείξεις για επαλήθευση της ανάλυσης Comments 3 Ερµηνεία ASSAY FLAG NC: IC not detected Στον NC, δεν ανιχνεύτηκαν meca και IC. ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP >,< meca > Στον NC, ανιχνεύτηκε meca. ASSAY FLAG RC: No amplicon: <meca> Το RC απέτυχε. SPECIMEN FLAG IC not detected εν ανιχνεύτηκαν meca και IC στο δείγµα. 3 Τα σφάλµατα του συστήµατος παρατίθενται στην ενότητα Αντιµετώπιση Προβληµάτων ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Σε κάθε ανάλυση εξέτασης πρέπει να συµπεριλαµβάνεται ένα αντίγραφο από κάθε NC και RC. Ο NC και το RC πρέπει να τοποθετηθούν σε καθορισµένες θέσεις, όπως περιγράφεται στην ενότητα Προετοιµασία Αντιδραστηρίου. Συνιστάται να αναλύεται ένα υλικό θετικού ορού ελέγχου εσωτερικής παρασκευής, ως Θετικός Ορός Ελέγχου, σε ολόκληρη τη ροή εργασιών, όπως περιγράφεται στην ενότητα Προετοιµασία Ορού Ελέγχου. Το SIS προσδιορίζει το αποτέλεσµα των IC, NC και RC. Εάν οι οροί ελέγχου δεν πληρούν τις καθορισµένες προδιαγραφές, όλα τα αποτελέσµατα δειγµάτων φέρουν µια ένδειξη. Ελέγξτε το πλαίσιο SPECIMEN της εκτύπωσης της ανάλυσης για ενδείξεις και σχόλια, για να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Αρνητικός Ορός Ελέγχου (NC) Ο NC πρέπει να είναι αρνητικός, ενώ το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου πρέπει να είναι θετικό. Αν ο NC δεν πληροί αυτά τα κριτήρια, όλα τα αποτελέσµατα δειγµάτων φέρουν µια ένδειξη. Ολόκληρη η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. Αντιδραστήριο Ελέγχου (RC) Το RC πρέπει να είναι θετικό για τον κλώνο (amplicon) meca. Αν το RC δεν πληροί αυτό το κριτήριο, όλα τα αποτελέσµατα δειγµάτων φέρουν µια ένδειξη. Ολόκληρη η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. Θετικός Ορός Ελέγχου (PC) Ο Θετικός Ορός Ελέγχου πρέπει να είναι θετικός. Αν ο PC δεν πληροί αυτό το κριτήριο, η ανάλυση δεν είναι έγκυρη. εν εµφανίζεται καµία ένδειξη από το SIS. Ολόκληρη η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου (IC) Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου πρέπει να ανιχνευτεί θετικό σε όλα τα αρνητικά δείγµατα, καθώς και στον Αρνητικό Ορό Ελέγχου. Αν το IC δεν πληροί αυτό το κριτήριο, το αποτέλεσµα δείγµατος φέρει µια ένδειξη. Σε περίπτωση µη έγκυρων ορών ελέγχου, επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία (προετοιµασία δείγµατος και ορού ελέγχου, ενίσχυση και ανίχνευση και των 3 αναλύσεων µε το LightCycler SeptiFast Test MG και στη συνέχεια µια εξέταση ανθεκτικότητας µε το LightCycler SeptiFast meca Test MG). Σε περίπτωση που οι οροί ελέγχου είναι διαρκώς µη έγκυροι, επικοινωνήστε µε τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. 6

ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ Πίνακας 4: Σφάλµατα του συστήµατος που εµφανίζονται στο πεδίο COMMENTS των RUN FLAGS και στην εκτύπωση του SIS Μήνυµα Συστήµατος (εµφανίζεται στα τµήµατα ενδείξεων της εκτύπωσης του SIS) Πιθανή Αιτία ιορθωτική Ενέργεια User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Η ανάλυση δεν είναι έγκυρη, οι πιθανές αιτίες περιγράφονται στο εγχειρίδιο χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου. Οι προεπιλεγµένες ρυθµίσεις της Μακροεντολής (π.χ. τιµές αναφοράς, πρωτόκολλο ανάλυσης, κλπ) µπορεί να έχουν αλλάξει. ύο ή περισσότερα διαφορετικά αρχεία Αντιστάθµισης Χρώµατος είναι ενεργά σε µία ή περισσότερες µονάδες ανάλυσης Το αντικείµενο Αντιστάθµισης Χρώµατος είναι µεγαλύτερο των έξι µηνών Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε τις τιµές αναφοράς σύµφωνα µε τον Πίνακα 2. Αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Επιλέξτε τη σωστή Αντιστάθµιση Χρώµατος και υπολογίστε ξανά. ηµιουργήστε νέο αντικείµενο Αντιστάθµισης Χρώµατος. Invalid Macro Εφαρµόστηκε λάθος Μακροεντολή Ελέγξτε για τη σωστή Μακροεντολή στο LightCycler Λογισµικό και/ή στο SeptiFast Software Set. Invalid Baseline Invalid Control Tube Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling Οι τιµές αναφοράς µπορεί να έχουν αλλάξει κατά λάθος Ένας ή περισσότεροι οροί ελέγχου έχουν ονοµαστεί εσφαλµένα Ένα ή περισσότερα τριχοειδή δειγµάτων έχουν ονοµαστεί εσφαλµένα ή λείπουν τριχοειδή δειγµάτων Εφαρµόστηκε λάθος έκδοση LightCycler Λογισµικού για τη διαδικασία εν έχει εκτελεστεί καµία χειροκίνητη Εµφάνιση τιµής T M (σε κανένα δείγµα και σε καµία µονάδα ανάλυσης). Η Μακροεντολή έχει τελειώσει χωρίς ανάλυση + additional run flags Έχουν ανιχνευτεί περισσότερες από 5 ενδείξεις ανάλυσης Invalid CCC File Name ύο ή περισσότερα διαφορετικά αρχεία Αντιστάθµισης Χρώµατος είναι ενεργά σε µία ή περισσότερες µονάδες ανάλυσης Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε τις τιµές αναφοράς σύµφωνα µε τον Πίνακα 2. Αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε την πληκτρολόγηση των ονοµάτων των ορών ελέγχου στον επεξεργαστή δείγµατος. Αλλάξτε σε προκαθορισµένα ονόµατα, αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε την πληκτρολόγηση των ονοµάτων των δειγµάτων στον επεξεργαστή δείγµατος. Αλλάξτε σε προκαθορισµένα ονόµατα, αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Ανοίξτε το LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε για το σωστό αριθµό έκδοσης. Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και εκτελέστε χειροκίνητη Εµφάνιση τιµής T M. Αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Προσπαθήστε να απαλείψετε τις συγκεκριµένες ενδείξεις που περιγράφονται, επαναλάβετε την ανάλυση µε το SIS. Επιλέξτε το σωστό αρχείο Αντιστάθµισης Χρώµατος και υπολογίστε ξανά. Εάν λείπουν ένα ή περισσότερα δείγµατα από την αναφορά του SIS, ελέγξτε αν ένα ή περισσότερα τριχοειδή δειγµάτων έχουν ονοµατιστεί εσφαλµένα ή εάν λείπουν τριχοειδή. Για να το διορθώσετε, ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε την πληκτρολόγηση των ονοµάτων των δειγµάτων στον επεξεργαστή δείγµατος. Αλλάξτε σε προκαθορισµένα ονόµατα, αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Εάν ανιχνευτεί S. aureus µε το LightCycler SeptiFast Test MG και το πεδίο σχολίων στο πλαίσιο specimen είναι <for meca resistance testing: Peak for CoNS from SML detected>, τότε έχει ανιχνευτεί ένα µίγµα S. aureus και CoNS. Η ανίχνευση του meca µπορεί να οφείλεται σε ένα στέλεχος CoNS που φέρει meca και όχι MRSA. Αν και τα CoNS που φέρουν meca δεν ανιχνεύονται από το LightCycler SeptiFast Test MG, η ανίχνευση του meca µπορεί να οφείλεται στην παρουσία CoNS κάτω από το όριο ανίχνευσης και όχι λόγω του MRSA. Κάτω από το καθορισµένο όριο ανίχνευσης (ανατρέξτε στην ενότητα Αναλυτική Ευαισθησία), µπορεί να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα, επειδή η ανίχνευση του DNA του S. aureus από το LightCycler SeptiFast Test MG µπορεί να είναι περισσότερο ευαίσθητη από την ανίχνευση του DNA meca από το LightCycler SeptiFast meca Kit MG. Το LightCycler SeptiFast meca Kit MG ανιχνεύει το γονίδιο meca και δεν επιτρέπει οριστική φαινοτυπική ταυτοποίηση. Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί για χρήση µόνο µε ανθρώπινο αίµα που έχει συλλεχτεί σε αντιπηκτικό K-EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δείγµατος µπορεί να οδηγήσει σε εσφαλµένα, ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά, αποτελέσµατα. Η χρήση του παρόντος προϊόντος πρέπει να περιορίζεται µόνο σε προσωπικό εκπαιδευµένο ειδικά στη ροή εργασιών του LightCycler SeptiFast meca Kit MG. Η απόδοση του LightCycler SeptiFast meca Kit MG έχει καθοριστεί για αίµα που περιέχει 1.000-30.000 WBC/µL. 7

ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΗ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Αναλυτική Ευαισθησία Η ελάχιστη ευαισθησία είναι 30 CFU/mL αίµατος µε αντιπηκτικό K-EDTA. Η µελέτη που περιγράφεται παρακάτω καταδεικνύει ότι το όριο ανίχνευσης του MRSA έχει καθοριστεί για τον S. aureus µε το LightCycler SeptiFast Test MG και για το meca µε το LightCycler SeptiFast meca Kit MG. ιαδοχικές αραιώσεις µιας γνωστής συγκέντρωσης MRSA (ATCC 33592) προστέθηκαν εξωγενώς σε ολικό αίµα υγιών δοτών και υπέστησαν επεξεργασία, όπως περιγράφεται στα ένθετα συσκευασίας των αντίστοιχων εξετάσεων. Κάθε επίπεδο αναλύθηκε σε οχτώ αντίγραφα µε τη χρήση δύο παρτίδων. Ο Πίνακας 5 δείχνει τα συνδυασµένα δεδοµένα και των δύο παρτίδων. Το όριο ανίχνευσης για το S. aureus είναι 7,7 CFU/mL (95%) CI=[4,9-19,0] και για το meca 24,2 CFU/mL (95%) CI=[15,9-48,9]. Πίνακας 5: Όριο ανίχνευσης Συγκέντρωση του MRSA [CFU/mL] Αρ. meca θετικών Αρ. S. aureus θετικών 100 16/16 16/16 50 16/16 16/16 25 14/16 16/16 12,5 14/16 16/16 6,25 10/16 14/16 3,13 5/16 13/16 1,56 1/16 7/16 0,78 0/16 4/16 0 0/16 0/16 Αναλυτική Ειδικότητα Συµπερίληψη Η συµπερίληψη εξετάστηκε µε γενοµικό DNA από 167 στελέχη MRSA. Τα εξεταζόµενα στελέχη περιελάµβαναν ένα στέλεχος αναφοράς (ATCC 33592) και 166 κλινικά αποµονωµένα στελέχη που συλλέχτηκαν απο την Ευρώπη και τις ΗΠΑ. Τα αποµονωµένα στελέχη περιείχαν SCCmec τύπου I V, όπως χαρακτηρίζονται από την Ηλεκτροφόρηση Παλλόµενου Πεδίου (PFGE). Η SCCmec είναι η Staphylococcal Chromosomal Cassette, ένα κινητό γενετικό στοιχείο, το οποίο περιέχει το γονίδιο meca. Αναλύθηκαν 588 επιπλέον κλινικά αποµονωµένα στελέχη MRSA, χωρίς περαιτέρω µοριακό χαρακτηρισµό. Σε 580 αποµονωµένα στελέχη ανιχνεύτηκε meca, τα υπόλοιπα 8 αποµονωµένα στελέχη ταξινοµήθηκαν ως στελέχη S. aureus Οριακά Ανθεκτικά στην Οξακιλλίνη (BORSA) ή Τροποποιηµένα στελέχη S. aureus (MODSA) 4, που εµφανίζουν MIC κάτω των 8 µg οξακιλλίνης ανά ml. Αποκλειστικότητα Εξετάστηκε το γενοµικό DNA των πιο κοινών παθογόνων του ακόλουθου πίνακα, τα οποία προκαλούν βακτηριαιµία (13), τα στελέχη που είναι στενά συνδεδεµένα µε αυτά, καθώς και τα στελέχη που είναι φυλογενετικά στενά συνδεδεµένα µε τον S. aureus. Όλα τα είδη που εξετάστηκαν βρέθηκαν meca αρνητικά. Actinobacillus actinomycetemcomitans Cryptococcus neoformans Pantoea agglomerans Acinetobacter baumannii Enterobacter aerogenes Peptostreptococcus magnus Aeromonas hydrophila Enterobacter cloacae Porphyromonas gingivalis Aspergillus fumigatus Enterobacter taylore Prevotella denticola Bacillus cereus Enterococcus faecalis Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis Enterococcus faecium Proteus mirabilis Bartonella henselae Escherichia coli Proteus vulgaris Bordetella pertussis Gemella haemolysans Pseudomonas aeruginosa Borrelia burgdorferi Histoplasma capsulatum Salmonella enterica Burkholderia cepacia Klebsiella oxytoca Serratia marcescens Campylobacter jejuni Klebsiella pneumoniae Shigella sonnei Candida albicans Legionella pneumophila Staphylococcus aureus Candida glabrata Listeria monocytogenes Staphylococcus epidermidis Candida krusei Moraxella (Branhamella) catarrhalis Staphylococcus haemolyticus Candida parapsilosis Morganella morganii Stenotrophomonas maltophilia Candida tropicalis Mycobacterium fortuitum Streptococcus agalactiae Cardiobacterium hominis Mycobacterium tuberculosis Streptococcus mitis Citrobacter freundii Mycobacterium xenopi Streptococcus pneumoniae Clostridium perfringens Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pyogenes Corynebacterium jeikeium Neisseria meningitidis Yersinia enterocolitica 4 Ο χαρακτηρισµός BORSA αναφέρεται στην ανθεκτικότητα χαµηλού επιπέδου, που βασίζεται σε αυξηµένη παραγωγή β-λακταµάσης, ενώ ο MODSA έχει τροποποιήσει τις δοµές PBP µε χαµηλότερη δεσµευτική συγγένεια ή υπερπαραγωγή PBPs (σπάνιο). Και οι δύο οµάδες δεν φέρουν το γονίδιο meca. 8

Παρεµβαλλόµενες Ουσίες Οι ακόλουθες ουσίες δεν αλληλεπιδρούν στην ανίχνευση του DNA meca µε την παρούσα εξέταση. Πίνακας 6: Παρεµβαλλόµενες Ουσίες Αρ. Εµπορική Ονοµασία Ενεργό Συστατικό Κατασκευαστής 1x C max. 3x C max. µονάδες 1 Piperacillin Πιπερακιλλίνη Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Κεφταζιντίµη GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Ιµιπενέµη/Σιλαστατίνη MSD Sharp & Dohme 0,27 0,67 mg/ml 4 Tazobac Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Σιπροφλοξασίνη Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Βανκοµυκίνη Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Γενταµυκίνη Merck 80 240 µg/ml 8 Zyvoxid Λινεζολίδη Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Κλινδαµυκίνη Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Μετρονιδαζόλη Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Φλουκοναζόλη Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Κασποφουγγίνη MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Αµφοτερικίνη Β Bristol-Myers Squibb 20 60 µg/ml 14 Novalgin Μεταµιζόλη Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal εξαµεθαζόνη Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Κυταραβίνη cell pharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Νορεπινεφρίνη (Νοραδρεναλίνη) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Νιτρoγλυκερίνη Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium-5000- Ηπαρίνη ratiopharm 0,83 2,5 I.U./mL ratiopharm ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ ΠΡΟΣ ΤΟΝ ΑΓΟΡΑΣΤΗ Η αγορά του παρόντος προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για ενίχυση και ανίχνευση αλληλουχιών νουκλεϊκού οξέος για ανθρώπινη in Vitro διαγνωστική. Με το παρόν δεν παρέχεται καµία ευρεσιτεχνία γενικού τύπου ή άλλη άδεια οποιουδήποτε είδους εκτός από το παρόν συγκεκριµένο δικαίωµα χρήσης από αγορά. 9

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Pfaller, M.A., et al. Survey of blood stream infections attributable to gram-positive cocci: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in 1997 in the United States, Canada, and Latin America from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. SENTRY Participants Group. Diagn Microbiol Infect Dis 1999; 33:283-97. 2. Diekema, D.J., et al. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999, Clin Infect Dis 32 (2001) (suppl 2), S114-S132. 3. Zetola, N., et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an emerging threat. The Lancet Infectious Diseases, Volume 5, Issue 5, 275-286. 4. Cosgrove, S.E., et al. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a meta-analysis. Clin Infect Dis. 2003 Jan 1;36(1):53-9. Epub 2002 Dec 13. 5. Whitby, M., et al. Risk of death from methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia: a meta-analysis. Med J Aust. 2001 Sep 3; 175(5):264-7. 6. Kolleff, M.H., et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest (1999); 115: 462-74. 7. Harbarth, S., et al. Inappropriate Initial Antimicrobial Therapy and Its Effect on Survival in a Clinical Trial of Immunomodulating Therapy for Severe Sepsis, Am J Med. (2003); 115: 529-35. 8. Lodise, T.P., et al. Outcomes Analysis of delayed antibiotic treatment for hospital-acquired Staphylococcus aureus bacteremia. Clin Infect Dis (2003); 36: 14-23. 9. Paterson, D.L., et al. Empirical antibiotic choice for the seriously ill patient: are minimization of selection of resistant organisms and maximization of individual outcome mutually exclusive? Clin Infect Dis. (2003);36(8):1006-12. 10. Ryffel, C., et al. Sequence comparison of meca genes isolated from methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Gene. 1990 Sep 28;94(1):137-8. 11. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 12. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997. 13. Cockerill FR 3rd, et al, Analysis of 281,797 consecutive blood cultures performed over an eight-year period: trends in microorganisms isolated and the value of anaerobic culture of blood, Clin Infect Dis. 1997; 24 (3): 403-18. 10

11

" Distributed by Κατασκευάζεται στη Γερµανία για τη: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247) Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F-38240 Meylan Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora C Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερµανία, +49 621 7590 Οι ονοµασίες ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, FASTSTART, SEPTIFAST, HYBPROBE και AMPERASE είναι σήµατα κατατεθέντα της Roche. Η ονοµασία ROCHE RESPONSE CENTER είναι σήµα υπηρεσίας της Roche. Η ονοµασία Amphotericin B είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της εταιρίας Bristol-Myers Squibb. Η ονοµασία Aquo-Trinitrosan είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της εταιρίας Merck & Co., Inc. Η ονοµασία ARA-cell είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της cell pharma GmbH. Η ονοµασία Arterenol είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Aventis Pharma Ltd. Η ονοµασία Cancidas είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της MSD Sharp & Dohme GmbH. Η ονοµασία Ciprobay είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Bayer AG. Η ονοµασία Dexahexal είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Hexal AG. Η ονοµασία Diflucan είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Pfizer Inc. Η ονοµασία Fortum είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της GlaxoSmithKline. Η ονοµασία Heparin-Natrium-5000-ratiopharm είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της ratiopharm International. Η ονοµασία InfectoClont είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Infectopharm GmbH. Η ονοµασία LTK-008 είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της biodelta, ZTB GmbH. Η ονοµασία Novalgin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Aventis Pharma Ltd. Η ονοµασία Piperacillin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Hexal AG. Η ονοµασία Refobacin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της εταιρίας Merck & Co., Inc. Η ονοµασία Sobelin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Pfizer Inc. Η ονοµασία Tazobac είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Wyeth Pharmaceuticals AG. Η ονοµασία Vancomycin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Lilly Pharma Holding GmbH. Η ονοµασία Zienam είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της MSD Sharp & Dohme GmbH. Η ονοµασία Zyvoxid είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Pfizer Inc. 2007, by Roche Molecular Systems, Inc. Με επιφύλαξη κάθε δικαιώµατος. 2/2007 (04623932001-02ENGL) 04802942001-02 12