ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ. Eφη. Πετεινάκη

Transcript

1 ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Eφη Πετεινάκη

2 ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΡΟΥΤΙΝΑΣ ΕΝΟΣ ΚΛΙΝΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ταυτοποίηση κάποιων βακτηρίων ο έλεγχος ευαισθησίας διάγνωση λοιμώξεων από μικροοργανισμούς που δεν καλλιεργούνται τυποποίηση λοιμώξεων βακτηρίων-έλεγχος ενδονοσοκομειακών

3 Η εισαγωγή των μοριακών μεθόδων έγινε με κύριο σκοπό να επιλυθούν οι αδυναμίες των κλασσικών μεθόδων, έτσι ώστε ο αιτιολογικός παράγοντας της λοίμωξης να ταυτοποιείται αξιόπιστα και γρήγορα με στόχο την εφαρμογή αιτιολογικής θεραπείας

4 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) η τεχνική του υβριδισμού ή συνδυασμός των δύο τεχνικών

5 Σύγχρονο Μικροβιολογικό Εργαστήριο εξοικείωση με τη χρήση των μοριακών τεχνικών επιλογή και σχεδιασμός καταλληλότερης μεθοδολογίας εμπορικά kits, in house μέθοδοι περιορισμός του κόστους, ασφάλεια

6 Βασικές αρχές της PCR Πολλαπλασιασμός ενός επιλεγμένου τμήματος DNA Χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers), primers),που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα του DNA-στόχου Ο κάθε κύκλος της PCR περιλαμβάνει στάδια 1.Αποδιάταξη του DNA στόχου (θέρμανση οC) 2. Σύνδεση των εκκινητών στα άκρα του DNA-στόχου 3. Επέκταση των συμπληρωματικών αλυσίδων, με τη βοήθεια του ενζύμου Taq-πολυμεράση

7

8 Βασικές αρχές του υβριδισμού Ομοιότητα του βακτηριακού DNA με την αλληλουχία του ιχνηθέτη που έχουμε επιλέξει Η πρόσδεση του βακτηριακού DNA με τον ιχνηθέτη ανιχνεύεται με διάφορους τρόπους

9 η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) έχει μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με την τεχνική του υβριδισμού τεχνική του υβριδισμού έχει όμως μεγαλύτερη ειδικότητα

10 Ταυτοποίηση βακτηρίων Ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους Ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους

11 ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ 1. στόχος 16S S rrna γονίδιο (ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους) 2. χρήση ειδικών εκκινητών (ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους )

12 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ ΓΕΝΟΥΣ Σε ποιες περιπτώσεις χρησιμοποιείται η μοριακή ταυτοποίηση? Ασυνήθη μικρόβια (Tsukamurella, Pasteurella κλπ) ή νέα μικρόβια Μικρόβια που παρουσιάζουν ασυμβατότητα ανάμεσα στη βιοχημική ταυτοποίηση και στο φαινότυπο αντοχής

13

14 Αδυναμία των βιοχημικών δοκιμασιών Η ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους είναι πιο πολύπλοκη, γιατί πολλές φορές η βιοχημική ταυτοποίηση δε μας κατευθύνει. Χρησιμοποιείται ζεύγος εκκινητών που έχουν στόχο το 16S rrna γονίδιο Οι συγκεκριμένοι εκκινητές αντιστοιχούν σε αλληλουχίες κοινές γα όλα τα βακτήρια

15 Προιόντα PCR μετά από πολλαπλασιασμό του 16S rrna διαφόρων βακτηρίων. Γραμμή 1: μάρτυρας μοριακών βαρών,, 2: Staphylococcus spp, 3: E. Coli,, 4: Klebsiella spp,, 5: Enterococcus spp,, 6: S. pneumoniae,, 7: Streptococcus spp 8: Pseudomonas spp,, 9: αρνητικός μάρτυρας

16 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Ανάλυση κατά Sanger (sequencing) Σύγκριση της συγκεκριμένης αλληλουχίας με όλες τις γνωστές μέχρι σήμερα αλληλουχίες μέσω μιας τράπεζας BLAST-GENOME Η ομοιότητα πρέπει να είναι πάνω από 99% για να είμαστε βέβαιοι ότι το βακτήριο ανήκει στο συγκεκριμένο γένος

17 Περιστατικό ενδοκαρδίτιδας Απομόνωση ενός Gram-αρνητικού βακτηριδίου Καταλάση αρνητικό, οξειδάση θετικό, ινδόλη και ουρία ασθενώς θετικά, μη ζύμωση κανενός σακχάρου. Ομάδα HACEK Ανεπαρκής η βιοχημική ταυτοποίηση (υψηλό βακτηριακό εναιώρημα, δύσκολο σε βραδέως αναπτυσσόμενα βακτήρια) Αναγκαία η μοριακή ταυτοποίηση

18 ??? ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggttgcccaa gtcagatgtg aaagccccgg gcttaacctg ggaactgcat ttgaaactgg gcgactagag tatgaaagag gaaagcggaa tttccagtgt agcagtgaaa tgcgtagata ttggaaggaa caccgatggc gaaggcagct ttctgggtcg atactgacgc tcatgtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa cgatgtcaac taggcgtcgg gttgttaaag actcggtgcc ggagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttga aactcaaaga aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat cctaggaact tggcagagat gccttggtgc cttcgggaac ctagagacag gtgttgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg

19 Σύγκριση της αλληλουχίας Cardiobacterium hominis 16S riboso % C.hominis 16S ribosomal RNA 99% Cardiobacterium sp.. A 16S ribo % Unidentified proteobacterium... 98% Cardiobacterium valvarum 16S ribos... 97% Cardiobacterium valvarum strain CC... 97% Cardiobacterium valvarum strain CC... 96%

20 Πλεονεκτήματα Ταυτοποίηση νέων ειδών (Cardiobacterium valvarum) Ποιοτικός έλεγχος των βιοχημικών δοκιμασιών Μειονεκτήματα εμπειρία

21 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ ΕΙΔΟΥΣ Εκκινητές ειδικοί για κάθε είδος παράδειγμα gram-θετικός θετικός κόκκος, καταλάση-αρνητικός αρνητικός π.χ. Ε. faecalis E. faecium E. gallinarum E. avium

22 DNA από κλινικά δείγματα εντεροκόκκων πολλαπλασιάστηκαν με ειδικά ζεύγη εκκινητών για τα είδη E. faecalis (άνω μισό) και E. faecium (κάτω μισό). H παρουσία προιόντος με ένα από τα δύο ζεύγη των εκκινητών ταυτοποιεί το στέλεχος σε επίπεδο είδους (Γραμμή 4, 6 : E. Faecalis, 2,3,5,7 : E. faecium)

23 Ταυτοποίηση σταφυλοκόκκων πέψη με ενδονουκλεάσες

24

25 Σωστή ταυτοποίηση του μικροοργανισμού σε επίπεδο είδους μικροοργανισμοί που ανήκουν σε ίδιο γένος αλλά σε διαφορετκό είδος έχουν διαφορετικά κριτήρια αντοχής για το ίδιο αντιβιοτικό βάσει της CLSΙ (σταφυλόκοκκοι και οξακιλλίνη)

26 Συμβολή των μοριακών τεχνικών στο χαρακτηρισμό της ευαισθησίας στελέχη ενδιάμεσης αντοχής γρήγορη ανίχνευση της αντοχής

27 παράδειγμα MIC oxacillin MIC 16mm 1μg/ml, ή ζώνη αναστολής Ανάγνωση : χαρακτηρισμός ευαίσθητο ευαίσθητο ερμηνεία meca (+) χαρακτηρισμός ανθεκτικό ανθεκτικό

28 Κριτήρια CLSI για λινεζολίδη Enterococci Ευαισθησία: 2 2 mg/l, Αντοχή 8 8 mg/l 1*-2* /6 επηρεάζουν ελάχιστα την ΜΙC (4-8 mg/l) χαρακτηρίζονται ΟΡΘΑ ως ΕΥΑΙΣΘΗΤΑ ΑΠΟΤΥΧΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

29 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ εύκολη και γρήγορη μέθοδος (8 h) συνδυασμός PCR και RFLP απάντηση στο ερώτημα αν το στέλεχος έχει αρχίσει να αναπτύσσει αντοχή αλλαγή θεραπείας

30 Τυποποίηση βακτηρίων συμβολή στην επιδημιολογία των λοιμώξεων παλαιότερες τεχνικές τυποποίησης (βιοτυπία, λυσιτυπία, οροτυπία κλπ) σύγχρονες μέθοδοι μοριακής τυποποίησης: ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE), MLST

31 Τυποποίηση βακτηρίων-pfge στελέχη που συνδέονται κλωνικά μεταξύ τους έχουν κοινά χαρακτηριστικά συγκεκριμένο χαρακτηριστικό σταθερότητα εμφάνισης αλλά και ποικιλομορφία εμφάνισης σε στελέχη του είδους ευαισθησία, ειδικότητα, τυποποιητική ικανότητα διακριτική ικανότητα, ευκολία στην εκτέλεση και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων

32 PFGE πέψη του DNA από μια ενδονουκλεάση συγκεκριμένη νουκλεοτιδική αλληλουχία ηλεκτροφόρηση των προιόντων της πέψης σύγκριση των θραυσμάτων του DΝΑ των διαφόρων υπό μελέτη στελεχών 6 διαφορές (κριτήρια Tenover) διάκριση σε κλώνους διάκριση σε υπότυπους του ίδιου κλώνου

33

34 Πλεονεκτήματα της PFGE μέθοδος αναφοράς για διερεύνηση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων μεγάλη επαναληψιμότητα μειονέκτημα η σύγκριση των στελεχών

35 Multilocus sequence typing, MLST ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κάποιων συγκεκριμένων γονιδίων του γένους (housekeeping genes) αντικειμενική καταγραφή, κωδικοποίηση των μεταλλάξεων, προσδιορισμός του γονοτύπου του στελέχους, κατάθεση των δεδομένων σε τράπεζα πληροφοριών κοινή παγκόσμια γλώσσα συσχέτιση των αποτελεσμάτων της PFGE με τα αποτελέσματα της MLST

36 Αμεση ανίχνευση του βακτηρίου στο κλινικό δείγμα μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα (μικρός αριθμός βακτηριακών κυττάρων) απάντηση σε συντομότερο διάστημα (Mycobacterium tuberculosis)

37 Πλεονεκτήματα των μοριακών τεχνικών έναντι των κλασσικών τεχνικών Αξιόπιστη ταυτοποίηση του βακτηρίου τόσο σε επίπεδο γένους και είδους Ανίχνευση γονιδίων αντοχής Ταχύτητα στην ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα της λοίμωξης Σημαντική βοήθεια στη διερεύνηση των ενδονοσοκομειαών λοιμώξεων

38 Αξιολόγηση του αποτελέσματος Απαιτεί εμπειρία Συνδυασμός με τα αποτελέσματα των συμβατικών μεθόδων Επικοινωνία με τον κλινικό ιατρό