LightCycler SeptiFast Test MG Για χρήση µε το LightCycler 2.0 Όργανο

Transcript

1 ΓΙΑ ΧΡΗΣΗ ΜΕ: LightCycler SeptiFast Test MG Για χρήση µε το LightCycler 2.0 Όργανο (σειριακός αριθµός και µεγαλύτερος) Για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : SeptiFast Software Set REF : ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ To LightCycler SeptiFast Test MG είναι µια in Vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ανίχνευση και την ταυτοποίηση του βακτηριακού και µυκητιακού DNA από µικροοργανισµούς που καθορίζονται στην Κύρια Λίστα SeptiFast (SML) σε ανθρώπινο αίµα µε αντιπηκτικό K-EDTA, χρησιµοποιώντας το LightCycler 2.0 Όργανο. Η εξέταση χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε την κλινική παρουσίαση, τις καθιερωµένες µικροβιολογικές αναλύσεις και/ή άλλους εργαστηριακούς δείκτες ως βοήθηµα στην αντιµετώπιση ασθενών µε υποψία σηψαιµίας και άλλων περιπτώσεων βακτηριαιµίας/µυκητιαιµίας. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η σηψαιµία θεωρείται µία από τις κύριες αιτίες θνησιµότητας και νοσηρότητας στα νοσοκοµεία, η οποία προκαλείται κυρίως από βακτηριαιµία και/ή µυκητιαιµία. Η άµεση έναρξη της κατάλληλης αντιβιοτικής θεραπείας αποτελεί παράγοντα αποφασιστικής σηµασίας για τη µείωση της νοσηρότητας και της θνησιµότητας που σχετίζονται µε τη σηψαιµία. Το ποσοστό των ασθενών που υποβλήθηκαν αρχικά σε θεραπεία µε ανεπαρκή αντιβιοτικά σχήµατα στις µονάδες εντατικής θεραπείας είναι σηµαντικό και κυµαίνεται από 11% µέχρι και 46% (1,2,3). Στα νοσοκοµεία, ο χρόνος που απαιτείται συνήθως για την ταυτοποίηση των βακτηριακών/µυκητιακών παθογόνων και της ευαισθησίας τους στα φάρµακα από καλλιέργειες αίµατος, είναι τουλάχιστον 48 ώρες (1). Η γρήγορη ανίχνευση των παθογόνων µε τη χρήση µοριακών διαγνωστικών εργαλείων διευκολύνει τη γρήγορη διάγνωση της βακτηριαιµίας/ µυκητιαιµίας και την έγκαιρη χορήγηση της κατάλληλης αντιβιοτικής θεραπείας, ενώ ταυτόχρονα βοηθά στην ελάττωση της ακατάλληλης κατάχρησης αντιβιοτικών ευρέος φάσµατος (4,5). Το LightCycler SeptiFast Test MG είναι σχεδιασµένο για την ανίχνευση µικροοργανισµών που προκαλούν περίπου το 90% όλων των περιπτώσεων βακτηριαιµίας (1,6). Ενώ οι µικροβιολογικές µέθοδοι ανιχνεύουν βιώσιµους µικροοργανισµούς, η συγκεκριµένη εξέταση ανιχνεύει τόσο βιώσιµους, όσο και µη βιώσιµους µικροοργανισµούς, καθώς επίσης και ελεύθερο µικροβιακό DNA. Τα είδη στόχοι παρατίθενται στην Κύρια Λίστα SeptiFast (SML), στον Πίνακα 1. Τα είδη αυτά ανιχνεύτηκαν ως θετικά χρησιµοποιώντας το LightCycler SeptiFast Test MG κατά τη διάρκεια εσωτερικών µελετών και/ή κλινικών δοκιµών. Η αντιµετώπιση ορισµένων από αυτά τα είδη τις περισσότερες φορές είναι ανεπαρκής: Enterococcus spp., E. coli, Candida spp., Klebsiella spp (6). Επιπλέον, η έγκαιρη ταυτοποίηση ορισµένων από τα είδη-στόχους της λίστας SML είναι µεγάλης σηµασίας, καθώς τα είδη αυτά προκαλούν µολύνσεις που είναι εξαιρετικά δύσκολες στη θεραπεία: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Σε ένα δείγµα είναι δυνατό να ανιχνευτούν περισσότερα από ένα είδη. Εποµένως η PCR Πραγµατικού Χρόνου αποτελεί ένα πρόσθετο εργαλείο για τη διευκόλυνση της έγκαιρης κλινικής εκτίµησης. Πίνακας 1: Κύρια λίστα SeptiFast (SML) Gram (-) Gram (+) Μύκητες Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) CoNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Staphylococci αρνητικοί στην κοαγκουλάση (είδη που απαρτίζουν την οµάδα CoNS παρατίθενται στον Πίνακα 9). 2 Τα είδη που απαρτίζουν την οµάδα Streptococcus spp. παρατίθενται στον Πίνακα 9. 3 Τα είδη που αναφέρονται συχνά ως A. calcoaceticus-a. baumannii (σύµπλοκο Acb) δεν ανιχνεύονται (8). 1

2 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το LightCycler SeptiFast Test MG βασίζεται σε 3 κύριες διαδικασίες: Προετοιµασία δείγµατος µε µηχανική λύση και καθαρισµό DNA Ενίσχυση PCR Πραγµατικού Χρόνου του DNA στόχου σε 3 παράλληλες αντιδράσεις (θετικά κατά gram βακτήρια, αρνητικά κατά Gram βακτήρια και µύκητες) και ανίχνευση από ειδικούς ιχνηθέτες υβριδισµού Αυτόµατη ταυτοποίηση ειδών και ορών ελέγχου Προετοιµασία είγµατος Η µηχανική λύση των δειγµάτων εκτελείται µε τη χρήση του SeptiFast Lys Kit MG και του MagNA Lyser Οργάνου. Με το SeptiFast Prep Kit MG τα δείγµατα που έχουν υποστεί λύση επωάζονται σε υψηλή θερµοκρασία µε πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθµιστικό διάλυµα λύσης που απελευθερώνουν νουκλεϊκά οξέα και προστατεύουν το απελευθερωµένο DNA από DNAses στο αίµα. Σε κάθε δείγµα εισάγεται µια καθορισµένη ποσότητα Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου (IC), µαζί µε το αντιδραστήριο λύσης. Το IC αποτελείται από µόρια συνθετικού δίκλωνου DNA µε περιοχές δέσµευσης εκκινητή ίδιες µε εκείνες των αλληλουχιών στόχου. Το IC περιλαµβάνει µοναδικές περιοχές δέσµευσης ιχνηθέτη H που επιτρέπουν τη διαφοροποίηση του ενισχυµένου IC από τον ειδικό για το στόχο κλώνο (amplicon). Μετά την προσθήκη δεσµευτικού ρυθµιστικού διαλύµατος, το µίγµα µεταφέρεται σε µία στήλη περιστροφής µε ένθετο φίλτρο από ίνες υάλου. Το ανθρώπινο γενοµικό DNA και το βακτηριακό/µηκυτιακό DNA στόχος δεσµεύονται στην επιφάνεια των ινών υάλου. Οι µη δεσµευµένες ουσίες, όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ουσίες, αποµακρύνονται µε δύο βήµατα πλύσης. Μετά την ολοκλήρωση των βηµάτων πλύσης, τα νουκλεϊκά οξέα που προσροφήθηκαν εκλούονται σε υψηλή θερµοκρασία. Τα εκλούµατα υποβάλλονται σε ανάλυση PCR. Ενίσχυση και Ανίχνευση PCR σε πραγµατικό χρόνο Επιλογή Στόχου Η περιοχή της εσωτερικά µεταγραφόµενης αλληλουχίας διαχωριστή (spacer) (ITS) έχει επιλεγεί ως περιοχή στόχος για τη διαφοροποίηση των βακτηριακών και µυκητιακών ειδών. Παρέχει υψηλότερη αναλυτική ευαισθησία από τα απλά γονίδια αντιγραφής, καθώς στα γονιδιώµατα των βακτηριών και των µυκήτων υπάρχουν πολλά οπερόνια. Επιπλέον, το ITS είναι περισσότερο ειδικό για κάθε είδος από τα ριβοσωµικά RNA και εποµένως πιο κατάλληλο για τη διαφοροποίηση των ειδών. Βρίσκεται µεταξύ των αλληλουχιών 16S και 23S ριβοσωµικού DNA όλων των gram(+) και gram(-) βακτηρίων και µεταξύ των αλληλουχιών 18S και 5,8S ριβοσωµικού DNA όλων των µυκήτων. Ενίσχυση Πριν από την ενίσχυση PCR, µειώνεται ο κίνδυνος µόλυνσης του κλώνου (amplicon), µε τη χρήση του ενζύµου AmpErase (ουρακίλη-ν-γλυκοζυλάση). Το ένζυµο αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυµιδίνη. Τα επεξεργασµένα δείγµατα προστίθενται στο µίγµα ενίσχυσης που περιέχει Taq πολυµεράση από τη µέθοδο hot start στα LightCycler Τριχοειδή (100 µl) MG, στα οποία πραγµατοποιείται η ενίσχυση PCR. Κάθε στόχος του συγκεκριµένου είδους ενισχύεται µε γενικούς ή ειδικούς εκκινητές. Ένα µίγµα στόχων ενισχύεται ταυτόχρονα στα Αντιδραστήρια Ελέγχου (RC). Ανίχνευση των Προϊόντων PCR σε πραγµατικό χρόνο από Ιχνηθέτες H Η ανίχνευση του κλώνου (amplicon) γίνεται µε φθορισµό χρησιµοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος Ιχνηθετών H. Αυτοί οι επισηµασµένοι µε φθορισµό ιχνηθέτες H υβριδοποιούνται σε µια εσωτερική αλληλουχία του ενισχυµένου θραύσµατος κατά τη φάση υβριδισµού του κύκλου ενίσχυσης. Ο εκπεµπόµενος φθορισµός µετράται από το LightCycler 2.0 Όργανο σε ένα από τα τέσσερα διαφορετικά κανάλια ανίχνευσης. Μετά την ολοκλήρωση της ενίσχυσης, διεξάγεται ανάλυση της καµπύλης τήξης. Η θερµοκρασία τήξης T M εξαρτάται από το µήκος, την αλληλουχία και τον βαθµό οµολογίας µεταξύ του ιχνηθέτη και του DNA-στόχου. Οι ιχνηθέτες έχουν σχεδιαστεί για το διαχωρισµό αυτών των ειδών από τη θερµοκρασία τήξης τους T M που ανιχνεύεται σε ένα κανάλι. Αυτόµατη Ταυτοποίηση Ειδών και Ορών Ελέγχου Οι θερµοκρασίες τήξης (T M s) των δειγµάτων και των ορών ελέγχου αναλύονται από ειδικό λογισµικό ταυτοποίησης (SeptiFast Identification Software) και δηµιουργείται µια αναφορά. Συνεπώς, οι χαµηλές συγκεντρώσεις των αρνητικών στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS) και Streptococci που αντανακλούν το εύρος µολύνσεων ροής εργασιών δεν εµφανίζονται. Εάν υπάρχει θετικό αποτέλεσµα για Staphylococcus aureus, ενδέχεται να ακολουθήσει εξέταση ανθεκτικότητας meca. Για περισσότερες λεπτοµέρειες ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: ). ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ SeptiFast Lys Kit MG P/N: Εξετάσεις LM (Τύπος είγµατος Λύσης) γυάλινα/κεραµικά σωµατίδια 100 x SeptiFast Prep Kit MG P/N: Εξετάσεις [1] LB (Ρυθµιστικό ιάλυµα Λύσης) < 50% Θειοκυανική γουανιδίνη 20% Triton X-100 Επιβλαβές 20 x 1500 µl [2] PK (Πρωτεϊνάση K) 2% Πρωτεϊνάση K Γλυκερόλη [3] BB (Ρυθµιστικό ιάλυµα έσµευσης) < 50% Θειοκυανική γουανιδίνη 20% Triton X-100 [4] IRB (Ρυθµιστικό ιάλυµα Αφαίρεσης Αναστολέα) < 50% Γουανιδίνη HCl < 40% Αιθανόλη Επιβλαβές Επιβλαβές Επιβλαβές 2 x 850 µl 10 x 1000 µl 10 x 1800 µl 2

3 SeptiFast Prep Kit MG P/N: Εξετάσεις [5] WB (Ρυθµιστικό ιάλυµα Πλύσης) < 0,2% Χλωριούχο νάτριο < 80% Αιθανόλη Πολύ Εύφλεκτο 10 x 1600 µl [6] EB (Ρυθµιστικό ιάλυµα Έκλουσης) 10 x 400 µl Ρυθµιστικό διάλυµα Τris-HCI BET (Σωληνάρια Αφαίρεσης Αίµατος) 1 x 50 FC (Στήλες Φίλτρου) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: Εξετάσεις [1a] RM 1a (Μίγµα Αντίδρασης 1a) 3 U/µL Taq Πολυµεράση από µέθοδο FastStart 3 x 27 µl < 0,1% Ένζυµο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) [1b] RM 1b (Μίγµα Αντίδρασης 1b) < 1% Brij < 0,1% ιάλυµα µαγνησίου < 0,1% dntp [2] DM G+ (Θετικό Κατά Gram Μίγµα Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες για G+ < 1% Brij [3] DM G- (Αρνητικό Κατά Gram Μίγµα Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες για G- < 1% Brij [4] DM F (Μύκητες Μίγµατος Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες για F < 1% Brij [5] RC G+ (Θετικό Κατά Gram Αντιδραστήριο Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA για G+ EDTA [6] RC G- (Αρνητικό Κατά Gram Αντιδραστήριο Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA για G- EDTA [7] RC F (Μύκητες Αντιδραστηρίου Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA για F EDTA [8] IC (Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου) < 0,001% DNA στο Πρότυπο Ελέγχου Επεξεργασίας για G+, G-, F EDTA [9] NC (Αρνητικός Ορός Ελέγχου) < 35% Πολυαιθυλενογλυκόλη x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1600 µl SeptiFast Software Set 1.0 ή νεότερο P/N: x SeptiFast Identification Software SeptiFast Macro SeptiFast meca Macro SeptiFast MCC Macro SeptiFast Proof Files 3

4 ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Γενικές Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις Για in Vitro ιαγνωστική Χρήση. Η παρούσα εξέταση προορίζεται µόνο για χρήση µε ανθρώπινο αίµα που έχει συλλεχτεί σε K-EDTA. Η ηπαρίνη έχει αποδειχτεί ότι αναστέλλει την PCR και δεν πρέπει να χρησιµοποιείται στη συγκεκριµένη διαδικασία. Εάν η εξέταση αυτή προορίζεται για ασθενή που θα λάβει ηπαρίνη (π.χ. θεραπευτικά ή κατά την αιµοκάθαρση), το δείγµα θα πρέπει να ληφθεί πριν από τη χορήγηση ηπαρίνης. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια χωρίς πούδρα µιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγµατα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας µετά το χειρισµό δειγµάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ, εκτός εάν απαιτούνται για το Κύριο Μίγµα. Η απόρριψη των αχρησιµοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριµµάτων και των δειγµάτων θα πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε τους κρατικούς και τοπικούς κανονισµούς. Μη χρησιµοποιείτε ένα κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης του. ιατίθενται ελτία εδοµένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τον τοπικό αντιπρόσωπο της Roche. Τα δείγµατα πρέπει να αντιµετωπίζονται ως µολυσµατικά και ο χειρισµός τους να γίνεται µε ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκµηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) και στο έγγραφο CLSI M29-A (9). Καθαρίζετε καλά και απολυµαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας και τα γάντια µε ένα αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008 ). Βεβαιωθείτε ότι τα γάντια είναι ανθεκτικά στο αντιδραστήριο απολύµανσης DNA. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια µίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφύγετε την επαφή των αντιδραστηρίων αυτών µε το δέρµα, τα µάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αµέσως µε άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άµεση αντιµετώπιση, µπορεί να προκληθούν εγκαύµατα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε µε νερό πριν τις σκουπίσετε. Αποφύγετε την επαφή του Ρυθµιστικού ιαλύµατος Λύσης (LB) και έσµευσης (BB) µε το δέρµα, τα µάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αµέσως µε άφθονη ποσότητα νερού, διαφορετικά µπορεί να προκληθούν εγκαύµατα. Αραιώστε τυχόν σταγόνες από αντιδραστήριο µε νερό πριν τις σκουπίσετε. Αποφύγετε την επαφή των ρυθµιστικών διαλυµάτων LB και BB µε διάλυµα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Το µίγµα αυτό ενδέχεται να παράγει ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να εκτελείται σε µονόδροµη κατεύθυνση, αρχίζοντας από την Περιοχή Προετοιµασίας Πριν από την Ενίσχυση και προχωρώντας προς την Περιοχή Προετοιµασίας Μετά την Ενίσχυση (Ενίσχυση/Ανίχνευση). Οι ενέργειες πριν από την ενίσχυση περιλαµβάνουν την προετοιµασία αντιδραστηρίου και την προετοιµασία δείγµατος. Τα υλικά και ο εξοπλισµός πρέπει να προορίζονται αποκλειστικά για κάθε ενέργεια που προηγείται της ενίσχυσης και όχι για άλλες ενέργειες, ούτε να µεταφέρονται µεταξύ των περιοχών. Πρέπει να φοράτε γάντια σε κάθε περιοχή και να τα αλλάζετε πριν από την έξοδό σας από τη συγκεκριµένη περιοχή. Ο εξοπλισµός και τα υλικά που χρησιµοποιούνται για την προετοιµασία του αντιδραστηρίου δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται για ενέργειες χειρισµού δειγµάτων και ορών ελέγχου ή για το χειρισµό µε πιπέτα ή την επεξεργασία ενισχυµένου DNA ή άλλων πηγών DNA-στόχου. Τα υλικά και ο εξοπλισµός που χρησιµοποιούνται µετά την ενίσχυση πρέπει να παραµένουν πάντοτε στον ειδικό χώρο που προορίζεται για την επεξεργασία µετά την ενίσχυση. Η παρουσία του ενζύµου AmpErase στο Κύριο Μίγµα Εργασίας µειώνει τον κίνδυνο µόλυνσης του κλώνου (amplicon). Ωστόσο, η µόλυνση από θετικούς ορούς ελέγχου και θετικά δείγµατα µπορεί να αποφευχθεί µόνο µε τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές και µε την προσεκτική τήρηση των διαδικασιών που περιγράφονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας. Ειδικές Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις κατά τη Χρήση του LightCycler SeptiFast Test MG DNA από τους οργανισµούς στόχους του LightCycler SeptiFast Test MG υπάρχει στο περιβάλλον. Για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων από ανίχνευση τέτοιου περιβαλλοντικού DNA (µόλυνση DNA), είναι απαραίτητο να καθιερωθεί µια ροή εργασιών χωρίς µολυσµατικό DNA. Συγκεκριµένα, ο χειριστής µπορεί να αποτελεί πηγή µολυσµατικού DNA, καθώς στο ανθρώπινο δέρµα και στην άνω αναπνευστική οδό υπάρχουν διάφοροι µικροοργανισµοί που επίσης αποτελούν οργανισµούς στόχους του LightCycler SeptiFast Test MG [π.χ., Streptococci και αρνητικοί στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS)]. Οι ακόλουθες αρχές αποτελούν συστάσεις για την αποφυγή µόλυνσης του DNA. Αντιδραστήρια και Αναλώσιµα του LightCycler SeptiFast Test MG Τα αντιδραστήρια και τα αναλώσιµα του LightCycler SeptiFast Test MG είναι ποιότητας MG. Τα προϊόντα MG είναι σχεδιασµένα για την ανίχνευση υψηλής ευαισθησίας των βακτηριακών και µηκυτιακών νουκλεϊκών οξέων. Αναπτύχθηκαν διαδικασίες παρασκευής ιδιοσκευασµάτων για να εξαλείψουν τη µόλυνση του DNA που µπορεί να αλληλεπιδράσει µε τέτοιες αναλύσεις. Αποφεύγετε το άσκοπο άνοιγµα και κλείσιµο των φιαλιδίων αντιδραστηρίων. Ένδυση και Γάντια Φοράτε γάντια χωρίς πούδρα κατά τη διάρκεια ολόκληρης της ροής εργασιών. Αποφεύγετε την έκθεση του δέρµατος, φοράτε γάντια πάνω από τα µανίκια της εργαστηριακής ποδιάς. Αλλάξτε γάντια αµέσως, σε περίπτωση που µολυνθούν ή καθαρίστε τα µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008, τα γάντια πρέπει να είναι ανθεκτικά στο αντιδραστήριο). Όταν βάζετε τα γάντια, µην αγγίζετε την παλάµη και τα δάχτυλά τους. Φροντίδα Θαλάµου Νηµατικής Ροής Καθαρίζετε τις επιφάνειες του χώρου εργασίας στο θάλαµο νηµατικής ροής µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA µετά από κάθε προετοιµασία δείγµατος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Βεβαιωθείτε ότι ο εξοπλισµός είναι ανθεκτικός στο αντιδραστήριο απολύµανσης DNA. Καθαρίζετε όλες τις επιφάνειες στο εσωτερικό του θαλάµου νηµατικής ροής ανά τακτά χρονικά διαστήµατα (τοιχώµατα, χώρο κάτω από τη πλάκα στη βάσης, πλάκα δαπέδου). Αν ο θάλαµος νηµατικής ροής χρησιµοποιείται από πολλούς χειριστές, βεβαιωθείτε ότι δεν περιέχει DNA. Ενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV και τον αερισµό για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εργασία. Απενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV κατά τη διάρκεια της εργασίας. Φροντίδα Σταθµού Εργασίας PCR Καθαρίζετε τις εξωτερικές επιφάνειες στο σταθµό εργασίας PCR µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA, µετά από κάθε ρύθµιση της PCR. Καθαρίζετε όλες τις επιφάνειες µέσα στο σταθµό εργασίας PCR σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Ενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εργασία. Βεβαιωθείτε ότι η ακτινοβολία UV είναι απενεργοποιηµένη κατά τη διάρκεια της εργασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάξτε τη λάµπα UV για το θάλαµο νηµατικής ροής και το σταθµό εργασίας PCR σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. 4

5 Χειρισµός Συσκευών και Αναλώσιµων Αφήνετε, εάν είναι δυνατόν, τα ειδικά αναλώσιµα και τις συσκευές που χρησιµοποιούνται για το LightCycler SeptiFast Test MG στo θάλαµο νηµατικής ροής. Ακτινοβολείτε όλα τα στοιχεία, για τουλάχιστον 30 λεπτά µε ακτινοβολία UV πριν από την εργασία. Χρησιµοποιείτε µόνο αναλώσιµα που δεν περιέχουν DNA (π.χ. ποιότητας MG. Βλ. ενότητα Απαιτούµενα Μη Παρεχόµενα Υλικά). Χρησιµοποιήστε τα µόνο µία φορά. Χρησιµοποιείτε το Εργαλείο Πωµατισµού για να κλείσετε τα τριχοειδή (για οδηγίες χειρισµού, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο). Σε περίπτωση θραύσης τριχοειδούς, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο (κεφάλαιο Συντήρηση ). Προφυλάξεις κατά τη διάρκεια διοχέτευσης µε Πιπέτα Ανοίξτε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων, τα κιβώτια ακροφυσίων πιπέτας και τα κιβώτια τριχοειδών µόνο µέσα στο θάλαµο νηµατικής ροής. Μην χρησιµοποιείτε τα ίδια ακροφύσια πιπέτας και τριχοειδή έξω από το θάλαµο νηµατικής ροής. Μην αγγίζετε τη στεφάνη ή το σπειροειδές τµήµα ενός ανοιχτού φιαλιδίου. Κατά τη διοχέτευση µε πιπέτα, κρατήστε το φιαλίδιο κάτω από τη στεφάνη. Μην αγγίζετε τη στεφάνη ενός ανοιχτού τριχοειδούς. Τακτοποιήστε όλα τα στοιχεία που χρησιµοποιούνται κατά τη διάρκεια των διαδικασιών στο θάλαµο νηµατικής ροής σε λογική σειρά (αποφύγετε τις περιττές κινήσεις µε την πιπέτα). Εάν πέσουν σταγόνες, τερµατίστε το τρέχον βήµα εργασίας και καθαρίστε αµέσως το χώρο εργασίας µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008 ) ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ SeptiFast Lys Kit MG Αποθηκεύστε στους 15 έως 25 C. Ανοίξτε τα φιαλίδια µόνο µία φορά. Μην τα επαναχρησιµοποιείτε. Μη χρησιµοποιείτε το προϊόν µετά την ηµεροµηνία λήξης του. SeptiFast Prep Kit MG Αποθηκεύστε στους 15 έως 25 C (µην καταψύχετε ή αποθηκεύετε στο ψυγείο). Ανοίξτε το PK έως και 3 φορές. Ανοίξτε τα άλλα φιαλίδια µόνο µία φορά και απορρίψτε τυχόν αντιδραστήρια που δεν χρησιµοποιούνται. Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε µία ανάλυση εκχύλισης. Μη χρησιµοποιείτε το προϊόν µετά την ηµεροµηνία λήξης του. LightCycler SeptiFast Kit MG Αποθηκεύστε στους -15 έως -25 C. Προφυλάξτε το από το φως. Αποθηκεύστε τα Κύρια Μίγµατα (µίγµατα [1a], [1b] και [2] ή [3] ή [4]) στους 2 έως 8 C έως και για 3 ηµέρες. Αποθηκεύστε το RC µετά τη χρήση στους 2 έως 8 C έως και για 10 ηµέρες ή ψύξτε αµέσως στους -15 έως -25 C µετά από κάθε χρήση. Ανοίξτε το RC έως και 6 φορές. Ανοίξτε τα άλλα φιαλίδια µόνο µία φορά και απορρίψτε τυχόν αντιδραστήρια που δεν χρησιµοποιούνται. Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε µία ανάλυση PCR. Μη χρησιµοποιείτε το προϊόν µετά την ηµεροµηνία λήξης του. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ SeptiFast Lys Kit MG P/N: Εξετάσεις SeptiFast Prep Kit MG P/N: Εξετάσεις LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: Εξετάσεις SeptiFast Software Set 1.0 ή νεότερο (παρέχεται µία φορά) P/N: ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Πωλούνται από τη Roche LightCycler 2.0 Όργανο µε Λογισµικό έκδοσης ή νεότερo LightCycler Τριχοειδή MG (100 µl) Φυγόκεντρος Περιστρεφόµενου ίσκου LC MagNA Lyser Όργανο (230 V) LightCycler Multicolor Compensation Set SeptiFast Μονάδα Ψύξης Πωλούνται από Άλλες Εταιρίες Φυγόκεντρος µε περιστρεφόµενο ρότορα για σωληνάρια 15 ml µε δύναµη VWR International τουλάχιστον 4200 g (π.χ. Eppendorf) x Φυγόκεντρος x προσαρµογείς (1 ζεύγος) µε στοιχεία για σωληνάρια 15 ml µε κωνική βάση x Περιστρεφόµενος ρότορας τουλάχιστον στα 4200 x g Φυγόκεντρος (π.χ. Eppendorf) 1x MiniSpin VWR International

6 2 Θερµικοί αναδευτήρες (π.χ. Eppendorf) 2x Θερµικοί αναδευτήρες Comfort (συµπ.) 1x Θερµική Μονάδα για φιαλίδια 24 x 2,0 ml και 1x Θερµική µονάδα για φιαλίδια 8 x 15 ml Κυλινδρικός αναδευτήρας σε σωλήνα/φιάλη (π.χ. Stuart Scientific) 1x Κυλινδρικός Αναδευτήρας 1x Αναδευτήρας τύπου Vortex Χρησιµοποιείτε µόνο φιαλίδια και ακροφύσια που δεν περιέχουν DNA (π.χ. Αναλώσιµα MG, greiner bio-one) Ακροφύσια µε Φίλτρο MG 5 ml Ακροφύσια µε Φίλτρο MG 1 ml Ακροφύσια µε Φίλτρο MG 100 µl Ακροφύσια µε Φίλτρο MG 20 µl Πιπέτα ορού MG 1 ml Σωληνάρια MG 1,5 ml Αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. biodelta GmbH) Σετ LTK-008 Πιπέτα 1-5 ml (π.χ. Thermo Life Sciences) 1x Finnpette 1-5 ml Πιπέτα µl (π.χ. Eppendorf) 2x Πιπέτα Αναφοράς µl 2x Πιπέτα Αναφοράς µl 1x Πιπέτα αναφοράς 2-20 µl (µόνο για εξέταση meca) Θάλαµος Νηµατικής Ροής (π.χ. Cleanair) Θάλαµος Βιολογικής Ασφάλειας EF 4E Σταθµός εργασίας PCR (π.χ. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Θάλαµος PCR παθητικού DNA Biocap Υλικό Θετικού Ορού Ελέγχου Παρέχεται από άλλες εταιρίες ή παρασκευάζεται στο εργαστήριο του χειριστή (βλ. ενότητα Προτάσεις για την Προετοιµασία του Υλικού Θετικού Ορού Ελέγχου). ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγµατα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται µολυσµατικά και ο χειρισµός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Συλλογή είγµατος Το LightCycler SeptiFast Test MG προορίζεται µόνο για χρήση µε δείγµατα αίµατος µε K-EDTA. Το αίµα πρέπει να συλλέγεται σε αποστειρωµένα σωληνάρια µε χρήση K-EDTA ως αντιπηκτικού. Μεταφορά και Αποθήκευση ειγµάτων Η µεταφορά ολικού αίµατος πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε τους κρατικούς και τοπικούς κανονισµούς που αφορούν στη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων (10). Το ολικό αίµα πρέπει να µεταφέρεται/αποθηκεύεται στους -15 έως -25 C ή στους 2 έως 8 C µέχρι και για 3 ηµέρες ή στους 15 έως 25 C µέχρι και για 4 ώρες. Σταθερότητα Εκλουµάτων Χρησιµοποιείτε τα επεξεργασµένα δείγµατα αµέσως µετά τον καθαρισµό του DNA. Αποθηκεύστε ένα κλάσµα δείγµατος, για να χρησιµοποιηθεί για επακόλουθη εξέταση meca (αν χρειαστεί) (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο LightCycler SeptiFast meca Kit MG). Τα εκλούµατα µπορούν να αποθηκευτούν στους -15 έως -25 C ή στους 2 έως 8 C µέχρι και για 3 ηµέρες ή στους 15 έως 25 C µέχρι και για 4 ώρες. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Πριν Από την Έναρξη Προετοιµασίας είγµατος και Ορού Ελέγχου VWR International VWR International greiner bio-one MG MG MG MG MG MG biodelta GmbH VWR International VWR International VWR International VWR International Προετοιµάστε το LightCycler 2.0 Όργανο και το Σταθµό Εργασίας PCR Αντιστάθµιση Χρώµατος: Χρησιµοποιήστε το LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: ). Αν το αρχείο Αντιστάθµισης Χρώµατος έχει λήξει, ετοιµάστε ένα νέο αρχείο. Για λεπτοµέρειες ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler Multicolor Compensation Set. Εγκατάσταση του SeptiFast Identification Software (SIS): Για την ενηµέρωση του λογισµικού, ελέγξτε εάν παρέχονται πρόσθετες πληροφορίες µαζί µε το προϊόν. 1. Συνδεθείτε στο σταθµό δεδοµένων LightCycler ως διαχειριστής. 2. Εισάγετε το CD του SeptiFast Software Set στη µονάδα CD του σταθµού δεδοµένων LightCycler. 3. Για την πρώτη εγκατάσταση: Σε περίπτωση που δεν είναι εγκατεστηµένο το Microsoft.NET 1.1 framework, θα σας ζητηθεί να το εγκαταστήσετε στην αρχή της εγκατάστασης του SIS. Η εγκατάσταση του Microsoft.NET 1.1 framework είναι απαραίτητη, διαφορετικά το SIS δεν θα λειτουργεί σωστά. 4. Πατήστε <OK> για να αρχίσει η εγκατάσταση του SIS, ακολουθήστε τις οδηγίες του βοηθού εγκατάστασης. 5. Επιλέξτε <just me> εάν πρόκειται εργάζεται µόνο ένας χειριστής στο σταθµό δεδοµένωνlightcycler, επιλέξτε <everyone> εάν περισσότεροι από ένας χειριστές πρόκειται να εργάζονται στο σταθµό δεδοµένων LightCycler. 6. Στο παράθυρο επιβεβαίωσης <Setup succeeded> πατήστε <OK> (η εκκίνηση του SIS µπορεί να γίνει τώρα από την επιφάνεια εργασίας µέσω του εικονιδίου του). 7. Ο φάκελος δεδοµένων <C:\Export to SIS> για τα αρχεία *.ixo δηµιουργείται αυτόµατα. 6

7 Ελέγξτε εάν έγινε σωστά η εγκατάσταση του SIS (για εξέταση µε LightCycler SeptiFast Test MG και LightCycler SeptiFast meca Kit MG): 1. Όλα τα διορθωµένα αρχεία αντιγράφονται αυτόµατα από το CD του SeptiFast Software Set στο φάκελο <C:\Export to SIS>. 2. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο SIS στην επιφάνεια εργασίας και πατήστε <Start>. 3. Επιλέξτε το διορθωµένο αρχείο από το <C:\Export to SIS> (SeptiFast Proof 1.0.ixo ή SeptiFast meca Proof 1.0, αντίστοιχα). 4. Επιλέξτε NO ως απάντηση στην ερώτηση εάν η LightCycler αναφορά περιέχει την ένδειξη <User Developed or Modified Test Method>. 5. Το αρχείο θα αναλυθεί αυτόµατα και θα εµφανιστούν τα δεδοµένα. 6. Εκτυπώστε την αναφορά. 7. Ανοίξτε και εκτυπώστε τα σχετικά αρχεία pdf (SeptiFast Proof 1.0.pdf ή SeptiFast meca Proof 1.0.pdf, αντίστοιχα). 8. Η εκτυπωµένη αναφορά πρέπει να αντιστοιχεί µε το εκτυπωµένο αρχείο proof.pdf. ιαφορετικά, επικοινωνήστε µε τον τοπικό αντιπρόσωπο της Roche. 9. Εκτελέστε τα βήµατα 3-8 µε το δεύτερο αρχείο proof. Απεγκατάσταση του SIS: 1. Συνδεθείτε στο σταθµό δεδοµένων LightCycler ως διαχειριστής. 2. Κάντε κλικ στο <Start> στη γραµµή εργασιών του σταθµού δεδοµένων LightCycler. 3. Επιλέξτε <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs>. 4. Θα εµφανιστεί µια λίστα µε όλα τα προγράµµατα που είναι εγκατεστηµένα τη δεδοµένη στιγµή, κάντε κλικ στο <SIS>. 5. Επιλέξτε <Remove> και επιβεβαιώστε πατώντας <Yes>. Εγκατάσταση των Μακροεντολών SeptiFast: 1. Εγκαταστήστε τις Μακροεντολές από το CD του SeptiFast Software Set. 2. Για την εγκατάσταση µιας Μακροεντολής, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου («για in Vitro ιαγνωστική Χρήση»). Προετοιµασία του Θαλάµου Νηµατικής Ροής και του Σταθµού Εργασίας PCR 1. Καθαρίστε και απολυµάνετε εκτενώς το θάλαµο νηµατικής ροής και το σταθµό εργασίας PCR (π.χ. µε LTK-008 ). 2. Ενεργοποιήστε για τουλάχιστον 30 λεπτά: την ακτινοβολία UV και τον αερισµό του θαλάµου νηµατικής ροής, καθώς και ακτινοβολία UV του σταθµού εργασίας PCR. 3. Απενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV κατά τη διάρκεια της εργασίας. 4. Ανοίξτε το LightCycler SeptiFast Kit MG και αφαιρέστε: 1 φιαλίδιο IC και 2 φιαλίδια NC και αφήστε τα να αποψυχθούν στους 2 έως 8 C σε µία υποδοχή κατάλληλη για προετοιµασία δείγµατος (δεν παρέχεται). 1 φιαλίδιο RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F και αφήστε τα να αποψυχθούν στη SeptiFast Μονάδα Ψύξης στους 2 έως 8 C κατά τη διάρκεια της προετοιµασίας δείγµατος. 5. Ενεργοποιήστε: Το Θερµικό αναδευτήρα 1 (για σωληνάρια 15 ml) και ρυθµίστε τη θερµοκρασία στους 56 C, το Θερµικό αναδευτήρα 2 (για σωληνάρια 1,5 ml) και ρυθµίστε τη θερµοκρασία στους 70 C. 6. Τοποθετήστε αρκετά φιαλίδια EB (1 φιαλίδιο ανά δείγµα/nc) στο Θερµικό αναδευτήρα 2 (70 C). 7. Τοποθετήστε τα σωληνάρια συλλογής αίµατος ή τα φιαλίδια δείγµατος στον κυλινδρικό αναδευτήρα σε φιάλη και ανακινήστε για 30 λεπτά. Επεξεργαστείτε τα αµέσως. Προετοιµασία είγµατος και Ορού Ελέγχου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εκτελείτε όλα τα βήµατα χειρισµού µέσα στο θάλαµο νηµατικής ροής. Προτάσεις για την Προετοιµασία του Υλικού Θετικού Ορού Ελέγχου Το υλικό Θετικού Ορού Ελέγχου µπορεί να αγοραστεί και από άλλες εταιρίες. Αν το υλικό αυτό παρασκευάζεται στο εργαστήριο του χειριστή, τα σαφώς προσδιορισµένα κλινικά αποµονωµένα στελέχη θα πρέπει να συλλέγονται ανάλογα µε τον τοπικό επιπολασµό και την κλινική επίδραση. Αυτές οι αποµονωµένες αποικίες θα πρέπει να υποβληθούν σε επαναιώρηση και να προστεθούν εξωγενώς σε αρνητικό αίµα σε συγκέντρωση περίπου 300 CFU/mL. Για θετικό ορό ελέγχου, µπορείτε να χρησιµοποιήσετε υλικό ATCC 33592, ένα S. aureus ανθεκτικό στη µεθικιλλίνη, το οποίο παρέχει τη δυνατότητα χρήσης του εκλούµατος ως θετικού ορού ελέγχου για το LightCycler SeptiFast Test MG, καθώς επίσης και το LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: ). Το στέλεχος καλλιεργήθηκε για ώρες στους 28 έως 37 C σε αιµατούχο άγαρ (5% αίµα προβάτου) και υποβλήθηκε σε επαναιώρηση σε ρυθµιστικό διάλυµα σε 0,5 McFarland (~1,5 x 10 8 CFU/mL). Το εναιώρηµα αυτό προστίθεται εξωγενώς σε αρνητικό αίµα σε τελική συγκέντρωση 300 CFU/mL. ιαδικασία πριν από τη λύση µε SeptiFast Lys Kit MG ΣΗΜΕΙΩΣΗ: ιαβάστε προσεκτικά το Εγχειρίδιο Χειριστή του MagNA Lyser Οργάνου. 1. Χρησιµοποιήστε 2 κατάλληλα επισηµασµένα φιαλίδια LM για κάθε δείγµα ή NC. 2. Ανοίξτε 2 φιαλίδια ταυτόχρονα και µεταφέρατε 1500 µl δείγµατος αίµατος ή NC σε κάθε φιαλίδιο. 3. Κλείστε σφιχτά τα 2 σωληνάρια. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μη σηµειώνετε στα καπάκια των σωληναρίων. 4. Εκτελέστε προκαταρκτική λύση στα δείγµατα στο MagNA Lyser Όργανο για 70 δευτερόλεπτα στα 7000 rpm. 5. Αφήστε τα φιαλίδια έξω από το όργανο για 10 λεπτά. Μην εκτελείτε φυγοκέντριση! Προετοιµασία είγµατος µε SeptiFast Prep Kit MG ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι καθαρά διαλύµατα. Αν σχηµατιστούν κατακρηµνίσµατα, θερµάνετε το διάλυµα (σε θερµοκρασία έως και 37 C). Ανακινήστε ελαφρώς µέχρι να διαλυθούν τα κατακρηµνίσµατα. 1. Προσθέστε 150 µl PK στο BET Προσθέστε 2x1 ml δείγµατος που υποβλήθηκε σε προκαταρκτική λύση ή NC σε BET 1. Αποφύγετε τη διοχέτευση µε πιπέτα των δειγµάτων λύσης στερεού τύπου ή αφρού. 3. Πωµατίστε τα σωληνάρια και στροβιλίστε για σύντοµο χρονικό διάστηµα. 4. Προσθέστε 10 µl IC. Χρησιµοποιείτε καινούριο ακροφύσιο πιπέτας για κάθε δείγµα ή NC. 5. Προσθέστε το περιεχόµενο 2 φιαλιδίων LB, πωµατίστε και στροβιλίστε αµέσως και εκτενώς. 6. Επωάστε για 15 λεπτά στους 56 C ανακινώντας ελαφρά (π.χ. στα 500 rpm µε το Θερµικό αναδευτήρα Eppendorf). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλό το υγρό στο BET 1 πρέπει να καλύπτεται µε τη συσκευή επώασης. 7. Προσθέστε το περιεχόµενο 1 φιαλιδίου BB, πωµατίστε και στροβιλίστε. 8. Τοποθετήστε το FC στο BET 2. Μην αγγίζετε την εσωτερική πλευρά ή την έξοδο του FC. 9. ιοχετεύστε µε πιπέτα το µισό µίγµα προετοιµασίας δείγµατος από το BET 1 στο φίλτρο του FC (περίπου 3,2 ml). 7

8 10. Πωµατίστε και φυγοκεντρίστε το σύστηµα BET 2-FC για 1 λεπτό στα 1900 x g. 11. ιοχετεύστε µε πιπέτα το υπόλοιπο µίγµα προετοιµασίας δείγµατος από το BET 1 στο φίλτρο του FC (περίπου 3,2 ml). Χρησιµοποιείτε καινούριο ακροφύσιο πιπέτας για κάθε δείγµα ή NC. 12. Πωµατίστε και φυγοκεντρίστε το σύστηµα BET 2-FC για 3 λεπτά στα 1900 x g. 13. Τοποθετήστε το FC στο BET 3. Απορρίψτε το BET 2 κατά τη ροή. 14. Προσθέστε το περιεχόµενο ενός φιαλιδίου IRB στο φίλτρο του FC στο BET Πωµατίστε και φυγοκεντρίστε το σύστηµα BET 3-FC για 2 λεπτά στα 4200 x g. 16. Προσθέστε το περιεχόµενο ενός φιαλιδίου WB στο φίλτρο του FC στο BET Πωµατίστε και φυγοκεντρίστε το σύστηµα BET 3-FC για 10 λεπτά στα 4200 x g. 18. Τοποθετήστε το FC στο BET 4. Απορρίψτε το BET 3 κατά τη ροή. 19. Φυγοκεντρίστε το BET 4 για 1 λεπτό στα 4200 x g. 20. Τοποθετήστε το FC στο BET 5. Απορρίψτε το BET ιοχετεύστε µε πιπέτα 300 µl EB που έχει προθερµανθεί (70 C) στο κέντρο του FC. 22. Πωµατίστε τα σωληνάρια και επωάστε τα για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. 23. Φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια για 2 λεπτά στα 4200 x g. 24. Απορρίψτε το FC. Μεταφέρετε το έκλουµα σε φιαλίδια 1,5 ml (π.χ. µε πιπέτες ορού από greiner bio-one). Αποφύγετε την επαφή µε το τοίχωµα του σωληναρίου. Προετοιµασία Αντιδραστηρίου µε LightCycler SeptiFast Kit MG ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Συνιστάται να εκτελείτε όλα τα βήµατα χειρισµού σε σταθµό εργασίας PCR, σε άλλο χώρο από αυτόν της προετοιµασίας δείγµατος. 1. Αφαιρέστε τη SeptiFast Μονάδα Ψύξης µε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων από το ψυγείο, απολυµάνετε µε αντιδραστήριο απολύµανσης DNA (π.χ. LTK-008 ) και µεταφέρατέ την στο σταθµό εργασίας PCR. 2. Στροβιλίστε για µικρό χρονικό διάστηµα τα αντιδραστήρια που έχουν αποψυχθεί (εκτός του RM 1a) και εκτελέστε καθίζηση σε όλα τα αντιδραστήρια (αν έχουν σχηµατιστεί κατακρηµνίσµατα, θερµάνατε το διάλυµα στους 37 C για 5 λεπτά και ανακατέψτε ελαφρώς µέχρι να διαλυθούν τα κατακρηµνίσµατα). 3. Τοποθετήστε τα φιαλίδια µε τα αντιδραστήρια που έχουν αποψυχθεί και τα φιαλίδια εκλούµατος στις ενδεδειγµένες θέσεις στη SeptiFast Μονάδα Ψύξης. 4. Ανοίξτε τα φιαλίδια RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- και DM F. 5. ιοχετεύστε µε πιπέτα 600 µl RM 1b στο RM 1a, ανακατέψτε ελαφρώς εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση µε την πιπέτα. 6. ιοχετεύστε µε πιπέτα 200 µl Μίγµα Αντίδρασης από το 1a σε κάθε φιαλίδιο DM G+, DM G- και DM F για να δηµιουργήσετε ένα Κύριο Μίγµα MM G(+), MM G(-) και MM F. Ανακατέψτε ελαφρώς εκτελώντας αναρρόφηση και έκχυση µε την πιπέτα. Προετοιµασία Αντιδράσεων PCR 1. Τοποθετήστε τον απαιτούµενο αριθµό τριχοειδών στη SeptiFast Μονάδα Ψύξης, 3 τριχοειδή για τα RC (θέσεις 1, 2, 3), 3 τριχοειδή για το έκλουµα NC (θέσεις 4, 5, 6), 3 τριχοειδή για κάθε έκλουµα δείγµατος (θέσεις 7 και πάνω). 2. ιοχετεύστε µε πιπέτα 50 µl MM G(+) σε κάθε τριχοειδές στην πάνω σειρά. 3. ιοχετεύστε µε πιπέτα 50 µl MM G(-) σε κάθε τριχοειδές στη µεσαία σειρά. 4. ιοχετεύστε µε πιπέτα 50 µl MM F σε κάθε τριχοειδές στην κάτω σειρά. 5. Ανοίξτε το πρώτο φιαλίδιο εκλούµατος δείγµατος. Ξεκινήστε τη διαδικασία από το φιαλίδιο στη δεξιά πλευρά της SeptiFast Μονάδας Ψύξης. 6. ιοχετεύστε µε πιπέτα 50 µl εκλούµατος δείγµατος σε καθένα από τα τρία παραπάνω τριχοειδή, που περιέχουν MM G(+), MM G(-) και MM F. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάξτε ακροφύσιο µετά από κάθε βήµα διοχέτευσης µε πιπέτα. 7. Κλείστε τα τρία τριχοειδή µε το Εργαλείο Πωµατισµού (µέρος του LightCycler 2.0 Οργάνου. Για τον τρόπο χρήσης ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου). 8. Συνεχίστε µε τα υπόλοιπα εκλούµατα δείγµατος, όπως περιγράφεται στα βήµατα 5-7. ιοχετεύστε το έκλουµα NC τελευταίο στα τριχοειδή στις θέσεις 4, 5 και Ανοίξτε το RC G ιοχετεύστε µε πιπέτα 50µl στο τριχοειδές της θέσης Κλείστε το τριχοειδές και στη συνέχεια, κλείστε το RC G ιοχετεύστε µε πιπέτα το RC G- και RC F στα τριχοειδή των θέσεων 2 και 3 αντίστοιχα, όπως περιγράφεται στα βήµατα Μεταφέρατε όλα τα τριχοειδή στο LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο ειγµάτων ανάλογα µε τον αριθµό τους. 14. Φυγοκεντρίστε το LightCycler Περιστρεφόµενο ίσκο ειγµάτων µε τη Φυγόκεντρο Περιστρεφόνου ίσκου LC Τοποθετήστε τον LightCycler 2.0 Περιστρεφόµενο ίσκο ειγµάτων στο LightCycler 2.0 Όργανο. Αποθήκευση των Υπόλοιπων Αντιδραστηρίων και Εκλουµάτων 1. Σηµειώστε στα µη χρησιµοποιηµένα Κύρια Μίγµατα MM G(+), MM G(-) και MM F τον αριθµό των υπολειπόµενων αντιδράσεων και την ηµεροµηνία. Τοποθετήστε τα φιαλίδια στις αντίστοιχες θέσεις της SeptiFast Μονάδας Ψύξης. 2. Το Κύριο Μίγµα MM µπορεί να αποθηκευτεί στους 2 έως 8 C µέχρι και για 3 ηµέρες. Για την επόµενη ανάλυση, µπορείτε να συµπληρώσετε το αποθηκευµένο Κύριο Μίγµα (MM) µε νέο MM για να εξασφαλίσετε τον απαιτούµενο όγκου του διαλύµατος εργασίας. Το διάλυµα αυτό πρέπει να χρησιµοποιηθεί αµέσως. 3. Αποθηκεύστε τα φιαλίδια RC στις αντίστοιχες θέσεις της SeptiFast Μονάδας Ψύξης στους 2 έως 8 C. 4. Σηµειώστε στα εκλούµατα των δειγµάτων και στο NC τον αριθµό ανάλυσης και την ηµεροµηνία. 5. Απορρίψτε όλα τα άδεια φιαλίδια αντιδραστηρίων. Φόρτωση και Λειτουργία του LightCycler 2.0 Οργάνου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Συνιστάται το LightCycler 2.0 Όργανο, να λειτουργεί σε χωριστό δωµάτιο από αυτό για τον καθαρισµό του DNA και την προετοιµασία διαλυµάτων εργασίας. 1. Εκκινήστε τη Μακροεντολή SeptiFast SeptiFast_1.0_ ή νεότερη (ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου, κεφάλαιο Εκτέλεση µιας Roche Macro ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν αποσυνδεθεί ο χειριστής, µην συνεχίσετε την ανάλυση. Ξεκινήστε νέα ανάλυση µε νέο όνοµα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην χρησιµοποιείτε το πεδίο <assay lot number>. Εάν θέλετε να προσθέσετε τον αριθµό παρτίδας ανάλυσης στην εξέταση, εισάγετε τις πληροφορίες στο αντίστοιχο πεδίο στον επεξεργαστή δείγµατος. 2. Αποθηκεύστε την ανάλυση µε ένα όνοµα που θα εξασφαλίζει ακριβή ταυτοποίηση (π.χ. όνοµα χειριστή και ηµεροµηνία). 8

9 3. Σε περίπτωση που απαιτούνται λιγότερα από 7 δείγµατα, µειώστε τα δείγµατα από τη λίστα φόρτωσης προεπιλογής. ιαγράψτε και τα 3 τριχοειδή ενός δείγµατος στη λίστα, όχι µόνο 1 ή 2 από τις 3 παράλληλες αναλύσεις. Εάν κατά λάθος διαγραφούν πάρα πολλά τριχοειδή, µην τα προσθέσετε, αλλά ξεκινήστε τη διαδικασία από την αρχή. 4. Μπορείτε να καταχωρήσετε συγκεκριµένα δεδοµένα ασθενή σε <αγκύλες> αντί να χρησιµοποιήσετε την προεπιλεγµένη ρύθµιση [π.χ., G(+) <Όνοµα_01> αντί για G(+) <δείγµα 1>]. Το κείµενο πρέπει να είναι ίδιο και στις 3 παράλληλες αναλύσεις µιας λίστας δειγµάτων, για να διασφαλίζεται η σωστή αναγνώριση του δείγµατος από το SIS. ιαφορετικά, αφήστε τις ρυθµίσεις προεπιλογής και πατήστε <Run Note> για να εισάγετε δεδοµένα, αν απαιτείται. 5. Μόλις προστεθούν όλες οι ειδικές για τα δείγµατα πληροφορίες, συνεχίστε κατά τον οδηγό κιτ και ξεκινήστε την ανάλυση µε το LightCycler 2.0 Όργανο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην αλλάζετε τα προθέµατα G(+), G(-), F. Μην αλλάζετε τα ονόµατα των αντιδραστηρίων ελέγχου [π.χ., G(+) #RC#] και των αρνητικών ορών ελέγχου [π.χ., G(+) #NC#]. 6. Μετά τη ολοκλήρωση της ανάλυσης, ελέγξτε τη στάθµη του υγρού στα τριχοειδή (τα αποτελέσµατα δεν είναι έγκυρα για το τριχοειδές, εάν η στάθµη του είναι µεταβλητή). Ανίχνευση Κορυφής και Αυτόµατη Ταυτοποίηση Ειδών Γενική Επεξήγηση των Μονάδων Ανάλυσης ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην ξεκινάτε την ανάλυση δεδοµένων κατά τη διάρκεια µιας ανάλυσης µε το LightCycler 2.0 Όργανο. Η χειροκίνητη εµφάνιση της τιµής Τ M απαιτεί 12 µονάδες εµφάνισης τιµής T M (3 αναλύσεις, 4 κανάλια). Οι Μονάδες Απόλυτης Ποσοτικοποίησης δεν απαιτούν χειροκίνητο χειρισµό. Η χειροκίνητη εµφάνιση τιµής T M µπορεί να εκτελεστεί έως και για 6 κορυφές χρησιµοποιώντας τις γραµµές T M. Οι γραµµές T M κάθε µονάδας ανάλυσης προκαθορίζονται στις SeptiFast Μακροεντολές. Στο παράθυρο της κορυφής τήξης, εµφανίζονται όλες οι καµπύλες των επιλεγµένων γραφηµάτων. Μπορείτε να επιλέξετε ή να αποεπιλέξετε τις γραµµές της τιµής T M χωρίς ένδειξη. Οι τιµές αναφοράς κάθε µονάδας ανάλυσης προκαθορίζονται στις SeptiFast Μακροεντολές. Μην αλλάζετε ή αποεπιλέγετε τις τιµές αναφοράς. Εάν αλλάξουν κατά λάθος, πληκτρολογήστε τις σωστές τιµές από τον Πίνακα 3: Τιµές αναφοράς. Εάν ενεργοποιηθούν περισσότερα από ένα τριχοειδή, οι ρυθµίσεις του πρώτου τριχοειδούς εµφανίζονται στο πλαίσιο ελέγχου. Η µετατόπιση των γραµµών επηρεάζει όλα τα ενεργοποιηµένα τριχοειδή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην αλλάζετε τις παρακάτω ρυθµίσεις: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> ή <Peak Width>. Μπορείτε να επιλέξετε <Display - Peak Height>. Οι κορυφές ορίζονται ως οι µέγιστες τιµές πάνω από την τιµή αναφοράς. Οι πλευρές δεν θεωρούνται κορυφές. Εξαίρεση αποτελεί το RC G-, Κανάλι 610 (βλ. Εικόνα 1, Γράφηµα 2). Οι δύο αριστερές κορυφές στο Γράφηµα 1 είναι µέγιστες και πρέπει να επισηµαίνονται µε ολισθητήρες. Στο γράφηµα 2, µία από τις κορυφές (π.χ. η δεύτερη) εµφανίζεται ως πλευρά, αλλά πρέπει επίσης να επισηµανθεί. Στα Γραφήµατα 3 και 4 µία από τις κορυφές λείπει. Πρέπει να ενεργοποιηθούν µόνο δύο αντί για τρεις ολισθητήρες. Σχήµα 1: RC G-, CH 610 Γράφηµα 1 Γράφηµα 2 Γράφηµα 3 Γράφηµα 4 Οι ολισθητήρες T M πρέπει να επιλεγούν εντός του ισχύοντος εύρους T M (βλ. Πίνακας 2). Πίνακας 2: Εύρος τιµών T M για έγκυρες κορυφές CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 Χαµηλή T M [ C] Υψηλή T M [ C] Χαµηλή T M [ C] Υψηλή T M [ C] Χαµηλή T M [ C] Υψηλή T M [ C] Χαµηλή T M [ C] Υψηλή T M [ C] G(+) G(-) F Οι τιµές αναφοράς είναι προκαθορισµένες σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα και δεν πρέπει να αλλάξουν. (Εάν αλλάξουν κατά λάθος, πληκτρολογήστε ξανά τις τιµές σύµφωνα µε τον πίνακα, διαφορετικά η ανάλυση θα επισηµανθεί). Πίνακας 3: Τιµές αναφοράς CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 G(+) 0,159 0,027 0,061 0,027 G(-) 0,234 0,001 0,236 0,065 F 0,196 0,033 0,111 0,059 9

10 Προσαρµογή των γραµµών της τιµής T M 1. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης, ο οδηγός πειραµάτων εµφανίζει το µήνυµα <Analyses have been created>. 2. Μετακινήσετε το παράθυρο στο κάτω µέρος (µην πατήσετε το <Finish>). 3. Βεβαιωθείτε ότι οι τιµές T M και η τιµή αναφοράς είναι ορατές. 4. Κάντε κλικ στη µονάδα ανάλυσης [π.χ., Εµφάνιση T M G(+) 610]. 5. Ενεργοποιήστε όλες τις θέσεις της ανάλυσης για να έχετε µια επισκόπηση [π.χ., G(+)]. 6. Κάντε κλικ µόνο στη θέση G(+) #RC#. 7. Ρυθµίστε τις γραµµές της T M στη µέγιστη τιµή κορυφής πάνω από την τιµή αναφοράς. Επικεντρωθείτε µόνο στο ισχύον εύρος τιµών T M (βλ. Πίνακα 2: εύρος τιµών T M για έγκυρες κορυφές). Εάν δεν υπάρχει κορυφή πάνω από την τιµή αναφοράς, η γραµµή της τιµής T M πρέπει να διαγραφεί (απενεργοποιήστε το αντίστοιχο πλαίσιο). Στο τέλος της Εµφάνισης της τιµής T M για ένα ειδικό τριχοειδές, πρέπει να υπάρχουν µόνο µέγιστες κορυφές µε γραµµές τιµής T M. Σε ορισµένες περιπτώσεις, ενδέχεται να εµφανιστούν χαµηλές συγκεντρώσεις E. faecium (G+, CH 705, T M 51,8-55,9) και C. albicans (F, CH 640, T M 53,4-57,5) ως πλευρές των αντίστοιχων IC κορυφών (G+, CH 705, T M 45,5-49,6, F, CH 640, T M 44,8-48,0). Επισηµάνετε και τις πλευρές αυτές µε µια γραµµή τιµής T M. 8. Ενεργοποιήστε την επόµενη θέση [π.χ., G(+) #NC#] µαζί µε το G(+) #RC# για να έχετε µια επισκόπηση. (Η αυτόµατη προσαρµογή κλίµακας θα προσαρµοστεί στην υψηλότερη κορυφή). 9. Ενεργοποιήστε µόνο την επιλεγµένη θέση [π.χ. G(+) #NC#]. (Η αυτόµατη προσαρµογή κλίµακας θα προσαρµοστεί στις κορυφές υποβάθρου του NC. Η τιµή αναφοράς µπορεί να µην είναι πλέον ορατή.) 10. Προχωρήστε µε την ανίχνευση κορυφής, όπως περιγράφεται στα βήµατα Μετά το τέλος µιας ανάλυσης (π.χ., Εµφάνιση T M G(+) 610), προχωρήστε µε την επόµενη, όπως περιγράφεται στα βήµατα Ολοκλήρωση Εµφάνισης της τιµής T M 1. Μετατοπίστε τον οδηγό πειράµατος στο κέντρο της οθόνης και πατήστε <Finish>. 2. ηµιουργείται αυτόµατα µια αναφορά που πρέπει να εκτυπωθεί. 3. Η ανάλυση αποθηκεύεται αυτόµατα. 4. Εξαγάγετε το αρχείο *.ixo στο <C:\Export to SIS>. 5. Ελέγξτε την αναφορά για ενδείξεις και για το αν εµφανίζεται το µήνυµα <run state: complete>. 6. Εάν προκύψουν ενδείξεις ή αν εµφανιστούν άλλα µηνύµατα για την κατάσταση ανάλυσης, η ανάλυση δεν είναι έγκυρη και πρέπει να επανεξεταστούν όλα τα δείγµατα. Αυτόµατη Ταυτοποίηση Κορυφής µε SeptiFast Identification Software (SIS) 1. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο SIS στην επιφάνεια εργασίας και πατήστε <Start>. 2. Επιλέξτε την ανάλυση από το φάκελο <C:\Export to SIS> και φορτώστε το αρχείο *.ixo. 3. Επιλέξτε Yes ή No για να αποφασίσετε αν η LightCycler Αναφορά περιέχει την ένδειξη <User Developed or Modified Test Method>. 4. Το αρχείο *.ixo θα αναλυθεί αυτόµατα και τα δεδοµένα θα εµφανιστούν σε µια αναφορά. 5. Εκτυπώστε την Αναφορά SIS. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ερµηνεία των Αποτελεσµάτων Οι ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ και τα ΣΧΟΛΙΑ µπορεί να δηµιουργηθούν από το SeptiFast Identification Software (SIS) ως RUN FLAGS, ASSAY FLAGS και FLAGS στο πλαίσιο SPECIMEN (βλ. παρακάτω). Ο χειριστής πρέπει να ελέγξει την εκτύπωση(εις) της ανάλυσης για FLAGS ή COMMENTS σε όλα τα πλαίσια. Σχήµα 2: Πλαίσιο Specimen Specimen Assay Data Result Flags Comment SeptiFast sample 1 Επιπλέον πληροφορίες µπορούν να ληφθούν στα πεδία COMMENT των RUN FLAGs και των ASSAY FLAGs. Αποτελέσµατα είγµατος Τα ονόµατα των <ειδών> στο πεδίο RESULT υποδεικνύουν ότι το δείγµα βρέθηκε θετικό για το σχετικό µικροοργανισµό. Τα πρωτογενή δεδοµένα των σχετικών κορυφών εµφανίζονται στο πεδίο DATA και συµπεριλαµβάνουν το κανάλι (CH), το σηµείο τήξης (T M ), το ύψος κορυφής (P H ) και το σηµείο επιχιασµού (CP 1 ). Το σύµβολο στο πεδίο RESULT σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αναλύτης µέσα στα καθορισµένα κριτήρια για το είδος. 1 Το CP εµφανίζεται µόνο για το G(+) του καναλιού 610, 640. Εξέταση meca Εάν υπάρχει θετικό αποτέλεσµα για Staphylococcus aureus, ενδέχεται να ακολουθήσει εξέταση ανθεκτικότητας meca. Για περισσότερες λεπτοµέρειες ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: ). Επαλήθευση Ανάλυσης G(+) <CH..., TM..., PH..., CP...> <species> G(-) F Η επαλήθευση ανάλυσης διεξάγεται από το SeptiFast Identification Software (SIS). Οι µη έγκυρες αναλύσεις εµφανίζονται αυτόµατα και επισηµαίνονται µε. Ολόκληρη η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. 10

11 Τα σχόλια των ενδείξεων και οι σχετικές ερµηνείες εµφανίζονται σε λίστα παρακάτω. Πίνακας 4: Ενδείξεις για επαλήθευση της ανάλυσης Comments 1 Ερµηνεία ASSAY FLAG NC: IC not detected Στον NC, δεν ανιχνεύτηκε στόχος και IC ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP 2 >,< species > Στον NC, ανιχνεύτηκε ένα είδος ASSAY FLAG NC: more amplicons detected Πρόσθετη ένδειξη, σε περίπτωση που ανιχνευτούν περισσότεροι από 3 κλώνοι (amplicons) στον NC ASSAY FLAG RC: No amplicon: <species> Ένας ή περισσότεροι κλώνοι (amplicons) του RC δεν ανιχνεύτηκαν ASSAY FLAG RC: more amplicons not detected Πρόσθετη ένδειξη σε περίπτωση που δεν ανιχνευτούν περισσότεροι από 3 κλώνοι (amplicons) του RC SPECIMEN FLAG IC not detected εν ανιχνεύτηκε στόχος και IC. 1 Τα σφάλµατα του συστήµατος παρατίθενται στην ενότητα Αντιµετώπιση Προβληµάτων. 2 Το CP εµφανίζεται µόνο για το G(+) στο Κανάλι 610, 640. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Ένα αντίγραφο του Αρνητικού Ορού Ελέγχου (NC) και ένα αντίγραφο καθενός από τα 3 Αντιδραστήρια Ελέγχου (RCs) πρέπει να συµπεριλαµβάνονται σε κάθε µία από τις 3 παράλληλες αναλύσεις [G(+), G(-), F] για κάθε ανάλυση εξέτασης. Ο NC και τα RC πρέπει να τοποθετηθούν σε καθορισµένες θέσεις, όπως περιγράφεται στην ενότητα Προετοιµασία Αντίδρασης PCR. Συνιστάται να αναλύεται ένα υλικό θετικού ορού ελέγχου της Roche, ως Θετικός Ορός Ελέγχου, σε ολόκληρη τη ροή εργασιών, (βλ. ενότητα Μη Παρεχόµενα Υλικά). Το SIS προσδιορίζει το αποτέλεσµα των IC, NC και RC. Εάν οι οροί ελέγχου δεν πληρούν τις καθορισµένες προδιαγραφές, όλα τα αποτελέσµατα δειγµάτων φέρουν µια ένδειξη στο πεδίο του πλαισίου SPECIMEN. Ελέγξτε το πλαίσιο SPECIMEN της εκτύπωσης της ανάλυσης για ενδείξεις και σχόλια, για να βεβαιωθείτε ότι η ανάλυση είναι έγκυρη. Αρνητικός Ορός Ελέγχου (NC) Ο NC πρέπει να είναι αρνητικός, ενώ το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου πρέπει να είναι θετικό. Αν ο NC δεν πληροί αυτά τα κριτήρια, όλα τα αποτελέσµατα δειγµάτων της ανάλυσης φέρουν µια ένδειξη. Ολόκληρη η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. Αντιδραστήριο Ελέγχου (RC) Κάθε RC πρέπει να είναι θετικό για τους κλώνους (amplicon) στόχους του RC. Αν κάποιο RC δεν πληροί αυτό το κριτήριο, όλα τα αποτελέσµατα δειγµάτων της ανάλυσης φέρουν µια ένδειξη. Ολόκληρη η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. Θετικός Ορός Ελέγχου Ο Θετικός Ορός Ελέγχου πρέπει να είναι θετικός. Εάν τα υλικά θετικού ορού ελέγχου της Roche ή εξωτερικής παρασκευής δεν πληρούν το παραπάνω κριτήριο, ολόκληρη η ανάλυση θεωρείται άκυρη. εν εµφανίζεται καµία ένδειξη από το SIS. Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου (IC) Το Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου πρέπει να ανιχνευτεί θετικό σε όλα τα αρνητικά δείγµατα, όπως και ο Αρνητικός Ορός Ελέγχου. Αν το IC δεν πληροί αυτό το κριτήριο, το αποτέλεσµα δείγµατος φέρει µια ένδειξη. Σε περίπτωση µη έγκυρων ορών ελέγχου, επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία (προετοιµασία δειγµάτων και ορών ελέγχου, ενίσχυση και ανίχνευση και των 3 αναλύσεων). Σε περίπτωση που οι οροί ελέγχου είναι διαρκώς µη έγκυροι, επικοινωνήστε µε τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ Πίνακας 5: Σφάλµατα του συστήµατος που εµφανίζονται στο πεδίο COMMENTS των RUN FLAGS και στην εκτύπωση του SIS Μήνυµα Συστήµατος (εµφανίζεται στα τµήµατα ενδείξεων της εκτύπωσης του SIS) Πιθανή Αιτία ιορθωτική Ενέργεια User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Η ανάλυση δεν είναι έγκυρη, οι πιθανές αιτίες περιγράφονται στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου. Οι προεπιλεγµένες ρυθµίσεις της Μακροεντολής (π.χ. τιµές αναφοράς, πρωτόκολλο ανάλυσης, κλπ) µπορεί να έχουν αλλάξει. ύο ή περισσότερα διαφορετικά αρχεία Αντιστάθµισης Χρώµατος είναι ενεργά σε µία ή περισσότερες µονάδες ανάλυσης Το αντικείµενο Αντιστάθµισης Χρώµατος είναι µεγαλύτερο των έξι µηνών 11 Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε τις τιµές αναφοράς σύµφωνα µε τον Πίνακα 3. Αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Επιλέξτε τη σωστή Αντιστάθµιση Χρώµατος και υπολογίστε ξανά. ηµιουργήστε νέο αντικείµενο Αντιστάθµισης Χρώµατος. Invalid Macro Εφαρµόστηκε λάθος Μακροεντολή Ελέγξτε για τη σωστή Μακροεντολή στο LightCycler Λογισµικό και/ή στο SeptiFast Software Set. Invalid Baseline Invalid Control Tube Οι τιµές αναφοράς µπορεί να έχουν αλλάξει κατά λάθος Ένας ή περισσότεροι οροί ελέγχου έχουν ονοµαστεί εσφαλµένα Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε τις τιµές αναφοράς σύµφωνα µε τον Πίνακα 3. Αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε την πληκτρολόγηση των ονοµάτων των ορών ελέγχου στον επεξεργαστή δείγµατος. Αλλάξτε σε προκαθορισµένα ονόµατα, αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά.

12 Πίνακας 5: Σφάλµατα του συστήµατος που εµφανίζονται στο πεδίο COMMENTS των RUN FLAGS και στην εκτύπωση του SIS (συνέχεια) Μήνυµα Συστήµατος (εµφανίζεται στα τµήµατα ενδείξεων της εκτύπωσης του SIS) Πιθανή Αιτία ιορθωτική Ενέργεια Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling Αν ένα ή περισσότερα δείγµατα λείπουν από την αναφορά SIS, ελέγξτε αν: 1) Το όνοµα κάποιου από τα τρία τριχοειδή της ανάλυσης ενός δείγµατος είναι εσφαλµένο, δηλ., τα ειδικά για την ανάλυση προθέµατα (G+, G-, F) διαγράφηκαν ακούσια ή 2) Το όνοµα ενός ή περισσότερων τριχοειδών δειγµάτων ήταν εσφαλµένα ή ορισµένα τριχοειδή δειγµάτων λείπουν. Για τη διόρθωση αυτών των σφαλµάτων, ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε την πληκτρολόγηση των ονοµάτων των δειγµάτων στον επεξεργαστή δείγµατος. Αλλάξτε σε προκαθορισµένα ονόµατα, αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί για χρήση µόνο µε ανθρώπινο αίµα που έχει συλλεχτεί σε αντιπηκτικό K-EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δείγµατος µπορεί να οδηγήσει σε εσφαλµένα, ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά, αποτελέσµατα. Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τις ορθές διαδικασίες συλλογής, µεταφοράς, αποθήκευσης και επεξεργασίας δειγµάτων. Η χρήση του παρόντος προϊόντος πρέπει να περιορίζεται µόνο σε προσωπικό εκπαιδευµένο ειδικά στη ροή εργασιών του LightCycler SeptiFast Test MG. Η απόδοση του LightCycler SeptiFast Test MG έχει καθοριστεί για αίµα που περιέχει WBC/µL. Η τρέχουσα ταξινόµηση των µικροοργανισµών βασίζεται κυρίως στην ταξινόµηση του φαινοτύπου (βιοχηµικές και φυσιολογικές ιδιότητες) και ενδέχεται να µη συµφωνεί µε το γενετικό προσδιορισµό. Σε σπάνιες περιπτώσεις, τα δείγµατα µε υψηλές ποσότητες DNA στόχου του Streptococcus spp. ενδέχεται να φέρουν ψευδώς αρνητικό αποτέλεσµα. ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Στόχοι και Μέθοδοι της Κλινικής Μελέτης ιεξήχθη µια πολυκεντρική κλινική µελέτη που περιλαµβάνει τέσσερα ευρωπαϊκά εργαστήρια. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η αξιολόγηση της απόδοσης του LightCycler SeptiFast Test MG (SeptiFast Lys Kit MG, SeptiFast Prep Kit MG, LightCycler SeptiFast Kit MG) σε σύγκριση µε τα αποτελέσµατα της Καλλιέργειας Αίµατος (BC) και άλλων µικροβιολογικών εξετάσεων. Συλλέχθηκαν δείγµατα ανθρώπινου ολικού αίµατος µε EDTA για την ταυτοποίηση του DNA στόχου, από είδη που περιέχονται στη SML (Κύρια Λίστα του SeptiFast, βλ. Πίνακα 1). Συνολικά συλλέχθηκαν 778 δείγµατα από 279 ασθενείς µε υποψία συστηµατικής βακτηριακής ή µηκυτιακής µόλυνσης, ανεξάρτητα από την κατάσταση αντιβιοτικής τους θεραπείας, και µε κλινικά συµπτώµατα συστηµατικής µόλυνσης, συµπεριλαµβανοµένης της σηψαιµίας, της οξείας σηψαιµίας και του σηπτικού σοκ. Κατά προτίµηση συµπεριλήφθηκαν ασθενείς από µονάδες εντατικής θεραπείας. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκαν καλλιέργειες αίµατος για τη διάγνωση ρουτίνας. Αποτελέσµατα Κλινικής Μελέτης Ένα ή περισσότερα τριχοειδή δειγµάτων έχουν Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και ονοµαστεί εσφαλµένα ή λείπουν τριχοειδή δειγµάτων ελέγξτε την πληκτρολόγηση των ονοµάτων των δειγµάτων στον επεξεργαστή δείγµατος. Αλλάξτε σε προκαθορισµένα ονόµατα, αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Εφαρµόστηκε λάθος έκδοση LightCycler Λογισµικού για τη διαδικασία εν έχει εκτελεστεί καµία χειροκίνητη Εµφάνιση τιµής T M (σε κανένα δείγµα και σε καµία µονάδα ανάλυσης). Η Μακροεντολή έχει τελειώσει χωρίς ανάλυση + additional run flags Έχουν ανιχνευτεί περισσότερες από 5 ενδείξεις ανάλυσης Invalid CCC File Name ύο ή περισσότερα διαφορετικά αρχεία Αντιστάθµισης Χρώµατος είναι ενεργά σε µία ή περισσότερες µονάδες ανάλυσης Η διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα δεν υπολογίστηκαν, διότι δεν διατίθεται κατάλληλη µέθοδος αναφοράς. Συνολικά πραγµατοποιήθηκε ανάλυση 778 δειγµάτων από 279 ασθενείς µε BC ή PCR. Τα δείγµατα στα οποία βρέθηκαν είδη που δεν περιλαµβάνονται στην Κύρια Λίστα SML εξαιρέθηκαν. 12 Ανοίξτε το LightCycler Λογισµικό και ελέγξτε για το σωστό αριθµό έκδοσης. Ανοίξτε το αρχικό αρχείο *.ixo στο LightCycler Λογισµικό και εκτελέστε χειροκίνητη Εµφάνιση τιµής T M. Αποθηκεύστε και εξαγάγετε ξανά. Προσπαθήστε να απαλείψετε τις συγκεκριµένες ενδείξεις που περιγράφονται, επαναλάβετε την ανάλυση µε το SIS. Επιλέξτε το σωστό αρχείο Αντιστάθµισης Χρώµατος και υπολογίστε ξανά. Πίνακας 6: Αριθµός ειδών που βρέθηκαν σε αίµα µε EDTA κατά την κλινική µελέτη Μόνο BC Μόνο PCR Και οι δύο µέθοδοι Staphylococcus aureus CoNS Streptococcus pneumoniae 2 4 Streptococcus spp Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Acinetobacter baumannii Enterobacter aerogenes / cloacae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae / oxytoca

13 Πίνακας 6: Αριθµός ειδών που βρέθηκαν σε αίµα µε EDTA κατά την κλινική µελέτη (συνέχεια) Μόνο BC Μόνο PCR Και οι δύο µέθοδοι Proteus mirabilis 1 1 Pseudomonas aeruginosa 8 3 Serratia marcescens Stenotrophomonas maltophilia Aspergillus fumigatus 28 Candida albicans Candida glabrata 2 Candida krusei 1 Candida parapsilosis Candida tropicalis Όλοι οι µικροοργανισµοί δείγµατα ήταν αρνητικά σε BC αλλά θετικά σε PCR. Τα αποτελέσµατα αυτά υποβλήθηκαν σε περαιτέρω ανάλυση κατά τη διάρκεια των επεισοδίων του ασθενή. Για την επίλυση των αντιφατικών αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκαν άλλα µικροβιολογικά αποτελέσµατα (δηλ., µια δεύτερη καλλιέργεια αίµατος που έγινε σε διαφορετική χρονική στιγµή, δείγµατα από σωµατικά υγρά/ιστούς, π.χ. παροχετεύσεις, τραύµατα, βιοψία κλπ.) ή ένα δεύτερο αποτέλεσµα PCR από διαφορετική λήψη αίµατος. Πίνακας 7: ιαχωρισµός 173 αποτελεσµάτων του LightCycler SeptiFast Test MG που διαφέρουν από τα αποτελέσµατα της BC Επιβεβαίωση Αποτελέσµατος Αριθµός από Συνολικά 122/173 % από Συνολικά 70,5% ιαφορετική Καλλιέργεια Αίµατος 32/173 18,5% ιαφορετικά Σωµατικά Υγρά 46/173 26,6% Αποτέλεσµα PCR από διαφορετική λήψη αίµατος 44/173 25,4% Εκκρεµή 51/173 29,5% Πρόσθετα αποτελέσµατα: Στα 43 από τα 778 δείγµατα, ανιχνεύτηκαν περισσότερα από ένα είδη µε το LightCycler SeptiFast Test MG. Στα 32 από τα 778 δείγµατα, ανιχνεύτηκαν µυκητιακά είδη µε το LightCycler SeptiFast Test MG. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΗ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Παρεµβαλλόµενες Ουσίες Οι ακόλουθες ουσίες δεν αλληλεπιδρούν στην ανίχνευση του βακτηριακού και µυκητιακού DNA µε την παρούσα εξέταση. Πίνακας 8: Παρεµβαλλόµενες Ουσίες Αρ. Εµπορική Ονοµασία Ενεργό Συστατικό Κατασκευαστής 1x C max. 3x C max. Μονάδες 1 Piperacillin Πιπερακιλλίνη Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Κεφταζιντίµη GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Ιµιπενέµη/Σιλαστατίνη MSD Sharp & Dohme 0,27* 0,80* mg/ml 4 Tazobac Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Σιπροφλοξασίνη Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Βανκοµυκίνη Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Γενταµυκίνη Merck 80,0 240,0 µg/ml 8 Zyvoxid Λινεζολίδη Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Κλινδαµυκίνη Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Μετρονιδαζόλη Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Φλουκοναζόλη Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Κασποφουγγίνη MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Αµφοτερικίνη Β Bristol-Myers Squibb 20,0 60,0 µg/ml 14 Novalgin Μεταµιζόλη Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal εξαµεθαζόνη Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Κυταραβίνη cellpharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Νορεπινεφρίνη (Νοραδρεναλίνη) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Νιτρoγλυκερίνη Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium ratiopharm Ηπαρίνη ratiopharm 0,83 2,5 I.U./mL εν ήταν δυνατόν να χρησιµοποιηθεί C MAX (0,67) του διαλύµατος έγχυσης Zienam, λόγω σηµαντικής αραίωσης του δείγµατος. 13

14 Αναλυτική Ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία του LightCycler SeptiFast Test MG αναλύθηκε βάσει της ανάλυσης του ποσοστού ευστοχίας κάθε αναλυτή µίας σειράς αραιώσεων των 100, 30 και 3 CFU/mL σε αίµα µε EDTA (βλ. Πίνακα 9). Για όλα τα είδη λήφθηκε ελάχιστη ευαισθησία των 30 CFU/mL, εκτός από τα Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes και Candida glabrata (100 CFU/ml). Πίνακας 9: Είδη που εξετάστηκαν βάσει ανάλυσης ποσοστού ευστοχίας Στόχος Αρ. Θετικών/ Αρ. εξεταζόµενων Στόχος Αρ. Θετικών/ Αρ. εξεταζόµενων Συγκέντρωση [CFU/mL] Συγκέντρωση [CFU/mL] Acinetobacter baumannii 8/8 12/12 17/20 Klebsiella pneumoniae 8/8 12/12 16/20 Aspergillus fumigatus 8/8 12/12 20/20 Proteus mirabilis 8/8 12/12 20/20 Candida albicans 8/8 12/12 14/20 Pseudomonas aeruginosa 8/8 12/12 20/20 Candida glabrata 8/8 9/12 0/20 Serratia marcescens 8/8 12/12 20/20 Candida krusei 8/8 12/12 11/20 Staphylococcus aureus 8/8 12/12 15/20 Candida parapsilosis 8/8 12/12 17/20 Staphylococcus epidermidis 1 8/8 9/12 0/20 Candida tropicalis 8/8 12/12 14/20 Staphylococcus haemolyticus 1 8/8 6/12 0/20 Enterobacter aerogenes 8/8 12/12 10/20 Stenotrophomonas maltophilia 8/8 12/12 19/20 Enterobacter cloacae 8/8 12/12 15/20 Streptococcus pneumoniae 8/8 12/12 6/20 Enterococcus faecalis 8/8 12/12 17/20 Streptococcus agalactiae 2 8/8 11/12 2/20 Enterococcus faecium 8/8 12/12 13/20 Streptococcus pyogenes 2 8/8 8/12 0/20 Escherichia coli 8/8 12/12 20/20 Streptococcus mitis 2 8/8 12/12 13/20 Klebsiella oxytoca 8/8 12/12 17/20 1 Είδη που απαρτίζουν την οµάδα CoNS της λίστας SML στον Πίνακα 1. 2 Είδη που απαρτίζουν την οµάδα Streptococcus spp. της λίστας SML στον Πίνακα 1. Αναλυτική Ειδικότητα Συµπερίληψη Για να αποδειχτεί η οµοιοµορφία και η οµοιογένεια της περιοχής ITS στόχου, συλλέχθηκαν κλινικά µεµονωµένα στελέχη από διάφορες γεωγραφικές περιοχές της Ευρώπης (νότια, κεντρική, βόρεια) και των ΗΠΑ. Συνολικά 1548 µεµονωµένα στελέχη χαρακτηρίστηκαν µε µικροβιολογικές µεθόδους και εξετάστηκαν µε το LightCycler SeptiFast Test MG [βλ. Πίνακα 1, Κύρια Λίστα SeptiFast (SML)]. Στα στελέχη που συλλέχθηκαν από τις ΗΠΑ δεν συµπεριλήφθηκαν τα Aspergillus fumigatus, Candida krusei και Staphylococcus haemolyticus. Μεταξύ των οµάδων του Streptococcus spp. και των αρνητικών στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS), τα είδη που απεικονίζονται στον Πίνακα 10 θεωρήθηκαν θετικά µετά από εξέταση µε το LightCycler SeptiFast Test MG. Πίνακας 10: Τα είδη που αντιπροσωπεύουν τις οµάδες του Streptococcus spp. και των αρνητικών στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS) αντίστοιχα, θεωρήθηκαν θετικά µετά από εξέταση µε το LightCycler SeptiFast Test MG Streptococcus spp. Αρνητικοί στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS) S. anginosus S. hominis subsp. novobiosepticus S. bovis S. pasteuri S. constellatus S. warneri S. cristatus S. cohnii subsp. urealyticum S. gordonii S. hominis subsp. hominis S. intermedius S. lugdunensis S. milleri S. cohnii subsp. cohnii S. mitis S. capitis subsp. ureolyticus S. mutans S. capitis subsp. capitis S. oralis S. caprae S. parasanguinis S. saprophyticus S. salivarius S. saprophyticus subsp. saprophyticus S. sanguinis S. xylosus S. thermophilus S. vestibularis S. viridans 14

15 Αντιφατικά αποτελέσµατα βρέθηκαν σε ποσοστό µικρότερο από 1,2% όλων των αποτελεσµάτων. 5 από 128 στελέχη Enterobacter (aerogenes/cloacae) βρέθηκαν στελέχη όµοια µε τα Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) στην περιοχή ITS και ερµηνεύτηκαν ως Klebsiella (pneumoniae/oxytoca). Τα στελέχη Citrobacter freundii και Salmonella enterica ενδέχεται να είναι όµοια µε τα στελέχη Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) και E. coli αντίστοιχα εντός των περιοχών τους ITS και θα ερµηνευτούν ως Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) και E. coli, αντίστοιχα. 14 από 158 στελέχη Streptococcus viridans βρέθηκαν όµοια µε τα στελέχη Streptococcus pneumoniae εντός της περιοχής ITS και θα ερµηνευτούν ως S. pneumoniae. Σε σπάνιες περιπτώσεις δεν είναι δυνατή η ανίχνευση των στελεχών Klebsiella (pneumoniae/oxytoca), εάν µία µετάλλαξη εντός της αλληλουχίας στόχου προκαλέσει µετατόπιση του σηµείου τήξης. Αποκλειστικότητα Πίνακας 11: Όλα τα είδη που εξετάστηκαν βρέθηκαν αρνητικά σε κάθε ανάλυση Actinobacillus actinomycetemcomitans Corynebacterium jeikeium Mycoplasma pneumoniae Aeromonas hydrophila Cryptococcus neoformans Neisseria meningitidis Bacillus cereus Gemella haemolysans Pantoea agglomerans Bacteroides fragilis Haemophilus influenzae Peptostreptococcus magnus Bartonella henselae Histoplasma capsulatum Porphyromonas gingivalis Bordetella pertussis Legionella pneumophila Prevotella denticola Borrelia burgdorferi Listeria monocytogenes Propionibacterium acnes Burkholderia cepacia Moraxella (Branhamella) catarrhalis Proteus vulgaris Campylobacter jejuni Morganella morganii Yersinia enterocolitica Cardiobacterium hominis Mycobacterium fortuitum Clostridium perfringens Mycobacterium tuberculosis ΑΚΡΙΒΕΙΑ Η Ακρίβεια αξιολογήθηκε µε τη χρήση ολικού αίµατος µε αντιπηκτικό K-EDTA, στο οποίο προστέθηκαν εξωγενώς Serratia marcescens, Klebsiella oxytoca, Candida krusei και Enterococcus faecalisµέσης (10³ CFU/mL) και χαµηλής συγκεντρωσης (10² CFU/mL). Τα δείγµατα αναλύθηκαν σε 7 αντίγραφα χρησιµοποιώντας 6 όργανα και περισσότερους από 3 χειριστές σε 3 ηµέρες. Αναλύθηκαν οι κορυφές τήξης. Για την ακρίβεια εντός της ανάλυσης καθώς και µεταξύ των αναλύσεων, όλες οι κορυφές κυµάνθηκαν εντός +/- 1,5 C. ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ ΠΡΟΣ ΤΟΝ ΑΓΟΡΑΣΤΗ Η αγορά του παρόντος προϊόντος επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για ενίσχυση και ανίχνευση αλληλουχιών νουκλεϊκού οξέος για ανθρώπινη in Vitro διαγνωστική. Με το παρόν δεν παρέχεται καµία ευρεσιτεχνία γενικού τύπου ή άλλη άδεια οποιουδήποτε είδους εκτός από το παρόν συγκεκριµένο δικαίωµα χρήσης από αγορά. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: Suttorp N. Changing populations and future trends in the management of serious infections from: AIM website ( 5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition pp. 15

16 Ú Distributed by Κατασκευάζεται στη Γερµανία για τη: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics Indianapolis, IN USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: ) Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: ) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F Meylan Roche Diagnostics GmbH D Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I Milano Roche Diagnostics S.L. E Barcelona Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora C Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερµανία, Οι ονοµασίες ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, MAGNALYSER, FASTSTART, SEPTIFAST, HYBPROBE και AMPERASE είναι σήµατα κατατεθέντα της Roche. Η ονοµασία ROCHE RESPONSE CENTER είναι σήµα υπηρεσίας της Roche Η ονοµασία Amphotericin B είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της εταιρίας Bristol-Myers Squibb. Η ονοµασία Aquo-Trinitrosan είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της εταιρίας Merck & Co., Inc. Η ονοµασία ARA-cell είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της cell pharma GmbH. Η ονοµασία Arterenol είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Aventis Pharma Ltd. Η ονοµασία Cancidas είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της MSD Sharp & Dohme GmbH. Η ονοµασία Ciprobay είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Bayer AG. Η ονοµασία Dexahexal είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Hexal AG. Η ονοµασία Diflucan είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Pfizer Inc. Η ονοµασία Fortum είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της GlaxoSmithKline. Η ονοµασία Heparin-Natrium-5000-ratiopharm είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της ratiopharm International. Η ονοµασία InfectoClont είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Infectopharm GmbH. Η ονοµασία LTK-008 είναι σήµα κατατεθέν της biodelta, ZTB GmbH. Η ονοµασία MiniSpin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Eppendorf. Η ονοµασία Novalgin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Aventis Pharma Ltd. Η ονοµασία Piperacillin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Hexal AG. Η ονοµασία Refobacin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της εταιρίας Merck & Co., Inc. Η ονοµασία Sobelin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Pfizer Inc. Η ονοµασία Tazobac είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Wyeth Pharmaceuticals AG. Η ονοµασία Vancomycin είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Lilly Pharma Holding GmbH. Η ονοµασία Zienam είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της MSD Sharp & Dohme GmbH. Η ονοµασία Zyvoxid είναι κατοχυρωµένο σήµα κατατεθέν της Pfizer Inc. 2005, by Roche Molecular Systems, Inc. Με επιφύλαξη κάθε δικαιώµατος. 11/2005 ( ENGL)