artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο

Απρίλιος 2009 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 24 (Αρ.Καταλόγου 4518263) 96 (Αρ.Καταλόγου 4518265) Εκδοση 1 Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με όργανα Rotor-Gene Q 4518263, 4518265 1049309EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden R3 1049309EL Sample & Assay Technologies

Τεχνολογίες δείγματος και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής τεχνολογιών δειγμάτων και εξετάσεων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προϊόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι τα αποτελέσματα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα για: Απομόνωση του DNA, RNA και πρωτεϊνών Συστήματα εξετάσεων για νουκλεϊνικά οξέα και πρωτεΐνες Ερευνα microrna και RNAi Αυτοματοποίηση τεχνολογίας δειγμάτων και εξετάσεων Σκοπός μας είναι να σας δοθεί η δυνατότητα να έχετε έξοχες επιτυχίες και σημαντικές ανακαλύψεις. Για περισσότερες πληροφορίες επισκευθείτε την ιστοσελίδα www.qiagen.com.

Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 4 Σύμβολα 4 Αποθήκευση 5 Προοριζόμενη χρήση 5 Περιορισμοί χρήσης προїόντος 6 Τεχνική εξυπηρέτηση 6 Ποιοτικός έλεγχος 6 Πληροφορίες ασφάλειας 7 Εισαγωγή 8 Αρχή 8 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες 8 Ειδικά χαρακτηριστικά 9 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια 18 Σημαντικές σημειώσεις 19 Γενικά μέτρα ασφάλειας 19 Λήψη, φύλαξη και μεταφορά των δειγμάτων 19 Απομόνωση RNA 21 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου 21 Ποσοτικοποίηση 22 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση 23 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 33 Παραπομπές 36 Πληροφορίες παραγγελιών 37 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 3

Περιεχόμενα του κιτ artus HCV RG RT-PCR Kit (24) (96) Αρ. καταλόγου 4518263 4518265 Αριθμός αντιδράσεων 24 96 Μπλε Hep. C Virus RG Master A 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Μωβ Hep. C Virus RG Master B 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κόκκινο Hep. C Virus RG QS 1* (10 4 IU/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο Hep. C Virus RG QS 2* (10 3 IU/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο Hep. C Virus RG QS 3* (10 2 IU/µl) 200 µl 200 µl Κόκκινο Hep. C Virus RG QS 4* (10 1 IU/µl) 200 µl 200 µl Πράσινο Hep. C Virus RG IC 1000 µl 2 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl Εγχειρίδιο 1 1 * Πρότυπο ποσοτικοποίησης. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. Σύμβολα <N> Το περιεχόμενο επαρκεί για <N> τεστ Ημερομηνία λήξης Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά 4 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Περιεχόμενα Αριθμός Περιορισμοί θερμοκρασίας Νόμιμος κατασκευαστής Παραπομπή στις πληροφορίες που δίνονται στο εγχειρίδιο Σημαντικές οδηγίες Αποθήκευση Τα υλικά του artus HCV RG RT-PCR Kit αποθηκεύονται στους -20 C και διατηρούνται μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέττα. Επαναληπτική απόψυξη/ψύξη (>2x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με τον τρόπο αυτό μειώνεται η ευαισθησία. Εάν τα αντιδραστήρια δεν χρησιμοποιούνται τακτικά, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός τους. Αποθήκευση στους 2 8 C δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. Προοριζόμενη χρήση Το artus HCV RG RT-PCR Kit είναι ένα σύστημα πολλαπλασιασμού νουκλεϊνικών οξέων in vitro για τον ποσοτικό προσδιορισμό τουrna του HCV σε πλάσμα ανθρώπου. Το διαγνωστικό αυτό κιτ εξέτασης χρησιμοποιεί την αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) και είναι διαμορφωμένο για τη χρήση με τα όργανα Rotor-Gene Q. Η εξέταση μπορεί να προσδιορίσει ποσοτικά RNA του HCV πάνω από το όριο των 65 1 x 10 6 HCV IU/ml. Το artus HCV RG RT-PCR Kit δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τα όργανα Rotor-Gene Q 2plex. Το artus HCV RG RT-PCR Kit προορίζεται για τη χρήση σε συνδυασμό με κλινικές παρουσιάσεις και εργαστηριακές εξετάσεις στην πρόγνωση της ασθένειας και ως βοήθεια στην εξακρίβωση παρουσίας ιών στην αντιιοική θεραπευτική αγωγή όπως μετράται σε αλλαγές των επιπέδων του RNA του HCV στο EDTA-πλάσμα. Το artus HCV RG RT-PCR Kit δεν προορίζεται για χρήση ως ανιχνευτικό τεστ για το HCV ή ως διαγνωστικό τεστ για τη διαπίστωση της παρουσίας λοίμωξης από HCV. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 5

Περιορισμοί χρήσης προїόντος Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro. Η χρήση πρέπει να γίνεται από ειδικά εκπαιδευμένο και καταρτισμένο προσωπικό στις διαγνωστικές διαδικασίες in vitro (EN375). Η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. Προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στη συσκευασία και στις ετικέττες των επιμέρους στοιχείων. Τα αντιδραστήρια των οποίων έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Τεχνική εξυπηρέτηση Στη QIAGEN είμαστε υπερήφανοι για την ποιότητα και την διαθεσιμότητα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης. Το τμήμα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης είναι πλαισιωμένο με έμπειρους επιστήμονες με ευρεία πρακτική και θεωριτική γνώση στις τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου και τη χρήση προїόντων της QIAGEN. Εάν έχετε γενικά ερωτήσεις που αφορούν το artus HCV RG RT-PCR Kit ή προїόντα της QIAGEN, μην καθυστερείτε να έρθετε σε επαφή μαζί μας. Οι πελάτες της QIAGEN αποτελούν μια μεγάλη πηγή πληροφοριών όσον αφορά την προώθηση και τις ειδικές χρήσεις των προїόντων μας. Οι πληροφορίες αυτές είναι χρήσιμες για άλλους επιστήμονες καθώς και τους ερευνητές της QIAGEN. Για το λόγο αυτό λάβετε το θάρρος να επικοινωνήστε με μας εάν έχετε οποιεσδήποτε προτάσεις που αφορούν την παρουσίαση των προїόντων ή καινούργιες εφαρμογές κια τεχνικές. Για τεχνική εξυπηρέτηση και περισσότερες πληροφορίες παρακαλούμε επισκευθείτε το κέντρο τεχνικής υποστήριξής μας στην ιστοσελίδα www.qiagen.com/support ή τηλεφωνήστε μια από τις τεχνικές υπηρεσίες της QIAGEN ή τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλέπε το πίσω εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα www.qiagen.com ). Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το σύστημα πιστοποιητικού ποιοτικής διαχείρησης ISO της QIAGEN, ελέγχεται κάθε παρτίδα του artus HCV RG RT-PCR Kit υπό καθορισμένα κριτήρια ελέγχου, για την εξασφάλιση μιας ομοιόμορφης ποιότητας του προϊόντος. 6 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Πληροφορίες ασφάλειας Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs). Στην επιγραμμική συλλογή μας των φυλλαδίων δεδομένων ασφάλειας, στην ιστοσελίδα www.qiagen.com/support/msds.aspx μπορείτε να βρείτε για κάθε κιτ και κάθε περιεχόμενο του κιτ το εκάστοτε MSDS ως PDF αρχείο, το οποίο μπορείτε να διαβάζετε και να εκτυπώνετε. Καταστρέψτε τα απορρίματα δειγμάτων και ανάλυσης σύμφωνα με τους κανονισμούς σας ασφάλειας. Κλήση κινδύνου σε 24ωρη βάση Σε περίπτωση κινδύνου μπορείτε να πάρετε ιατρικές πληροφορίες όλο το 24ωρο στην αγγλική, γαλλική και γερμανική γλώσσα: Κέντρο πληροφοριών δηλητηριάσεων στο Mainz, Γερμανία Tel: +49-6131-19240 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 7

Εισαγωγή To artus HCV RG RT-PCR Kit είναι ένα σύστημα έτοιμο προς χρήση για την ανίχνευση του RNA του HCV μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στα όργανα Rotor-Gene Q. To Hep. C Virus RG Master Α και Β περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για την για την αντίστροφη μεταγραφή τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 240 bp, του γονιδιώματος του HCV καθώς και για την άμεση ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.FAM (πηγή 470 nm, ανιχνευτής 510 nm) του Rotor-Gene 3000. Πέραν αυτού, το artus HCV RG RT-PCR Kit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Orange του Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού A.ROX (πηγή 585 nm, ανιχνευτής 610 nm) του Rotor-Gene 3000. Το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής RT-PCR του HCV δεν επηρεάζεται αρνητικά (βλέπε Αναλυτική ευαισθησία, σελίδα 9). Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (Hep. C Virus RG QS 1-4), με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός της ποσότητας του παθογόνου παράγοντα. Ανατρέξτε σχετικά στην ενότητα Ποσοτικοποίηση, σελίδα 22. Αρχή Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού, κατά την εξέλιξη της PCR (που σημαίνει πραγματικού χρόνου), επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR.* Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Η ηπατίτιδα C είναι μία φλεγμονή του ήπατος, η οποία προκαλείται από τη μόλυνση με τον ομώνυμο ιό. Σε αντίθεση με τους άλλους ιούς της ηπατίτιδας, A, B, D και E, η μόλυνση από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) οδηγεί σε πολλές περιπτώσεις σε χρόνια ηπατική νόσο. Συχνά, η μόλυνση από τον HCV δεν προκαλεί σωματικές ενοχλήσεις για μεγάλο χρονικό διάστημα. Για το λόγο αυτόν, οι περισσότεροι από όσους έχουν προσβληθεί από τον ιό δεν το γνωρίζουν καθόλου. Η θεραπεία είναι αποτελεσματικότερη, εάν ξεκινήσει από την αρχική φάση της ασθένειας. Η μοναδική αποδεδειγμένα δραστική αγωγή σήμερα είναι η χορήγηση ιντερφερόνης α (ενδεχομένως σε συνδυασμό με ριμπαβιρίνη). Ωστόσο είναι επίσης γνωστό ότι μόνο σε ένα μέρος των περιπτώσεων χρόνιας ηπατίτιδας C υπάρχει ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπεία με ιντερφερόνη. Σε ορισμένες περιπτώσεις, αυτό έχει ως * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. 8 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

αποτέλεσμα την άσκοπη υποβολή των ασθενών σε μία αγωγή, η οποία αφενός είναι ιδιαίτερα δαπανηρή, και αφετέρου μπορεί να έχει εν μέρει σημαντικές παρενέργειες όπως εξασθένιση του ανοσοποιητικού συστήματος και επιδείνωση (π.χ. επιχείλιος έρπης, έρπης ζωστήρ). Ειδικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία Για τον προσδιορισμό της αναλυτικής ευαισθησίας του artus HCV RG RT-PCR Kit δημιουργήθηκε μία πρότυπη σειρά αραιώσεων από 10 ως την ονομαστική τιμή 0,0316 IU/µl μεταγραφημένων αντιγράφων RNA in vitro και αναλύθηκε με το artus HCV RG RT-PCR Kit. Οι έλεγχοι εκτελέστηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Tο αναλυτικό όριο ανίχνευσης του artus HCV RG RT-PCR Kit βρίσκεται στις 0,19 IU/µl (p = 0,05). Αυτό σημαίνει ότι 0,19 IU/µl μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95%. Η αναλυτική ευαισθησία, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (QIAamp DSP Virus Kit) του artus HCV RG RT-PCR Kit στα όργανα Rotor-Gene, καθορίστηκε με μία πρότυπη σειρά αραιώσεων του WHO International HCV RNA Standard από 500 ως την ονομαστική τιμή 5 IU/ml του HCV σε κλινικά δείγματα πλάσματος. Αυτά υποβλήθηκαν σε απομόνωση RNA με το QIAamp DSP Virus Kit (όγκος εκχύλισης: 0,5 ml, όγκος έκλουσης: 25 μl). Κάθε ένα από τα εννέα στάδια αραίωσης αναλύθηκε σε τρεις διαφορετικές ημέρες, με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών, με τη βοήθεια του artus HCV RG RT-PCR Kit. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Η γραφική της αξιολόγηση εμφανίζεται στην Εικόνα 1. Επομένως, το αναλυτικό όριο ανίχνευσης, λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση του artus HCV RG RT-PCR Kit σε συνδυασμό με τα όργανα Rotor-Gene, βρίσκεται κατά συνέπεια στις 33,6 IU/ml (p = 0.05). Αυτό σημαίνει ότι 33,6 IU/ml μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95%. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 9

Εικόνα 1. Ανάλυση probit: HCV (Rotor-Gene 3000). Αναλυτική ευαισθησία του λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση (QIAamp DSP Virus Kit, QIAGEN) artus HCV RG RT- PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene 3000. Ειδικότητα Η ειδικότητα του artus HCV RG RT-PCR Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο έχει ελεγχθεί και η δυνατότητα ανίχνευσης των σχετικών υποτύπων και γονοτύπων. Επιπλέον,η ειδικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση 100 διαφορετικών δειγμάτων πλάσματος, τα οποία ήταν αρνητικά στον HCV. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για HCV εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στους Hep. C Virus RG Masters. Μία ενδεχόμενη διασταυρωμένη αντίδραση του artus HCV RG RT-PCR Kit, εξετάστηκε με τη χρήση της ομάδας ελέγχου που αναφέρεται στον Πίνακα 1. Κανένας απο τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Καμμία διασταυρωμένη αντίδραση δεν εμφανίστηκε με μικτές λοιμώξεις. 10 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Πίνακας 1. Ειδικός έλεγχος σχετικών γονοτύπων Ιός ηπατίτιδας C Γονότυπος Προμηθευτής Ιός ηπατίτιδας C 1 NIBSC,HemaCare, University of Essen HCV (Cycling Green/ A.FAM) Πρότυπο εσωτερικο ύ ελέγχου (Cycling Green/ A.FAM)) + + Ιός ηπατίτιδας C 2 NIBSC,HemaCare, University of Essen + + Ιός ηπατίτιδας C 3 NIBSC,HemaCare, University of Essen + + Ιός ηπατίτιδας C 4 NIBSC, HemaCare, University of Essen + + Ιός ηπατίτιδας C 5 NIBSC, HemaCare, University of Essen + + Ιός ηπατίτιδας C 6 NIBSC, HemaCare, University of Essen + + Πίνακας 2. Ειδικός έλεγχος του κιτ με δυνητικά διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες Ομάδα ελέγχου Ανθρώπινος ιός ανοσολογικής ανεπάρκειας 1 HCV (Cycling Green/ A.FAM)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Orange/ A.ROX)) + Ιός ηπατίτιδας Α + Ιός ηπατίτιδας B + Ανθρώπινος ερπητοϊός 1 (ιός απλού έρπητα 1) Ανθρώπινος ερπητοϊός 2 (ιός απλού έρπητα 2) Ανθρώπινος ερπητοϊός 3 (ιός ανεμοβλογιάς-έρπητα ζωστήρα) Ανθρώπινος ερπητοϊός 5 (κυτταρομεγαλοϊός) Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα + + + + artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 11

Πίνακας 2. Συνέχεια Ομάδα ελέγχου Ανθρώπινος ιός λευχαιμίας των T κυττάρων τύπος 1 και τύπος 2 HCV (Cycling Green/ A.FAM)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Orange/ A.ROX)) + Ανθρώπινος ερπητοϊός 6Α + Ανθρώπινος ερπητοϊός 6Β + Ανθρώπινος ερπητοϊός 8 (Σάρκωμα Kaposi s ερπητοϊός) + Εντεροϊός + Παρβοϊός B19 + Δάγγειος ιός + Κίτρινος πυρετός + Aspergillus flavus + Aspergillus fumigatus + Candida albicans + Chlamydia trachomatis + Cryptosporidium parvum + Filobasidiella neoformans + Mycoplasma pneumoniae + Pneumocystis cariniie + Staphylococcus sp. + Streptococcus agalactiae + Staphylococcus aureus + Streptococcus pyogenes + Γραμμικό εύρος Το γραμμικό εύρος της ποσοτικοποίησης (αναλυτική μέτρηση) του artus HCV RG RT-PCR Kit προσδιορίστηκε μέσω της ανάλυσης μιας σειράς αραιώσεων του μεταγραφημένου in vitro HCV, σε όρια συγκέντρωσης από 1 x 10 7 IU/µl μέχρι 1 IU/µl. Προηγουμένως έγινε βαθμονόμηση της σειράς αραιώσεων έναντι του WHO International HCV RNA Standard. 12 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Κάθε αραίωση εξετάσθηκε πολλαπλώς (n = 8) με το artus HCV RG RT-PCR Kit στα όργανα Rotor-Gene. Το γραμμικό εύρος του artus HCV RG RT-PCR Kit καλύπτει επομένως συγκεντρώσεις από 1 IU /µl μέχρι τουλάχιστον 1 x 10 7 IU/µl. Το γραμμικό εύρος λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση του artus HCV RG RT-PCR Kit, καθορίστηκε με την ανάλυση δειγμάτων από το Acrometrix. Η απομόνωση έγινε πολλαπλώς (n = 6) από 50 IU/ml μέχρι 10 3 IU/ml και (n = 4) από 5 x 10 3 IU/ml μέχρι 10 6 IU/ml χρησημοποιώντας το QIAamp DSP Virus Kit (όγκος εκχύλισης: 0,5 ml, όγκος έκλουσης: 25 µl). Κάθε ένα από τα δείγματα αναλύθηκαν χρησημοποιώντας το artus HCV RG RT-PCR Kit στα όργανα Rotor-Gene. Το γραμμικό εύρος λαμβάνοντας υπόψη την απομόνωση του artus HCV RG RT-PCR Kit καθορίσθηκε να καλύπτει συγκεντρώσεις από 65 IU/ml μέχρι τουλάχιστον 1 x 10 6 IU/ml (βλέπε Εικόνα 2). Εικόνα 2. Γραμμικό εύρος του artus HCV RG RT-PCR Kit. Υπολογισμός του γραμμικού εύρους της ποσοτικοποίησης. Η ευθεία καθορίστηκε μέσω μιας γραμμικής παλινδρόμησης των λογ10 υπολογισθέντων συγκεντρώσεων με τις λογ10 ονομαστικές συγκεντρώσεις. Η εξίσωση της ευθείας παλινδρόμησης περιέχεται στην εικόνα. Ακρίβεια Τα δεδομένα ακριβείας, για το artus HCV RG RT-PCR Kit, συνελέχθηκαν μέσω των οργάνων Rotor-Gene και επιτρέπουν την εξακρίβωση της ολικής διακύμανσης (ολική διασπορά) του συστήματος ανάλυσης. H ολική διακύμανση προέρχεται από την μεταβλητότητα intra-assay (διασπορά δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης μέσα σε ένα πείραμα), την μεταβλητότητα inter-assay (διασπορά λόγω της χρήσης διαφόρων συσκευών του ίδιου τύπου από διάφορα άτομα εντός ενός εργαστηρίου) και την μεταβλητότητα inter-batch (διασπορά μέσω της χρήσης διαφορετικών παρτίδων). Συγχρόνως υπολογίζεται κάθε φορά η τυπική απόκλιση, η διακύμανση και ο συντελεστής μεταβλητότητας για την PCR του συγκεκριμένου παθογόνου παράγοντα και προτύπου εσωτερικού ελέγχου. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 13

Τα δεδομένα αυτά συνελέχθηκαν, για το artus HCV RG RT-PCR Kit, βάσει του προτύπου ποσοτικοποίησης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση (QS 4: 10 IU/µl). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε βάσει των τιμών C T των καμπύλων πολλαπλασιασμού. (C T : threshold cycle, βλέπε Πίνακας 3). Τα δεδομένα ακρίβειας για ποσοτικά αποτερλέσματα σε IU/µl προσδιορίσθηκαν ξεχωριστά με τη χρήση των αντιστοίχων τιμών Ct ( βλέπε Πίνακας 4). Βάσει των αποτελεσμάτων αυτών η ολική διασπορά ενός τυχαίου δείγματος της αναφερομένης συγκέντρωσης ανέρχεται στο 1,52% (C T ) ή 25,71% (συγκέντρωση) και για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο 0,75% (C T ). Οι τιμές αυτές βασίζονται στο σύνολο των επιμέρους τιμών των εξεταζομένων μεταβλητοτήτων. Πίνακας 3 : Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των τιμών C T. Intra-assay μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG QS 4 Intra-assay μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG IC Inter-assay μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG IC Inter-batch μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG IC Ολική διακύμανση: Hep. C Virus RG QS 4 Ολική διακύμανση: Hep. C Virus RG IC Τιμή C T Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας [%] 32,81 0,09 0,28 30,04 0,08 0,27 32,14 0,5 1,57 30,23 0,22 0,71 32,56 0,48 1,46 30,28 0,24 0,78 32,41 0,49 1,52 30,29 0,29 0,75 14 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Πίνακας 4. Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των ποσοτικών τιμών (σε IU/µl). Intra-assay μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: Hep. C Virus RG QS 4 Ολική διακύμανση: Hep. C Virus RG QS 4 Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας [%] 0,64 0,41 6,34 1,00 1,00 9,93 3,92 15,34 37,35 2,63 6,93 25,71 Ανθεκτικότητα Ο έλεγχος της ανθεκτικότητας επιτρέπει τον προσδιορισμό του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus HCV RG RT-PCR Kit. 100 αρνητικά στον HCV δείγματα πλάσματος αναμίχθηκαν με 2 IU/µl όγκου έκλουσης του του προτύπου RNA του HCV (περίπου τριπλή συγκέντρωση των αναλυτικών ορίων ευαισθησίας). Μετά την εκχύλιση με το QIAamp DSP Virus Kit τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με το HCV RG RT-PCR Kit. Το ποσοστό αποτυχίας για όλα τα δείγματα του HCV ανήλθε στο 0%. Επιπλέον,η ανθεκτικότητα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ελέγχθηκε μέσω της απομόνωσης και της ανάλυσης 100 αρνητικών στον HCV δειγμάτων πλάσματος. Το συνολικό ποσοστό αποτυχίας ανήλθε στο 0%. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Έτσι η ανθεκτικότητα του artus HCV RG RT-PCR Kit ανέρχεται στο 99%. Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα της επαναληψιμότητας, επιτρέπουν μια τακτική αξιολόγηση της απόδοσης του artus HCV RG RT-PCR Kit καθώς και σύγκριση της απόδοσής του με άλλα προϊόντα. Τα δεδομένα αυτά αποκτώνται με τη συμμετοχή σε καθιερωμένα ειδικά προγράμματα. Διαγνωστική αξιολόγηση Το artus HCV RG RT-PCR Kit αξιολογήθηκε σε μία μελέτη. Για τη σύγκριση του artus HCV RG RT-PCR Kit με το TaqMan HCV Test, εξετάσθηκαν 276 αναδρομικά δείγματα πλάσματος. Ολα τα δείγματα πλάσματος εξετάσθηκαν προηγουμένως για το αν είναι θετικά ή αρνητικά με το διαγνωστικό τεστ COBAS TaqMan HCV. Το RNA του HCV για τη εξέταση του artus HCV RG RT-PCR Kit απομονώθηκε με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit και η ανάλυση έγινε με το Rotor-Gene 6000. Για το συγκριτικό τεστ με το COBAS TaqMan HCV Test, το RNA του HCV αναλύθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή που περιέχονται στη συσκευασία. Τα αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με τη χρήση του artus HCV RG RT-PCR Kit artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 15

συγκρίθηκαν με εκείνα του COBAS TaqMan HCV Test (βλέπε Πίνακα 5 και Εικόνα 3). 137 από139 δείγματα που εξετάσθηκαν θετικά με το COBAS TaqMan HCV Test, ήταν θετικά και με το artus HCV RG RT-PCR Kit. Ολα τα 137 δείγματα που εξετάσθηκαν αρνητικά με το COBAS TaqMan HCV Test, ήταν αρνητικά και με το artus HCV RG RT-PCR Kit. Εάν τα αποτελέσματα με το COBAS TaqMan HCV Test ληφθούν ως αναφορά, η διαγνωστική ευαισθησία είναι 100%, και η διαγνωστική ειδικότητα είναι 98,6%. Πίνακας 5. Αποτελέσματα των 276 αναδρομικά αναλυθέντων δειγμάτων EDTAπλάσματος COBAS TaqMan HCV Test + Αθροισμα artus HCV RG RT-PCR Kit + 137 2 139 0 137 137 16 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Σύγκριση του COBAS TaqMan HCV Test με το artus HCV RG RT-PCR Kit Εικόνα 3. Σύγκριση του COBAS TaqMan HCV Test (Roche, HCV: με απομόνωση δείγματος με τη χρήση του συστήματος COBAS AmpliPrep) με το artus HCV RG RT-PCR Kit (Qiagen, HCV: με απομόνωση δείγματος με τη χρήση του QIAamp DSP Virus Kit). Συσχέτιση των ποσοτικών αποτελεσμάτων και των δύο συστημάτων ανάλυσης (Πίνακας 5) έγινε με τη βοήθεια γραμμικής παλινδρόμησης. Τα λογαριθμικά αποτελέσματα των δύο κιτ προβάλονται σε ένα XY (διασπορά) διάγραμμα με λογ λογ κλίμακα. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 17

Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. Κιτ απομόνωσης RNA (βλέπε Απομόνωση RNΑ, σελίδα 21) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Οργανο Rotor-Gene Q ή Rotor-Gene* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και Cycling Orange ή με κανάλια φθορισμού για Cycling A.FAM και Cycling A.ROX Rotor-Gene Q software version 1.7.94 (Rotor-Gene 6000 software version 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94: Rotor-Gene 3000 software version 6.0.23) Σειρές σωληναρίων και καλλυμάτων, 0,1 ml, για τη χρήση με κεφαλή 72 υποδοχών (αριθ.κατ. 981103 ή 981106) Προαιρετικά: Σωληνάρια PCR, 0,2 ml, for για τη χρήση με κεφαλή 36 υποδοχών (αριθ.κατ. 981005 ή 981008) Μονάδα ψύξης (Loading Block 72 x 0,1 ml σωληναρίων, αριθ.κατ. 9018901 ή Loading Block 96 x 0,2 ml σωληναρίων, αριθ.κατ. 9018905) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα ελέγχονται, συντηρούνται και βαθμονομούνται τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Το artus HCV RG RT-PCR Kit δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τα όργανα Rotor-Gene Q 2plex 18 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Σημαντικές σημειώσεις Γενικά μέτρα ασφάλειας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου(15 25 C), πριν αρχίσετε μια διαδικασία. Μετά την απόψυξη, ανάμιξη των υλικών (με επαναληπτική αναρρόφηση με πιπέτα ή με γρήγορο στροβιλισμό) και σύντομη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μονάδα ψύξης (72/96 well loading block). Λήψη, φύλαξη και μεταφορά των δειγμάτων Όλα τα δείγματα πρέπει να χειρίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά. Επιτρέπονται μόνο τα ακόλουθα είδη δειγμάτων, για τα οποία οι ακόλουθοι κανόνες και ειδικές οδηγίες σχετικά με τη συλλογή, μεταφορά και αποθήκευση, πρέπει να τηρούνται αυστηρά. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι το EDTA ή κιτρικό πλάσμα ως το καταλληλότερο υλικό δείγματος για την ανίχνευση του HCV. Για αυτό το λόγο συνιστούμε τη χρήση των υλικών αυτών με το artus HCV RG RT-PCR Kit. Η εγκυρότητα του artus HCV RG RT-PCR Kit έγινε με τη χρήση δειγμάτων EDTAπλάσματος ανθρώπου. Δείγματα άλλων υλικών δεν ενδεικνύονται. Χρησιμοποιήστε μόνο το προτεινόμενο κιτ απομόνωσης νουκλεϊνικού οξέος (βλέπε Απομόνωση RNA, σελίδα 21) για την προετοιμασία των δειγμάτων. Για την ασφαλή χρήση υλικών δειγμάτων πρέπει να ακολουθούνται αυστηρά ειδικές οδηγίες που αφορούν τη συλλογή, φύλαξη και τη μεταφορά των δειγμάτων. Δειγματοληψία Κάθε αιματοληψία έχει σαν αποτέλεσμα τον τραυματισμό αιματοφόρων αγγείων (αρτηρίες, φλέβες, τριχοειδή αγγεία). Επιτρέπεται μόνο η χρήση άψογου και αποστειρωμένου υλικού. Για τη λήψη αίματος διατίθενται υλικά μιας χρήσης. Κατά την παρακέντηση των φλεβών δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται πολύ λεπτές βελόνες. Η φλεβική αιματοληψία πρέπει να γίνεται σε κατάλληλα σημεία της περιοχής του εσωτερικού του αγκώνα, του αντιβραχίου ή του μετακαρπίου. Το αίμα παραλαμβάνεται με τυποποιημένα σωληνάρια (κόκκινο κάλυμμα, Sarstedt ή ομοιότυπα σωληνάρια άλλου κατασκευαστή). Πρέπει να παραλαμβάνονται 5-10 ml μίγματος EDTA-αίματος. Τα σωληνάρια πρέπει, αμέσως μετά την παραλαβή του αίματος, να αναμειγνύονται με αναστροφή πολλές φορές (8x, όχι ανατάραξη). artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 19

Δείγματα από άτομα που λαμβάνουν ηπαρίνη δεν πρέπει να ελέγχονται (βλέπε Ανεπιθύμητες ουσίες, σελίδα 20). Φύλαξη δειγμάτων Το ολικό αίμα θα πρέπει να διαχωρισθεί στο πλάσμα και τα κυτταρικά του στοιχεία μέσα σε διάστημα έξι ωρών, με φυγοκέντρηση στους 800 1.600 x g για 20 λεπτά. Το διαχωρισμένο πλάσμα πρέπει να μεταφερθεί σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου. Η ευαισθησία της εξέτασης μπορεί να μειωθεί μέσω επαναληπτικής κατάψυξης ή μακροχρόνιας φύλαξης των δειγμάτων. Το RNA που περιέχεται στον ιό διατηρείται σταθερό στους +4 C για ημέρες, στους -20 C για εβδομάδες και στους -70 C για μήνες ή χρόνια. * Μεταφορά δειγμάτων Το υλικό των δειγμάτων θα πρέπει βασικά να αποστέλλεται σε μη εύθραυστα δοχεία, για να αποφεύγεται μία πιθανή μόλυνση από διαρροή του δείγματος. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται σύμφωνα με τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά με τη μεταφορά παθογόνου υλικού. Ο χρόνος μεταφοράς δεν πρέπει να υπερβεί τις έξι ώρες. Δεν συνιστάται αποθήκευση των δειγμάτων στον τόπο λήψης τους. Ταχυδρομική αποστολή είναι δυνατή. Στο σημείο αυτό πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι νομικές υποδείξεις. Συνιστούμε την μεταφορά των δειγμάτων με υπηρεσία courier. Τα δείγματα αίματος πρέπει να αποστέλλονται υπό ψύξη (+2 C μέχρι +8 C) και του πλάσματος υπό κατάψυξη (-15 C μέχρι 30 C). Ανεπιθύμητες ουσίες Υψηλές τιμές χολερυθρίνης ( 15 mg/dl) και λιπιδίων ( 800 mg/dl) καθώς και αιμολυτικά δείγματα δεν επηρεάζουν καθόλου το αναλυτικό σύστημα. Η ηπαρίνη ( 10 IU/ml) επηρεάζει την PCR. Δείγματα, τα οποία συλλέχθηκαν σε σωληνάρια που περιείχαν ηπαρίνη ως αντιπηκτικό, δεν ενδείκνυνται. Επίσης δείγματα από πρόσωπα που λαμβάνουν ηπαρίνη δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. * Arbeitskreis Blut, V17 (09.1997), Bundesgesundheitsblatt 11/1997, p. 452 456. International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 20 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Απομόνωση RNA Το QIAamp DSP Virus Kit (QIAGEN, αριθ.κατ. 60704) είναι επικυρωμένο για τον καθαρισμό RNA του ιού από πλάσμα ανθρώπου με τη χρήση του artus HCV RG RT- PCR Kit. Εκτελέστε τον καθαρισμό του RNA του ιού σύμφωνα με τις οδηγίες του QIAamp DSP Virus Kit Handbook. Η προσθήκη του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της απομόνωσης και επομένως για την απόδοση του DNA/RNA. Για να επιτύχουμε υψηλότερη σταθερότητα του φορέα RNA, ο οποίος παρέχεται μαζί με το QIAamp DSP Virus Kit, ακολουθήστε τις οδηγίες για την νέα παρασκευή και αποθήκευση του φορέα RNA που περιέχονται στο σχετικό εγχειρίδιο ( Preparing reagents and buffers ). Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus HCV RG RT-PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου, παρακάτω). Βεβαιωθείτε ότι ένα αρνητικό δείγμα πλάσματος περιλαμβάνεται στη διαδικασία απομόνωσης. Το σήμα του εντός αυτού περιεχομένου προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποτελεί τη βάση για την αξιολόγηση της απομόνωσης. Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Hep. C Virus RG IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του RNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το QIAamp DSP Virus Kit, το RNA εκλούεται σε 60 µl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (ΑVΕ). Συνεπώς, αρχικά προστίθενται 6 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και εάν είναι απαραίτητο ο φορέας RNA (βλέπε Απομόνωση RNA, παραπάνω) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης). Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Προαιρετικά, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR. Για το σκοπό αυτό, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο μίγμα του Hep. C artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 21

Virus RG Master A και Hep. C Virus RG Master B, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 24). Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (Hep. C Virus RG QS 1-4) χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και εισάγονται στον ίδιο όγκο (20 µl). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης στα όργανα Rotor-Gene, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και τα τέσσερα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και να ορισθούν ως πρότυπα στο στο πλαίσιο διαλόγου Edit Samples με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις (βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου). Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως IU/µl *. Για τη μετατροπή των τιμών που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη σε IU/ml υλικού δείγματος πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσμα (IU/ml) = Αποτέλεσμα IU/µl x Όγκος έκλουσης (µl) Όγκος δείγματος (ml) Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την εκχύλιση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). Σχετικές οδηγίες για την ποσοτική ανάλυση παθογόνων στα ανιχνευτικά συστήματα των οργάνων Rotor-Gene διατίθενται από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ( Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments ). * Το πρότυπο βαθμονομήθηκε με τη χρήση του 1st International HBV standard (WHO). 22 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση Σημαντικές υποδείξεις πριν από την εκκίνηση Πριν αρχίσετε τη διαδικασία, διαβάστε Σημαντικές σημειώσεις, σελίδες 19-22. Εξοικονομήστε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το όργανο Rotor-Gene Q πριν αρχίσετε με το πρωτόκολλο. Βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Σιγουρευτείτε ότι σε κάθε ανάλυση PCR συμπεριλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης καθώς και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιήστε και τα τέσσερα πρότυπα ποσοτικοποίησης που παρέχονται για κάθε ανάλυση PCR (Hep. C Virus RG QS 1-4). Τι πρέπει να γίνει πριν από την εκκίνηση Βεβαιωθείτε ότι η μονάδα ψύξης (εξάρτημα του Rotor-Gene Q) έχει προψυχθεί περίπου στους 2 8 C. Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης, να αναμιγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και τελικά να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. Εκτέλεση 1. Τοποθετήστε τον αριθμό σωληναρίων PCR στις υποδοχές της μονάδας ψύξης. 2. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου για την επιτήρηση της διαδικασίας απομόνωσης του RNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2a. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου επιλεκτικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2b. 2a. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου έχει ήδη προστεθεί στην απομόνωση (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου, σελίδα 21). Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον Πίνακα 6. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 23

Πίνακας 6. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου για την επιτήρηση της απομόνωσης του RNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR). Αριθμός δειγμάτων 1 12 Hep. C Virus RG Master A 12 µl 144 µl Hep. C Virus RG Master B 18 µl 216 µl Hep. C Virus RG IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 30 µl 360 µl 2b. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο μίγμα του Hep. C Virus RG Master A και Hep. C Virus RG Master Β. Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον Πίνακα 7. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. Πίνακας 7. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 Hep. C Virus RG Master A 12 µl 144 µl Hep. C Virus RG Master B 18 µl 216 µl Hep. C Virus RG IC 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 32 µl* 384 µl* * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 3. Εισάγετε με πιπέτα σε κάθε σωληνάριο PCR 30 μl του master mix. Στη συνέχεια εισάγετε 20 µl από το εκλούμενο RNA του (βλέπε Πίνακα 8). Αντίστοιχα πρέπει να προστεθούν ως θετικό πρότυπο ελέγχου 20 µl από ένα τουλάχιστον πρότυπο ποσοτικοποίησης (Hep. C Virus RG QS 1-4) και ως αρνητικό πρότυπο ελέγχου 20 µl νερό (Water, PCR grade). 24 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Πίνακας 8. Παρασκευή αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Master mix 30 µl 30 µl για κάθε ένα Δείγμα 20 µl 20 µl για κάθε ένα Συνολικός όγκος 50 μl 50 µl για κάθε ένα 4. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Λάβετε υπόψη ότι στην κεφαλή θα πρέπει να τοποθετείται ένας δακτύλιος ασφάλειας (εξάρτημα του Rotor-Gene), για να εμποδίζεται το τυχαίο άνοιγμα των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. 5. Για την ανίχνευση του RNA του HCV δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα εργασίας. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων PCR Εικόνα 4, 5, 6 Αντίστροφη μεταγραφή του RNA Εικόνα 7 Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start Εικόνα 8 Πολλαπλασιασμός του cdna Εικόνα 9 Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού Εικόνα 10 Εκκίνηση της διαδικασίας Εικόνα 11 Ολες οι τεχνικές προδιαγραφές αναφέρονται στο Rotor-Gene Q έκδοση λογισμικού 1.7.94 και Rotor-Gene 6000 εκδόσεις λογισμικού 1.7.65, 1.7.87 1.7.94 και Rotor-Gene 3000 έκδοση λογισμικού 6.0.23. Παρακαλούμε βρείτε περαιτέρω πληροφορίες πάνω στον προγραμματισμό των οργάνων Rotor-Gene στο εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Στις απεικονίσεις αυτές οι ρυθμίσεις πλαισιόνονται με έντονο μαύρο. Για τα όργανα Rotor-Gene Q περιλαμβάνονται απεικονίσεις. Οπου απαιτούνται διαφορετικές τιμές για το Rotor-Gene 3000, οι διαφορές αυτές περιγράφονται στο κείμενο. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 25

6. Αρχικά, ανοίξτε το πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 4). Ελέγξτε το πλαίσιο Locking Ring Attached και πατήστε Next. Εικόνα 4. Πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard. 7. Επιλέξτε 50 για τον όγκο αντίδρασης της PCR και πατήστε Next (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων. 26 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

8. Πατήστε το κουμπί Edit Profile στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 6), και προγραμματείστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως φαίνεται στις εικόνες 6 9. Εικόνα 6. Επεξεργασία του προφίλ Εικόνα 7. Αντίστροφη μεταγραφή του RNA. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 27

Εικόνα 8. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start. Εικόνα 9. Πολλαπλασιασμός του cdna. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr, ROX. 28 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

9. Η περιοχή ανίχνευσης των καναλιών φθορισμού πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με τις εντάσεις φθορισμού στα σωληνάρια της PCR. Πατήστε Gain Optimisation στο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (βλέπε Εικόνα 6) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου Auto-Gain Optimisation Setup. Ορίστε τη θερμοκρασία ένδειξης στους 50 για να αντιπαραθέσετε τη θερμοκρασία υβριδισμού στο πρόγραμμα πολλαπλασιασμού (Εικόνα 10). Εικόνα 10. Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr και ROX. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 29

10. Οι τιμές gain που εξάγονται από τη βαθμονόμηση του καναλιού αποθηκεύονται αυτόματα και εμφανίζονται στο τελευταίο παράθυρο μενού του προγραμματισμού (βλέπε Εικόνα 11). Πατήστε Start Run. Εικόνα 11. Εκκίνηση της διαδικασίας Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr και ROX. 11. Μετά το τέλος της διαδικασίας, αναλύστε τα δεδομένα. Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα (11a, 11b και 11c). Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR εμφανίζονται στις εικόνες 12 και 13. Ο πίνακας 9 παρουσιάζει καθοδηγητικές γραμμές για την ερμηνεία των ποσοτικών αποτελεσμάτων. 11a. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει RNA του HCV. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι Cycling Orange είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του RNA του HCV (θετικό σήμα στο κανάλι Cycling Green) ενδέχεται να οδηγούν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Orange (Ανταγωνισμός). Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM για θετικό σήμα και Cycling A.ROX για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. 11b. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Τον ίδιο χρόνο, εμφανίζεται ένα σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Orange. Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο RNA του HCV. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. 30 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Όταν η RT-PCR του HCV είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της RT-PCR. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM για θετικό σήμα και Cycling A.ROX για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. 11c. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια Cycling Green ή Cycling Orange. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, σελίδα 33. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM και Cycling A.ROX. Εικόνα 12. Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (Hep. C Virus RG QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. NTC: No template control (αρνητικό πρότυπο). artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 31

Εικόνα 13. Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Orange με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (Hep. C Virus RG QS 1-4). NTC: No template control (αρνητικό πρότυπο). Πίνακας 9: Ερμηνεία των ποσοτικών αποτελεσμάτων. Αποτέλεσμα HCV RNA >34 IU/ml HCV RNA <34 IU/ml HCV RNA αρνητικό Ερμηνεία Το αποτέλεσμα ευρίσκεται εντός των καθορισμένων ορίων του τεστ. Η πιθανότητα ανίχνευσης του RNA του HCV είναι > 95%. Το θετικό αποτέλεσμα του τεστ είναι στατιστικά διασφαλισμένο. Το αποτέλεσμα ευρίσκεται εκτός των καθορισμένων ορίων του τεστ. Η αναπαραγωγή του θετικού αποτελέσματος δεν είναι σίγουρη. Δεν ανιχνεύθηκε RNA του HCV. 32 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Στον οδηγό αυτό αντιμετώπισης προβλημάτων θα βρείτε χρήσιμες υποδείξεις οι οποίες μπορούν να σας βοηθήσουν στην επίλυση τυχόν προβλημάτων που μπορούν να εμφανισθούν. Για περισσότερες πληροφορίες βλέπε επίσης τη σελίδα συχνών ερωτήσεων στο κέντρο τεχνικής σας υποστήριξης: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx.h επιστήμονες της τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN απαντά ευχαρίστως στις ερωτήσεις σας σχετικά με το περιεχόμενο και τα πρωτόκολλα του εγχειριδίου αυτού ή τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου (πληροφορίες επαφής, βλέπε οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα www.qiagen.com). Παρατηρήσεις και προτάσεις Κανένα σήμα με θετικά πρότυπα ελέγχου (Hep. C Virus RG QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM a) Το κανάλι φθορισμού που επιλέξατε για την ανάλυση των δεδομένων της PCR, δεν ανταποκρίνεται στα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου. Για την ανάλυση των δεδομένων διαλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM για την αναλυτική RT-PCR του HCV και το κανάλι φθορισμού Cycling Orange ή Cycling A.ROX για την RT-PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. b) O προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας του οργάνου Rotor-Gene είναι εσφαλμένος c) Εσφαλμένη διάταξη της αντίδρασης της PCR d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus HCV RG RT-PCR Kit έχει λήξει Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με τα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 23). Ελέγξτε τα στάδια εργασίας σας με τη βοήθεια του σχήματος επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 23) και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 33

Παρατηρήσεις και προτάσεις Ασθενές ή ανύπαρκτο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Orange ή Cycling A.ROX με ταυτόχρονη απουσία ενός σήματος στο κανάλι Cycling Green ή Cycling A.FAM: a) Οι συνθήκες της PCR δεν συμφωνούν με το πρωτόκολλο Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε ανωτέρω) και επαναλάβετε την PCR με διορθωμένες ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. b) Έγινε αναστολή της PCR Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Βεβαιωθείτε ότι κατά την απομόνωση του RNA το επιπλέον προτεινόμενο βήμα φυγοκέντρησης, για την απόλυτη απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης έχει εκτελεστεί πριν από την εκχύλιση (βλέπε Απομόνωση RNA, σελίδα 21). c) Υφίσταται απώλεια RNA κατά την εκχύλιση d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus HCV RG RT-PCR Kit έχει λήξει Εάν το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει προστεθεί στην απομόνωση, μπορεί η απουσία του σήματος του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να σημαίνει απώλειες RNA κατά την εκχύλιση. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε Απομόνωση RNA, σελίδα 21) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. 34 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Παρατηρήσεις και προτάσεις Σήματα με τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM της αναλυτικής PCR a) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Εισάγετε με πιπέτα τα θετικά πρότυπα ελέγχου κατά κανόνα στο τέλος. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. b) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την εκχύλιση Επαναλάβετε την εκχύλιση και την PCR των εξεταζόμενων δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση νέων αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 35

Παραπομπές Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη ενημερωμένη επιγραμμική βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιευμάτων σχετικά με τη χρήση των προїόντων της QIAGEN. Επιλεκτικές αναλυτικές αναζητήσεις σας επιτρέπουν να βρείτε το άρθρο που χρειάζεστε είτε κατά την αναζήτηση με μία απλή κωδική λέξη είτε ειδικότερα βάσει της εφαρμογής, ερευνητικού πεδίου, τίτλου, κ.τ.λ. Για μία πλήρη λίστα παραπομπών, επισκευθείτε την QIAGEN Reference Database online στην ιστοσελίδα www.qiagen.com/refdb/search.asp ή ελάτε σε επαφή με την τεχνική υπηρεσία της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. 36 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Πληροφορίες παραγγελιών Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. artus HCV RG RT-PCR Kit (24) artus HCV RG RT-PCR Kit (96) Για 24 αντιδράσεις: 2 Master, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) Για 96 αντιδράσεις :2 Master, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) 4518263 4518265 QIAamp DSP Virus Kit για τον καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων του ιού από πλάσμα ανθρώπου για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro QIAamp DSP Virus Kit Για 50 αντιδράσεις: QIAamp MinElute Spin Columns, ρυθμιστικά διαλύματα, αντιδραστήρια, σωληνάρια, επεκτάσεις στήλης και VacConnectors Rotor-Gene Q και εξαρτήματα Rotor-Gene Q 5plex Real-time PCR cycler με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Real-time PCR cycler και αναλυτή High Resolution Melt με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), συν κανάλι HRM, φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Real-time PCR όργανο με 6 κανάλια (μπλέ πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) φορητός μικροϋπολογιστής, λογισμικό, εξαρτήματα, εγγύηση 1 έτους για επιμέρους και εργαστηριακά είδη Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης με πιπέτα ενός καναλιού σε 72 x 0,1 ml σωληνάρια 60704 Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες Ζητείστε πληροφορίες 9018901 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009 37

Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης σε μία πρότυπη σειρά 8 x 12 με τη χρήση 96 x 0,2 ml σωληναρίων 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 1000 αντιδράσεις 9018905 981103 Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) 10 x 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 10.000 αντιδράσεις 981106 PCR Tubes, 0,2 ml (1000) 1000 λεπτά σωληνάρια για 1000 αντιδράσεις 981005 PCR Tubes, 0,2 ml (10000) 10 x 1000 λεπτά σωληνάρια για 10000 αντιδράσεις 981008 Για πρόσφατες πληροφορίες αδείας χρήσης και ειδικές αποποιήσεις προϊόντων, ανατρέξτε στο αντίστοιχο εγχειρίδιο του QIAGEN kit ή του χρήστη. Αυτά είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα www.qiagen.com ή μπορούν να ζητηθούν από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. 38 artus HCV RG RT-PCR Kit Εγχειρίδιο 04/2009

Η αγορά του προϊόντος αυτού επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για την εκτέλεση διαγνωστικών εξετάσεων του ανθρώπου στη διαγνωστική in-vitro. Καμμιά γενική πατέντα ή άλλη άδεια κάθε είδους δεν παρέχεται επί τουπαρόντος εκτός αυτής του ειδικού δικαιώματος της χρήσης από τον αγοραστή. Εμπορικές ονομασίες: QIAamp, artus, MinElute (QIAGEN Group); COBAS, TaqMan (Roche Group); FAM, ROX (Applera Corporation or its subsidiaries); Rotor-Gene (Corbett Research); SYBR (Molecular Probes, Inc.). Το artus HCV RG RT-PCR Kit και το QIAamp DSP Virus Kit είναι σημασμένα CE διαγνωστικά κιτ σύμφωνα με τον ευρωπαïκό κανονισμό 98/79/EC σχετικό με τη διαγνωστική in vitro. Δεν είναι διαθέσιμα σε όλες τις χώρες. Συμφωνία περιορισμένης αδείας Η χρήση του προїόντος αυτού σημαίνει ότι κάθε αγοραστής ή χρήστης του artus HCV RG RT-PCR Kit συμφωνεί με τους ακόλουθους όρους: 1. Το artus HCV RG RT-PCR Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σύμφωνα με το εγχειρίδιο artus HCV RG RT- PCR Kit και μόνο με τα αντιδραστήρια που περιέχονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παραχωρεί καμμία άδεια υπό την πνευματική της ιδιοκτησία για τη χρήση ή συσσωμάτωση των περιεχομένων στο κιτ αυτό αντιδραστηρίων με αντιδραστήρια που δεν συμπεριλαμβάνονται εντός του ίδιου κιτ εκτός εάν αναφέρεται στο εγχειρίδιο του artus HCV RG RT-PCR Kit και στα περιλαμβανόμενα πρωτόκολλα διαθέσιμα στην ιστοσελίδα www.qiagen.com. 2. Διαφορετικά από τις κατηγορηματικές κρατικές άδειες, η QIAGEN δεν παρέχει καμμία εγγύηση ότι αυτό το κιτ και/ή η χρήση του δεν παραβιάζει τα δικαιώματα τρίτων προσώπων. 3. Το κιτ αυτό και τα αντιδραστήριά του διατίθενται για μία χρήση και δεν μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, ανακαινισθούν ή μεταπωληθούν. 4. Ειδικότερα η QIAGEN αποποιεί οποιαδήποτε άλλες άδειες, που διατυπώνουν ή υπονοούν οτιδήποτε άλλο από τις σαφείς αυτές συνθήκες. 5. Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνεί να μην επιτρέπει σε κανένα άλλο να λαμβάνει οποιαδήποτε μέτρα που θα μπορούσαν να οδηγήσουν ή να διευκολύνουν πράξεις που απαγορεύονται παραπάνω. Η QIAGEN μπορεί να επιβάλλει τις απαγορεύσεις αυτής της συμφωνίας περιορισμένης αδείας σε οποιοδήποτε δικαστήριο και να ανακτήσει όλα της τα προανακριτικά και του δικαστηρίου έξοδα συμπεριλαμβανομένων και των δικηγορικών αμοιβών, σε κάθε πράξη που επιβάλλει αυτή η συμφωνία περιορισμένης αδείας ή οτιδήποτε από τα δικαιώματα της πνευματικής της ιδιοκτησίας που έχουν σχέση με το κιτ και/ή τα αντιδραστήριά του. Για νεότερη ενημέρωση που αφορούν τους όρους αδείας, μπορείτε να δείτε στην ιστοσελίδα www.qiagen.com 2009 QIAGEN, όλα τα δικαιώματα είναι κατωχυρωμένα.

www.qiagen.com Australia Orders 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800/28-10-10 Fax 0800/28-10-19 Technical 0800/28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Brazil Orders 0800-557779 Fax 55-11-5079-4001 Technical 0800-557779 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 021-3865-3865 Fax 021-3865-3965 Technical 800-988-0325 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Offers 01-60-920-928 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800 555 049 Fax 1800 555 048 Technical 1800 555 061 Italy Orders 02-33430-420 Fax 02-33430-426 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-6890-7300 Fax 03-5547-0818 Technical 03-6890-7300 Korea (South) Orders 1544 7145 Fax 1544 7146 Technical 1544 7145 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 Mexico Orders 01-800-7742-639 Fax 01-800-1122-330 Technical 01-800-7742-639 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 65-67775366 Fax 65-67785177 Technical 65-67775366 Spain Orders 91-630-7050 Fax 91-630-5145 Technical 91-630-7050 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1049309EL 130189572 Sample & Assay Technologies