Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός

Κεφάλαιο 12 Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός Θ. Κατσίλα Περίληψη Οι συχνότητες των αλληλόμορφων για έναν σημειακό μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNP) δύναται να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών και εθνικών ομάδων. Σε μια προσπάθεια συλλογικής παρουσίασης της γενετικής ποικιλομορφίας, αναπτύχθηκε, το 2003, το διεθνές πρόγραμμα «International HapMap», το οποίο αποσκοπεί στην καταγραφή των συχνοτήτων των αλληλόμορφων των SNPs σε πληθυσμιακά δείγματα αναφοράς αντιπροσωπευτικά της ανθρώπινης ποικιλομορφίας (π.χ. Καυκάσιοι/Ευρωπαίοι, Αφρικανοί, Κινέζοι, Ιάπωνες). Το πρόγραμμα «International HapMap» επιτρέπει την κατασκευή χάρτη απλότυπων (HapMap) και την ανεύρεση SNPs επισήμανσης (tag SNPs) ενδεικτικών γενετικής σύνδεσης. Προαπαιτούμενη γνώση Κατανόηση του φαινομένου του ανασυνδυασμού. Προηγούμενη μελέτη των κεφαλαίων 9 και 10 του συγγράμματος Thompson & Thompson, Ιατρική γενετική, 2η ελληνική έκδοση, Αθήνα: εκδ. Πασχαλίδης, 2011. 12.1 Θεωρητικό μέρος 12.1.1 Γoνιδιωματική ποικιλομορφία Το φαινόμενο του ανασυνδυασμού συσχετίζεται εξ ορισμού με τη γονιδιωματική ποικιλομορφία, καθώς οδηγεί στη δημιουργία απλότυπων. Οι τελευταίοι αφορούν συνδυασμούς αλληλικών οντοτήτων των πολυμορφισμών στο ίδιο μόριο DNΑ. Ο γενετικός ανασυνδυασμός εξαιτίας επιχιασμού μεταξύ γενετικών τόπων οδηγεί στη δημιουργία νέων συνδυασμών συνδεδεμένων γονιδίων (απλότυπων) (εικόνα 12.1). H πιθανότητα ανασυνδυασμού (η γενετική απόσταση) μεταξύ δύο αυτοσωμικών θέσεων εξαρτάται από τη σχετική τους απόσταση. Aπόμακροι γενετικοί τόποι τείνουν να διαχωρίζονται πιο συχνά, εξαιτίας του φαινομένου του ανασυνδυασμού. Ωστόσο, η γενετική απόσταση δεν καθορίζεται αποκλειστικά από τη φυσική απόσταση, καθώς οι δύο δεν σχετίζονται γραμμικά. Συνεπώς, υπάρχει η τάση συγκεκριμένων αλληλόμορφων γειτονικών γενετικών τόπων να συγκληρονομούνται εξαιτίας μειωμένου ανασυνδυασμού. Η γενετική σύνδεση (linkage) αφορά το φαινόμενο κατά το οποίο τα γειτονικά 265

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ αλληλόμορφα ενός χρωμοσώματος τείνουν να κληρονομούνται μαζί στους απογόνους (μεταβιβάζονται ως ενιαία μονάδα κατά τη μείωση), χωρίς να διαχωρίζονται ανεξάρτητα. Αυτή η ιδιότητα καλείται ανισορροπία σύνδεσης (LD) και παρατηρείται όταν δύο αλληλόμορφα συγκληρονομούνται πιο συχνά από όσο θα αναμενόταν αν υπήρχε τυχαιότητα και επομένως βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα. Εξαιτίας της μη τυχαίας συσχέτισης των γειτονικών αλληλόμορφων, η γνώση ενός αλληλόμορφου σε μια γενετική θέση Α επιτρέπει την πρόβλεψη του αλληλομόρφου μιας γειτονικής γενετικής θέσης Β, όταν οι Α και Β βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης. Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί στις θέσεις Α και Β χαρακτηρίζονται ως SNPs επισήμανσης (tag SNPs). Πιστεύεται πως το ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται από τμήματα ανισορροπίας σύνδεσης ή απλότυπων (LD / Haplotype blocks) που διαχωρίζονται από περιοχές υψηλής πιθανότητας ανασυνδυασμού. Πέραν των φαινομένων ανασυνδυασμού, φαινόμενα γενετικής απόκλισης ή πληθυσμιακής διαστρωμάτωσης μπορούν επίσης να διαμορφώσουν διαφορετικά πρότυπα απλοτυπικών συμπλόκων. Τα τελευταία, μάλιστα, διαφέρουν σημαντικά μεταξύ πληθυσμών. Ενδεικτικά, οι πληθυσμοί αφρικανικής καταγωγής χαρακτηρίζονται από μικρότερα σε μέγεθος απλοτυπικά σύμπλοκα, σε σχέση με τους ασιατικούς ή ευρωπαϊκούς πληθυσμούς, επειδή είναι εξελικτικά παλαιότεροι. Εικόνα 12.1 Η επίδραση του φαινομένου του γενετικού ανασυνδυασμού στη σύσταση απλότυπων. (α) Απουσία γενετικού ανασυνδυασμού, τέσσερις σημειακοί νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs) αποδίδουν πέντε απλότυπους. (β) Ένα κεντρικό σημείο ανασυνδυασμού αποδίδει τέσσερις επιπρόσθετους γενετικούς ανασυνδυασμούς. (γ) Ο ελεύθερος ανασυνδυασμός αποδίδει συνολικά δεκαέξι απλότυπους. 266

Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός 12.1.2 Μέτρα εκτίμησης της γενετικής σύνδεσης Έως σήμερα έχουν προταθεί πολλοί διαφορετικοί υπολογισμοί για την εκτίμηση της ισχύος της LD, οι περισσότεροι από τους οποίους αφορούν την ισχύ του βαθμού συσχέτισης μεταξύ των ζευγών διαλληλικών τόπων. Δύο τέτοιοι σημαντικοί όροι είναι οι LD και r 2 (μερικές φορές συμβολίζονται και ως D και Δ 2, αντίστοιχα), οι τιμές των οποίων κυμαίνονται από 0 (δεν υφίσταται ανισορροπία σύνδεσης) έως 1 (απόλυτη ανισορροπία σύνδεσης). Η ερμηνεία τους, ωστόσο, είναι ελαφρώς διαφορετική. Το LD ορίζεται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να είναι ίσο προς 1 εάν μόνο δύο ή τρεις από τους πιθανούς απλοτύπους είναι παρόντες και <1 αν και οι τέσσερις πιθανοί απλότυποι είναι παρόντες. Έτσι, μια τιμή LD<1 υποδεικνύει πως έχει συμβεί ανασυνδυασμός (ιστορικά) μεταξύ δύο γενετικών τόπων. Ενδιάμεσες τιμές του LD είναι πιο δύσκολο να ερμηνευτούν (για παράδειγμα, πόσο διαφορετική είναι η τιμή 0,3 από 0,7;). Από την άλλη, το r 2 αντιπροσωπεύει τη στατιστική συσχέτιση μεταξύ δύο γενετικών τόπων και λαμβάνει την τιμή 1 μόνο εάν δύο απλότυποι είναι παρόντες. Έτσι, το r 2 είναι πιο σχετικό για σκοπούς χαρτογράφησης, καθώς υπάρχει μια απλή αντίστροφη σχέση μεταξύ του r 2 και του μεγέθους του δείγματος που απαιτείται για την ανίχνευση συσχέτισης μεταξύ τόπων και SNPs. Για παράδειγμα, ας υποθέσουμε ότι ο SNP1 εμπλέκεται σε μια νόσο, αλλά εμείς έχουμε γονοτυπήσει τον γειτονικό του SNP2. Τότε, για να ανιχνεύσουμε την εν λόγω συσχέτιση για τον SNP2 (όπως θα είχαμε κάνει για τον SNP1), πρέπει να αυξήσουμε το μέγεθος του δείγματός μας κατά 1/ r 2. Σε περίπτωση που επιθυμούμε να υπολογίσουμε την ισχύ της LD σε μια ολόκληρη περιοχή που περιέχει πολλές θέσεις πολυμορφισμού ενδεικτικά, εάν η ισχύς της LD διαφέρει σημαντικά μεταξύ τόπων ή σε διαφορετικούς πληθυσμούς ή αν υπάρχει περισσότερο ή λιγότερο ισχυρή LD σε μια περιοχή από ό,τι είχε προβλεφθεί, οι υπολογισμοί γίνονται πολύπλοκοι. Μια προσέγγιση αφορά τον όρο ρ, του οποίου η χρήση είναι ευρεία στη γενετική πληθυσμών. Σε γενικές γραμμές, ο ρ υποδεικνύει το μέγεθος του ανασυνδυασμού που απαιτείται στο πλαίσιο ενός πληθυσμιακού μοντέλου για την ανισορροπία σύνδεσης που παρατηρείται στα υπό μελέτη δεδομένα. 12.1.3 Το πρόγραμμα «International HapMap» Το πρόγραμμα «International HapMap» αποτελεί πολύτιμο εργαλείο και πηγή πληροφορίας για τις μελέτες συσχέτισης, καθώς βασίζεται στην εύρεση και τον χαρακτηρισμό προτύπων γενετικής σύνδεσης και ποικιλομορφίας σε διαφορετικούς πληθυσμούς.το 2005, ενδεικτικά, κατά την 1η φάση του προγράμματος, γονοτυπήθηκαν 1.000.000 SNPs και κατά τη 2η φάση, το 2007, ολοκληρώθηκε η γονοτύπηση περισσότερων από 3.000.000 SNPs. Κατά τη διάρκεια του προγράμματος, άλλωστε, διαπιστώθηκε πως σε κάθε χρωμόσωμα υπάρχει ένας μοναδικός συνδυασμός αλληλόμορφων, ένας «απλότυπος». Επιπλέον, σκιαγραφείται μια εξαιρετικά ανομοιόμορφη κατανομή του φαινομένου του γενετικού ανασυνδυασμού στο γονιδίωμα, η οποία και αποδίδεται με ασυνεχείς δομές (blocks) ανισορροπίας σύνδεσης. Αυτές οι δομές δύνανται να εμπεριέχουν πλήθος SNPs, που σχετίζονται έντονα μεταξύ τους και, συνεπώς, παρουσιάζουν περιορισμένη απλοτυπική ποικιλομορφία, αναμενόμενη αν συλλογιστούμε τα σχετικά λίγα ιστορικά γεγονότα ανασυνδυασμού. Πολύ σημαντικό είναι ότι η αποκάλυψη αυτών των ασυνεχών δομών ισχυρής ανισορροπίας σύνδεσης στο γονιδίωμα επιτρέπει την επιλογή και χρήση ενός συνόλου SNPs ως tagsnps. 267

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 12.1.4 Απλότυποι Oι απλότυποι είναι σημαντικής κλινικής και βιοϊατρικής σημασίας στο πλαίσιο μελετών συσχέτισης. Επιπλέον, είναι καθοριστικός ο ρόλος τους κατά τη σύνθεση φυλλογενετικών δέντρων, αλλά και για την κατανόηση της δομής και γιατί όχι της λειτουργίας του γονιδιώματος. Ορισμένοι γενετικοί τόποι στον άνθρωπο είναι απλοειδείς. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν το χρωμόσωμα Υ, το μιτοχονδριακό DNA και το χρωμόσωμα Χ στους άρρενες. Σ αυτούς τους γενετικούς τόπους οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί που ταυτοποιούνται αντιστοιχούν άμεσα σε απλότυπους. Ωστόσο, για την πλειοψηφία του ανθρώπινου γονιδιώματος, που είναι διπλοειδές, ο χαρακτηρισμός των απλότυπων είναι πολυπλοκότερος. Για την πλειοψηφία του γονιδιώματος στον άνθρωπο κάτι τέτοιο δεν είναι εφικτό. Το πρόβλημα, λοιπόν, έγκειται στην απόκτηση απλότυπων από τα γονοτυπικά δεδομένα του διπλοειδούς DNA. Ο χαρακτηρισμός των απλότυπων στις διπλοειδείς θέσεις του γονιδιώματος γίνεται με τρεις τρόπους: (α) τον φυσικό διαχωρισμό, (β) την ανάλυση γενεαλογικών δέντρων και (γ) τη χρήση στατιστικών μεθόδων. Κατά τον φυσικό διαχωρισμό, χρησιμοποιούνται μέθοδοι αλληλούχησης επόμενης γενιάς ή ειδική για το αλληλόμορφο PCR, αποδίδοντας απλότυπους σε απόσταση μεγαλύτερη των 10 kb. Προσδιορίζεται ο απλότυπος του ενός χρωμοσώματος, ενώ ο έτερος απλότυπος υπολογίζεται έμμεσα με αφαίρεση. Ένας περιορισμός της μεθόδου είναι ότι μπορεί να οδηγήσει σε παραπλανητικά αποτελέσματα, αν υπάρχουν στον υπό μελέτη πληθυσμό αλληλόμορφα με ελλείψεις. Ο χαρακτηρισμός των απλότυπων με την ανάλυση γενεαλογικών δέντρων χρησιμοποιείται συχνότερα στις μονογονιδιακές παθήσεις αλλά και σε πιο πολύπλοκα μοντέλα κληρονόμησης, με την ταυτόχρονη μελέτη μητέρας, πατέρα και τέκνου. Η εξαγωγή συμπερασμάτων από τα γενεαλογικά δένδρα εξαρτάται από την ποιότητα της πληροφορίας που παρέχουν τα δέντρα. Η συμμετοχή τέτοιων δεδομένων, αν και εξαιρετικά εξαρτώμενη από την ποιότητα της πληροφορίας που αφορά τους γονείς, ήταν σημαντική κατά την αξιολόγηση και επικύρωση των στατιστικών μεθοδολογιών που εφαρμόστηκαν στο πρόγραμμα «International HapMap». Τέλος, έχουν αναπτυχθεί πολλές και αρκετά διαφορετικές στατιστικές μέθοδοι, ορισμένες από τις οποίες αναφέρονται παρακάτω. 12.1.5 Υπολογιστικά προγράμματα και εργαλεία Δεδομένης της πολυπλοκότητας των υπολογισμών που απαιτούνται, οι εργασίες με απλότυπους βασίζονται στη χρήση υπολογιστικών προγραμμάτων. Το ίδιο ισχύει και για τις γενετικές μελέτες που αποσκοπούν στην ανεύρεση γονιδίων ή SNPs που σχετίζονται με την παθοβιολογία μιας ασθένειας. Οι γενετικές μελέτες διακρίνονται γενικά στις μελέτες γενετικής σύνδεσης και στις μελέτες συσχέτισης. Οι μελέτες γενετικής σύνδεσης εξετάζουν τον τρόπο κληρονόμησης ενός γενετικού δείκτη στα μέλη οικογενειών. Έχουν ιδιαίτερη αξία για την διερεύνηση μονογονιδιακών ασθενειών. Ωστόσο, η συλλογή γενετικού υλικού από επαρκή αριθμό οικογενειών με πλήρη γενεαλογικά δένδρα είναι δύσκολη. Επιπλέον, τη διερεύνηση δυσκολεύει πιθανή γενετική ετερογένεια σε συνδυασμό με επιγενετικούς παράγοντες. Οι μελέτες συσχέτισης αφορούν κυρίως μελέτες ασθενών-μαρτύρων σε ισοζυγισμένους πληθυσμούς, σχετικά με το φύλο, την ηλικία ή άλλους παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν τον κλινικό φαινότυπο ενδιαφέροντος. Πριν την επεξεργασία των ευρημάτων πρέπει να εξασφαλιστεί η ικανοποίηση της αρχής Hardy-Weinberg. Στις μελέτες γενετικής συσχέτισης, όταν γίνεται χρήση πληθυσμιακού δείγματος που στερείται οικογενειακών δεσμών είναι αδύνατο να γνωρίζουμε για τον κάθε συμμετέχοντα ποιο αλληλόμορφο προέρχεται από τον πατέρα και ποιο από τη μητέρα. Η χρήση αλγόριθμων, εδώ, είναι αναγκαία για να επιτύχουμε το phasing των δεδομένων. Το πρόγραμμα «HapMap» χρησιμοποιεί το υπολογιστικό πρόγραμμα PHASE v2.0 [1]. Σε έναν 268

Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός γονότυπο, κάθε αλληλόμορφο αποδίδεται σε ένα από τα γονεϊκά χρωμοσώματα (πατρικό ή μητρικό), εφαρμόζοντας έναν αλγόριθμο μέγιστης πιθανοφάνειας (maximum likelihood algorithm) που χρησιμοποιεί πληροφορίες τύπου «τριάδων» από τις πληθυσμιακές ομάδες του προγράμματος «HapMap» και αν οι πληροφορίες τύπου «τριάδων» δεν είναι διαθέσιμες, τα δεδομένα προσαρμόζονται σε ένα μοντέλο που ελαχιστοποιεί τον αριθμό των εμπλεκόμενων ιστορικών διασταυρώσεων σε έναν πληθυσμό. Οι απορρέοντες απλότυποι απεικονίζονται γραφικά, με το κάθε χρωμόσωμα κάθε ατόμου του δείγματος να αντιπροσωπεύεται με μια γραμμή (ένα pixel πιο ψηλά) και κάθε πολυμορφικό (SNP) αλληλόμορφο να βάφεται κυανό ή κίτρινο. Μια περιοχή υψηλής LD θα εμφανιστεί ως μια μακρά περιοχή SNPs των οποίων τα αλληλόμορφα φέρουν το ίδιο χρώμα, υποδεικνύοντας την ύπαρξη χαμηλού ανασυνδυασμού. Αντίστοιχα, μια περιοχή χαμηλής LD θα φέρει μικρότερα και περισσότερα θραύσματα [2]. Το πρόγραμμα HaploView επιτρέπει την ανάλυση δεδομένων στον ηλεκτρονικό υπολογιστή του ερευνητή [3]. Το πρόγραμμα SNAP (SNP Annotation and Proxy search, https://www.broadinstitute.org/ mpg/snap/ldsearchpw.php) αναπτύχθηκε από το Broad Institute για την εύρεση γειτονικών SNPs βάσει ανισορροπίας σύνδεσης, φυσικής απόστασης ή/και συμμετοχής σε επιλεγμένες και εμπορικά διαθέσιμες μικροσυστοιχίες (όπως εκείνες των εταιρειών Illumina και Affymetrix) [4]. Όσον αφορά την ανισσοροπία σύνδεσης, οι υπολογισμοί γίνονται ανά ζεύγη (pair-wise, για τον υπό μελέτη SNP και τους γειτονικούς του πολυμορφισμούς) και βασίζονται στα «phased» γονοτυπικά δεδομένα του προγράμματος HapMap. 269

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ 12.2 Πρακτικό μέρος 12.2.1 Μελέτη των απλότυπων του γονιδίου TAS2R38 Στο πρακτικό μέρος της άσκησης θα εξετάσουμε τους απλότυπους των πολυμορφισμών του γονιδίου TAS2R38, rs1726866, rs713598 και rs10246939, χρησιμοποιώντας πληθυσμιακά δεδομένα από τη βάση του www.1000genomes.org, η οποία αποτελεί σημείο αναφοράς για τη γενετική ποικιλομορφία στον άνθρωπο σε παγκόσμιο επίπεδο. Για την εργασία αυτή θα χρησιμοποιηθεί το λογισμικό HaploView. Τα ψηφιακά αρχεία που χρησιμοποιούνται στο πρακτικό μέρος της άσκησης βρίσκονται στον φάκελο chapter_12 του αποθετηρίου των «Ελληνικών Ακαδημαϊκών Ηλεκτρονικών Συγγραμμάτων και Βοηθημάτων», στον σύνδεσμο http://repfiles.kallipos.gr:8080/d/36e390ce1c/. Ανάκτηση αρχείων πληθυσμιακών δεδομένων 1. Μεταβαίνουμε στον περιηγητή γονιδιωμάτων ENSEMBL (www.ensembl.org/index.html) και στα πεδία αναζήτησης επιλέγουμε Human και εισάγουμε το όνομα του πολυμορφισμού rs1726866. Ο περιηγητής δημιουργεί μια προβολή με πλήθος πληροφοριών σχετικά με τον πολυμορφισμό που μελετάμε (εικόνα 12.2). Εικόνα 12.2 Προβολή του περιηγητή ENSEMBL. Αποτελέσματα αναζήτησης για τον πολυμορφισμό rs1726866. 2. Επιλέγουμε το εικονίδιο population genetics και οδηγούμαστε σε μια νέα προβολή του περιηγητή, όπου είναι διαθέσιμα τα πληθυσμιακά δεδομένα του «1000 Genomes» για τον πολυμορφισμό rs1726866, είτε ως διαγράμματα πίτας, είτε ως συνοπτικός πίνακας. Για την αναζήτηση και λήψη των δεδομένων ανά πληθυσμό που μας ενδιαφέρει, εστιάζουμε στη στήλη «Genotype 270

Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός detail», και επιλέγουμε Show. Με την επιλογή του εικονιδίου Excel μπορούμε να ανακτήσουμε τα λεπτομερή δεδομένα από τα αποτελέσματα γονοτύπησης των ατόμων του πληθυσμού. Επιλέγουμε τον ευρωπαϊκό πληθυσμό (EUR) και ανακτούμε τα δεδομένα επιλέγοντας το εικονίδιο Excel. 3. Στο παράθυρο της εφαρμογής LibreOffice Calc επιλέγουμε ως διαχωριστικό των πεδίων το κόμμα και ανακτούμε τα δεδομένα με τη μορφή πίνακα. Αποθηκεύουμε το αρχείο σε μορφή ods (προτεινόμενο όνομα rs1726866_εur.ods) και επαναλαμβάνουμε την ίδια διαδικασία για τους πολυμορφισμούς rs713598 και rs10246939. Παρατηρούμε ότι τα δεδομένα που συλλέξαμε προέρχονται από μεμονωμένα άτομα των πληθυσμών και όχι από οικογένειες ή τριάδες (γονείς και τέκνο). Στην περίπτωση αυτή ο υπολογισμός των απλότυπων και της συχνότητάς τους μπορεί να γίνει μόνο με την χρήση κατάλληλων υπολογιστικών αλγόριθμων, όπως εξηγήθηκε στο θεωρητικό μέρος. Για τους υπολογισμούς θα χρησιμοποιηθεί η εφαρμογή Haploview, που εξάγει τους απλότυπους και εκτιμά τη συχνότητά τους με τον αλγόριθμο του PHASE v2.0. Η εφαρμογή Haploview χρησιμοποιεί τα αρχεία εισόδου.ped και.info, που προετοιμάζονται με τον ακόλουθο τρόπο: Προετοιμασία αρχείων εισόδου.ped και.info 1. Κατεβάστε στον υπολογιστή σας το πρόγραμμα SNP_tools [5] από τον ιστότοπο http:// www.bioinformatics.org/snp-tools-excel/. Ακολουθώντας τις οδηγίες εγκαταστήστε το πρόσθετο στο πρόγραμμα MS Excel σε περιβάλλον λειτουργικού συστήματος Windows. Μετά την επιτυχή εγκατάσταση, το πρόγραμμα εμφανίζεται στη γραμμή εργαλείων (εικόνα 12.3). Εικόνα 12.3 Εφαρμογή SNP_tools. Μετά από επιτυχή εγκατάσταση η εφαρμογή εμφανίζεται στη γραμμή εργαλείων του προγράμματος MS Excel. 2. Σε ένα αρχείο Microsoft Excel, δημιουργούμε πίνακα με πέντε στήλες. Η πρώτη στήλη αφορά τον πληθυσμό υπό μελέτη (υγιείς ή ασθενείς ή υγιείς-ασθενείς), η δεύτερη αφορά την ταυτότητα των δειγμάτων, ενώ οι υπόλοιπες τρεις στήλες αντιστοιχούν σε καθέναν από τους υπό μελέτη SNPs. Έτσι, ονομάζουμε την πρώτη στήλη «affect status» και τη δεύτερη «SampleID». Η τρίτη στήλη ονομάζεται «SNP1_rs1726866», η τέταρτη «SNP2_rs713598» και, τέλος, η πέμπτη «SNP3_rs10246939». Για κάθε SNP σημειώνεται η κυτταρογενετική του θέση (στη δεύτερη γραμμή της κάθε στήλης). 3. Για κάθε SNP (στήλες 3-5) συμπληρώνεται το σύνολο των γονότυπων του υπό μελέτη πληθυσμού (στη δική μας περίπτωση ο ευρωπαϊκός πληθυσμός), όπως περιγράφεται παραπάνω («Ανάκτηση αρχείων πληθυσμιακών δεδομένων», βήματα 1 και 2). Η τελική μορφή του αρχείου μας απεικονίζεται παρακάτω (εικόνα 12.4). 271

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 12.4 Τελική μορφή αρχείου Excel. Δομή του αρχείου με το σύνολο των γονότυπων (άτομα) για τους υπό μελέτη SNPs. 4. Από τη γραμμή εργαλείων, επιλέγουμε SNP. 5. Στο παράθυρο που προκύπτει (εικόνα 12.5) επιλέξτε τα δεδομένα σας (A1:E505) και τη μορφή αυτών (ACGT, Del, Het) και επιλέξτε Convert. Εικόνα 12.5 Παράθυρο μετατροπής δεδομένων του SNP_tools. 6. Τα αρχεία.ped,.info (και.map) είναι έτοιμα για την εισαγωγή τους στο πρόγραμμα HaploView. Εκτίμηση της γενετικής σύνδεσης με την εφαρμογή HaploView 1. Μεταβαίνουμε στον φάκελο της εφαρμογής HaploView και εκκινούμε την εφαρμογή πληκτρολογώντας: 272

Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός $ j a v a j a r Haploview. j a r 2. Από την επιλογή Linkage format εισάγουμε τη διαδρομή προς το αρχείο.ped που προετοιμάσαμε, ενώ αυτόματα εισάγεται το συνοδευτικό αρχείο.info. Επιλέγουμε do association test και case/control data (έχουμε άτομα και όχι οικογένειες). Πατώντας το κουμπί OK αναδύεται το παράθυρο με τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δεδομένων μας. 3. Στην καρτέλα «Check markers» προβάλεται ο ποιοτικός έλεγχος των δεδομένων γονοτύπησης. Όπως αναφέθηκε στο κεφάλαιο 11, ο έλεγχος της ισορροπίας Hardy-Weinberg πραγματοποιει- ται συχνά ως διαδικασία ρουτίνας ελέγχου της ποιότητας των γονοτυπικών δεδομένων. Παρατηρούμε ότι τα αλληλόμορφα ακολουθούν την ισορροπία Hardy-Weinberg (μη στατιστικά σημαντικές τιμές HWpval). 4. Επιλέγοντας την καρτέλα «Haplotypes», διαπιστώνουμε ότι οι πολυμορφικές θέσεις που εξετα- ζουμε βρίσκονται σε κοινό σύμπλοκο απλότυπων, γεγονός που δεν προκαλεί έκπληξη, εξαιτίας της φυσικής τους εγγύτητας (μερικές εκατοντάδες ζ.β.) στο γονίδιο TAS2R38 του χρωμοσώματος 7. 5. Παρατηρούμε ότι ο αλγόριθμος προβλέπει τρεις πιθανούς απλότυπους (τους TAC, CGG και CGC), με αντίστοιχες εκτιμώμενες συχνότητες 0,538, 0,424 και 0,38 (εικόνα 12.6). Εικόνα 12.6 Προβολή απλότυπων στην εφαρμογή Haploview. Οι απορρέοντες απλότυποι και οι αντίστοιχες εκτιμώμενες συχνότητες (προβολή της καρτέλας «Haplotypes»). 6. Επιλέγοντας την καρτέλα «LD plot», βλέπουμε μια από τις χαρακτηριστικές γραφικές παραστα- σεις του προγράμματος HaploView. Πρόκειται για ένα τριγωνικό γράφημα, όπου οι υπολογισμοί της γενετικής σύνδεσης μεταξύ των πολυμορφισμών προβάλλονται ανά δύο. Με τον τρόπο αυτό μπορεί εύκολα να διαπιστωθεί η σχέση ανάμεσα σε δύο πολυμορφικές θέσεις, καθώς με κόκκινο χρώμα υποδηλώνεται η απόλυτη LD (D =1, r 2 > 0.8) (εικόνα 12.7). 273

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 12.7 Προβολή HaploView. Δεδομένα γενετικής σύνδεσης μεταξύ των SNPs του γονιδίου TAS2R38 (προβολή της καρτέλας «LD plot»). Εκτίμηση της γενετικής σύνδεσης με την εφαρμογή SNAP Η εφαρμογή SNAP μάς επιτρέπει να εκτιμήσουμε τη γενετική σύνδεση μεταξύ μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών χωρίς να είναι απαραίτητο να προετοιμάσουμε αρχεία εισόδου, χρησιμοποιώντας μόνο τα αναγνωριστικά τους ονόματα. Για να εκτιμήσουμε τη γενετική σύνδεση μεταξύ των μονοκλουετιδικών πολυμορφισμών του TAS2R38 ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα: 1. Μεταβαίνουμε στον ιστότοπο https://www.broadinstitute.org/mpg/snap/index.php. 2. Επιλέγουμε την καρτέλα «Pairwise LD» και στην ετικέτα «Query SNPs-Input SNPs» επιλέγουμε Text Entry. Στο τετράγωνο πλαίσιο που μας δίνεται, γράφουμε τους υπό μελέτη SNPs: rs1726866 rs713598 rs10246939 3. Στην ετικέτα «Search options-snp data set», επιλέγουμε HapMap release 22. 4. Στην ετικέτα «Search options-r 2 threshold», επιλέγουμε no limit. 5. Επιλέγοντας Search, λαμβάνουμε ένα αρχείο txt με τα αποτελέσματα της αναζήτησής μας. Tα ευρήματα της αναζήτησης αφορούν τη γενετική σύνδεση των SNPs (ανά ζεύγη) και αποδίδονται με τις τιμές των D και r 2, τη μεταξύ τους απόσταση, το χρωμόσωμα στο οποίο εδράζονται, καθώς και τις διαθέσιμες μικροσυστοιχίες για τη μελέτη τους. Τέλος, δίνεται η θέση τους, σύμφωνα με το γονιδίωμα αναφοράς 18. 274

Απλότυποι, γενετική σύνδεση και ανασυνδυασμός 12.3 Ερωτήσεις - εργασίες 1. Χρησιμοποιώντας τον περιηγητή ENSEMBL και τα δεδομένα από το «1000 Genomes», τι παρατηρείτε ως προς τη συχνότητα εμφάνισης (σε επίπεδο γονότυπων και αλληλόμορφων) για τον rs1726866, όταν συγκρίνετε τον αφρικανικό και τον ευρωπαϊκό πληθυσμό; 2. Πώς θα λάβετε τα δεδομένα του rs1726866 για τον αφρικανικό και τον ευρωπαϊκό πληθυσμό; 12.4 Βιβλιογραφία [1] M. Stephens and P. Donnelly, A comparison of bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data, Am. J. Hum. Genet., vol. 73, no. 5, pp. 1162 1169, Nov. 2003, [PubMed Central:PMC1180495]. [2] G. A. Thorisson, A. V. Smith, L. Krishnan, et al., The International HapMap Project Web site, Genome Res., vol. 15, no. 11, pp. 1592 1593, Nov. 2005, [PubMed Central:PMC1310647]. [3] J. C. Barrett, B. Fry, J. Maller, et al., Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps, Bioinformatics, vol. 21, no. 2, pp. 263 265, Jan. 2005. doi: 10.1093/bioinformatics/ bth457. [4] A. D. Johnson, R. E. Handsaker, S. L. Pulit, et al., SNAP: a web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap, Bioinformatics, vol. 24, no. 24, pp. 2938 2939, Dec. 2008, [PubMed Central:PMC2720775]. [5] B. Chen, S. Wilkening, M. Drechsel, et al., SNP_tools: A compact tool package for analysis and conversion of genotype data for MS-Excel, BMC Res Notes, vol. 2, p. 214, 2009, [PubMed Central:PMC2771038]. Χρήσιμες ηλεκτρονικές διευθύνσεις Ιστότοπος του προγράμματος «International HapMap» http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ Ιστότοπος του προγράμματος «1000 Genomes» www.1000genomes.org 275