Μετάδοση του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV) με αφίδες

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Μετάδοση του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV) με αφίδες Χριστίνα Καλογήρου Γεωπόνος Α.Π.Θ. Μεταπτυχιακή Διατριβή Θεσσαλονίκη 2010

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Μετάδοση του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV) με αφίδες Χριστίνα Καλογήρου Μεταπτυχιακή Διατριβή Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Ν. Ι. Κατής Καθηγητής Α. Λαγοπόδη Επίκουρη Καθηγήτρια Γ. Καραογλανίδης Λέκτορας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, ΑΠΡΙΛΙΟΣ 2010 Εισηγητής Μέλος Μέλος

2 στην οικογένειά μου

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...7 Ευχαριστίες...8 Περίληψη...10 Abstract...12 Συντομογραφίες ιών...13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗΣ ΦΥΤΙΚΩΝ ΙΩΝ...15 1.1. Γενικές πληροφορίες για τους ιούς...15 1.2. Τρόποι μετάδοσης των ιών...17 1.3. Η μετάδοση των φυτικών ιών με έντομα...18 1.3.1. Μετάδοση με αφίδες...19 1.3.2. Μετάδοση με άλλα έντομα...21 1.4. Μηχανισμοί μη-έμμονης μετάδοσης...22 1.5. Φυτικοί ιοί που μεταδίδονται με μη έμμονο τρόπο...23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΙΟΣ ΤΟΥ ΜΩΣΑΪΚΟΥ ΤΟΥ ΓΟΓΓΥΛΙΟΥ (Turnip Mosaic Virus, TuMV)...26 2.1. Οικογένεια Potyviridae...26 2.2. Γένος Potyvirus...28 2.3. Ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus,tumv)...29 2.4. Ξενιστές του TuMV...33 2.5. Ο TuMV στην Ελλάδα...40

4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΟΙ ΑΦΙΔΕΣ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΤΟΥ TuMV...41 3.1 Κυριότερα είδη αφίδων...41 3.2. Η αφίδα Myzus persicae (Sulzer)...42 3.3 Η αφίδα Aphis gosypii Glover...47 3.4. Αφιδομετάδοση των ιών του γένους Potyvirus...50 3.4.1. Θεωρία της γέφυρας...52 3.4.2. Θεωρία της άμεσης πρόσδεσης...53 3.4.3 Εξειδίκευση με αφίδες στη μετάδοση των φυτικών ιών...55 ΣΚΟΠΟΣ...57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...58 4.1 Φυτά που χρησιμοποιήθηκαν...58 4.1.1 Φυτά για αφιδομεταδόσεις...58 4.1.2. Φυτά για διατήρηση αφίδων...59 4.2. Στελέχη του TuMV...59 4.3. Διατήρηση του ιού...60 4.4 Μηχανική μετάδοση...61 4.5. Αφιδομεταδόσεις...62 4.5.1. Διαδικασία παραγωγής άπτερων ενήλικων ατόμων...62 4.5.2. Πειράματα με άπτερα άτομα...63 4.5.3. Συλλογή πτερωτών αφίδων...65 4.5.4. Πειράματα με πτερωτά άτομα...65 4.5.5. Πειράματα που στηρίζονται στην δοκιμή ARENA...67 4.6. Ανοσοεζνυμική Δοκιμή ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent

5 Assay, ELISA)...68 4.6.1. Αντιδραστήρια...68 4.6.2. Σύζευξη γ-σφαιρίνης...68 4.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής άμεσης DAS-ELISA (Double antibody sandwich ELISA)...69 4.7. Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων...72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...73 5.1. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με άπτερα ενήλικα θηλυκά της αφίδας Myzus persicae...73 5.2. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με ομάδα άπτερων ενήλικων θηλυκών της αφίδας Myzus persicae...73 5.3. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με πτερωτά άτομα του κλώνου της αφίδας Myzus persicae...74 5.4. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με πτερωτά άτομα της αφίδας Myzus persicae που συλλέχθηκαν από δέντρα ροδακινιάς...75 5.5 Σύγκριση της αποτελεσματικότητας μετάδοσης του TuMV από άπτερα ενήλικα θηλυκά των αφίδων Myzus persicae και Aphis gossypii78 5.6 Δοκιμές τύπου ARENA...79 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: ΣΥΖΗΤΗΣΗ...82 6.1 Παραλλακτικότητα των στελεχών του TuMV...82 6.2 Σύγκριση μορφών και ειδών αφίδων...84 6.3 Σύγκριση άμεσης αφιδομετάδοσης (direct) και δοκιμές τύπου ARENA...86

6 6.4 Σύνοψη αποτελεσμάτων...87 6.5 Μελλοντικοί στόχοι...87 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...89

7 Πρόλογος Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η ικανότητα μετάδοσης στελεχών του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού TuMV από διαφορετικές αφίδες-φορείς (Hemiptera: Aphididae) σε φυτά ραπανιού Rhaphanus sativus. Η διατριβή αποτελείται από δυο μέρη το γενικό και το ειδικό μέρος. Στο γενικό μέρος γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση της μετάδοσης ιών με φορείς με ιδιαίτερη έμφαση στη μετάδοση ιών από έντομα και στους μηχανισμούς μετάδοσης αυτών. Επίσης, δίδονται στοιχεία για την οικογένεια Potyviridae και το γένος Potyvirus. Τέλος, γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπη για τον ιό του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV). Στο ειδικό μέρος, περιγράφονται οι πειραματικές εργασίες που πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης για τη διεκπεραίωση της μελέτης, αναλύονται τα αποτελέσματα και εξάγονται συμπεράσματα μέσα από συγκρίσεις με άλλες παρόμοιες μελέτες από τη βιβλιογραφία.

8 Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη 2006-2009 στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ) στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών Επιστημών Φυτοπροστασίας. Ολοκληρώνοντας την προσπάθεια αυτή αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω όλους όσους συνέβαλαν στην πραγματοποίησή της. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Νικόλαο Ι. Κατή για την συνεχή καθοδήγηση, την άριστη συνεργασία, την υπομονή και την αμέριστη υποστήριξή του, εντός και εκτός του εργαστηρίου, καθ όλη την διάρκεια των προπτυχιακών και μεταπτυχιακών μου σπουδών. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Αναστασία Λαγοπόδη και στον Λέκτορα κ. Γεώργιο Καραογλανίδη, μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την κριτική ανάγνωση της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Πολλές ευχαριστίες εκφράζονται στο Δρ. Ιωάννη Τ. Μαργαριτόπουλο για την πολύτιμη και αμέριστη βοήθεια του για τη διεξαγωγή της παρούσας διατριβής και τις χρήσιμες συμβουλές του κατά την συγγραφή της. Επίσης, θα ήθελα ιδιαίτερα να τον ευχαριστήσω για το ενδιαφέρον του, τις συμβουλές του, τη διάθεση του για κάθε είδους συζητήσεις σχετικές με το θέμα της διατριβής αλλά και για την υποστήριξη του σε προβλήματα που παρουσιάστηκαν κατά τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων. Επίσης, ευχαριστίες οφείλω στους κ. Κωνσταντίνο Ευθυμίου και Δρ. Βαρβάρα Μαλιόγκα για την συνεχή βοήθεια και συμπαράστασή τους, τις πολύτιμες υποδείξεις τους και την μετάδοση της αγάπης τους για την επιστήμη της Ιολογίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω σύσσωμο το Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. και τους συμφοιτητές μου στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών για το όμορφο κλίμα των ετών αυτών. Βαθύτατες

9 ευχαριστίες αρμόζουν στους Μένια, Λεωνίδα, Αποστόλη, Χάρη, Γιώργο, Νατάσα, Ξένια και Λέλα για την πολύτιμη βοήθεια και υποστήριξή τους. Ευχαριστίες εκφράζονται επίσης στην ερευνητική ομάδα του Δρ. Κ. Ohshima του πανεπιστημίου Σάγκα της Ιαπωνίας για την παραχώρηση των διαφορετικών στελεχών του ιού. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου για την οικονομική και πάνω από όλα για την ηθική υποστήριξη όλα τα χρόνια της προπτυχιακής και μεταπτυχιακής μου διαδρομής αλλά και για την πίστη τους στους στόχους και τις φιλοδοξίες μου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους φίλους μου για την αγάπη, την συμπαράσταση και την κατανόηση που έδειξαν όλο αυτό το χρονικό διάστημα. Χριστίνα Καλογήρου Θεσσαλονίκη, Απρίλιος 2010

10 Περίληψη Ο ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip Mosaic Virus, TuMV) έχει μεγάλο εύρος ξενιστών που ανήκουν κυρίως στην οικογένεια Brassicaceae στο γένος Potyvirus της οικογένειας Potyviridae και μεταδίδεται, όπως και οι υπόλοιποι ιοί του γένους, με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η μετάδοση του ιού με δύο είδη αφίδων. Χρησιμοποιήθηκαν έξι διαφορετικά στελέχη του TuMV και τα πειράματα αφιδομεταδόσεων έγιναν σε ραπανάκια (Rhaphanus sativus). Οι αφιδομεταδόσεις έγιναν με πτερωτά (εργαστηριακής εκτροφής ή συλλεχθέντα από τον αγρό) και άπτερα ενήλικα άτομα (εργαστηριακής εκτροφής) Myzus persicae (Sulzer) καθώς και άπτερα ενήλικα άτομα Aphis gosypii Glover συλλεχθέντα από τον αγρό. Έγιναν πειράματα άμεσης μετάδοσης (άπτερα και πτερωτά τοποθετούνται στα ιωμένα και στα υπό εξέταση υγιή φυτά) και δοκιμές ΑRΕΝΑ (πτερωτές αφίδες κινούνται ελεύθερα σε κλωβό με ιωμένα και υγιή φυτά). Δεν βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην αποτελεσματικότητα μετάδοσης διαφορετικών στελεχών του ιού από τις αφίδες στα πειράματα άμεσων αφιδομεταδόσεων. Τα στελέχη του ΤuΜV εμφάνισαν μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης με πτερωτά Μ. persicae από τον αγρό σε σχέση με τα πτερωτά και άπτερα της εργαστηριακής εκτροφής. Τα πτερωτά και άπτερα άτομα της εργαστηριακής εκτροφής μετέδωσαν τον ιό το ίδιο ικανοποιητικά. Το Μ. persicae μετέδωσε πιο αποτελεσματικά τα στελέχη του TuMV σε σχέση με το A. gossypii. Τέλος, χαμηλότερα ποσοστά μετάδοσης παρατηρήθηκαν στις δοκιμές ΑRΕΝΑ σε σχέση με αυτές της άμεσης μετάδοσης, κάτι που συμφωνεί και με προγενέστερες μελέτες. Ωστόσο, η δοκιμή ARENA προσομοιώνει καλύτερα τη δυνητικότητα του φορέα καθώς οι πειραματικές συνθήκες είναι παραπλήσιες με αυτές του αγρού. Συνοψίζοντας, η παρούσα εργασία αποτελεί μια πρώτη προσέγγιση της

11 μετάδοσης διαφορετικών στελεχών του ιού με αφίδες. Η έλλειψη διαφορών στη μετάδοση των στελεχών, υποδηλώνει πιθανή έλλειψη γενετικής παραλλακτικότητας σχετική με την ικανότητα μετάδοσης από τις αφίδες φορείς του ιού. Το Μ. persicae βρέθηκε πιο ικανό στη μετάδοση του ιού από το A. gossypii. Ωστόσο, αν και μη αποικίζον είδος, το Α. gossypii φαίνεται ότι συνεισφέρει στην επιδημιολογία του ιού ειδικά σε περιοχές όπου συνυπάρχει το ραπάνι με καλλιέργειες όπου υπάρχουν υψηλοί πληθυσμοί της αφίδας. Τέλος, οι πτερωτές μορφές του Μ. persicae βρέθηκαν αποτελεσματικές στη μετάδοση του ιού, κάτι που έχει ιδιαίτερη σημασία στην πρωτογενή διασπορά του ιού στις καλλιέργειες ραπανιού.

12 Abstract Turnip Mosaic Virus (TuMV) belongs to the genus Potyvirus of the family Potyviridae and is probably the most common and important virus in Brassicaceae crops throughout the world. TuMV is transmitted by aphids in a non-persistent manner. In the present study we examined the transmission of six TuMV isolates in radish plants by different morphs of the Myzus persicae and Aphis gosypii. All isolates transmitted TuMV with similar efficiency using the same aphid-vector, but M. persicae transmitted the virus more efficiently than A. gosypii. Winged adults of M. persicae transmitted the virus adequately suggesting their significant role in the primary virus spread. In agreement with previous studies, winged aphids showed lower transmission in ARENA tests compared to the direct transmission assays.

13 Συντομογραφίες ιών AlfMV (Alfalfa mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού της μηδικής BMYV (Beet mild yellowing virus) Ιός του ήπιου κιτρινίσματος των τεύτλων BYDV (Barley yellow dwarf virus) Ιός του κίτρινου ναννισμού του κριθαριού BYMV (Bean yellow mosaic virus) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού της φασολιάς BYV (Beet yellows virus) Ιός του ικτέρου των τεύτλων CaMV (Cauliflower mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού του κουνουπιδιού CeMV (Celery mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού του σέλινου CLV (Carnation latent virus) Λανθάνων ιός της γαρυφαλιάς CMV (Cucumber mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού του αγγουριού CTV (Citrus tristeza virus) Ιός της τριστέτσας των εσπεριδοειδών LNYV (Lettuce necrotic yellows virus) Ιός του νεκρωτικού ικτέρου του μαρουλιού PLRV (Potato leafroll virus) Ιός του καρουλιάσματος των φύλλων της πατάτας PVA (Potato virus A) Iός Α της πατάτας PVX (Potato virus X) Ιός Χ της πατάτας PVY (Potato virus Y) Ιός Υ της πατάτας SBMV (Southern bean mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού της νότιας φασολιάς ToMV (Tomato mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού της ντομάτας TuMV (Turnip mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού TVDV (Tobacco vein distorting virus) Ιός της παραμόρφωσης των νεύρων του καπνού WMV (Watermelon mosaic virus) Ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) Ιός του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗΣ ΦΥΤΙΚΩΝ ΙΩΝ 1.1. Γενικές πληροφορίες για τους ιούς Ως μικροοργανισμοί ή μικρόβια χαρακτηρίζονται εκείνοι οι οργανισμοί τους οποίους δεν μπορούμε να διακρίνουμε με γυμνό μάτι, γιατί έχουν μέγεθος μικρότερο από 0,1 mm. Ορισμένοι από τους μικροοργανισμούς προκειμένου να επιβιώσουν και να αναπαραχθούν, περνούν ένα μέρος ή ολόκληρη τη ζωή τους στο εσωτερικό κάποιου άλλου οργανισμού. Οι μικροοργανισμοί αυτοί χαρακτηρίζονται ως παράσιτα και ο οργανισμός που τους φιλοξενεί ως ξενιστής. Οι μικροοργανισμοί που αποτελούν νοσογόνους παράγοντες, έχουν δηλαδή την ικανότητα να προκαλούν νόσο σε κάποιον οργανισμό, ονομάζονται παθογόνοι. Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί μπορεί να είναι ευκαρυωτικοί, προκαρυωτικοί ή ιοί. Στους ευκαρυωτικούς ανήκουν τα πρωτόζωα και οι μύκητες, ενώ στους προκαρυωτικούς τα βακτήρια. Οι ιοί αποτελούν ακυτταρικές, μη αυτοτελείς μορφές ζωής. Σε αντίθεση με το κύτταρο, που είναι η θεμελιώδης μονάδα της ζωής, ο ιός δεν είναι τίποτα περισσότερο από νουκλεϊκό οξύ και πρωτεΐνες. Μόνο όταν βρεθεί μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή, ο ιός «ενεργοποιείται» και εκφράζει τη χαρακτηριστικότερη ιδιότητα των ζωντανών οργανισμών, δηλαδή την αναπαραγωγή. Οι ιοί είναι μικρότεροι και από τα πιο μικρά βακτήρια (μέγεθος 20250 nm) και είναι ορατοί μόνο με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Ο ιός (virus) είναι ένα γενετικό στοιχείο που περιέχει DNA ή RNA και αντιγράφεται στο εσωτερικό ενός κυττάρου ξενιστή. Οι ιοί εξασφαλίζουν από τον ξενιστή τους μηχανισμούς αντιγραφής, μεταγραφής και μετάφρασης, καθώς και τα περισσότερα ένζυμα και υλικά που τους είναι απαραίτητα για τις λειτουργίες αυτές. Για το λόγο αυτό χαρακτηρίζονται ως υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα. Οι ιοί συγκαταλέγονται στους πολυπληθέστερους μικροοργανισμούς

16 του πλανήτη μας και μπορούν να μολύνουν κάθε είδος οργανισμού. Οι ιοί ουσιαστικά «υποχρεώνουν» το κύτταρο-ξενιστή να αναπαράγει το νουκλεϊκό τους οξύ με ακρίβεια, όπως ακριβώς κάνει και με το δικό του γονιδίωμα. Δεν ανιχνεύονται αμέσως μετά την είσοδο τους στο κύτταρο, επειδή μεσολαβεί κάποιο χρονικό διάστημα κατά το οποίο αντιγράφεται το γενετικό τους υλικό και οι πρωτεΐνες τους. Η φάση αυτή τελειώνει όταν συγκροτηθούν τα νέα ιοσωμάτια (virions). Ένας ορισμός του ιού διατυπώθηκε πρόσφατα από τον Matthews (1991) και είναι ο εξής: «ο ιός αποτελεί ένα ή περισσότερα μόρια (μήτρες) νουκλεϊκού οξέος που συνήθως περιβάλλονται από ένα προστατευτικό κάλυμμα ή καλύμματα πρωτεΐνης ή λιποπρωτεΐνης, των οποίων η αναπαραγωγή μπορεί να οργανωθεί μόνο σε ζωντανά κύτταρα του ξενιστή του». Μέσα σε αυτά τα κύτταρα η παραγωγή ιοσωματίων: α) εξαρτάται από τη «μηχανή» πρωτεϊνοσύνθεσης του ξενιστή, β) οργανώνεται από «πισίνες» των απαιτούμενων υλικών και όχι από διχοτόμηση, γ) βρίσκεται σε θέσεις του κυττάρου που δε διαχωρίζονται από το περιεχόμενό του από λιποπρωτείνη διπλού τοιχώματος και δ) εμφανίζονται νέες παραλλαγές (variants) που οφείλονται σε μεταλλαγές στο ιικό γονιδίωμα. Από τον παραπάνω ορισμό καταλαβαίνουμε ότι η δομή των ιών είναι σχετικά απλή. Αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό περίβλημα με χαρακτηριστική γεωμετρία, το καψίδιο, μέσα στο οποίο προφυλάσσεται το γενετικό τους υλικό. Ορισμένοι ιοί διαθέτουν και ένα επιπλέον περίβλημα το έλυτρο, το οποίο είναι λιποπρωτεϊνικής φύσεως. Το γενετικό υλικό μπορεί να είναι είτε DNA ή RNA και διαθέτει πληροφορίες για τη σύνθεση των πρωτεϊνών του περιβλήματος αλλά και για τη σύνθεση κάποιων ενζύμων απαραίτητων για τον πολλαπλασιασμό του. Σύμφωνα με τον ορισμό του Matthews γίνεται σαφής διάκριση ανάμεσα στους ιούς και τα άλλα παθογόνα των φυτών, όπως είναι τα ιοειδή, τα φυτοπλάσματα και οι ρικέτσιες, τα οποία προκαλούν παρόμοια συμπτώματα με αυτά των ιών. Ως προς το είδος του ξενιστή που προσβάλλουν, οι ιοί διακρίνονται σε ιούς βακτηρίων (βακτηριοφάγοι) και ιούς των ζωικών και των φυτικών κυττάρων.

17 Το γονιδίωμα των φυτικών και ζωικών ιών ποικίλλει ευρέως και κωδικοποιεί από μία έως 250 πρωτεΐνες, ενώ ειδικά, το γονιδίωμα των φυτικών ιών κωδικοποιεί μία έως 12 πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες παίζουν ρόλο στην αναπαραγωγή του ιού, τη μετακίνηση τους από κύτταρο σε κύτταρο, τη δομή του ιού και τη μετάδοση με διάφορους φορείς (έντομα, νηματώδεις ή μύκητες). Για να χαρακτηριστεί ως παθογόνο των φυτικών κυττάρων ένας ιός, θα πρέπει να αποδειχθεί ότι μεταδίδεται από ένα φυτό σε ένα άλλο και προκαλεί ασθένεια σε έναν τουλάχιστον ξενιστή. Οι περισσότεροι ιοί των φυτών είναι RNA ιοί και μπορούν να επιδράσουν δυσμενώς στην ανάπτυξη και στην απόδοση τους. Οι ιοί μεταδίδονται με έντομα, μέσω πληγών στην επιδερμίδα ή με μολυσμένο σπόρο και μοσχεύματα. 1.2. Τρόποι μετάδοσης των ιών Οι φυτικοί ιοί δεν μπορούν να μολύνουν κύτταρα άθικτων ιστών. Γι αυτό το λόγο εισέρχονται από πληγές, οι οποίες προκαλούνται μηχανικά, με επαφή και τριβή γειτονικών φυτών ή από οργανισμούς που μεταδίδουν ιούς. Ο οργανισμός ο οποίος μεταφέρει τον ιό από ασθενές σε υγιές φυτό ονομάζεται φορέας. Αν και είναι πιθανό όλοι οι φυτικοί ιοί να είχαν φορέα σε κάποια φάση, σήμερα αυτό δε συμβαίνει. Η μηχανική μετάδοση των ιών στον αγρό συμβαίνει κυρίως σε σταθερούς ιούς, που βρίσκονται στα φυτά-ξενιστές σε υψηλές συγκεντρώσεις και σε φυτά που πληγώνονται εύκολα και είναι ιδιαίτερα ευπαθή στη μόλυνση (π.χ. ο ιός Χ της πατάτας (Potato virus X, PVX)) (Loughanne & Murphy 1938). Τα είδη των ιών που αναπτύσσουν υψηλές συγκεντρώσεις στα μολυσμένα φυτά διαδίδονται ευκολότερα στον αγρό π.χ.ο ιός του μωσαϊκού της ντομάτας (Tomato mosaic virus, ToMV) που εισέρχεται στα κύτταρα των ριζών από πληγές που δημιουργούνται κατά την ανάπτυξη των ριζών μέσα στο έδαφος (Broadbent 1976). Ο πιο κοινός τρόπος μηχανικής μετάδοσης είναι κατά την εκτέλεση διαφόρων καλλιεργητικών εργασιών (μεταφύτευση, κλάδεμα κλπ).

18 Ένας κοινός τρόπος μετάδοσης είναι μέσω εντόμων καθώς πολλά έντομα αποτελούν φορείς πολλών ιών των καλλιεργούμενων φυτών (υποκεφάλαιο 1.3). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η μετάδοση των φυτικών ιών γίνεται και με νηματώδεις του εδάφους (Brown et al. 1995). Οι ιοί που μεταδίδονται με νηματώδεις ανήκουν στις ομάδες Nepovirus και Tobravirus και έχουν ευρεία γεωγραφική μετάδοση κυρίως στο βόρειο ημισφαίριο. Γενικά οι ιοί και οι νηματώδεις φορείς έχουν μεγάλο εύρος ξενιστών μεταξύ καλλιεργούμενων και αυτοφυών φυτών. Άλλοι φορείς μετάδοσης φυτικών ιών είναι οι μύκητες (Adams 1991). Μέχρι σήμερα τουλάχιστον 20 ιοί ή ασθένειες που αποδίδονται σε ιούς, χωρίς όμως να έχει απομονωθεί ο παθογόνος παράγοντας, έχουν ως φορέα μύκητα. Οι συγκεκριμένοι μύκητες είναι κατώτεροι μύκητες που ανήκουν στις τάξεις Chrytridiales και Plasmodiophorales που προσβάλλουν το ριζικό σύστημα των φυτών. Η μετάδοση των ιών με μύκητες γίνεται με μη έμμονο ή έμμονο τρόπο. Άλλος τρόπος μετάδοσης είναι η μετάδοση με το σπόρο. Η πλειοψηφία των ιών που μεταδίδονται με το σπόρο δε μεταφέρονται παθητικά ως επιμόλυνση του εξωτερικού περιβλήματος των σπερμάτων, αλλά εισχωρούν και εντοπίζονται στο έμβρυο των σπερμάτων (εμβρυακή μετάδοση). Αυτός ο τρόπος μετάδοσης χαρακτηρίζεται ως «πραγματικός» τρόπος μετάδοσης με το σπόρο καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία των ιών, καθορίζει δηλαδή τη συχνότητα μετάδοσης τους σε μια καλλιέργεια. Έχει επίσης αναφερθεί ότι 37 ιοί μεταδίδονται με τη γύρη (Mandahar 1981) είτε «κάθετα» από τη γύρη στο σπόρο, είτε «οριζόντια» με τη μολυσμένη γύρη στα υγιή φυτά. Τέλος, ως κυρίαρχοι τρόποι μετάδοσης αναφέρονται και οι εξής: μετάδοση με αγενές πολλαπλασιαστικό υλικό, με εμβολιασμό και με το παράσιτο κουσκούτα. 1.3. Η μετάδοση των φυτικών ιών με έντομα Τα έντομα προκαλούν σημαντικές ζημιές στις φυτικές καλλιέργειες με δύο

19 τρόπους: α) άμεσα καθώς ορισμένες καλλιέργειες αποτελούν υλικό για τη διατροφή τους και β) έμμεσα καθώς αποτελούν φορείς πολλών φυτικών ιών (Katis et al. 2007). 1.3.1. Μετάδοση με αφίδες Σύμφωνα με τους Watson & Roberts (1939), οι ιοί που μεταδίδονται με αφίδες διακρίνονται σε δυο κατηγορίες: στους μη-έμμονους ιούς, όταν οι αφίδες παραμένουν ιοφόρες για λίγα λεπτά και στους έμμονους ιούς, όταν οι αφίδες παραμένουν ιοφόρες για μερικές εβδομάδες έως όλη τη διάρκεια της ζωής της αφίδας. Οι ημι-έμμονοι ιοί προστέθηκαν αργότερα από τον Sylvester (1956) για να περιγράψει τους ιούς που μεταδίδονται όταν οι αφίδες είναι ιοφόρες από μία έως μερικές μέρες. Το συγκεκριμένο σύστημα χρησιμοποιείται ευρέως καθώς στηρίζεται σε συγκεκριμένη ιδιότητα των αφιδών, όπως είναι η διάρκεια διατήρησης της ιοφόρας ικανότητας, η οποία μπορεί εύκολα να εκτιμηθεί. Το δεύτερο σύστημα προτάθηκε από τους Kennedy et al. (1962) και στηρίχτηκε στη θέση συγκράτησης του ιού στο φορέα. Σύμφωνα με αυτό το σύστημα, οι ιοί που μεταδίδονται με αφίδες διακρίνονται σε αυτούς που φέρονται επί των στυλέτων και σε αυτούς που κυκλοφορούν στο σώμα του εντόμουφορέα. Το τρίτο σύστημα προτάθηκε το 1983 από τον Harris και διαιρεί τους ιούς σε δυο κατηγορίες: στους μη-κυκλοφορούντες, που περιλαμβάνονται οι μη έμμονοι και οι ημι-έμμονοι και στους κυκλοφορούντες, στους οποίους ανήκουν μόνο οι έμμονοι. Μη-έμμονοι ιοί Η πρόσληψη των μη έμμονων ιών επιτυγχάνεται μετά από νύγματα δοκιμασίας των αφίδων στα ασθενή φυτά διάρκειας λίγων δευτερολέπτων ή λεπτών. Τα ιοφόρα άτομα έχουν τη δυνατότητα άμεσης μετάδοσης του ιού σε υγιή φυτά μετά από νύγματα δοκιμασίας διάρκειας λίγων δευτερολέπτων ή λεπτών. Οι αφίδες διατηρούν τη μολυσματικότητα τους για λίγα λεπτά έως μερικές ώρες μετά την απομάκρυνση τους από το ασθενές φυτό, γι αυτό

20 άλλωστε οι ιοί ονομάζονται μη-έμμονοι (Watson & Roberts 1939). Οι αφίδες φέρουν τους ιούς πάνω ή κοντά στα στοματικά μόρια τους. Τέλος, οι ιοί δεν πολλαπλασιάζονται στους ιστούς των φορέων. Ο ιός δεν εισέρχεται στο μεσοέντερο του φορέα, γι' αυτό οι αφίδες χάνουν την ιοφόρο ικανότητα μετά την έκδυση. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης των μη-έμμονων ιών αυξάνεται, όταν τα έντομα υποβάλλονται σε νηστεία (για λίγα λεπτά ή μερικές ώρες), πριν τους επιτραπούν νύγματα δοκιμασίας σε μολυσμένα φυτά (Watson & Plumb 1972). Τα νύγματα δοκιμασίας των εντόμων μετά την νηστεία, είναι συνήθως μικρής διάρκειας (δευτερολέπτων ή λίγων λεπτών), πράγμα που ευνοεί την πρόσληψη των μη-έμμονων ιών. Επειδή η πρόσληψη και η μετάδοσή τους επιτυγχάνεται με νύγματα δοκιμασίας ακόμη και 10 δευτερολέπτων πιστεύεται ότι τόσο η πρόσληψη, όσο και η μετάδοση, των ιών αυτών γίνεται στα επιδερμικά κύτταρα του ξενιστή. Η παρουσία των ιών αυτών στα επιδερμικά κύτταρα των ξενιστών τους, δικαιολογεί και τη σχετικά εύκολη μετάδοση τους μηχανικά (με φυτικό εκχύλισμα) στο εργαστήριο. Παραδείγματα μη έμμονων ιών είναι οι ιοί των γενών Potyvirus, Carlavirus, Caulimovirus, Cucumovirus, Alfamovirus και Fabavirus. Ημι-έμμονοι ιοί Τα έντομα φορείς διατηρούν την ικανότητα μετάδοσης των ημι-έμμονων ιών μέχρι 3 έως 4 μέρες. Εξακολουθούν όμως να θεωρούνται μη έμμονοι με την έννοια ότι δεν κυκλοφορούν στο σώμα των εντόμων (Harris 1981). Ο ελάχιστος χρόνος πρόσληψης τους είναι 30 λεπτά, αν και η αποτελεσματικότητα μετάδοσης είναι μεγαλύτερη, όταν ο χρόνος πρόσληψης αυξάνεται σε μερικές ώρες. Όπως και οι έμμονοι ιοί, οι ήμι-έμμονοι εντοπίζονται συνήθως στο φλοίωμα των ασθενών φυτών. Η νηστεία των αφίδων πριν από τα νύγματα διατροφής στα μολυσμένα φυτά δεν αυξάνει την αποτελεσματικότητα μετάδοσής τους. Δε μεταδίδονται μετά την έκδυση των αφίδων. Παραδείγματα ημι-έμμονων ιών είναι: ο ίκτερος των τεύτλων (Beet yellows virus, BYV), η τριστέτσα των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, CTV) κ.α.

21 Έμμονοι ιοί Η πρόσληψη των έμμονων ιών απαιτεί μεγάλης διάρκειας τροφική δραστηριότητα της αφίδας στο μολυσμένο φυτό-ξενιστή του ιού. Είναι χαρακτηριστικό ότι η απόδοση της μετάδοσης αυξάνεται, όταν ο χρόνος διατροφής κυμαίνεται από 6 έως 24 ώρες (Katis et al. 2006). Αμέσως μετά την πρόσληψη του ιού από το φορέα, ο ιός απενεργοποιείται παροδικά, καθώς παρατηρείται μια λανθάνουσα περίοδος (ή φάση λυσιγονίας) μεγαλύτερη των 12 ωρών, κατά τη διάρκεια της οποίας, ο ιός κυκλοφορεί στο σώμα του εντόμου. Στη συνέχεια, το έντομο γίνεται μολυσματικό. Τα έντομα διατηρούν την ικανότητα μετάδοσης των έμμονων ιών είτε για μια εβδομάδα είτε για όλη τους τη ζωή. Τα ιοφόρα άτομα διατηρούν τη μολυσματικότητα και μετά την έκδυση, ένα φαινόμενο που καλείται ως «μετάδοση του ιού από στάδιο σε στάδιο». Σε αυτό το σημείο αξίζει να σημειωθεί ότι οι έμμονοι ιοί εμφανίζουν υψηλό βαθμό εξειδίκευσης στη σχέση τους με το φορέα. Η μετάδοση τους γίνεται μόνο από είδη αφίδων που ξενίζουν τον ξενιστή του ιού. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης δεν αυξάνεται όταν τα έντομα υποβληθούν σε νηστεία, πριν τραφούν στα ασθενή φυτά. Οι έμμονοι ιοί εντοπίζονται στο φλοίωμα των φυτών. Παραδείγματα έμμονων ιών είναι ο ιός του κίτρινου νανισμού του κριθαριού (Barley yellow dwarf virus, BYDV), ο οποίος δεν πολλαπλασιάζεται στο φορέα (Paliwal & Sinha 1970) και ο ιός του νεκρωτικού ίκτερου του μαρουλιού (Lettuce necrotic yellows virus, LNYV) που πολλαπλασιάζεται στο φορέα (O Loughlin & Chambers 1967). 1.3.2. Μετάδοση με άλλα έντομα Εκτός από τις αφίδες, έντομα των οικογενειών Cicadellidae, Delphacidae και Membracidae αποτελούν μερικούς από τους σπουδαιότερους φορείς ιών. Ο τρόπος μετάδοσης των ιών σε αυτήν την περίπτωση είναι είτε έμμονος είτε ημιέμμονος. Άλλα έντομα φορείς είναι οι αλευρώδεις (Aleurodidae), τα κολεόπτερα (σκαθάρια), οι ψευδόκοκκοι (Pseudococcidae), οι θρίπες, τα ακάρεα και άλλα. Οι μη-έμμονοι ιοί μεταδίδονται συνήθως με αφίδες ενώ οι ημι-έμμονοι ιοί

22 μεταδίδονται με αφίδες, αλευρώδεις,τζιτζικάκια και ψευδόκοκκους. 1.4. Μηχανισμοί μη-έμμονης μετάδοσης Οι μηχανισμοί μη-έμμονης μετάδοσης φυτικών ιών από τις αφίδες αποτελούν αντικείμενο εκτεταμένης έρευνας. Υπάρχουν πολλές θεωρίες που προσπαθούν να εξηγήσουν αυτούς τους μηχανισμούς. Οι θεωρίες που είναι κοινά αποδεκτές από την επιστημονική κοινότητα σχετικά με την αφιδομετάδοση των μη-έμμονων ιών είναι η θεωρία της απορρόφησης-έκκρισης (IngestionEgestion Theory, I-ET) και η θεωρία της έκκρισης σιέλου (Ingestion-Salivation Hypothesis, I-SH) (Εικ. 1). Το σύνολο των φυτικών ειδών πάνω στα οποία μπορεί να τραφεί ένα είδος εντόμου είναι γνωστό ως εύρος ξενιστών αυτού του εντόμου. Αυτό μπορεί να είναι στενό ή ευρύ αλλά ποτέ δεν περιλαμβάνει το σύνολο των φυτικών ειδών. Συνήθως, τα έντομα αναζητούν τα φυτά εκείνα που τους προσφέρουν τα θρεπτικά συστατικά που τους είναι απαραίτητα. Οι αφίδες αποτελούν έντομα που εξερευνούν υπομονετικά τη φύση προς εύρεση του φυτού-ξενιστή τους. Σύμφωνα με την πρώτη θεωρία αφιδομετάδοσης (I-ET) φυτικών ιών, οι αφίδες ελέγχουν και ουσιαστικά «δοκιμάζουν» το χυμό κάθε φυτού, ώστε να αποφασίσουν αν πρόκειται για τον κατάλληλο ξενιστή τους. Η διαδικασία αυτή συνοδεύεται λοιπόν, από απορρόφηση αλλά και αποβολή φυτικού πρωτοπλάσματος μέσα στο φυτό όπως και από έγχυση σιέλου. Η έκκριση σιέλου πραγματοποιείται τη στιγμή της απόσυρσης του στιλέτου της αφίδας από το φυτό. Ως συνέπεια της συμπεριφοράς τους, οι αφίδες μπορούν να απορροφήσουν κάποιο παθογόνο παράγοντα και να τον μεταδώσουν στο επόμενο φυτό μέσω της ίδιας διαδικασίας. Ο ιός εισέρχεται στο υγιές φυτό κατά τη διάρκεια της ενδοκυτταρικής αποβολής της τροφής της αφίδας, ενώ αυτή ερευνά τον επόμενο πιθανό φυτικό ξενιστή (Harris & Bath 1973, Harris 1977).

23 Εικόνα 1: Αναπαράσταση του μοντέλου μετάδοσης του ιού μέσω της θεωρίας έκκρισης σιέλου (salivation theory) μετά από την είσοδο του στυλέτου της αφίδας μέσα στο κύτταρο (αριστερά). «Μόλυνση» αφίδας με τον ιό μέσω της λήψης τροφής από μολυσμένο φυτό (ingestion). Η αφίδαφορέας θα μολύνει το επόμενο φυτό μέσω απορρόφησης-έκκρισης σιέλου (δεξιά) (Martin et. al. 1997) Η δεύτερη θεωρία αφιδομετάδοσης (I-SH) προτάθηκε αρχικά από τον Martin et. al. (1997) και αναλύθηκε περαιτέρω από τους Collar & Fereres (1997, 1998), και απο τους Fereres & Collar (2001). Ο εναλλακτικός αυτός μηχανισμός υποστηρίζει ότι οι αφίδες μολύνουν τα φυτά με τα ιοσωμάτια με έκκριση σιέλου μέσα στον πρωτοπλάστη, πριν ή χωρίς να πραγματοποιήσουν τη διαδικασία απορρόφησης πρωτοπλάσματος. Με άλλα λόγια, η διαδικασία της απορρόφησης δεν συμμετέχει στο μηχανισμό απελευθέρωσης του ιού στον ξενιστή. Ο ιός εισέρχεται στο υγιές φυτό κατά την αρχική διάτρηση της επιδερμίδας του φυτού. 1.5. Φυτικοί ιοί που μεταδίδονται με μη έμμονο τρόπο Σε αυτό το κεφάλαιο γίνεται μια προσπάθεια ομαδοποίησης των φυτικών ιών που μεταδίδονται με μη έμμονο τρόπο, σύμφωνα με το νέο σύστημα ταξινόμησής τους. Η νέα ταξινόμηση επικυρώθηκε από τη συνέλευση της Διεθνούς Επιτροπής για την ταξινόμηση (International Committee of Taxonomy of Viruses, ICTV) τo 1997. Με το σύστημα αυτό οι φυτικοί ιοί έχουν οργανωθεί σε οικογένειες και γένη, σύμφωνα δηλαδή με την εθιμοτυπική ιεραρχία του Λινναίου και τη φυλογενετική συσχέτιση (Martelli 1997).

24 Α. Οικογένεια Bromoviridae (ιοί με ssrna τριμερές γονιδίωμα) Περιλαμβάνει τα γένη Bromovirus, Cucumovirus, Ilavirus, Alfamovirus και Oleavirus, τα οποία διαφέρουν ως προς τη μορφολογία και το μέγεθος των ιοσωματίων, τον τύπο του φορέα καθώς και τον τρόπο μετάδοσης. Οι ιοί του γένους Cucumovirus καθώς και του γένους Alfamovirus μεταδίδονται εύκολα στο εργαστήριο μηχανικά, ενώ στη φύση μεταδίδονται με αφίδες με μη έμμονο τρόπο. Ένα τυπικό μέλος του γένους Cucumovirus είναι ο ιός του μωσαϊκού της αγγουριάς (Cucumber mosaic virus, CMV), ενώ του γένους Alfamovirus είναι ο ιός του μωσαϊκού της μηδικής (Alfalfa mosaic virus, AlfMV). B. Οικογένεια Potyviridae (ιοί με + ssrna γονιδίωμα) Τα μέλη της οικογένειας διαιρούνται, ανάλογα με το μέγεθος των ιοσωματίων και του γονιδιώματος, την οργάνωση του γονιδιώματος και τον τύπο του φορέα σε τρία γένη: Potyvirus (μετάδοση με αφίδες), Rymovirus (μετάδοση με ακάρεα) και Bymovirus (μετάδοση με αλευρώδεις). Οι ιοί του γένους Potyvirus μεταδίδονται με αφίδες με μη έμμονο τρόπο. Ορισμένα μέλη του ίδιου γένους μεταδίδονται και με το σπόρο κάποιων ξενιστών (Hollings & Brunt 1981), ενώ ένας μικρός αριθμός ιών μεταδίδονται με τη γύρη. Τυπικά μέλη του γένους Potyvirus είναι ο ιός Υ της πατάτας (Potato virus Y, PVY) καθώς και ο ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV), η μετάδοση του οποίου μελετάται στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή. Γ. Οικογένεια Caulimoviridae (ιοί με dsdna γονιδίωμα) Περιλαμβάνει τα γένη Caulimovirus και Badnavirus. Το χαρακτηριστικό τους είναι ότι αναπαράγονται με αντίστροφη μεταγραφή, όπως οι ρετροιοί. Δεν ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η αναπαραγωγή τους περιλαμβάνει μια φάση στον πυρήνα (μεταγραφή) και μια φάση στο κυτταρόπλασμα (μετάφραση). Η συγκρότηση των ιοσωματίων πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα. Οι ιοί του γένους Caulimovirus μεταδίδονται στη φύση με αφίδες με μη έμμονο ή ημι-έμμονο τρόπο. Δε μεταδίδονται με το σπόρο. Στο εργαστήριο ορισμένα είδη μεταδίδονται εύκολα μηχανικά ενώ άλλα δε μεταδίδονται μηχανικά

25 (Shepherd & Lawson 1981). Ένα τυπικό μέλος αυτού του γένους είναι ο ιός του μωσαϊκού του κουνουπιδιού (Cauliflower mosaic virus, CaMV). Δ. Ανεξάρτητα γένη (ιοί με + ssrna γονιδίωμα) Τα μέλη του γένους Sobemovirus έχουν περιορισμένο εύρος ξενιστών και μερικά μέλη μεταδίδονται με το σπόρο. Επίσης, μεταδίδονται μηχανικά στο εργαστήριο, ενώ στη φύση μεταδίδονται με αφίδες, τζιτζικάκια και κολεόπτερα με μη έμμονο ή ημι-έμμονο τρόπο (Sehgal 1981). Μερικά μέλη μεταδίδονται με τη γύρη στο σπόρο σε υγιή φυτά. Ένα τυπικό μέλος του γένους είναι ο ιός του μωσαϊκού της νότιας φασολιάς (Southern bean mosaic virus, SBMV). Τα μέλη του γένους Carlavirus έχουν περιορισμένο εύρος ξενιστών και δεν προκαλούν σοβαρές ασθένειες, με εξαίρεση ορισμένους ιούς των ψυχανθών. Μεταδίδονται μηχανικά στο εργαστήριο ενώ στη φύση μεταδίδονται με αφίδες με μη έμμονο τρόπο (Wetter & Milne 1981). Έχει επίσης αναφερθεί μετάδοση με αλευρώδεις και με το σπόρο. Ένα τυπικό μέλος του αυτού του γένους είναι ο λανθάνων ιός της γαριφαλιάς (Carnation latent virus, CLV).

26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΙΟΣ ΤΟΥ ΜΩΣΑΪΚΟΥ ΤΟΥ ΓΟΓΓΥΛΙΟΥ (Turnip Mosaic Virus, TuMV) Ο TuMV ανήκει στο γένος Potyvirus της οικογένειας Potyviridae (Tomimura 2004). Μολύνει μεγάλο εύρος φυτικών ειδών, κυρίως της οικογένειας Brassicaceae. Αποτελεί τον πιο διαδεδομένο και σημαντικό ιό που μολύνει τόσο καλλιεργούμενα φυτικά είδη (κηπευτικά και καλλωπιστικά) όσο και αυτοφυή φυτά σε όλο τον κόσμο. Σε έρευνα που διεξήχθη σε 28 χώρες και αφορούσε τους φυτικούς ιούς, ο TuMV κατατάχθηκε δεύτερος στην κατηγορία των ιών με τη μεγαλύτερη οικονομική σημασία, μετά τον CMV (Tan et al. 2005,Tomlinson 1987, Walsh & Jenner 2002). 2.1. Οικογένεια Potyviridae Τα μέλη της οικογένειας διαιρούνται, ανάλογα με το μέγεθος των ιοσωματίων και του γονιδιώματος, την οργάνωση του γονιδιώματος και τον τύπο του φορέα, σε τρία γένη: Potyvirus, Rymovirus και Bymovirus. Τα ιικά σωματίδια της οικογένειας είναι νηματοειδή διαμέτρου 11-15nm, τα οποία περιέχουν μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας (Εικ. 2). Τα μέλη της οικογένειας που περιέχουν ένα μόριο RNA στα ιικά σωματίδια τους, όπως τα μέλη του γένους Potyvirus, έχουν μήκος 650-950 nm. Το μήκος του γονιδιώματος ποικίλλει από 8 έως 11 Kb (μοριακό βάρος 2.7 x 10 6 έως 3 x 106 ). Το γενωμικό RNA συνδέεται στο 5 άκρο του με μια RNA-συνδεόμενη πρωτεΐνη που ονομάζεται VPg (μοριακό βάρος 24000), ενώ στο 3 άκρο υπάρχει πολυ-αδενική ουρά (polya tail). Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη είναι πολυ-λειτουργική και παίζει σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής αυτών των ιών, καθώς συνεργάζεται με την RNA πολυμεράση κατά τον πολλαπλασιασμό του RNA. Επίσης, φαίνεται να ευθύνεται και για το μικρό εύρος ξενιστών (Tomimura et al. 2004). Η καψιδιακή πρωτεΐνη (CP) των περισσότερων μελών της οικογένειας Potyviridae έχει

27 μοριακό βάρος 30-37 KDa. Όλα τα μέλη επάγουν το σχηματισμό κυλινδρικών εγκλείστων στο κυτταρόπλασμα του ξενιστή, τα οποία αποτελούνται από μια πρωτείνη 70 KDa. Ορισμένα μέλη επάγουν επίσης το σχηματισμό πυρηνικών εγκλείστων, τα οποία αποτελούνται από 2 είδη πρωτεϊνών (49 και 58 KDa). Τα μέλη του γένους Potyvirus μεταδίδονται με αφίδες, τα μέλη του γένους Rymovirus μεταδίδονται με τα ακάρεα, ενώ τα μέλη του γένους Bymovirus μεταδίδονται μεσω του μύκητα Polymyxa graminis. Εικόνα 2: Ηλεκτρονική μικρογραφία του ραβδόμορφου ιικού σωματιδίου του γένους Potyvirus (Berger et. al. 2000) Τα περισσότερα μέλη της οικογένειας Potyviridae έχουν περιορισμένο ή πολύ περιορισμένο εύρος ξενιστών αν και ορισμένα μέλη μολύνουν ένα μεγάλο εύρος μονοκοτυλήδονων και δικοτυλήδονων φυτών. Παρόλα αυτά, τα μέλη αυτής της οικογένειας μολύνουν ορισμένα από τα πιο σημαντικά καλλιεργούμενα είδη. Τα συμπτώματα που προκαλούν διαφοροποιούνται σημαντικά, ανάλογα µε το γενότυπο του φυτού, το στέλεχος του ιού, το χρόνο προσβολής (πρώιµα-όψιµα) και τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Οι περισσότεροι προκαλούν μωσαϊκό και κηλιδώσεις στα φύλλα, δυσχρωμίες στα άνθη, στίγματα και αλλοιώσεις στους καρπούς αλλά και μείωση της απόδοσης και της ποιότητας της παραγωγής.

28 2.2. Γένος Potyvirus Αποτελεί το πολυπληθέστερο γένος της οικογένειας Potyviridae, με τα περισσότερα μέλη του γένους να έχουν περιορισμένο εύρος ξενιστών, αλλά να προκαλούν σοβαρές ασθένειες. Το μονόκλωνο RNA γονιδίωμα θετικής πολικότητας βρίσκεται σε εύκαμπτα ραβδόμορφα ιοσωμάτια μήκους 680-900 nm και πάχους 11 nm, τα οποία περιέχουν 5-8% RNA, 92-95% πρωτεΐνη και 0% λιπίδια. Το RNA αποτελείται από 9000-12000 nt, ενώ στα άκρα του υπάρχουν πάντοτε μη μεταφραζόμενες περιοχές, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάφραση των πρωτεϊνών του. Το μοναδικό πλαίσιο ανάγνωσης του ιικού γονιδιώματος κωδικοποιεί μια πολυπρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από 10 δομικές και μη δομικές ιικές πρωτεΐνες (Berger et al. 2000) (Εικ. 3). Εικόνα 3: Η οργάνωση του γονιδιώματος των γενών Potyvirus της οικογένειας Potyviridae. AI: πρωτεΐνη που δημιουργεί άμορφα έγκλειστα, CI: πρωτεΐνη που δημιουργεί κυλινδρικό έγκλειστο. NIa and Nib: πρωτεΐνες που συναθροίζονται στον πυρήνα και δημιουργούν έγκλειστα, NIa: πρωτείνη που κόβει την ιική πολυπρωτείνη σε διαφορετικές πρωτεΐνες, CP: καψιδιακή πρωτείνη, HC-Pro: πολυλειτουργική πρωτεΐνη: βοηθητική πρωτεΐνη αφιδομετάδοσης και VPg: πρωτεΐνη που συνδέεται στο 5 άκρο του ιικού RNA (Berger et al. 2000) Η πρωτεΐνη 1 (P1) που βρίσκεται στο 5 άκρο του γονιδιώματος δεν είναι συντηρημένη μεταξύ των διαφόρων ειδών. Ο πολλαπλασιασμός του γονιδιώματος πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα. Παρά το γεγονός ότι η P1 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και προωθεί την μετακίνηση του ιού στο φυτό, δεν είναι απαραίτητη για τη μολυσματικότητα του ιού. Οι πρωτεΐνες των 6 KDa

29 εμπλέκονται στην διακυτταρική μετακίνηση των ιών και στην εμφάνιση των συμπτωμάτων. Η πρωτεΐνη NIa-Pro προκαλεί πρωτεόλυση της πολυπρωτεΐνης. Η CP εμπλέκεται στην αφιδομετάδοση, στη διακυτταρική μετακίνηση, την καψιδίωση του ιικού RNA και στη ρύθμιση του ιικού πολλαπλασιασμού. Οι αλληλουχίες της CP έχουν αναλυθεί εκτενώς και αποτελούν μέτρο σύγκρισης της ομοιότητας μεταξύ διαφορετικών ειδών Potyvirus (Tomimura et al. 2004). Σε αρκετά μέλη του γένους, η μετάδοση στη φύση με αφίδες πραγματοποιείται μέσω μιας βοηθητικής πρωτεΐνης (HC-Pro) που παράγεται στο κυτταρόπλασμα του μολυσμένου ξενιστή. Η HC-Pro είναι πολυ-λειτουργική και αναλύεται εκτενώς στο υποκεφάλαιο 3.4. Η μετάδοση με αφίδες γίνεται με μη έμμονο τρόπο. Τέλος, έχει καταγραφεί μετάδοση ορισμένων μελών είτε με το σπόρο είτε με τη γύρη. Ορισμένα τυπικά μέλη του γένους είναι ο ιός του κίτρινου μωσαϊκού της φασολιάς (Bean yellow mosaic virus, BYMV), ο ιός του μωσαϊκού του σέλινου (Celery mosaic virus, CeMV) και ο ιός TuMV. 2.3. Ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus,tumv) Ο TuMV αποτελεί τον πιο σημαντικό και συχνότερα ανιχνεύσιμο ιό στις καλλιέργειες λάχανου (οικογένεια Brassicaceae), παγκοσμίως. Ανιχνεύεται ευρέως σε εύκρατες και υποτροπικές περιοχές όπως είναι η Αφρική, η Ασία, η Ευρώπη, η Βόρεια και η Νότια Αμερική (Provvidenti,1996). Αποτελεί τον δεύτερο σημαντικότερο ιό των καλλιεργειών λαχανικών μετά CMV καθώς μπορεί να προκαλέσει μεγάλη οικονομική ζημιά στην γεωργική παραγωγή (Tomlinson 1987, Walsh & Jenner 2002). Τα ιικά σωματίδια είναι εύκαμπτα νηματοειδή, μήκους 680-754 nm, καθένα από τα οποία περιέχει ένα μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας (Farzadfar et al. 2009). Το γονιδίωμα έχει μήκος 9830 νουκλεοτίδια και η οργάνωση του είναι

30 πανομοιότυπη με αυτήν των υπολοίπων μελών του γένους Potyvirus (Shukla et al.1994). Ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά στα φυτικά είδη Brassica chimensis, B. japonica και B. rapa, στις ΗΠΑ. Σε γενικές γραμμές, η ποικιλία των ξενιστών είναι ευρεία: μολύνει 318 είδη σε 156 γένη, τα οποία ανήκουν σε 43 διαφορετικές οικογένειες φυτικών ειδών (Shukla et al.1994). Τα διαφορετικά στελέχη του TuMV διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους στη μολυσματικότητα αλλά και στα συμπτώματα που προκαλούν στα φυτά. Το 1975, τα στελέχη διαχωρίστηκαν σε δυο κατηγορίες: στον τύπο Ι ανήκουν τα στελέχη που μπορούν να μολύνουν όλα τα είδη του γένους Brassica, ενώ στον τύπο ΙΙ ανήκουν τα στελέχη εκείνα που δεν μπορούν να μολύνουν όλα τα είδη του γένους. Δώδεκα στελέχη του ιού έχουν χαρακτηριστεί πλήρως μετά από τη μελέτη του παθολογικού φαινοτύπου σε φυτά του είδους Brassica napus (Jenner & Walsh 1996). Μεταδίδεται, όπως και οι υπόλοιποι ιοί του ίδιου γένους, με τις αφίδες με μη έμμονο τρόπο (Hamlyn 1953). Οι σημαντικότεροι φορείς μετάδοσης του ιού είναι οι αφίδες Myzus persicae και Aphis gossypii. Συνολικά έχουν αναφερθεί 89 είδη αφίδων που είναι ικανά να μεταδώσουν τον ιό, συμπεριλαμβανομένου και του είδους Brevicoryne brassicaceae (L.) (Edwardson & Christie 1991). Τα συμπτώματα που προκαλεί περιλαμβάνουν στίγματα, νεκρωτικά σχέδια δακτυλίου στα λάχανα, στα κουνουπίδια και στα λαχανάκια Βρυξελλών. Άλλοι ξενιστές μπορεί να εμφανίσουν μωσαϊκό, παραμόρφωση, ζάρωμα και αδρότητα στα φύλλα, δυσχρωμία στα άνθη και μη φυσιολογική ανάπτυξη (Εικ. 4).Έχει μάλιστα αναφερθεί ότι αν ορισμένα φυτά μολυνθούν από τον TuMV, τότε τα φυτά δεν επιβιώνουν (Shattuck 1992). Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις στελεχών τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα μετάδοσης με αφίδες (Sako 1980, Hu et al. 1996). Έχει μάλιστα αποδειχθεί ότι μια νουκλεοτιδική αντικατάσταση στην αλληλουχία, που κωδικοποιεί την αμινοτελική περιοχή της CP του ιού, μπορεί να επηρεάσει την μολυσματικότητα και τη μετάδοση του ιού με αφίδες (Kantrong et al. 1995). Αυτή

31 η διαπίστωση είναι πολύ σημαντική καθώς δείχνει ότι η μετάδοση με αφίδες σχετίζεται άμεσα με την εξωτερική επιφάνεια (CP) του ιού. Παρά το γεγονός ότι ορισμένοι ιοί έχουν χάσει την ικανότητα αφιδομετάδοσης, εξακολουθούν να μολύνουν και να προκαλούν νόσο σε διάφορα είδη φυτών. Το 1996, αναφέρθηκε μόλυνση κουκιών (Vicia faba L.) σε μια περιοχή της Κίνας (Hu et al. 1996). Τα τυπικά συμπτώματα των μολυσμένων φύλλων ήταν λευκές κηλιδώσεις καθώς και κόκκινες νεκρωτικές περιοχές. Η μελέτη των βιολογικών χαρακτηριστικών του μολυσματικού παράγοντα της νόσου οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός στελέχους του TuMV που δεν μεταδίδεται με αφίδες. Κύκλος της ασθένειας Η φυσική εξάπλωση του ιού στον αγρό εξαρτάται από τις αφίδες. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV διαφέρει και εξαρτάται από το είδος της αφίδας αλλά και από τη σχέση μεταξύ αφίδας και ξενιστή (Shattuck 1992). Σε γενικές γραμμές, οι αφίδες διατηρούν τον ιό για λίγα λεπτά μετά τη μόλυνση τους. Οι καιρικές συνθήκες που ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των αφίδων και τη μετανάστευσή τους, διευκολύνουν τη διάδοση του ιού. Έχουν παρατηρηθεί μικτές μολύνσεις του TuMV με άλλους ιούς όπως ο CMV, ο PVY, o ιός του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV), ο ιός του μωσαϊκού της καρπουζιάς (Watermelon mosaic virus, WMV) κ.α. (Sako & Ogata 1981, Fujisawa 1985, Wang et. al. 1998, Dombrovsky et. al. 2005). Πηγές του ιού αποτελούν οι μολυσμένες καλλιέργειες, όπως διάφορα φυτικά είδη του γένους Brassica (γογγύλι, ραπανάκι κ.α.) αλλά και τα πολυάριθμα είδη ζιζανίων. (Rimmer et. al. 2007).

32 Εικόνα 4: Στην εικόνα Α παρατηρείται μωσαϊκό στις πράσινες περιοχές του φύλλου, οι οποίες περικυκλώνονται από κίτρινες νεκρωτικές περιοχές (φύλλο γογγυλιού). Φύλλα από ραπανάκι (εικόνα B και Γ) τα οποία εμφανίζουν νεκρωτικές κηλίδες και μωσαϊκό. Οι φωτογραφίες B και Γ αφορούν ραπανάκια ποικιλίας Saxa 2 που μολύνθηκαν μηχανικά με τον ιό κατά τη διάρκεια της παρούσας διπλωματικής διατριβής Καταπολέμηση Είναι σημαντικό οι καλλιεργητές να γνωρίζουν τα καλλιέργούμενα και τα αυτοφυή είδη που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην εξάπλωση του TuMV. Σε περιοχές καλλιέργειας ευπαθών ξενιστών, είναι απαραίτητη η συνεργασία μεταξύ των αγροτών ώστε να διατηρούν τα χωράφια τους καθαρά από ζιζάνια με σκοπό

33 να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα διάδοσης του ιού. Οι ημερομηνίες σποράς και συγκομιδής θα πρέπει να τροποποιούνται έτσι ώστε να μη συμπίπτουν με τις περιόδους στις οποίες ο αριθμός των αφίδων είναι αυξημένος οπότε και είναι αυξημένη η πιθανότητα μετάδοσης του ιού. Επίσης, τα εισαγόμενα φυτά και σπόροι θα πρέπει να ελέγχονται για μόλυνση με TuMV (Rimmer et. al. 2007). Η χρήση εντομοκτόνων συμβάλλει στην πρόληψη της ασθένειας καθώς μειώνει τον πληθυσμό των αφίδων, αρκεί να χρησιμοποιούνται οι σωστές δόσεις και ο ψεκασμός να γίνεται τη σωστή στιγμή και στη σωστή συχνότητα, γι' αυτό είναι απαραίτητη η ενημέρωση του καλλιεργητή από ειδικούς γεωπόνους πριν τη χρήση εντομοκτόνων (Shattuck 1992). Η ικανότητα μετάδοσης του ιού με τις αφίδες μειώνεται επίσης και με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων (γ-ανοσοσφαιρίνες- IgG). Αν τα ιοφόρα άτομα καταναλώσουν θρεπτικό υλικό που περιέχει γ-ανοσοσφαιρίνες, τότε η μετάδοση του ιού μειώνεται σε αξιοσημείωτο βαθμό (Fujisawa 1985). Ουσιαστικά, πρόκειται για έναν προτεινόμενο τρόπο αντιμετώπισης για τον περιορισμό ενδεχόμενης εμφάνισης του ιού σε κάποια περιοχή, το οποίο έχει άμεσα και μακροπρόθεσμα αποτελέσματα καθώς απευθύνεται στο φορέα και όχι στον ξενιστή. 2.4. Ξενιστές του TuMV Ο ιός του TuMV σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία εμφανίζει ευρύ κύκλο ξενιστών, ο οποίος περιλαμβάνει τόσο καλλιεργούμενα φυτά (κηπευτικά (Πιν. 1), καλλωπιστικά (Πιν.3)) όσο και αυτοφυή φυτά (ζιζάνια) (Πιν.2).

34 Πίνακας 1: Καλλιεργούμενα φυτά (κηπευτικά) ξενιστές του TuMV Οικογένεια/Είδος Κοινό όνομα (αναφορά) Amaranthaceae Spinacia oleracea L. Σπανάκι (Sako 1980, Brunt et al. 1996) Asteraceae Carthamus tinctorius L. Κάρθαμο (Klisiewicz 1981) Cynara scolymus L. Αγκινάρα (Gallitelli et al. 2004) Lactuca sativa L. Μαρούλι (Brunt et al. 1996) Chenopodiaceae Beta vulgaris L. Κοκκινογούλι (Brunt et al. 1996) Crucifereae (Brassicaceae) Brassica campestris ssp. pekinensis Κινέζικο λάχανο (Brunt et al. 1996) B. chinesis cv. Ajaohuang Κινέζικο πλατύ λάχανο (Hu et al.1996) B. juncea (L.) Czern. Σινάπι φαιό (Brunt et al. 1996, Hu et al.1996, Chivasa et al. 2002) B. napus L. Ελαιοκράμβη (Ohshima et. al. 2007) B. napus ssp. oleifera Ελαιοκράμβη (Shahraeen et al. 2003) B. nigra L. Σινάπι μαύρο (Sako & Ogata 1981, Spak 1991) B. oleracea var. botrytis Κουνουπίδι (Evans 1971) B. oleracea var. capitata f. album Άσπρο λάχανο (Walkey et al. 1978) B. oleracea var. capitata f. rubra Κόκκινο λάχανο (Walkey & Webb 1978) B. oleracea var. italica Μπρόκολο (Benetti et al. 1978) B. rapa L. Γογγύλι (Ohshima et. al. 2007) B. perviridis L. H. Bailey. Σινάπι (Wang et al. 1998) Raphanus sativus L. Ρεπάνι (Sako 1980, Brunt et al 1996, Hu et al.1996) Sinapis alba L. Σινάπι άσπρο (Spak 1991)

35 Curcubitaceae Cucumis sativus L. Αγγούρι (Wang et al. 1998) Curcubita maxima Duch. Κολοκύθα (Sako & Ogata 1981) C. pepo L. Κολοκυθάκι (Sako & Ogata 1981, Brunt et al. 1996) Fabaceae (Leguminosae) Arachis hypogaea L. Αραχίδα (Hu et al.1996) Cicer arietinum L. Ρεβίθι (Brunt et al. 1996) Lens esculenta Moench. Φακή (Brunt et al, 1996) Lupinus albus L. Λούπινα (Brunt et al. 1996) Pisum sativum L. Μπιζέλι (Provvidenti 1978, Brunt et al. 1996, Hu et al.1996) Vicia faba L. Κουκιά (Hu et al.1996) Malvaceae Hibiscus esculentus (L.) Moench. Μπάμια (Chivasa et al. 2002) Musaceae Musa sapientum Linn. Μπανάνα (Chivasa et al. 2002) Polygonaceae Rheum L. Σέσκουλο (Robertson & Ianson 2005) Tetragoniaceae Tetragonia expansa Murray. Σπανάκι Νέας Ζηλανδίας (Brunt et al. 1996, Hu et al. 1996) Solanaceae Nicotiniana tabacum L. Καπνός (Brunt et al. 1996)

36 Πίνακας 2: Αυτοφυή φυτά (ζιζάνια) ξενιστές του TuMV Οικογένεια/Είδος Κοινό όνομα (αναφορά) Amarynthaceae Amaranthus caudatus L. (Brunt et al. 1996) A. hybridus L. Πλαγιαστό βλήτο (Chivasa et al. 2002) Gomphrena globosa L. Γκομφρένα ή βουρτσάκι (Stobbs & Stirling 1990, Brunt et al. 1996) Carryophyllaceae Arenaria serpyllifolia L. (Stobbs & Stirling 1990) Spergula arvensis L. Σπέργκουλα (Stobbs & Stirling 1990) Stellaria media L. Στελλάρια (Stobbs & Stirling 1990, Brunt et al. 1996) Chenopodiaceae Chenopodium album L. Λουβουδιά (Brunt et al. 1996) C. album spp. amaranticolor Λουβουδιά (Brunt et al. 1996, Hu et al.1996) C.murale L. Λουβουδιά (Brunt et al. 1996) C. quinoa Wild. Λουβουδιά (Brunt et al. 1996, Hu et al.1996) Commelinaceae Commelina bengalensis Linn. (Chivasa et al. 2002) Compositeae (Asteraceae) Bidens pilosa L. (Chivasa et al. 2002) Calendula officinalis L. Καλέντουλα (Brunt et al. 1996) Cichorium endive var. crispa Άγριο κιχώριον, Αντίδι (Brunt et al. 1996) Conyza sumatrensis (Retz.) E.Walker. Κόνυζα (Chivasa et al. 2002) Cynara cardunculus L. Αγριοαγκινάρα (Gallitelli et al. 2004) Calinsoga parviflora Γκαλινσόγκα (Chivasa et al. 2002) Senecio vulgaris L. Μαρτιάκος (Brunt et al. 1996)

37 Sonchus asper (L.) Hill. Ζωχός (Stobbs & Stirling 1990) S. oleraceus L. Ζωχός (Chivasa et al, 2002) Crucifereae (Brassicaceae) Alliaria officinalis Andrz. ex M. Bieb. Αλλιάρια (Guglielmone et al. 2000) A. petiolata (M. Bieb) Cavara & Grande. Αλλιάρια, άγριο σινάπι (Stobbs et al. 1990) Brassica campestris L. Αγριολάχανο (Stobbs & Stirling 1990) B. napus L. sp. oleifera (Metzger) Sink. Ελαιοκάμβη (Stobbs & Stirling 1990) Capsella bursa-pastoris (L.) Medic. Ταγάρι του βοσκού (Stobbs & Stirling 1990, Brunt et al. 1996) Candaria draba (L.) Desv. Βρωμολάχανο (Stobbs & Stirling 1990) Diplotaxis tenuifolia (L.) DC. Άγρια ρόκα (Stobbs & Stirling 1990) Erucastum gallicum (Willd.) O.E. Schulz. (Stobbs & Stirling 1990) Erysimum cheiranthoides L. (Stobbs & Stirling 1990) Hesperis matronalis L. Εσπερίδα (Stobbs & Stirling 1990) Rapistrum rugosum (L.) Ράπιστρο (Farzadfar et al. 2005) Sinapis arvensis L. Σινάπι άγριο (Stobbs & Stirling 1990) Sisymbrium alliaria L. Αλλιάρια (Guglielmone et al. 2000) S. loeselii L. Σισύμπριο (Prochazkov 1980, Farzadfar et al. 2005) Cyperaceae Cyperus esculentus L. Κύπερη Κίτρινη (Chivasa et al. 2002) Fabaceae Cassia occidentalis L. Κάσσια (Brunt et al. 1996) Melitotus alba Medik. Trifolium hybridum L. Τριφύλλιον το νόθο (Brunt et al. 1996) T. incarnatum L. Τριφύλλιον το σαρκόχρουν (Brunt et al. 1996)

38 Liliaceae Allium ampeloprasum L. Αγριόσκορδο (Gera et al. 1997) A. guttatum Steven. (Dovas et al. 2001) A. neapolitanum Cirillo. Σκορδαψιός (Dovas et al. 2001) A. sphaerocephalon L. Αγριοκρέμμυδο (Dovas et al. 2001) A. subhirsutum L. Αγριόσκορδο (Dovas et al. 2001) Malvaceae Abutilon theophrasti Medik. Αγριοβαμβακιά (Guglielmone et al. 2000) Papaveraceae Papaver nudicaule L. Παπαρούνα (Brunt et al. 1996) Phytolaccaceae Phytolacca americana L. Αγριοσταφίδα (Stobbs & Stirling 1990, Brunt et al. 1996) Solanaceae Datura metel L. Τάτουλας (Brunt et al. 1996) D. stramonium L. Τάτουλας (Brunt et al. 1996) Lycopersicon pimpinellifolium L. Nicandra physaloides (L.) Gaertn. (Brunt et al. 1996, Hu et al. 1996) Nicotiana glutinosa L. (Brunt et al. 1996, Hu et al. 1996) N. rustica L. (Brunt et al. 1996) N. sylvestris Speg. & Comes. (Brunt et al. 1996) Physalis floridana Rydb. Φυσαλίδα (Brunt et al, 1996, Sako 1980) Portulacaceae Portulaca oleracea L. Γλιστρίδα ή αντράκλα (Chivasa et al. 2002)

39 Πίνακας 3: Καλλιεργούμενα φυτά (καλλωπιστικά) ξενιστές του TuMV Οικογένεια/Είδος Κοινό όνομα (αναφορά) Amaranthaceae Celosia argentea L. Σελόσια (Brunt et al. 1996) Araceae Zanthedeschia spp. Κρίνος (Chen et al. 2003) Balsaminaceae Impatiens balsamina L. Έρωτας (Farzadfar et al. 2005) Compositae (Asteraceae) Chrysanthemum coronarium L. Χρυσάνθεμο (Sako 1980, Farzadfar et al. 2005) Zinnia elegans L. Ζίνια (Sako 1980, Farzadfar et al. 2005) Crucifereae (Brassicaceae) Cheiranthus cheiri (L.) Crantz. Χείρανθος ο χείρος ή κίτρινη βιολέτα (Brunt et al. 1996, Farzadfar et al. 2005) Lunaria-annua L. (Ashby & Thomson 1980) Matthiola incana (L.) W. T. Aiton. Βιολέτα (Brunt et al. 1996) Onagraceae Clarkia amoena (Lehm.) A. Nels. & J. F. (Brunt et al. 1996) Macbr. Orchidaceae Calanthe sp. (Chivasa et al. 2002) Plumbaginaceae Limonium perezii (Stapf) F. T. Hubbard. Λεβάντα (Laird & Dickson 1972) Solanaceae Petunia hybrida (Hook.) Vilm. Πετούνια (Farzadfar et al. 2005) Violaceae Viola wittrockiana L. Πανσές (Wang et al. 1998)

40 2.5. Ο TuMV στην Ελλάδα Όπως είναι αναμενόμενο, ο ιός TuMV είναι αρκετά διαδεδομένος και στην Ελλάδα. Κρούσματα μόλυνσης καλλιεργειών από τον ιό TuMV σε πολλές περιοχές της Ελλάδας, έχουν καταγραφεί σε διάφορες δημοσιεύσεις (Jenner & Walsh 1996, Tomimura et al. 2004, Sanchez et al. 2007). Διάφοροι υποπληθυσμοί του ιού έχουν απομονωθεί σε διάφορες περιοχές της Ελλάδας (Βόλος, Ξάνθη, Ορεστιάδα, Θεσσαλονίκη) κυρίως από είδη του γένους Brassica και Allium (Jenner & Walsh 1996, Dovas et al. 2001, Tomimura et al. 2004). Ο ιός TuMV ανιχνεύτηκε στα είδη A. sphaerocephalon L. (αγριοκρέμμυδο), A. guttatum Steven, A. subhirsutum L. (αγριόσκορδο) και A. neapolitanum Cirillo, τα οποία ανήκουν στην οικογένεια Liliaceae (Dovas et al. 2001). Δεδομένης όμως της πανελλαδικής εξάπλωσης των φορέων του, ο ιός TuMV έχει βρεθεί σε περιοχές σχεδόν σε όλη την Ελλάδα καθώς και σε πολλά είδη καλλιεργειών, μιας και το εύρος των ξενιστών του είναι πολύ μεγάλο.

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΟΙ ΑΦΙΔΕΣ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΤΟΥ TuMV 3.1 Κυριότερα είδη αφίδων Περισσότερα από 4000 είδη αφίδων έχουν αναγνωρισθεί μέχρι σήμερα. Περίπου 300 είδη έχουν δοκιμασθεί και πάνω από 200 έχει βρεθεί ότι μπορούν να μεταδώσουν τουλάχιστον ένα είδος φυτικού ιού. Η πλειονότητα των φορέων βρίσκεται στην υποοικογένεια Aphidinae, συμπεριλαμβανομένων των γενών Myzus, Aphis και Macrosiphum. Οι πιο επιτυχημένοι φορείς των ιών του γένους Potyvirus είναι είδη πολυφάγα όπως για παράδειγμα τα Myzus persicae (Sulzer), Aphis gosypii Glover, Aphis craccivora Koch και Aphis fabae Scopoli (Raccah et al. 2001). Οι αφίδες που αποτελούν τους πιο σημαντικούς φορείς του ιού TuMV είναι οι Myzus persicae (Sulzer), Myzus ascalonicus Doncaster, Aphis gossypii Glover, Brevicoryne brassicae (Linnaeus) Lipaphis erysimi Kalt. αν και έχει βρεθεί ότι ο ιός μπορεί να μεταδοθεί από 89 είδη αφίδων, τα οποία κατατάσσονται σε 29 διαφορετικά γένη (Edwardson & Christie 1991). Στον παρακάτω πίνακα 4 αναφέρονται ορισμένα είδη αφίδων-φορέων του TuMV. Πίνακας 4. Είδη αφίδων φορείς του μωσαϊκού του γογγυλιού (TuMV) Acyrthosiphum pisum (Harris) Brevicoryne brassicae (Linnaeus) Aphis craccivora Koch Dactynotus gobonis Mats.K Aphis fabae Scopol Lipaphis erysimi Kalt. Aphis glycines Matsumura Myzus ascalonicus Doncaster Aphis gossypii Glover Myzus persicae (Sulzer) Aphis pisum (Harris) Rhopalosiphum maidis (Fitch) Brachycaudus helichrysi (Kaltenbach)

42 Οι αφίδες ανήκουν στην οικογένεια Aphididae, στην υπόταξη Homoptera της τάξης Hemiptera (Εικ.5). Η οικογένεια περιλαμβάνει μεγάλο αριθμό ειδών, τα οποία προσβάλλουν τις καλλιέργειες όπου προκαλούν άμεσες ζημίες ως εχθροί των καλλιεργούμενων φυτών και έμμεσες ως φορείς πολλών ιών, ανάμεσα τους και οι Poty-ιοί. Εικόνα 5: Ενήλικο άτομο αφίδας τη στιγμή που τρέφεται. Διακρίνεται το στιλέτο της αφίδας καθώς και το φλοίωμα του φυτικού ιστού Οι αφίδες έχουν την ικανότητα μεταδόσεως του TuMV, μετά την πρόσληψή του, για λίγα λεπτά έως και λίγες ώρες. Παρακάτω περιγράφονται λεπτομερώς δύο από τα σημαντικότερα είδη αφίδων που αποτελούν και σημαντικούς φορείς του TuMV: η Myzus persicae και η Aphis gossypii. 3.2. Η αφίδα Myzus persicae (Sulzer) Το είδος Myzus persicae (Sulzer) ανήκει στο Ζωικό Βασίλειο, στην κλάση: Insecta, υπόκλαση: Εξωπτερυγωτά, τάξη: Homoptera, υπεροικογένεια Aphidoidea, και οικογένεια Aphididae. Το κοινό όνομα του M. persicae είναι

43 πράσινη αφίδα της ροδακινιάς. Η M. persicae είναι εξαιρετικά πολυφάγο είδος και προσβάλλει περισσότερα από 400 είδη φυτών, σε όλες τις ηπείρους. Κατά τη διάρκεια των καλοκαιρινών μηνών οι αφίδες εγκαταλείπουν τους δενδρώδεις ξενιστές τους για δευτερογενείς ή ποώδεις ξενιστές, συμπεριλαμβανομένων των λαχανοκομικών φυτών στις οικογένειες Solanaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Malvaceae, Rosaceae, Umbellifereae, Papilionaceae και Curcubitaceae. Η M. persicae αποικίζει την αγγουριά, την κολοκυθιά, την καρπουζιά, το σπαράγγι, την φασολιά, το παντζάρι, το μπρόκολο, το λάχανο, το καρότο, το καλαμπόκι, τη μελιτζάνα, το μαρούλι, το σινάπι, την πιπεριά, την πατάτα και την τομάτα. Τα χειμερινά αυγά γεννιούνται κυρίως στη ροδακινιά Prunus persica L. και μερικές φορές σε άλλα πυρηνόκαρπα (P. nigra, P. tanella, P. serotina και υβρίδια ροδακινιάς και αμυγδαλιάς). Εξάπλωση και σπουδαιότητα Η αφίδα M. persicae συναντάται σε όλο τον κόσμο. Πιθανώς προέρχεται από την Ασία όπως και ο πρωτεύων ξενιστής της η ροδακινιά. Εκτός από το ότι μολύνει φυτά στους αγρούς, μολύνει λαχανικά και καλλωπιστικά φυτά στα θερμοκήπια. Όταν μολύνονται νεαρά φυτά σε θερμοκήπια και έπειτα μεταφυτεύονται στους αγρούς οι αγροί δεν μολύνονται απλώς από τις αφίδες αλλά αναπτύσσεται και ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα. Η ζημιά που προκαλούν εκτός από την εξασθένιση και τη μάρανση των φύλλων, είναι η μεταφορά πολλών ασθενειών δεδομένου ότι οι αφίδες αυτές μπορούν να μεταφερθούν σε μεγάλες αποστάσεις με τον άνεμο. Συμπτώματα προσβολής από την Myzus persicae Επειδή η M. persicae είναι ένα έντομο που τρέφεται μυζώντας τους χυμούς προκαλεί και άμεση (συστροφή φύλλων) αλλά και έμμεση ζημιά (κυρίως ως φορέας ασθενειών). Η πράσινη αφίδα μπορεί να επιτύχει μεγάλες πυκνότητες σε νεαρούς φυτικούς ιστούς, προκαλώντας μάρανση και μείωση της ανάπτυξης

44 του φυτού. Παρατεταμένη μόλυνση από αφίδες μπορεί να προκαλέσει σημαντική μείωση της απόδοσης των φυτών. Μόλυνση του συγκομιζόμενου τμήματος του φυτού με αφίδες ή με το μελίτωμα των αφίδων, επίσης προκαλεί απώλειες. Σημάδια στον φυτικό ιστό, συνήθως με τη μορφή κίτρινων κηλίδων, μπορεί να προέρχονται από τις αφίδες. Οι μεγαλύτερες απώλειες που προκαλούνται από την M. persicae οφείλονται στη μετάδοση ιών. Πράγματι, αυτή η αφίδα θεωρείται ο πιο σημαντικός φορέας των ιών στα φυτά σε όλο τον κόσμο μιας και έχει τη δυνατότητα να μεταδώσει αποτελεσματικά πάνω από 100 ιούς φυτών (Kennedy et al. 1962). Οι προνύμφες και τα ενήλικα είναι το ίδιο ικανά στην μεταφορά των ιών αλλά τα ενήλικα έχουν το προτέρημα της πτήσης, έχοντας περισσότερες ευκαιρίες για μετάδοση. Μερικοί από τους έμμονους ιούς που μεταδίδει είναι ο ιός του ήπιου κιτρινίσματος των τεύτλων (Beet mild yellowing virus, BMYV), της παραμόρφωσης των νεύρων του καπνού (Tobacco vein distorting virus, TVDV) και του καρουλιάσματος των φύλλων της πατάτας (Potato leafroll virus, PLRV). Επίσης η M. persicae μεταδίδει μη έμμονους ιούς όπως ο CMV,ο PVY,ο TuMV, ο ιός Α της πατάτας (PVA) κ.α (Brunt et al. 1996). Περιγραφή του εντόμου Το άπτερο ενήλικο παρθενογενετικό θηλυκό της M. persicae έχει σώμα σχετικά λεπτό με μικρό ως μέτριο μέγεθος. Το μέγεθος στα άπτερα και πτερωτά θηλυκά κυμαίνεται από 1,2 έως 2,3 mm. Το άπτερο έχει ομοιόμορφο χρωματισμό με διάφορες αποχρώσεις του πράσινου και του κόκκινου (πράσινο, ανοικτό, κιτρινοπράσινο, πρασινοκίτρινο, κίτρινο, κόκκινο ή ρόδινο). Τα πτερωτά θηλυκά είναι πράσινου χρώματος και φέρουν μια μαύρη περιοχή επί του νωτιαίου μέρους της κοιλιάς (Εικ. 6). Τα ενήλικα ωοτόκα θηλυκά έχουν συνήθως πορφυρό κόκκινο χρώμα (πιο σκούρα απόχρωση στους κόκκινους κλώνους) και διακρίνεται ένα σκούρο τμήμα στη ραχιαία περιοχή της κοιλιάς. Τα αρσενικά είναι κίτρινου χρώματος. Στα θηλυτόκα των πράσινων κλώνων, τα ανήλικα στάδια έχουν πράσινη απόχρωση, που συνήθως προοδευτικά γίνεται ρόδινη. Στους κόκκινους

45 ή ρόδινους κλώνους το χρώμα παραμένει το ίδιο. Εικόνα 6: Άπτερο και πτερωτό ενήλικο άτομο αφίδας του είδους Myzus persicae Βιολογικός κύκλος Έχει περισσότερες από πέντε γενεές το έτος. Σε περιοχές με σχετικά ψυχρό χειμώνα το είδος διαχειμάζει ως χειμερινό αυγό στο φλοιό των κύριων ξενιστών (ροδακινιάς ή άλλων πυρηνοκάρπων). Τα χειμερινά αυγά βρίσκονται στους οφθαλμούς ή σε εσοχές αδρών μερών του φλοιού. Στο τέλος του χειμώνα με αρχές ανοίξεως τα αυγά εκκολάπτονται και δίνουν άπτερα παρθενογενετικά θηλυκά τα λεγόμενα θεμελιωτικά. Ακολουθεί μικρός αριθμός παρθενογενετικών γενεών στη ροδακινιά και έπειτα πτερωτά άτομα μεταναστεύουν σε ποώδη φυτά (δευτερεύοντες ξενιστές), όπου η μία παρθενογενετική γενιά διαδέχεται την άλλη. Το φθινόπωρο παράγονται στα ποώδη φυτά πτερωτά θηλυτόκα και αρσενικά τα οποία μεταναστεύουν στον πρωτεύοντα ξενιστή. Εκεί τα θηλυτόκα γεννούν τα ωοτόκα, τα οποία εναποθέτουν τα χειμερινά αυγά, μετά από σύζευξη με τα αρσενικά. Σε περιοχές με ήπιο χειμώνα το έντομο αναπαράγεται παρθενογενετικά όλες τις εποχές του έτους. Επίσης υπάρχουν γενότυποι που χρησιμοποιούν και τις δυο στρατηγικές διαχείμασης. Το φθινόπωρο οι ανδροκυκλικοί κλώνοι παράγουν παρθενογενετικές μορφές, που θα διαχειμάσουν σε αυτοφυή φυτά ή χειμερινές καλλιέργειες και αρσενικά που

46 συμμετέχουν στη σεξουαλική φάση του είδους (Müller 1954, 1958, Waldhauer 1953, 1957, van Emden et al. 1969, Blackman 1971, 1974). Οι ενδιάμεσοι κλώνοι γεννούν την ίδια εποχή πολλά άπτερα και πτερωτά παρθενογενετικά θηλυκά και λίγα αρσενικά και «ενδιάμεσα» πτερωτά. Τα «ενδιάμεσα» πτερωτά παράγουν κυρίως παρθενογεντικές μορφές και αριθμό ωοτόκων θηλυκών (Blackman 1971, 1972). Το είδος είναι ανθεκτικό στο κρύο και μπορεί να αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες μεταξύ 50 Cκαι 30 C. Στους 25 Cτα θηλυκά ζουν κατά μέσο όρο 25 ημέρες και γεννούν 60 νύμφες (Rivnay 1962). Καταπολέμηση Τα μολυσμένα φυτά όπως επίσης και τα ζιζάνια, τα οποία αποτελούν ξενιστές στους οποίους διαχειμάζουν οι αφίδες πρέπει να καταστρέφονται αμέσως για να εμποδιστεί η υπερβολική εξάπλωση των εντόμων. Όταν η συνεχής καλλιέργεια ευθύνεται για την διατήρηση του πληθυσμού των αφίδων τότε είναι απαραίτητη η αγρανάπαυση. Χαρακτηριστικό των αφίδων είναι το υψηλό δυναμικό αναπαραγωγής. Βέβαια ένα μέρος του πληθυσμού τους καταστρέφεται από αρπακτικά και παράσιτα, αλλά και αυτό που μένει συχνά προκαλεί σοβαρές ζημιές. Έτσι είναι υποχρεωτικό να χρησιμοποιούνται χημικά μέσα καταπολέμησης. Οι επεμβάσεις μπορεί να γίνονται είτε το χειμώνα για την καταστροφή των αυγών ή παρθενογενετικών ατόμων είτε κατά την περίοδο της βλάστησης. Επειδή η άμεση ζημιά (παραμορφώσεις φύλλων κ.α) που προκαλούν συχνά είναι σημαντική οι επεμβάσεις με εντομοκτόνα επαφής πρέπει να γίνονται αμέσως μόλις εμφανιστούν τα πρώτα άτομα. Πολλές φορές είναι απαραίτητη η επικάλυψη των σπόρων με διασυστηματικά εντομοκτόνα, η διασπορά αφιδοκτόνων σε κοκκώδη μορφή στο έδαφος ή και ο ψεκασμός με διασυστηματικά εντομοκτόνα. Ο ψεκασμός πρέπει να είναι ιδιαίτερα προσεκτικός και έγκαιρος και να επαναλαμβάνεται μόλις λήξει η δράση του εντομοκτόνου. Όμως η υπερβολική και άσκοπη χρήση των εντομοκτόνων πρέπει να αποφεύγεται διότι μπορεί να

47 οδηγήσει σε ανθεκτικότητα που θα έχει ως αποτέλεσμα την έξαρση των πληθυσμών του εντόμου. 3.3 Η αφίδα Aphis gosypii Glover Αυτά τα πολυφάγα είδη δείχνουν μια προτίμηση στα είδη Cucurbitaceae και στα Malvaceae. Εκτός από το βαμβάκι προσβάλλουν την καρπουζιά, την κολοκυθιά, την αγγουριά, το αβοκάντο, την μπανάνα, τη φασολιά, την παπάγια, την πατάτα, το σπανάκι, την τομάτα, την πιπεριά, τη μελιτζάνα κ.α. Επίσης προσβάλλουν τα είδη του γένους Citrus. Ανάμεσα στα καλλιεργούμενα λαχανικά, ζημιές διαπιστώνονται κυρίως στην πεπονιά, την αγγουριά και τη φράουλα. Εξάπλωση και σπουδαιότητα Η A. gosypii συναντάται στις τροπικές και εύκρατες περιοχές όλου του κόσμου εκτός από τις βορειότερες περιοχές. Είναι επίσης γνωστή σε Ευρώπη, Αυστραλία, Βραζιλία, Δυτική Ινδία, Χαβάη και Μεξικό. Η ζημιά που προκαλεί, εκτός από την εξασθένηση και το μαρασμό των φύλλων, είναι η μεταφορά πολλών ιών. Περιγραφή του εντόμου Οι νύμφες ποικίλουν ως προς το χρώμα από καστανές ως γκρι ή πράσινες, και συχνά με μαύρο κεφάλι, θώρακα και πτερωτά άκρα. Τα άπτερα παρθενογενετικά θηλυκά είναι περίπου 1-2 mm σε μήκος (Εικ. 7). Το χρώμα του σώματος διαφέρει: πιο συνηθισμένο είναι το ανοιχτό πράσινο με στίγματα σκούρου πράσινου αλλά συναντώνται και λευκές, κίτρινες, ανοιχτού πράσινου και σκούρου πράσινου μορφές. Τα πτερωτά παρθενογενετικά θηλυκά είναι 1,11,7 mm σε μήκος. Το κεφάλι και ο θώρακας είναι μαύρα και τα πτερύγια είναι καστανά. Το θηλυκό που εναποθέτει τα αυγά είναι σκούρο πορφυρό-πράσινο και το αρσενικό παρόμοιο. Βιολογικός κύκλος Το A. gossypii εμφανίζεται σε τροπικές, υποτροπικές, ήπιου κλίματος περιοχές σε όλο τον κόσμο εκτός από τις πιο βόρειες (πολύ ψυχρές) περιοχές. Ο

48 βιολογικός κύκλος διαφέρει πολύ μεταξύ του Βορά και του Νότου. Στο Βορά, τα αυγά εκκολάπτονται την άνοιξη στους πρωτεύοντες ξενιστές όπου εμφανίζονται και οι θηλυκές νύμφες. Οι νύμφες τρέφονται, ωριμάζουν, ενηλικιώνονται και αναπαράγονται παρθενογενετικά στον πρωτεύοντα ξενιστή όλο το καλοκαίρι, ή παράγονται τα πτερωτά θηλυκά που διασκορπίζονται στους δευτερεύοντες ξενιστές όπου δημιουργούν νέες αποικίες. Τα πτερωτά θηλυκά επιλέγουν χαρακτηριστικά τη νέα βλάστηση για να τραφούν, και μπορούν να παράγουν πτερωτούς και άπτερους θηλυκούς απογόνους. Την περίοδο του φθινοπώρου όπως επίσης και στην περίπτωση πυκνών πληθυσμών παράγονται πτερωτές μορφές. Προς το τέλος της χρονιάς, τα πτερωτά θηλυκά επιστρέφουν στους αρχικούς ξενιστές όπου παράγονται τα αρσενικά και τα ωοτόκα θηλυκά άτομα. Αυτά ζευγαρώνουν και τα θηλυκά αποθέτουν τα κίτρινα αυγά τα οποία αποτελούν τη διαχειμάζουσα μορφή του εντόμου. Υπό θερμές συνθήκες, μια παραγωγή μπορεί να ολοκληρωθεί παρθενογενετικά σε περίπου επτά ημέρες. Στο Νότο, οι σεξουαλικές μορφές είναι σπάνιες. Τα θηλυκά παράγουν απογόνους χωρίς σύζευξη (μόνο παρθενογενετική αναπαραγωγή) εφ' όσον το επιτρέπει ο καιρός, η σίτιση και η αύξηση. Αντίθετα από πολλά είδη αφίδας, το A. gossypii δεν επηρεάζεται αρνητικά από τις ζεστές καιρικές συνθήκες. Μπορεί υπό κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες, να ολοκληρώσει την ανάπτυξή του και να αναπαραχθεί μέσα σε μια εβδομάδα, δημιουργώντας πολυάριθμες γενεές. Μπορεί να παράγει κοντά στις εξήντα γενιές το χρόνο, επειδή έχει σχετική ανθεκτικότητα στην καλοκαιρινή ζέστη. Η ιδανική θερμοκρασία για την αναπαραγωγή αναφέρεται ότι είναι 21-27 C.

49 Εικόνα 7: Άπτερο άτομο του είδους Aphis gossypii Συμπτώματα προσβολής από την Αphis gosypii Το Α. gosypii (νύμφες και ενήλικα άτομα) τρέφεται στο κάτω μέρος των φύλλων ή στην αναπτυσσόμενη κορυφή των βλαστών, με μύζηση θρεπτικών στοιχείων από το φυτό. Το φύλλωμα μπορεί να γίνει χλωρωτικό και να νεκρωθεί πρόωρα. Η θρέψη των αφίδων προκαλεί παραμόρφωση και συστροφή των φύλλων, περιορίζοντας τη φωτοσυνθετική ικανότητα του φυτού. Επιπρόσθετα, εκκρίνουν μελιτώματα, τα οποία παρέχουν ένα σημαντικό υπόστρωμα για ανάπτυξη καπνιάς, οπότε η ποιότητα των καρπών μπορεί να χειροτερεύσει και η φωτοσυνθετική ικανότητα του φυλλώματος να παρεμποδιστεί ακόμη περισσότερο. Τέλος μεγάλες απώλειες οφείλονται και στη μετάδοση ιών εφόσον το Α. gossypii αποτελεί φορέα αρκετών ιών. Καταπολέμηση Γίνεται συνήθως με χημικά μέσα όπως αναφέρθηκε και παραπάνω. Για να είναι όμως αποτελεσματική, πρέπει να μην εξαφανίζει τα ωφέλιμα αδιφάγα έντομα και άλλα αρθρόποδα, που συμπληρώνουν το έργο των εντομοκτόνων, ώστε η καταπολέμηση να είναι οικονομική, να έχει διάρκεια και να μη συντελεί στη γρήγορη δημιουργία πληθυσμών αφίδων ανθεκτικών στα εντομοκτόνα.

50 3.4. Αφιδομετάδοση των ιών του γένους Potyvirus Ο κύριος τρόπος μετάδοσης των ιών του γένους Potyvirus είναι η αφιδομετάδοση με μη-έμμονο τρόπο. Σύμφωνα με τις δυο επικρατέστερες θεωρίες αφιδομετάδοσης (θεωρία απορρόφησης-έκκρισης & θεωρία έκκρισης σιέλου), η τροφική συμπεριφορά των αφίδων είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την κατανόηση του ρόλου που διαδραματίζουν αυτά τα έντομα στο μη-έμμονο τρόπο μετάδοσης των φυτικών ιών. Πολλοί είναι οι παράγοντες από τους οποίους εξαρτάται εάν ένα είδος αφίδας αποτελεί αποτελεσματικό φορέα για έναν ιό. Οι βασικότεροι είναι οι εξής: 1. Η εναλλαγή μεταξύ άπτερων και πτερωτών μορφών. 2. Η μετανάστευση από τους αρχικούς και δευτερεύοντες ξενιστές (για τις σεξουαλικές και παρθενογενετικές μορφές αντίστοιχα). 3. Η εξειδίκευση ως προς το φυτό ξενιστή. Πολλές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για την διαλεύκανση του τρόπου μετάδοσης των ιών του γένους Potyvirus με αφίδες. Είναι απαραίτητο να αναφερθεί ότι αρκετές έρευνες έχουν αποκαλύψει τη μερική ή την ολική απώλεια της ικανότητας μετάδοσης ενός ιού από τις αφίδες. Επίσης, έχει παρατηρηθεί απώλεια της αφιδομετάδοσης λόγω ατελειών στην κατασκευή του ιϊκού σωματιδίου. Για τους ιούς των φυτών χωρίς φάκελο, όπως είναι αυτοί του γένους Potyvirus, η CP αποτελεί το εξωτερικό περίβλημά τους και επομένως είναι αυτή που έρχεται σε άμεση επαφή με τα όργανα και την επιφάνεια του φορέα. Γίνεται εύκολα κατανοητό λοιπόν ότι οποιαδήποτε αλλαγή σε αυτή την πρωτεΐνη μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στον τρόπο μετάδοσης του ιού (James & Perry 2004). Τέλος, για την μετάδοση του ιού μέσω αφίδων έχει αποδειχθεί και η ανάγκη ύπαρξης ενός βοηθητικού συστατικού, το οποίο αργότερα ταυτοποιήθηκε ως πρωτεΐνη HC-Pro. Επομένως, μεταβολές της HC-Pro έχουν ενοχοποιηθεί για την απώλεια της μετάδοσης του ιού μέσω αφίδων. Η πρώτη λειτουργία που αποδόθηκε στην HC-Pro ήταν αυτή της μεσολάβησης στην αφιδομετάδοση του ιού. Ιδιαίτερα σημαντικά είναι δύο

51 συντηρημένα μοτίβα της αλληλουχίας: τα KITC (Λυσίνη-Ισολευκίνη-ΘρεονίνηΚυστεΐνη) και PTK (Προλίνη-Θρεονίνη-Λυσίνη) (Εικ. 8). Τα μοτίβα αυτά είναι τόσο απαραίτητα που ακόμα και η αλλαγή ενός μόνο αμινοξέος οδηγεί σε απώλεια της λειτουργίας της πρωτεΐνης (Raccah et al. 2001, Dombrovsky et al. 2005). Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση των σημαντικότερων περιοχών της HC-Pro. Σε κάθε περιοχή φαίνονται τα μοτίβα τα οποία ενοχοποιούνται για την εκάστοτε δράση της πρωτεΐνης Εκτός όμως από αυτή την ιδιαίτερα σημαντική λειτουργία, έχει αποδειχθεί ότι η HC-Pro είναι μια πολύ-λειτουργική πρωτεΐνη η οποία διαδραματίζει ρόλους κλειδιά στον κύκλο ζωής του ιού. Χαρακτηριστικά αναφέρονται: δια-κυτταρική μετακίνηση, πρόσδεση του RNA, πολλαπλασιασμός του γονιδιώματος, γονιδιακή σίγηση και άλλα. Πολλές θεωρίες έχουν προταθεί για τον τρόπο δράσης της HC-Pro, όσον αφορά τη συμμετοχή της στην αφιδομετάδοση των Poty-ιών. Δύο είναι οι επικρατέστερες θεωρίες που επιβεβαιώνονται από πειραματικά δεδομένα: 1. Η υπόθεση της γέφυρας (Bridge Hypothesis-ο τομέας VB) 2. Η υπόθεση της άμεσης πρόσδεσης (Direct-Bindinding Hypothesis ο τομέας VC) Έως σήμερα έχει πραγματοποιηθεί μεγάλη πρόοδος και υπάρχουν ορισμένες απόψεις οι οποίες είναι πολύ καλά τεκμηριωμένες και ευρέως αποδεκτές από τους επιστήμονες και ερευνητές που ασχολούνται με τη δομή και τη βιολογική σημασία της HC-Pro (Raccah et al. 2001). Αυτές είναι οι εξής: Οι αφίδες είναι απαραίτητο να αποκτήσουν την HC-Pro πριν ή κατά τη διάρκεια της πρόσληψης του ιού έτσι ώστε να μπορούν να μεσολαβήσουν στη μετάδοση του.

52 Η HC-Pro πρωτεΐνη περιλαμβάνει τουλάχιστον δύο λειτουργικές περιοχές που εμπλέκονται στη μετάδοση του ιού μέσω των αφίδων. Η μία (περιοχή KITC) συμμετέχει στην διατήρηση της HC-Pro στο στιλέτο της αφίδας, ενώ η άλλη (PTK περιοχή) συμμετέχει στην πρόσδεση της με το ιοσωμάτιο. Η HC-Pro από μόνη της παραμένει στο στιλέτο των αφίδων, όπως έχει αποδειχθεί με πειραματικά δεδομένα. Τα ιϊκά σωματίδια διατηρούνται στο στιλέτο της αφίδας μονάχα παρουσία μιας λειτουργικής HC-Pro. Το μοτίβο DAG (τριπλέτα αμινοξέων: ασπαρτικό οξύ-αλανίνη- γλυκίνη) στο αμινοτελικό άκρο της καψιδιακής πρωτεΐνης CP αντιδρά ειδικά με την HC-Pro. Για τη συγκεκριμένη σύνδεση υπάρχει και αντίθετη άποψη σύμφωνα με την οποία το μοτίβο DAG έχει τη δυνατότητα να αντιδρά απευθείας με το στιλέτο της αφίδας και όχι μέσω της HC-Pro (Εικ. 9). Εικόνα 9: Η πολυπρωτείνη του ιού TuMV στην οποία φαίνεται η θέση των πρωτεϊνών HC-Pro και CP πάνω στο γονιδίωμα του. Η αλληλουχία KITC περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1-51, η PTK τα αμινοξέα 329-457 και η περιοχή DAG τα αμινοξέα 225-265 3.4.1. Θεωρία της γέφυρας Σύμφωνα με τη θεωρία της γέφυρας, η περιοχή KITC της HC-Pro αναγνωρίζει κάποιον, άγνωστο προς το παρόν, υποδοχέα στο στιλέτο της αφίδας. Ταυτόχρονα ή ίσως λίγο αργότερα, μια άλλη περιοχή της HC-Pro, η οποία περιέχει το μοτίβο PTK, αντιδρά με το μοτίβο DAG της καψιδιακής πρωτεΐνης. Με το παραπάνω τρόπο επιτυγχάνεται η συγκράτηση του ιϊκού

53 καψιδίου στο φορέα (Raccah et al. 2001) (Εικ. 10). Μετάλλαξη σε ένα ή περισσότερα από τα παραπάνω αμινοξέα (π.χ. αντικατάσταση της γλυκίνης από γλουταμίνη), έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της ικανότητας μετάδοσης από αφίδες (Atreya et al. 1995, Ng & Perry 2004). Η έλλειψη μετάδοσης λόγω μεταλλάξεων που συμβαίνουν στο μοτίβο του DAG μελετήθηκε από πολλούς ερευνητές (Atreya et al. 1992, Atreya & Pirone 1993, Blanc et al. 1998, LopezMoya et al. 1999), κοινή διαπίστωση των οποίων ήταν ότι το αμινοτελικό τμήμα της καψιδιακής πρωτεΐνης λαμβάνει μέρος στη μετάδοση. Συνεπώς, μεταλλάξεις στο τμήμα αυτό έχουν άμεση επίδραση στη μετάδοση με αφίδες (Ng & Perry 2004). Εικόνα 10: (A) Μοντέλο που δείχνει την αλληλεπίδραση των δυο μορίων της HC-Pro (B) Μόρια HC-Pro συνδεδεμένα με τις υπομονάδες του καψιδίου. (C) Πιθανή δομή σύνδεσης του PKT και KITC της HC-Pro με τη CP και το στιλέτο της αφίδας αντίστοιχα (το DAG βρίσκεται στο Ν ακραίο τμήμα της CP) 3.4.2. Θεωρία της άμεσης πρόσδεσης Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή, η πρόσδεση της HC-Pro στο μοτίβο DAG, προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση της CP, οι οποίες της επιτρέπουν την άμεση πρόσδεση των ιϊκών σωματιδίων σε υποδοχείς του στιλέτου της αφίδας. Παρόλα αυτά, η παραπάνω θεωρία φαίνεται να μην συμφωνεί απόλυτα με τα έως τώρα

54 πειραματικά δεδομένα (Raccah et al. 2001): Για την αποφυγή φαινομένων συναγωνισμού, η θεωρία αυτή προτείνει την ύπαρξη δύο διαφορετικών υποδοχέων στο στιλέτο των αφίδων. Έναν για την HC-Pro και έναν για την CP. Τα αποτελέσματα όμως από πειράματα με τη χρήση μικροσκοπίου δείχνουν ότι η HC-Pro και τα ιικά σωματίδια βρίσκονται στην ίδια περιοχή, δεδομένο το οποίο ενισχύει την ύπαρξη ενός υποδοχέα. Επίσης προτείνει ότι η αμινοτελική περιοχή της CP η οποία εμπλέκεται στην σύνδεση δεν είναι το μοτίβο DAG. Σύγκριση αλληλουχιών μεταξύ ιών που μεταδίδονται από το ίδιο είδος αφίδας δείχνει ότι η παραπάνω περιοχή είναι υψηλά μεταβλητή εκτός από το μοτίβο DAG, πράγμα το οποίο καθιστά την ύπαρξη μιας άλλης περιοχής ιδιαίτερα απίθανη. Η πρόσδεση της HC-Pro στο μοτίβο DAG προκαλεί μια δομική αλλαγή στην CP εμφανίζοντας την περιοχή πρόσδεσης στην αφίδα. Αυτό υποδηλώνει ότι η καψιδιακές πρωτεΐνες όλων των ιών οι οποίοι μεταδίδονται με τη βοήθεια μιας συγκεκριμένης HC-Pro έχουν παρόμοιο μοντέλο αναδίπλωσης. Αυτό όμως είναι ιδιαίτερο δύσκολο δεδομένης της μεγάλης μεταβλητότητας που παρουσιάζεται στη συγκεκριμένη περιοχή. Εάν ο ιός συνδεόταν κατευθείαν με την αφίδα, θα ήταν αναμενόμενο να υπάρχει μια εξειδίκευση οι οποία θα εξαρτάται από την CP. Σε αντίθεση όμως, τα πειραματικά δεδομένα αποδεικνύουν ότι η εξειδίκευση αυτή εξαρτάται από την HC-Pro και όχι από την CP. Συμπερασματικά προκύπτει ότι η θεωρία που ταυτίζεται περισσότερο με τα πειραματικά αποτελέσματα είναι αυτή της θεωρίας της γέφυρας. Λίγα είναι αυτά τα οποία υποστηρίζουν τη θεωρία της άμεσης σύνδεσης και τα οποία συνήθως δεν μπορούν να αναπαραχθούν σε όλους τους Poty-ιούς. Πιο λογικό είναι να υπάρχει ένας γενικός μηχανισμός, ο οποίος θα ισχύει για τους περισσότερους εάν όχι για όλους τους ιούς του γένους. Επομένως έως ότου βρεθούν και άλλα στοιχεία τα οποία να υποστηρίζουν τη θεωρία της άμεσης σύνδεσης, δεν μπορεί παρά να υπάρχουν αρκετά ερωτηματικά για την ευστάθειά της (Ng & Perry 2004).

55 3.4.3 Εξειδίκευση με αφίδες στη μετάδοση των φυτικών ιών Με τον όρο εξειδίκευση περιγράφεται η πιθανότητα ένας συγκεκριμένος ιός να μεταδίδεται από ένα συγκεκριμένο είδος αφίδας. Αρχικά υπήρχε η άποψη ότι οι Potyviruses είχαν πολύ μικρή εξειδίκευση όσον αφορά το είδος του φορέα. Στη βιβλιογραφία υπάρχει πληθώρα αναφορών στις οποίες γίνεται λόγος για το γεγονός αυτό. Παρόλα αυτά υπάρχουν και αναφορές στις οποίες υποστηρίζεται η διαφορετική αποτελεσματικότητα μετάδοσης των Potyviruses από διαφορετικά είδη αφίδων. Η αναποτελεσματικότητα μετάδοσης μπορεί να οφείλεται στους παρακάτω λόγους (Katis 1989, Raccah et al. 2001): Στην αφίδα-φορέα. Για παράδειγμα η αφίδα Myzus persicae μεταδίδει τον ιό TuMV σε υψηλό ποσοστό στα είδη Raphanus sativus, Spinacia olearaceae και Physalis floridana και με πολύ μικρότερο ποσοστό στα είδη Zinnia elegans και Chrysanthemum coronarium. Η διαφορετικότητα αυτή όσον αφορά την εξειδίκευση μπορεί να οφείλεται και στην έλξη ή την απώθηση που μπορεί να έχει η αφίδα με τον ξενιστή, κάτι το οποίο μπορεί να επηρεάσει το χρόνο που η αφίδα θα παραμείνει πάνω στο φυτό ξενιστή άρα και την ικανότητα και στη διάρκεια της λήψης τροφής (Sako et al. 1984, Collar & Fereres 1998). Τέλος, διαφορά μπορεί να υπάρχει και στην εξειδίκευση που εμφανίζουν ορισμένα είδη αφίδων με συγκεκριμένους ιούς. Στο είδος του ξενιστή από τον οποίο «προσλαμβάνεται» ο ιός από την αφίδα ή στον οποίο «μεταδίδεται» (Raccah et al. 2001) Στη συμβατότητα του ιϊκού σωματιδίου και της βοηθητικής πρωτείνης (HC-Pro) (Sako & Ogata 1981, Raccah et al. 2001) Στη συμβατότητα μεταξύ του είδους της αφίδας και της βοηθητικής πρωτεΐνης (HC-Pro) (Wang et al. 1998, Raccah et al. 2001).

56 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

57 ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής είναι να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα μετάδοσης στελεχών του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip Mosaic Virus, TuMV) από διαφορετικές αφίδες-φορείς σε φυτά ραπανιού Rhaphanus sativus L. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα άμεσων αφιδομεταδόσεων με έξι στελέχη του ιού με άπτερα και πτερωτά άτομα Myzus persicae (Sulzer) και άπτερα άτομα Aphis gossypii Glover. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα τύπου ARENA για τη μελέτη της δυναμικής του M. persicae στη μετάδοση του TuMV. Τέλος, έγινε προσπάθεια συσχέτισης της γενετικής παραλλακτικότητας των έξι αποτελεσματικότητα μετάδοσης από αφίδες. στελεχών του ιού με την

58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ. 4.1 Φυτά που χρησιμοποιήθηκαν 4.1.1 Φυτά για αφιδομεταδόσεις Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν ραπανάκια (R. sativus), ποικιλίας Saxa 2 (Agris Α.Ε) (Εικ. 11) ηλικίας 15-20 ημερών. Οι σπόροι της συγκεκριμένης ποικιλίας σπέρνονταν σε γλάστρες διαμέτρου 12cm σε υπόστρωμα τύρφης. Τα φυτά ποτίζονταν κάθε δεύτερη μέρα και συντηρούνταν σε εντομοστεγή κλουβιά ξύλινου πλαισίου, μεγέθους 1.5m x 1m x 50cm, καλυμμένου με λεπτό ύφασμα τύπου οργάτζας ώστε να αποφεύγεται η μόλυνση από αφίδες. Εικόνα 11: Τα φυτά του είδους Rhaphanus sativus που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα αφιδομεταδόσεων και για τη συντήρηση των στελεχών του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (TuMV) Τα εντομοστεγή κλουβιά τοποθετούνταν σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών με θερμοκρασία 18-20οC και διάρκεια φωτοπεριόδου 16 ώρες. Μετά από 3-4 μέρες τα φυτά που βρίσκονταν στο στάδιο των κοτυληδόνων (κατάλληλο για μηχανικές

59 μολύνσεις με τον ιό) μολύνονταν και χρησιμοποιούνταν ως πηγή ιού σε όλα τα παρακάτω πειράματα. 4.1.2. Φυτά για διατήρηση αφίδων Φυτά πατάτας αναπτύσσονταν σε γλάστρες διαμέτρου 12cm μέσα σε εντομοστεγή κλουβιά (Εικ. 12) σε θερμοκρασία 18-20οC. Τα ανεπτυγμένα φυτά, τουλάχιστον 20-25 μέρες μετά τη σπορά, χρησιμοποιούνταν για τη διατήρηση των αφίδων. Εικόνα 12: Εντομοστεγή κλουβιά για την προστασία των φυτών από αφίδες και αφιδομεταδιδόμενους ιούς 4.2. Στελέχη του TuMV Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν έξι διαφορετικά στελέχη του ιού TuMV (Πιν. 5), που παραχωρήθηκαν από τον καθηγητή Κ. Ohsima του πανεπιστημίου Σάγκα της Ιαπωνία (Ohsima et al. 2007).

60 Πίνακας 5: Στελέχη του ιού TuMV που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Η συντομογραφία BR που περιγράφει τον τύπο του ξενιστή σημαίνει ότι τα συγκεκριμένα στελέχη μολύνουν τα φυτά Brassica rapa και Raphanus sativus Στέλεχος Ξενιστής Γεωγραφική Χρονολογία Τύπος όπου προέλευση συλλογής ξενιστή εντοπίστηκε FKDOO4J Raphanus Funehiki, Fukushina, 2000 BR (No 3) sativus Ιαπωνία 59J R. sativus Saga, Saga, Ιαπωνία 1996 BR R. sativus Lushun, Liaoning, Κίνα 1999 BR R.sativus Guilin, Guangxi, Κίνα 2000 BR CP845J Calendula Kisarazu, Chiba, Κίνα 1997 BR (No 8) officinalis HRD R. sativus Zhejiang, 1998 BR (No 5) CHL13 (No 6) CHK16 (No7) (No 10) Hongzhou, Κίνα 4.3. Διατήρηση του ιού Η διατήρηση του ιού έγινε σε ραπανάκια, R. sativus, ποικιλία Saxa 2 (Agris Α.Ε.). Για τη διατήρηση του ιού χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της μηχανικής μετάδοσης, το πρωτόκολλο της οποίας αναλύεται στη συνέχεια. Τα ραπανάκια που χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή του ιού τοποθετούνταν σε ειδικά ξύλινα κλουβιά διαστάσεων 40cm x 50cm x 47 cm, σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών με θερμοκρασία 18-20οC και διάρκεια φωτοπεριόδου 16 ώρες. Τα φυτά εκδήλωναν συμπτώματα μωσαϊκού 18-20 ημέρες μετά τη μόλυνση.

61 4.4 Μηχανική μετάδοση Η μηχανική μετάδοση, είναι μια διαδικασία η οποία περιλαμβάνει (α) την επιτυχή εξαγωγή του ιού από το μολυσμένο φυτικό ιστό, μέσω λειοτρίβησης και (β) τη μεταφορά και επάλειψη του μολυσματικού εκχυλίσματος στην επιφάνεια υγιών φυτών, έτσι ώστε ο ιός να εισχωρήσει στα κύτταρα. Η μηχανική μετάδοση χρησιμοποιείται στο εργαστήριο για την απομόνωση ιών από μολυσμένα φυτά και τη διατήρησή τους στο εργαστήριο σε φυτοδείκτες. Η ίδια μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό ιών από μεικτές μολύνσεις, όταν αυτοί προκαλούν διαφορετικά συμπτώματα στον ίδιο ξενιστή ή μολύνουν διαφορετικούς ξενιστές. Τέλος, οι μηχανικές μολύνσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για δοκιμές μολυσματικότητας, όπου η μολυσματική ικανότητα του ιού μετράται με τον αριθμό των τοπικών κηλίδων που προκαλούνται από το μόλυσμα στα φύλλα ειδικά επιλεγμένων ξενιστών. Σε ότι αφορά το πρωτόκολλο μηχανικής μετάδοσης ιών στο εργαστήριο, ακολουθήθηκε η μέθοδος που περιγράφεται από τους Dijkstra και De Jager (1998). Αρχικά, ιστός φύλλων από ιωμένα φυτά, ομογενοποιήθηκε με τη βοήθεια φωσφορικού διαλύματος (ΚΗ2PO4 και Na2HPO4 σε αναλογία δυο προς τρία και τελική συγκέντρωση 0,1Μ με ph 7,0 και 0,01Μ Να2SO3) με ιγδίο και ύπερο τα οποία είχαν τοποθετηθεί πριν από την χρήση στο ψυγείο (0-4οC) ώστε να αποφευχθεί η αδρανοποίηση του ιού κατά την εκχύλιση. Ακολούθησε ομοιόμορφη επίπαση των φύλλων των φυτοδεικτών με ανθρακοπυρίτιο (Carborundum, 450 mesh, Aldrich) για τη δημιουργία πληγών και τέλος, έγινε επάλειψη του εκχυλίσματος στα φύλλα με τη βοήθεια βαμβακοφόρου. Περίπου πέντε λεπτά αργότερα τα φύλλα ξεπλύθηκαν με νερό βρύσης και τα φυτά τοποθετήθηκαν στο θάλαμο ανάπτυξης για 2-4 εβδομάδες για παρατήρηση συμπτωμάτων. Έπειτα ελέχθηκαν και με την ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA.

62 4.5. Αφιδομεταδόσεις 4.5.1. Διαδικασία παραγωγής άπτερων ενήλικων ατόμων Χρησιμοποιήθηκε ένας κόκκινος κλώνος M. Persicae που παραχωρήθηκε από το Εργαστήριο Εντομολογίας και Γεωργικής Ζωολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Η κλωνική αποικία της M. Persicae διατηρούνταν στο εργαστήριο σε βιοκλιματικούς θαλάμους (Εικ. 14) με συνθήκες μεγάλης ημέρας (L16:D8) στους 20οC. Η διαδικασία με την οποία έγινε η παραγωγή των ενήλικων άπτερων θηλυκών ήταν η εξής: Α. Τοποθέτηση πέντε άπτερων ενήλικων θηλυκών του κόκκινου κλώνου (1η σειρά), σε φύλλα πατάτας μέσα σε ειδικά κουτιά εκτροφής αφίδων (7,7 cm 4.5 cm 2 cm) (Blackman 1971) (Εικ. 13) και διατήρηση τους σε βιοκλιματικό θάλαμο με σταθερή θερμοκρασία 20οC και διάρκεια φωτοπεριόδου 16 ώρες (Εικ. 14). Β. Μεταφορά των άπτερων θηλυκών ατόμων σε νέα κουτιά Blackman όταν γεννήθηκαν περισσότερα από 15 άτομα που αποτελούν τη 2η σειρά άπτερων ατόμων. Η συντήρηση αυτών έγινε και πάλι σε φύλλα πατάτας με τις ίδιες συνθήκες συντήρησης της πρώτης σειράς. Εικόνα 13: Κουτιά τύπου Blackman για τη διατήρηση των κλωνικών σειρών των αφίδων, τα οποία στη βάση τους διαθέτουν σπόγγο για την κατακράτηση νερού που είναι απαραίτητο για τη συντήρηση του φύλλου

63 Γ. Απομάκρυνση των θηλυκών άπτερων από τη δεύτερη σειρά κουτιών Blackman όταν οι απόγονοι ξεπερνούσαν τα 10 άτομα. Δ. Οχτώ με δέκα μέρες από την παραγωγή των απογόνων στην πρώτη σειρά κουτιών Blackman εμφανίζονταν τα πρώτα ενήλικα άτομα. Επρόκειτο για τα άτομα πρώτης ημέρας, κατάλληλα για αφιδομετάδοση. Εικόνα 14: Βιοκλιματικός θάλαμος συντήρησης αφίδων 4.5.2. Πειράματα με άπτερα άτομα 1ο πείραμα: Έλεγχος αποτελεσματικότητας αφιδομετάδοσης με άπτερα άτομα Myzus persicae (single aphid inoculation) για κάθε στελέχος του ιού Χρησιμοποιήθηκαν άπτερα ενήλικα θηλυκά άτομα από τον κόκκινο κλώνο M. persicae και έξι διαφορετικά στελέχη του ιού TuMV που περιγράφονται στην παράγραφο 4.2. Πραγματοποιήθηκαν πέντε επαναλήψεις για κάθε στέλεχος. Σε κάθε επανάληψη, χρησιμοποιούνταν 10 άπτερα ενήλικα θηλυκά άτομα, τα οποία αφού υποβάλλονταν σε νηστεία για 30 λεπτά, τοποθετούνταν στη συνέχεια για 3 λεπτά (χρόνος πρόσληψης ιού) σε ραπανάκια μολυσμένα με κάποιο από τα έξι στελέχη του ιού. Η συντήρηση των άπτερων αφίδων σε

64 συνθήκες νηστείας αποτελεί απαραίτητο βήμα πριν τη δοκιμασία αφιδομετάδοσης, καθώς έχει αποδειχθεί ότι η αποτελεσματικότητα μετάδοσης μη-έμμονων ιών αυξάνεται όταν τα έντομα-φορείς υποβάλλονται σε νηστεία (Watson & Plumb 1972). Έπειτα, κάθε άτομο μεταφερόταν σε υγιές φυτό για 10 λεπτά (χρόνος μετάδοσης). Στη συνέχεια, τα φυτά ψεκάστηκαν με imidacloprid (confidor 200 SC) και τοποθετήθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης 3-4 εβδομάδες για εκδήλωση συμπτωμάτων. Τέλος, υποβάλλονταν σε ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 50 φυτά/στέλεχος οπότε και για τα έξι στελέχη χρησιμοποιήθηκαν 300 φυτά και 300 άπτερες αφίδες. 2ο πείραμα: Έλεγχος της αποτελεσματικότητας της αφιδομετάδοσης με ομάδες άπτερων ατόμων (group inoculation)για κάθε στέλεχος του ιού Χρησιμοποιήθηκαν ομάδες των πέντε ενήλικων άπτερων ατόμων τα οποία ανήκουν στον κόκκινο κλώνο του M. persicae καθώς και τα έξι διαφορετικά στελέχη του TuMV που περιγράφονται στην παράγραφο 4.2. Κάθε ομάδα των πέντε ατόμων, μετά από νηστεία 30 λεπτών, τοποθετούταν για 3 λεπτά σε ραπανάκια μολυσμένα με κάποιο από τα έξι στελέχη του ιού, προκειμένου τα άτομα να καταστούν ιοφόρα. Έπειτα κάθε ομάδα μεταφερόταν σε υγιές φυτό για 10 λεπτά. Σε κάθε ραπανάκι που γινόταν η αφιδομετάδοση ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που περιγράφτηκε παραπάνω. Για κάθε στέλεχος του ιού έγιναν 3 επαναλήψεις και χρησιμοποιήθηκαν 10 υγιή φυτά και 10 ομάδες αφίδων. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 180 φυτά και 900 αφίδες καθώς μελετήθηκαν και τα έξι διαφορετικά στελέχη του ιού. 3ο πείραμα: Σύγκριση αποτελεσματικότητας μετάδοσης στελεχών του ιού TuMV με διαφορετικά είδη αφίδων (Aphis gossypii και Myzus persicae) Πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις (10 φυτά/επανάληψη) για κάθε ένα από τα έξι διαφορετικά στελέχη του ιού, με άπτερα άτομα A. gosypii (συλλέχθησαν από τον αγρό από φυτά γερμανός) και M. persicae (εργαστηριακής εκτροφής) (συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 300 φυτά και 300 θηλυκά άπτερα άτομα από κάθε είδος αφίδας). Η διαδικασία μετάδοσης του ιού

65 είναι όμοια με αυτή που περιγράφηκε παραπάνω. 4.5.3. Συλλογή πτερωτών αφίδων Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με ενήλικα πτερωτά άτομα M. persicae, πραγματοποιήθηκε μία δειγματοληψία για τη μαζική συλλογή πτερωτών από δέντρα ροδακινιάς. Η δειγματοληψία έγινε σε 5 ροδακινεώνες στην Μελίκη Ημαθίας. Από κάθε οπωρώνα συλλέγονταν περίπου 13-15 δείγματα που αποτελούνταν από 3-4 κλαδιά ροδακινιάς. Το κάθε δείγμα μετά τη συλλογή του τοποθετείτο σε ειδικό αεροστεγές σακουλάκι μαζί με απορροφητικό χαρτί. Τα δείγματα τοποθετούνταν σε φορητό ψυγείο για την καλύτερη διατήρηση τους μέχρι την μεταφορά τους στο εργαστήριο. Η συντήρηση των δειγμάτων στο εργαστήριο γινόταν σε ειδικά κλουβιά διαστάσεων 40cm x 50cm x 47 cm, όπου τοποθετήθηκαν τα κλαδιά της ροδακινιάς από τα οποία είχαν απομακρυνθεί τα πτερωτά άτομα αφήνοντας μόνο τις νύμφες μέχρι την ενηλικίωσή τους. Τα κλαδιά της ροδακινιάς τοποθετήθηκαν σε δοχεία με νερό σε κλουβιά. Μόλις εμφανίστηκαν τα πρώτα πτερωτά άτομα στα κλουβιά μεταφέρθηκαν σε νέο κενό κλουβί, όπου διατηρήθηκαν σε κατάσταση νηστείας για 8-10 περίπου ώρες. Για την μεταφορά των πτερωτών ατόμων σε νέα κλουβιά χρησιμοποιούνταν πινέλα που βοηθούσαν στην συλλογή των αφίδων καθώς και διάφανα κυλινδρικά δοχεία με καπάκι για την διατηρησή τους μέχρι την μεταφορά τους στα νέα κλουβιά. Η συντήρηση σε συνθήκες νηστείας ερμηνεύεται αν αναλογιστεί κανείς ότι η αποτελεσματικότητα μετάδοσης μη-έμμονων ιών αυξάνεται, όταν τα έντομαφορείς υποβάλλονται σε νηστεία. Ερευνητές υποστηρίζουν ότι μετά την νηστεία πτερωτών ατόμων και την μεταφορά τους σε κλωβούς όπου μπορούν να πετάξουν, αυτά γίνονται πιο δεκτικά στο να δοκιμάσουν ή να εγκατασταθούν σε φυτά ξενιστές.(cockbain et. al.1963, Collar & Fereres 1998, Dusi & Peters 1999). 4.5.4. Πειράματα με πτερωτά άτομα Πτερωτά άτομα μετά από την περίοδο νηστείας 8-10 ωρών, μεταφέρονταν

66 σε ραπανάκια μολυσμένα με κάποιο από τα έξι στέλέχη του ιού και αφήνονταν ελεύθερα για 3 λεπτά προκειμένου να καταστούν ιοφόρα. Στη συνέχεια, οι αφίδες παρενοχλούνταν ελαφρά για να αποσύρουν τα στιλέτα τους και μετά από προσεκτική συλλογή με τη βοήθεια πινέλου μεταφέρονταν σε υγιή φυτά για 10 λεπτά. Κάθε πτερωτό άτομο μεταφερόταν σε διαφορετικό υγιές φυτό. Σε κάθε ραπανάκι που γινόταν η αφιδομετάδοση τοποθετούνταν ειδικά ταμπελάκια στα οποία αναγράφονταν το στέλεχος του ιού, η ημερομηνία μετάδοσης καθώς και ο αριθμός της επανάληψης. Στη συνέχεια, τα φυτά ψεκάστηκαν με imidacloprid (confidor 200 SC) και τοποθετήθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης όπου για περίπου 3 εβδομάδες ελέγχονταν για ανάπτυξη συμπτωμάτων. Έπειτα υποβλήθηκαν και σε έλεγχο με την ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA. 1ο πείραμα: Έλεγχος της αποτελεσματικότητας μετάδοσης των στελεχών του TuMV με πτερωτά άτομα από δέντρα ροδακινιάς Σε αυτό το πείραμα πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις, για κάθε στέλεχος του ιού, όπου σε κάθε επανάληψη χρησιμοποιήθηκαν 10 φυτά και 10 πτερωτά άτομα, ένα σε κάθε φυτό. Συνολικά εξετάστηκαν 50 φυτά για κάθε στέλεχος και 300 φυτά για όλα τα διαφορετικά στελέχη του ιού. 2ο πείραμα: Έλεγχος αποτελεσματικότητας μετάδοσης του TuMV με πτερωτά άτομα του κόκκινου κλώνου Myzus persicae Η παραγωγή πτερωτών από τον κλώνο Μ. persicae έγινε με εκτροφή των αφίδων σε κουτιά Blackman σε κατάσταση συνωστισμού. Παρόμοια με το προηγούμενο πείραμα, μόλις εμφανίζονταν τα πρώτα πτερωτά άτομα, μεταφέρονταν σε νέο κλουβί και διατηρούνταν σε κατάσταση νηστείας για 8-10 περίπου ώρες. Ακολουθούσε η ίδια διαδικασία αφιδομετάδοσης που περιγράφηκε παραπάνω. Σε αυτό το πείραμα χρησιμοποιήθηκαν 2 από τα 6 στελέχη του ιού που εμφάνισαν υψηλότερα ποσοστά μετάδοσης (No 5: TuMV59J, No 10: TuMV-HRD). Για κάθε στέλεχος του ιού πραγματοποιήθηκαν 5 επαναλήψεις, σε καθεμία από τις οποίες χρησιμοποιήθηκαν 10 πτερωτά άτομα, ένα σε κάθε υγιές φυτό. Συνολικά, εξετάστηκαν 50 φυτά για κάθε στέλεχος του ιού άρα 100 φυτά.

67 4.5.5. Πειράματα που στηρίζονται στην δοκιμή ARENA Ο στόχος της συγκεκριμένης δοκιμής είναι η αξιολόγηση της δυνητικής μετάδοσης του ιού και όχι η μέτρηση της ικανότητας μετάδοσης του από το συγκεκριμένο φορέα. Σε αυτό το σημείο είναι σημαντικό να τονιστεί ότι στα πειράματα τύπου ARENA δεν παρεμβάλλεται κανενός είδους εμπόδιο μεταξύ των αφίδων, του ιωμένου και των υγιών φυτών. Είναι λογικό η δυνητική μετάδοσης ενός ιού να ποικίλλει στη φύση λόγω των φυσικών εμποδίων που συναντά ένα έντομο από το ένα φυτό στο επόμενο. Επομένως για να εκτιμηθεί η δυνητική μετάδοση του ιού ανεξάρτητα από εξωγενείς παράγοντες προσομοιώνοντας τις συνθήκες του αγρού στο εργαστήριο, πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμές ARENA που επιβάλλουν την μη ύπαρξη παρεμβολών μεταξύ εντόμων και φυτών (Yuan & Ullman 1996). 1ο Πείραμα ARENA με τις αφίδες ελεύθερες Πραγματοποιήθηκαν 6 επαναλήψεις για ένα στέλεχος ιού (στέλεχος No 5: TuMV-59J) με στόχο να μελετηθεί η δυνητική μετάδοση του συγκεκριμένου στελέχους από τις πτερωτές αφίδες του κόκκινου κλώνου της M. persicae. Σε κάθε επανάληψη χρησιμοποιήθηκε ένα κλουβί μέσα στο οποίο είχαν τοποθετηθεί περιμετρικά σε κύκλο 8 υγιή φυτά. Στο κέντρο του κλουβιού είχαν τοποθετηθεί 2 ιωμένα φυτά, από το ίδιο στέλεχος του ιού, που αποτελούσαν και την πηγή του μολύσματος. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν 26 ενήλικες πτερωτές αφίδες, οι οποίες τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri. Το τρυβλίο με τα πτερωτά άτομα τοποθετήθηκε ανάμεσα στα 2 γλαστράκια με τα ιωμένα φυτά και αφαιρέθηκε το καπάκι, ώστε να ελευθερωθούν οι αφίδες. Μετά από 24 ώρες οι αφίδες συλλέχθηκαν και τα φυτά ψεκάστηκαν με imidacloprid (confidor 200 SC). Στη συνέχεια, τα φυτά τοποθετήθηκαν σε κλουβιά και ελέγχονταν για ανάπτυξη συμπτωμάτων, ενώ μετά από χρονικό διάστημα 18-20 ημερών υποβλήθηκαν σε έλεγχο με την ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA. 2ο Πείραμα ARENA με τις αφίδες τοποθετημένες πάνω στα ιωμένα φυτά Έγιναν 6 επαναλήψεις με το ανωτέρω στέλεχος και ακολουθήθηκε η ίδια

68 πειραματική διάταξη, με τη διαφορά ότι οι αφίδες τοποθετήθηκαν απευθείας πάνω στα φύλλα του ιωμένου φυτού αντί να τοποθετηθούν σε ένα τρυβλίο Petri και έπειτα να αφεθούν ελεύθερες. Ο στόχος του πειράματος ήταν ο ίδιος, η εκτίμηση δηλαδή της δυνητικής μετάδοσης του συγκεκριμένου στελέχους του ιού από τις αφίδες της αποικίας του κόκκινου κλώνου του M. persicae. 4.6. Ανοσοεζνυμική Δοκιμή ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 4.6.1. Αντιδραστήρια Τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από τις εξής εταιρείες: Διάφορα χημικά: Sigma, J.T. Baker Αλκαλική φωσφατάση: Fluka Αντισώματα: Το πολυκλωνικό αντίσωμα ήταν μια ευγενική χορηγία του Δρ. K. Ohsima (Ιαπωνία). 4.6.2. Σύζευξη γ-σφαιρίνης Α. Καθαρισμός ακατέργαστου αντιορού (Crude antiserum) Για τον καθαρισμό ακατέργαστου αντιορού αρχικά έγινε διαπίδυση 1 ml σε 1000 ml ½x PBS (950 ml αποσταγμένο νερό και 50ml PBS:1,4M NaCl, 0,01M KH2PO4, 0,08M Na2HPO4 x 2H2O, 0,02M KCl) στους 4οC. Η διαπίδυση πραγματοποιήθηκε τρεις φορές ανά 6-8 ώρες και κατόπιν έγινε διαχωρισμός της γ-σφαιρίνης σε στήλη συγγένειας (affinity column) πρωτεΐνης Α (Sigma, P3391). Τέλος, ακολούθησε διαπίδυση 3 φορές σε ½x PBS, μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα (OD280) σε φασματοφωτόμετρο (Jenway 6405 uv/vis) και προστέθηκε αζίδιο του νατρίου (0,02 % β/ο) για μακρόχρονη διατήρηση στους 4 οc. Αναλυτικά, τα βήματα της διαδικασίας καθαρισμού της γ-σφαιρίνης σε στήλη συγγένειας πρωτεΐνης Α είναι τα εξής:

69 1. Διόγκωση 250mg Protein A Sepharose CL-4B (Sigma, P3391). Το λυοφιλιωμένο παρασκεύασμα της πρωτεΐνης Α αφήνεται να διογκωθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα (0,02Μ NaH2PO4, 0,15M NaCl, ph 8, 0) για μια ώρα (7ml/ 250mg πρωτεΐνης Α). Στη συνέχεια, τοποθετείται σε στήλη χρωματογραφίας. 2. Απομόνωση της γ-σφαιρίνης από ακατέργαστο αντιορό. Καθαρισμός της στήλης με 5ml ρυθμιστικού διαλύματος (0,02M NaH2PO4, 0,15M NaCl, ph 8,0). Εισαγωγή του ακατέργαστου αντιορού. Έκλουση με 6ml ρυθμιστικού διαλύματος (0,02Μ ΝαΗ2PO4, 0,15M NaCl, ph 8,0). Έκλουση της γ-σφαιρίνης με 3ml ρυθμιστικού διαλύματος (0,025Μ κιτρικό οξύ, 0,006Μ Na2HPO4, ph 3,0). Συλλογή της γ-σφαιρίνης, με τη βοήθεια συλλέκτη κλασμάτων (Foxy 200) σε δοκιμαστικό σωλήνα όπου περιέχονται 100μl φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος 2M με ph 8,0, για κάθε ml κλάσματος. Β. Σύζευξη της γ-σφαιρίνης με αλκαλική φωσφατάση Μια ποσότητα του ενζύμου αλκαλική φωσφατάση διαλύθηκε σε 500μl γσφαιρίνης ώστε να έχει τελικά συγκέντρωση 1000u/ml και ακολούθησε διαπίδυση 3 φορές σε ½x PBS. Έπειτα, προστέθηκε 0,06% γλουταραλδεΰδη και ακολούθησε διαπίδυση σε 500ml ½x PBS για έξι ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και άλλη μία σε 1000 ml ½x PBS στους 4 οc. Τέλος, το σύζευγμα συλλέχτηκε, προστέθηκε αζίδιο του νατρίου και διατηρήθηκε στους 4οC. 4.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής άμεσης DAS-ELISA (Double antibody sandwich ELISA) H δοκιμή DAS-ELISA, η οποία έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που προτάθηκε από τους Clark & Adams (1977) σε μικροπλάκες πολυστυρενίου 96 φρεατίων περιλαμβάνει τέσσερα στάδια (Εικ. 15). Στο πρώτο στάδιο οι μικροπλάκες επιστρώθηκαν με το αντίσωμα αραιωμένο (1/1000) σε διάλυμα

70 επίστρωσης της πλάκας (0,035M NaHCO3, 0,014M Na2CO3, ph 9,6). Στη συνέχεια, οι πλάκες επωάστηκαν στους 37οC για 3 ώρες και κατόπιν ξεπλύθηκαν 3 φορές ανά τρίλεπτα διαστήματα με διάλυμα PBS-Tween. Στο δεύτερο στάδιο προστέθηκαν τα δείγματα καθώς και ιστός υγιών φυτών. Η εκχύλιση των δειγμάτων έγινε με το ρυθμιστικό διάλυμα PBS-Tween σε αναλογία 1/10 (β/ο) και σε κάθε βοθρίο προστέθηκαν 100μl φυτικού εκχυλίσματος. Ακολούθησε επώαση των μικροπλακών για 16 περίπου ώρες στους 4οC και αμέσως μετά πλύσιμο και προσθήκη συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση αντισώματος (1/750). Το διάλυμα αραίωσης του συζεύγματος ήταν PBS-Tween που περιείχε 2% PVP και 0,2% αλβουμίνη. Μετά από επώαση τριών ωρών στους 37οC και πλύσιμο των μικροπλακών προστέθηκε το υπόστρωμα φωσφορικής παρανιτροφαινόλης (pparanitrophelyl phosphate) αραιωμένο σε διάλυμα υποστρώματος με ph 9,8 (1mg/ml). Τέλος, οι μικροπλάκες επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για μια ώρα και μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση σε φωτόμετρο (Labsystems multiskan RC). Στα φρεάτια που είχαν τοποθετηθεί θετικά δείγματα εμφανίζεται χρώμα λόγω υδρόλυσης του υποστρώματος από το συζευγμένο ένζυμο. Για να εμφανιστεί το κίτρινο χρώμα πρέπει να υπάρξει διαδοχική σε κάθε στάδιο σύνδεση των αντισωμάτων με τα ομόλογα αντιγόνα. Μόνο σε αυτή την περίπτωση θα ελευθερωθεί το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση κατά το τελευταίο στάδιο, η οποία καταλύει το σπάσιμο των φωσφοδιεστερικών δεσμών του υποστρώματος και οδηγεί στην εμφάνιση του κίτρινου χρώματος. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) στα 405 nm δίνει μια ποσοτική εκτίμηση της συγκέντρωσης του ιού στους ιστούς των μολυσμένων ξενιστών. Κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων θα πρέπει οι τιμές της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων να συγκριθούν με τις αντίστοιχες τιμές των δυο μαρτύρων (θετικού και αρνητικού). Η ύπαρξη του θετικού μάρτυρα επιτρέπει να διαπιστώσουμε εάν ο αντιορός αναγνωρίζει το γνωστό θετικό δείγμα. Ο αρνητικός μάρτυρας ουσιαστικά λειτουργεί ως μάρτυρας μη αντίδρασης, μας αποτρέπει να θεωρήσουμε ένα αρνητικό δείγμα ως θετικό.

71 Γενικά πρέπει να ισχύουν οι παρακάτω τύποι: Μολυσμένο δείγμα: Οπτική πυκνότητα δείγματος > 2-3 Χ Οπτική πυκνότητα μάρτυρα Υγιές δείγμα: Οπτική πυκνότητα δείγματος < 2-3 Χ Οπτική πυκνότητα μάρτυρα Μετά τα αποτελέσματα των δοκιμών ELISA για κάθε πείραμα, υπολογίστηκε το ποσοστό των ιωμένων φυτών. Εικόνα 15: Αναπαράσταση (αριστερά) της τεχνικής της ανοσοενζυμικής μεθόδου ELISA κατά την οποία το πρώτο αντίσωμα καθηλώνεται στη βάση των φρεατίων της μικροπλάκας και το αντιγόνο αναγνωρίζεται από το πρώτο αντίσωμα και συνδέεται με αυτό. Στη συνέχεια, προστίθεται το δεύτερο αντίσωμα που αναγνωρίζει και συνδέεται ειδικά με μια άλλη περιοχή του αντιγόνου. Το δεύτερο αντίσωμα είναι συζευγμένο με ένζυμο (συνηθέστερα αλκαλική φωσφατάση). Η προσθήκη του υποστρώματος έχει σαν αποτέλεσμα την υδρόλυση αυτού και την παραγωγή χρώματος. Η οπτική πυκνότητα μετριέται συνήθως στα 405 nm (εξαρτάται από το ένζυμο και το υπόστρωμα που χρησιμοποιούνται σε κάθε τεχνική) με τη βοήθεια φασματοφωτομέτρου. Η συγκεκριμένη τεχνική πραγματοποιείται σε ειδικές μικροπλάκες 96 πηγαδίων (δεξιά)

72 4.7. Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Στις περισσότερες περιπτώσεις η ανάλυση των ποσοστών έγινε με ANOVA, σύμφωνα με το πλήρως τυχοιοποιημένο σχέδιο με ομάδες, όπου ομάδες ήταν οι επαναλήψεις. Τα ποσοστά πριν χρησιμοποιηθούν στην ANOVA μετατρέπονταν σε τόξο ημιτόνου ποσοστού. Για τη σύγκριση των ποσοστών μετάδοσης του ιού με άπτερα του κλώνου M. persicae και πτερωτά του αγρού ή του κλώνου αλλά και για τη σύγκριση των ποσοστών των δύο τύπων ARENA με τα πτερωτά του κλώνου M. persicae έγινε ανάλυση ποσοστών με το κριτήριο Χ2.

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με άπτερα ενήλικα θηλυκά της αφίδας Myzus persicae Ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης των έξι στελεχών του ΤuΜV από άπτερα ενήλικα θηλυκά της αφίδας Μ.persicae ήταν 39±2,5% (Σχ. 1). Πιο συγκεκριμένα, μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης εμφάνισε το στέλεχος 5 (44±5,1%), ενώ ακολουθούσαν τα 7 και 10 με ποσοστά 41±4,9% και 41±5,2%, αντίστοιχα. Το στέλεχος 3 μεταδόθηκε σε ποσοστό 39±9,2% και τέλος τα στελέχη 6 και 8 εμφάνισαν ποσοστά 34±8,8% και 34±3,9%, αντίστοιχα. Δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς την ικανότητα μετάδοσης του ιού μεταξύ των στελεχών (F = 0,396, BE = 5, 20, P = 0,846) και των ομάδων (επαναλήψεων) (F = 0,242, BE = 4, 20, P = 0,911). 5.2. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με ομάδα άπτερων ενήλικων θηλυκών της αφίδας Myzus persicae Σε αντίθεση με τα ποσοστά μετάδοσης του TuMV που παρουσιάστηκαν παραπάνω (παρ. 5.1) όπου η μετάδοση του ιού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός μόνο άπτερου ενήλικου θηλυκού Μ. persicae, όταν χρησιμοποιήθηκε ομάδα πέντε άπτερων ενήλικων θηλυκών το ποσοστό μετάδοσης του ιού και στις 3 επαναλήψεις ανήλθε για όλα τα στελέχη στο 100% σύμφωνα με τα αποτελέσματα των δοκιμών ELISA. Σε όλα τα φυτά (10 φυτά για κάθε στέλεχος/επανάληψη) εμφανίστηκαν τα χαρακτηριστικά συμπτώματα του ιού 1820 μέρες μετά την μόλυνση.

74 Σχήμα 1. Ποσοστό (%) ιωμένων φυτών σε πειράματα αφιδομεταδόσεων με τα έξι στελέχη.(no 3: TuMV-FKD004J, No 5: TuMV-59J, No 6: TuMV-CHL13, No 7: TuMV-CHK16, No 8 TuMVCP845J, No 10: TuMV-HRD, M.O.: μέσο ποσοστό για τα στελέχη) του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (ΤuΜV) με άπτερα ενήλικα θηλυκά της αφίδας Μyzus persicae. Οι γραμμές υποδηλώνουν τυπικό σφάλμα (±SE). Πέντε επαναλήψεις για κάθε στέλεχος με 10 φυτά ανά επανάληψη 5.3. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με πτερωτά άτομα του κλώνου της αφίδας Myzus persicae Ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης των δύο στελεχών ( No 5: TuMV59J, No 10: TuMV-HRD) του ΤuΜV από πτερωτά άτομα της αφίδας Μ. persicae ήταν 56±3,7% (Σχ. 2). Πιο συγκεκριμένα, μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης εμφάνισε το στέλεχος 10 (60±4,5%), ενώ το στέλεχος 5 μεταδόθηκε σε ποσοστό 52±5,8%. Δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών (F = 0,857, BE = 1, 4, P = 0,406) και των ομάδων (επαναλήψεων) (F = 0,459, BE = 4, 4, P = 0,765).

75 Σχήμα 2. Ποσοστό (%) ιωμένων φυτών σε πειράματα αφιδομεταδόσεων με τα δύο στελέχη (No 5, No 10, M.O. = μέσο ποσοστό για τα στελέχη) του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (ΤuΜV) με πτερωτά άτομα του κλώνου της αφίδας Μyzus persicae. Γραμμές υποδηλώνουν τυπικό σφάλμα (±SE). Πέντε επαναλήψεις για κάθε στέλεχος με 10 φυτά ανά επανάληψη 5.4. Αποτελεσματικότητα μετάδοσης του TuMV με πτερωτά άτομα της αφίδας Myzus persicae που συλλέχθηκαν από δέντρα ροδακινιάς Ο μέσος όρος των ποσοστών μετάδοσης των έξι στελεχών του ΤuΜV από τα πτερωτά άτομα αγρού ήταν 69±1,33% (Σχ. 3).

76 Σχήμα 3. Ποσοστό (%) ιωμένων φυτών σε πειράματα αφιδομεταδόσεων με τα έξι στελέχη του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (ΤuΜV) με πτερωτά άτομα της αφίδας Μyzus persicae από δέντρα ροδακινιάς. Γραμμές υποδηλώνουν τυπικό σφάλμα (±SE). Πέντε επαναλήψεις για κάθε στέλεχος με 10 φυτά ανά επανάληψη Συγκεντρωτικά, τα δύο στελέχη του ΤuΜV (No 5: TuMV-59J, No 10: TuMV-HRD) στις τρεις από τις τέσσερις παραπάνω διαφορετικές μεταχειρίσεις (μετάδοση του TuMV με άπτερα και πτερωτά άτομα του εργαστηριακού κλώνου της αφίδας Μ. Persicae αλλά και μετάδοση με πτερωτά άτομα της Μ. Persicae που συλλέχθηκαν από δέντρα ροδακινιάς), εμφάνισαν μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης όταν η μετάδοση του ιού πραγματοποιήθηκε με πτερωτά άτομα που προήλθαν από δέντρα ροδακινιάς σε σχέση με πτερωτά και άπτερα του εργαστηριακού κλώνου της αφίδας (Σχ. 4). Έτσι, τα στελέχη 5 και 10 εμφάνισαν ποσοστά μετάδοσης 68±3,7% και 70±3,2% αντίστοιχα με τα πτερωτά άτομα της αφίδας από δέντρα ροδακινιάς, ενώ με τα πτερωτά άτομα του εργαστηριακού

77 κλώνου τα ποσοστά ήταν 52±5,8% και 60±4,5%, αντίστοιχα. Τέλος, με τα άπτερα άτομα του εργαστηριακού κλώνου της αφίδας Μ. persicae τα ποσοστά ήταν 44±5,1% και 41±5,2%, αντίστοιχα. Τόσο για το στέλεχος 5 όσο και για το στέλεχος 10 δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς την αποτελεσματικότητα μετάδοσης του ιού μεταξύ άπτερων και πτερωτών του κλώνου (στέλεχος 5: Χ2 = 0,64, ΒΕ = 1 και P = 0,423 και στέλεχος 10: Χ2 = 3,64, ΒΕ = 1 και P = 0,056). Ενώ και για τα δύο στελέχη βρέθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς την αποτελεσματικότητα μετάδοσης του ιού μεταξύ άπτερων του κλώνου και πτερωτών του αγρού (στέλεχος 5: Χ2 = 5,84, ΒΕ = 1 και P = 0,0156 και στέλεχος 10: Χ2 = 8,54, ΒΕ = 1 και P = 0,0035). Σχήμα 4. Ποσοστό (%) ιωμένων φυτών στα πειράματα αφιδομεταδόσεων για τα στελέχη No 5 και No 10 του ιού ΤuΜV τόσο με πτερωτά άτομα της αφίδας Μyzus persicae από δέντρα ροδακινιάς όσο και με πτερωτά και άπτερα άτομα του εργαστηριακού κλώνου της αφίδας. Γραμμές υποδηλώνουν τυπικό σφάλμα (±SE). Apt: άπτερα εργαστηριακού κλώνου, Alt: πτερωτά άτομα αγρού, Alt_lab: πτερωτά άτομα εργαστηριακού κλώνου