ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ II II-1. Σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης Το σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης που χρησιµοποιείται για τη συγκεκριµένη εργαστηριακή άσκηση αποτελείται από τα ακόλουθα τµήµατα: Κινητή φάση (Εκλούτης) Αντλία παροχής κινητής φάσης Βαλβίδα εισαγωγής δείγµατος Προ-Στήλη Στήλη Ανιχνευτής Ηλεκτρονικός Υπολογιστής (Η/Υ) Αντλία παροχής κινητής φάσης: Ο ρόλος της αντλίας στο χρωµατογραφικό σύστηµα είναι να παρέχει την κινητή φάση σε σταθερή πίεση που εξασφαλίζεται µε σταθερή ροή. Υπάρχουν τρεις τύποι αντλιών, οι παλινδροµικές αντλίες, οι αντλίες σύριγγας ή εκτόπισης και οι πνευµατικές ή σταθερής πίεσης αντλίες. Στην παρούσα άσκηση χρησιµοποιείται αντλία παλινδρόµησης που µπορεί να λειτουργήσει σε πιέσεις έως 6000 psi και µε ταχύτητες ροής 0,01-9,99 ml/min. Η κινητή φάση αντλείται µέσω των σωληνώσεων που συνδέονται σε ένα πλαστικό ή µεταλλικό φίλτρο. Μετά την παρασκευή της κινητής φάσης, για την οποία χρησιµοποιούνται υπερκάθαροι διαλύτες αναλυτικού βαθµού HPLC, αυτή πρέπει να διηθείται µε φίλτρα 0,4 µm και να απαερώνεται πριν τη χρήση της. Η απαέρωση της κινητής φάσης µπορεί να γίνει: α) µε εφαρµογή κενού στο δοχείο του διαλύτη, β) µε χρήση λουτρού υπερήχων και γ) µε διοχέτευση αερίου He. Η σχολαστική εφαρµογή των παραπάνω αποτρέπει την απόφραξη της αντλίας από τυχόν σωµατίδια, την εµφάνιση πλασµατικών κορυφών ή θορύβου στο χρωµατογράφηµα και το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα στις κεφαλές της αντλίας, οι οποίες προκαλούν αστάθεια στη ροή, αλλά και ακόµη πιο σηµαντικά προβλήµατα όταν εγκλωβιστούν στη στήλη ή στον ανιχνευτή. 1
Ανιχνευτής αγωγιµότητας Στήλη Εκλούτης Προ-στήλη Βαλβίδα εισαγωγής δείγµατος Αντλία: Marathon III HPLC pump Σχήµα II-1: Σύστηµα χρωµατογραφιας υψηλής απόδοσης Βαλβίδα εισαγωγής δείγµατος: Η εισαγωγή του δείγµατος στο σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας γίνεται µε ειδική µικροσύριγγα µέσω ειδικής βαλβίδας εισαγωγής, η οποία έχει δυο θέσεις λειτουργίας. Η λειτουργία της βαλβίδας εισαγωγής φαίνεται στο σχήµα II-2 και είναι η εξής: Στη θέση πλήρωσης (load) ο εκλούτης ρέει µέσα από τη στήλη και ο βρόχος (loop) µεταξύ του εκλούτη και του δείγµατος είναι αποµονωµένος. Έτσι, γίνεται πλήρωση του βρόχου µε το δείγµα µέσω της µικροσύριγγας, προσέχοντας ώστε να µην έχει εγκλωβιστεί κάποια φυσαλίδα στη σύριγγα. Ένα µέρος του δείγµατος, ίσο µε τον όγκο του 2
βρόχου, κατακρατείται σε αυτόν, και το υπόλοιπο απορρίπτεται. Έπειτα, ο δίσκος στρέφεται στη θέση έγχυσης (Inject) και τα κανάλια που είναι χαραγµένα στο δίσκο αλλάζουν διαδροµή. Τα κανάλια που ήταν στη διαδροµή του δείγµατος, και τώρα περιέχουν το δείγµα, µπαίνουν στη διαδροµή του εκλούτη και έτσι το δείγµα παρασύρεται στη στήλη προς ανάλυση. Η περιστροφή του δίσκου της αντλίας πρέπει να είναι ταχεία και οµοιόµορφη, ώστε οι νεκροί όγκοι στο τµήµα της έγχυσης να ελαχιστοποιούνται. Θέση πλήρωσης δείγµατος (Fill) (α) βρόχος (loop) 20 µl Από αντλία Θέση εισαγωγής δείγµατος (Inject) (β) βρόχος Από αντλία (loop) 20 µl σύριγγα Προς απόβλητα Προς στήλη Προς στήλη Σχήµα II-2: Λειτουργία µιας τυπικής βαλβίδας εισαγωγής δείγµατος Προστήλη: Οι προστήλες χρησιµοποιούνται για να προστατεύσουν τις αναλυτικές στήλες της χρωµατογραφίας, οι οποίες κοστίζουν αρκετά ακριβά, καθώς αποµακρύνουν όχι µονο τα αιωρούµενα σωµατίδια και τις προσµίξεις από το διαλύτη, αλλά και συστατικά του δείγµατος που συνδέονται µε τη στατική φάση µη αντιστρεπτά. Οι στήλες αυτές τοποθετούνται µετά τη βαλβίδα έγχυσης και πριν την αναλυτική στήλη, έχουν µικρότερο µήκος από την κύρια στήλη, και περιέχουν συνήθως το ίδιο πληρωτικό υλικό, συνήθως µε µεγαλύτερο µέγεθος κόκκων, ώστε να ελαχιστοποιείται η πτώση πίεσης. Αναλυτική στήλη: Η αναλυτική στήλη αποτελείται από τον εξωτερικό µεταλλικό κύλινδρο από ανοξείδωτο χάλυβα και το υλικό πλήρωσης που βρίσκεται στο εσωτερικό του. Οι στήλες χαρακτηρίζονται από το µήκος τους (10-30 cm), την εσωτερική διάµετρο (4-10 mm), καθώς 3
και από το είδος, τη διάµετρο (1,7-10 µm) και την επιφάνεια των κόκκων του υλικού πλήρωσης. Ανιχνευτής υπεριώδους ορατού: Ο ανιχνευτής που χρησιµοποιείται στη συγκεκριµένη άσκηση είναι ανιχνευτής απορρόφησης. Υπάρχουν ανιχνευτές απορρόφησης µε φίλτρο στην υπεριώδη περιοχή, ανιχνευτές απορρόφησης υπεριώδους µε µονοχρωµάτορες, διατάξεις µε ανιχνευτές συστοιχιών διόδων, ανιχνευτές απορρόφησης υπερύθρου. Στην συγκεκριµένη άσκηση, χρησιµοποιείται ανιχνευτής απορρόφησης υπεριώδους µε επιλογή ενός µήκους κύµατος, το οποίο επιλέγεται έτσι, ώστε να επιτυγχάνεται βέλτιστη ανίχνευση όλων των συστατικών του διαχωρίζοµενου µίγµατος. Λήψη και επεξεργασία αποτελεσµάτων: Το σήµα της απορρόφησης του ανιχνευτή ως προς το χρόνο αποθηκεύεται στη µνήµη ενός υπολογιστή. Συνήθως, τα σύχρονα συστήµατα διαθέτουν λειτουργίες, όπως η διόρθωση της απόκλισης βάσης, η εξοµάλυνση των δεδοµένων εισόδου, η ολοκλήρωση των κορυφών, κτλ. II-2. ιαδικασία αναλύσεως 1. Ανοίγουµε τον χρωµατογράφο. 2. Ξεκινάµε τον Η/Υ (Τον υπολογιστή τον χειριζόµαστε από το πληκτρολόγιο και όχι µε το ποντίκι, γιατί η υποδοχή για το ποντίκι χρησιµοποιείται ήδη). 3. Ανοίγουµε την αντλία του χρωµατογράφου (διακόπτης πίσω). 4. Συνδέουµε τη στήλη και την αντλία (outlet) µε τη βαλβίδα έγχυσης (χρησιµοποιείται βρόχος, loop 20 µl). 5. Ανοίγουµε τον ανιχνευτή υπεριώδους ορατού (διακόπτης στη θέση ON) και επιλέγουµε το ABS. Ρυθµίζουµε το µήκος κύµατος λ=275 nm, το εύρος, Range, στην τιµή 0.005, το time constant στην τιµή 1. Το καλώδιο εξόδου του ανιχνευτή (πίσω µέρος του ανιχνευτή, θέση 1V intergrator) είναι µόνιµα συνδεδεµένο στη θέση CH1 του µετατροπέα (Vernier καταγραφικού). 6. Ανοίγουµε το λογισµικού πρόγραµµα χειρισµού του χρωµατογράφου: Logger Pro 2.2.1 (start program Vernier Software Logger Pro 2.2.1 ) 7. Ανοίγουµε τις ρυθµίσεις του χρωµατογραφήµατος (Alt + F Open par-caf.mbl ). 4
8. Ελέγχουµε τις ρυθµίσεις για το µέγιστο και το ελάχιστο πίεσης της αντλίας (σε συνεννόηση µε τον υπεύθυνο και µε βάση το εγχειρίδιο λειτουργίας της στήλης). 9. Αποµακρύνουµε από τις σωληνώσεις της αντλίας τυχόν παλαιό εκλούτη. Ανοίγουµε τη βαλβίδα PRIME/PURGE (τη στρέφουµε όλη τη διαδροµή αριστερά) και τοποθετούµε κατάλληλο περιέκτη κάτω από την οπή. Λειτουργώντας την αντλία στη θέση PRIME/PURGE η ροή είναι στο µέγιστο (9.99 ml/min) γεγονός που σηµαίνει ότι απαγορεύεται αυστηρά να χρησιµοποιηθεί η εντολή PRIME εάν η αντίστοιχη βαλβίδα δεν είναι ανοιχτή (όλη η διαδροµή αριστερά) γιατί θα προκληθεί ζηµιά στο υπόλοιπο σύστηµα του χρωµατογράφου. Εφαρµόζουµε την εντολή PRIME για 1-2 min. Με τον τρόπο αυτό καθαρίζουν οι σωληνώσεις από τον προηγούµενο εκλούτη. 10. Τοποθετούµε τις σωληνώσεις της αντλίας στο καινούργιο εκλούτη. Η βαλβίδα θα πρέπει να παραµείνει στη θέση PRIME/PURGE (όλη η διαδροµή αριστερά). Εφαρµόζουµε την εντολή PRIME για 1-2 min. Με τον τρόπο αυτό γεµίζουν οι σωληνώσεις από τον καινούργιο εκλούτη. Εάν διαπιστώσουµε φυσαλίδες µέσα στις σωληνώσεις συνεχίζουµε να χρησιµοποιούµε την αντλία στη θέση PRIME µέχρι να εξαλειφθούν. Εάν διαπιστώσουµε αδυναµία αναρρόφησης ενηµερώνουµε τον υπεύθυνο ώστε να υποβοηθηθεί η αναρρόφηση µέσω πλαστικής σύριγγας. 11. Κλείνουµε την βαλβίδα PRIME/PURGE (στρέφουµε όλη τη διαδροµή δεξιά). 12. Ρυθµίζουµε τη ροή από τον πίνακα ελέγχου σε 0.5 ml/min και διαβιβάζουµε εκλούτη στο σύστηµα δίνοντας την εντολή RUN. Ελέγχουµε όλες τις συνδέσεις του συστήµατος για διαρροές και εάν η έξοδος των αποβλήτων είναι κανονική. 13. ιατηρούµε τη ροή 0.5 ml/min, για µισή ώρα περίπου, ώστε να εξισορροπηθεί η στήλη. 14. Εάν διαπιστώσουµε υπερπίεση ή διακοπή της ροής ενηµερώνουµε τον υπεύθυνο. 15. Αυξάνουνε τη ροή σταδιακά σε 1 ml/min που είναι και η ροή στις συνθήκες ανάλυσης. 16. Καταγράφουµε το σήµα του ανιχνευτή στον Η/Υ από τη θέση Experiment. (Αlt + X Collect ) 17. Ρυθµίζουµε το παράθυρο του χρωµατογραφήµατος από τη θέση View (Alt + V, tab, ρύθµιση των αξόνων.) 18. Πραγµατοποιούµε τις ρυθµίσεις του ενισχυτή (Alt + S). Εάν είναι επιθυµητό το κλείσιµο κάποιου παραθύρου αυτό γίνεται µε το πλήκτρο Esc. 5
19. Όταν σταθεροποιηθεί το σήµα του ανιχνευτή γίνεται µηδενισµός της γραµµής βάσης από το κουµπί zero στο µπροστινό τµήµα του ανιχνευτή. 20. Η εισαγωγή των δειγµάτων γίνεται µε ειδική γυάλινη µικροσύριγγα. Για την έγχυση δείγµατος στο χρωµατογράφο, τοποθετείται η βαλβίδα έγχυσης στη θέση φόρτωσης (Load), πληρώνεται η µικροσύριγγα ακριβείας µε όγκο δείγµατος 3πλάσιο από τον όγκο του βρόχου, µε προσοχή, ώστε να µην περιέχονται φυσσαλίδες στη σύριγγα και εγχύεται το δείγµα στη βαλβίδα. Ακολούθως, η βαλβίδα τοποθετείται στη θέση έγχυσης (inject), ώστε το δείγµα να κατευθυνθεί προς την αναλυτική στήλη για διαχωρισµό και ταυτόχρονα ενεργοποιούµε την καταγραφή στον Η/Υ από τη θέση Experiment (Alt + X Collect ). Πριν από κάθε ένεση του δείγµατος θα πρέπει να εκπλύνουµε το βρόχο µε το ίδιο δείγµα 3-4 φορές. Αυτό γίνεται εάν στη θέση Load ενέσουµε το ίδιο δείγµα πού θα αναλύσουµε. Είναι αυτονόητο ότι θα πρέπει να φροντίσουµε για τον καθαρισµό της σύριγγας πριν ενέσουµε το δείγµα. Οι σύριγγες που χρησιµοποιούνται στη χρωµατογραφία είναι αρκετά ακριβές και θα πρέπει να χειρίζονται προσεκτικά. 21. Όταν ολοκληρωθεί το χρωµατογράφηµα η καταγραφή απενεργοποιείται από τη θέση Experiment (Alt + X Stop collect). 22. Σηµειώνουµε επίσης ορισµένες χρήσιµες παραµέτρους της ανάλυσης (Full Scale, ροή εκλούτη, απορρόφηση εκλούτη, όγκος του βρόχου ανάλυσης, είδος στήλης). 23. Αφήνουµε τον εκλούτη να τρέξει µέσα από τη στήλη για 30 min ακόµα. 24. Κλείνουµε την αντλία και το χρωµατογράφο. 25. Σε συνεννόηση µε τον υπεύθυνο και λαµβάνοντας υπ όψιν τα αντίστοιχα εγχειρίδια του συστήµατος κάνουµε τις απαραίτητες ενέργειες για την συντήρηση της αντλίας και της στήλης µέχρι την επόµενη χρήση. 26. Καθαρίζουµε το χώρο εργασίας (Αδειάζουµε τα δοχεία αποβλήτων κλπ.) 27. Αποθηκεύουµε τα δεδοµένα στη δισκέτα από τη θέση File (Alt + F Export data, µε tab και τα βελάκια οδηγείται ο κέρσορας στη τοποθεσία δισκέτα, δίνεται όνοµα στο αρχείο ). 28. Κλείνουµε τον Η/Υ. 6