ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 5. ΝΕΟ ΥΒΡΙΔΙΚΟ ΒΙΟΫΛΙΚΟ ΒΙΟΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΕΝΙΣΧΥΜΕΝΩΝ ΜΕ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΑΡΓΥΡΟΥ ΚΑΙ Η ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΣΤΗΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Σπαθής Ά., Ρίζος Ε., Παπαδόπουλος Δ., Τσουκνίδας Α., Τσιπάς Δ., Μιχαηλίδης Ν., Αγγελή Α. aspathis@cheng.auth.gr, aggeli@auth.gr Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, TK 544 Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, TK 544 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μεγάλο ενδιαφέρον έχουν προσεγγίσει τα μεταλλικά νανοσωματίδια τα τελευταία χρόνια λόγω των εκπληκτικών ιδιοτήτων τους και του τεράστιου εύρους εφαρμογών τους. Στην παρούσα εργασία γίνεται φασματοσκοπικός χαρακτηρισμός νέου υβριδικού βιοϋλικού υδρογέλης αποτελούμενο από αποικοδομημένο κολλαγόνο (ζελατίνη τύπου Α) και νανοσωματίδια αργύρου (AgNPs), παρασκευασμένα με νέα πρωτοπόρο μέθοδο. Η φασματοσκοπία UV-Vis είναι ιδιαίτερα χρήσιμη τεχνική κυρίως για τον ποιοτικό αλλά και για τον ποσοτικό χαρακτηρισμό δειγμάτων. Έγινε σύγκριση του φάσματος του βιοϋλικού με φάσματα των συστατικών που το αποτελούν έτσι ώστε να διακριθεί κάθε κορυφή και να διερευνηθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους. Η παρουσία του πρωτεϊνικού πλέγματος προκαλεί πύκνωση στα AgNPs, αλλά μόνον σε υψηλές συγκεντρώσεις AgNPs. Τέλος, διαπιστώθηκε πως το υβριδικό βιοϋλικό είναι σταθερό στο πέρασμα του χρόνου και δεν αλλοιώνεται η ποιότητά του.. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πολυάριθμες προηγούμενες έρευνες έχουν μελετήσει και εντοπίσει τo σημαντικό ρόλο του αργύρου στην ιατρική, για παράδειγμα την ισχυρή αντιμικροβιακή δράση του ιοντικού αργύρου. Νανοδομές μεταλλικού αργύρου έχουν επίσης μελετηθεί από ορισμένους ερευνητές και έχει παρατηρηθεί ότι βελτιώνουν κατά πολύ το βιολογικό ρόλο του αργύρου, για παράδειγμα την αντιμικροβιακή και την αντιφλεγμονώδη δράση του. Επιπλέον εφαρμογές των νανοσωματιδίων αργύρου έχουν σημειωθεί εκτός από την θεραπευτική ιατρική και στην διάγνωση ασθενειών, σε καθετήρες, στην ορθοπεδική και σε χειρουργικά πλέγματα []. Το πρωτεϊνικό πλέγμα κολλαγόνου (collagen gel) είναι ένα βιοϋλικό φιλικό προς τον ανθρώπινο οργανισμό, αφού εντοπίζεται σε πολλούς ιστούς και ιδιαίτερα στον συνδετικό. Η προσθήκη νανοσωματιδίων αργύρου στο πρωτεϊνικό πλέγμα κολλαγόνου υπόσχεται καλύτερο έλεγχο της δράσης των νανοσωματιδίων αργύρου (ελεγχόμενη ή/και παρατεταμένη απελευθέρωση ιοντικού αργύρου), επιτυχή εφαρμογή της δραστικής ουσίας στο σημείο ανάγκης, έλεγχο στη δημιουργία και ιδιότητες των νανοσωματιδίων, παρεμπόδιση του σχηματισμού συσσωματωμάτων, καθώς και βελτίωση της συμπεριφοράς του βιοπολυμερούς ή ακόμη και δημιουργία νέων ιδιοτήτων του βιοπολυμερικού πλέγματος. Είναι μία οδός που δεν έχει διερευνηθεί επαρκώς μέχρι σήμερα και οι ενδείξεις δείχνουν ότι το τελικό προϊόν που δύναται να παραχθεί, μπορεί να είναι υψηλής ποιότητας και δράσης. Η ακόλουθη διεπιστημονική μελέτη επικεντρώνεται στην παραγωγή πρωτοπόρων υβριδικών βιοϋλικών βασισμένων σε πρωτεϊνικό πλέγμα αποικοδομημένου κολλαγόνου, ενισχυμένο με καινοτόμα νανοσωματίδια αργύρου που παρήχθησαν με νέα, φιλική προς το περιβάλλον μέθοδο. Ο χαρακτηρισμός του υβριδικού βιοϋλικού διεξάγεται χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία υπεριώδους ορατού για τη διερεύνηση των μοριακών και διαμοριακών αλληλεπιδράσεων, βιο-μηχανική μελέτη για το χαρακτηρισμό των ρεολογικών ιδιοτήτων του, μικροσκοπία για την μελέτη της δομής των νανοσωματιδίων αργύρου μέσα στο πρωτεϊνικό πλέγμα καθώς και τα δομικά χαρακτηριστικά του πλέγματος και έκθεση σε μικροβιακό περιβάλλον για καθορισμό της αντιμικροβιακής του ικανότητας, συναρτήσει της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης και των νανοσωματιδίων αργύρου. Αναμένεται ότι το υλικό που θα προκύψει θα έχει πολυάριθμες εφαρμογές σε ειδικά προβλήματα του χώρου της ιατρικής και η μελέτη του θα ανοίξει ενδεχομένως τον δρόμο για την περεταίρω διερεύνηση των πολύτιμων ιδιοτήτων των υβριδικών βιοϋλικών.. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ.. Υδατικά διαλύματα ζελατίνης Α Ζελατίνη τύπου Α από την εταιρία Sigma-Aldrich chemicals διαλύθηκε σε απιονισμένο νερό με θέρμανση στους 4 o C και παράλληλη μηχανική ανάδευση σε χρόνους 5 έως 6 min, μέχρι να διαλυθεί πλήρως η ζελατίνη,
ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 5. ώστε να παραχθούν τέσσερα διαλύματα συγκεντρώσεων.65,.,.7 και % w/w για φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού... Διαλύματα AgNPs Το διάλυμα AgNPs παράχθηκε με την αναγωγή νιτρικού αργύρου (AgNO 3 ) από ουσίες που περιέχονταν στο εκχύλισμα των φύλλων του φυτού Arbutus unedo, από την επιστημονική ομάδα των Μιχαηλίδη/Τσιπά []. Οι πρώτες δοκιμές στα πλαίσια της παρούσας εργασίας έγιναν με διάλυμα νανοσωματιδίων που είχε πρασινωπό χρώμα και πριν από κάθε χρήση απαιτούσε καλή ανακίνηση για διάσπαση των συσσωματωμάτων που ενδεχομένως είχαν δημιουργηθεί κατά την κατάσταση ηρεμίας. Στη συνέχεια, αντικαταστάθηκε από ένα διάλυμα νανοσωματιδίων που παρασκευαζόταν με πιο προηγμένη μέθοδο, είχε χρώμα σκούρο κόκκινο και δεν χρειαζόταν ανακίνηση καθώς είχε παρεμποδιστεί σημαντικά ο σχηματισμός συσσωματωμάτων. Τα δύο διαλύματα μπορούν να συγκριθούν οπτικά στο Σχήμα. Σχήμα. Νέο (αριστερά) και παλιό (δεξιά) διάλυμα νανοσωματιδίων αργύρου Ελήφθησαν τα φάσματα και των δύο διαλυμάτων καθώς και αραιωμένων : δειγμάτων αυτών..3. Διάλυμα AgNO 3 και εκχύλισμα φυτού Διάλυμα AgNO 3 mm και εκχύλισμα φύλλων φυτού που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των νανοσωματιδίων μετρήθηκαν, επίσης, στο φασματοφωτόμετρο..4. Ζελατίνη Α σε διάλυμα AgNPs Απαιτούμενη ποσότητα ζελατίνης τύπου Α διαλύθηκε σε διάλυμα AgNPs με παράλληλη θέρμανση στους 4 o C και μηχανική ανάδευση ώστε να διαλυθεί πλήρως η ποσότητα ζελατίνης. Πριν το διάλυμα αφεθεί σε ηρεμία και θερμοκρασία περιβάλλοντος απομακρύνθηκε μικρή ποσότητα για να αραιωθεί :. Έτσι με το αρχικό διάλυμα να έχει συγκέντρωση % w/w gel. A σε AgNPs, το αραιωμένο διαμορφώθηκε στο.% w/w. Και από τα δύο διαλύματα ελήφθησαν δείγματα για φασματοσκοπία.. Φασματοσκοπική ανάλυση υπεριώδους-ορατού Για την φασματοσκοπική ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο Shimadzu σε εύρος μηκών κύματος 9-94 και 34-94 nm για τα υδατικά διαλύματα ζελατίνης και τα διαλύματα AgNPs αντίστοιχα. Για τα φάσματα εύρους 9-94 nm χρησιμοποιήθηκαν κυψελίδες χαλαζία, ενώ για εκείνα εύρους 34-94 nm κυψελίδες υάλου, όλες με πάχος και πλάτος mm. 3. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Στο Σχήμα παρουσιάζονται τα φάσματα των υδατικών διαλυμάτων ζελατίνης σύστασης,65,,,,7 και % w/w. Σε όλα τα δείγματα παρατηρείται μία κύρια κορυφή περίπου στα nm και μία δευτερεύουσα στα 8 nm ενώ η πρωτεΐνη, όπως αναμένεται, δεν απορροφά στην ορατή περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Στη συνέχεια, στο Σχήμα, παρατίθενται τα φάσματα των δύο διαλυμάτων AgNPs (παλιού και νέου) καθώς και των αραιωμένων δειγμάτων τους στο Σχήμα 3. Από το Σχήμα εύκολα μπορεί κανείς να συμπεράνει ότι το φάσμα του νέου διαλύματος νανοσωματιδίων, που παρουσιάζει την κύρια κορυφή του προσεγγιστικά στα 5 nm, έχει μικρότερη διασπορά από το φάσμα του παλιού διαλύματος, του οποίου η κορυφή εντοπίζεται στα 5-
Απορρόφηση ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 5. 54 nm. Μεγάλη διασπορά του φάσματος και ανύψωση της βάσης της καμπύλης σηματοδοτεί ενίσχυση του φαινομένου της σκέδασης του φωτός και άρα ύπαρξη δομών μεγαλύτερης διαμέτρου, δηλαδή συσσωματωμάτων. Έτσι επαληθεύεται ότι το νέο διάλυμα νανοσωματιδίων έχει σταθερότερες δομές που αντέχουν στον χρόνο. Αντίστοιχα συμπεράσματα εξάγονται και από τα φάσματα των αραιωμένων δειγμάτων που φαίνονται στο Σχήμα 3. Όπως ήταν αναμενόμενο, το φάσμα του παλιού διαλύματος νανοσωματιδίων έχει μεγαλύτερη διασπορά λόγω συσσωματωμάτων. Επιπλέον, στο φάσμα του αραιωμένου νέου διαλύματος νανοσωματιδίων διακρίνεται καλύτερα η κορυφή στα 46 nm..5,65% gel. A,% gel. A,7% gel. A % gel. A.5 9 4 9 34 39 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 Σχήμα. Υδατικά διαλύματα ζελατίνης τύπου A 3.5 3 Νέο διάλυμα AgNPs Παλιό διάλυμα AgNPs.5.5 34 39 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 94 99 4 Σχήμα. Παλιό και νέο διάλυμα νανοσωματιδίων
Απορρόφηση ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 5..4. Αραιωμένο παλιό διάλυμα AgNPs Αραιωμένο νέο διάλυμα AgNPs.8.6.4. 34 39 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 94 99 4 Σχήμα 3. Αραιωμένα παλιό και νέο διάλυμα νανοσωματιδίων Ακολούθως, παρουσιάζονται στο Σχήμα 4 τα φάσματα του διαλύματος AgNO 3 και του εκχυλίσματος των φύλλων του φυτού σε σύγκριση με το φάσμα των AgNPs. Αρχικά, παρατηρούμε ότι η κορυφή του φάσματος νανοσωματιδίων στα 36 nm, που εντοπίζεται και στο φάσμα του αραιωμένου νέου διαλύματος νανοσωματιδίων στο ίδιο μήκος κύματος του Σχήματος 3, συμπίπτει με την μοναδική κορυφή του φάσματος του εκχυλίσματος του φυτού και έτσι αυτή η κορυφή αποδίδεται κυρίως στα συστατικά του εκχυλίσματος του φυτού που εντοπίζονται στο διάλυμα νανοσωματιδίων. Τέλος παρατηρούμε ότι πιθανά υπολείμματα ιοντικού αργύρου στο διάλυμα AgNPs που δεν ανήχθησαν, δεν γίνονται αντιληπτά μέσω της φασματοσκοπίας. 3.5 3.5 Διάλυμα AgNPs Αραιωμένο εκχύλισμα φυτού Διάλυμα AgNO3.5 33 38 43 48 53 58 63 68 73 78 83 88 93 98 3 Σχήμα 4. Φάσματα νέου διαλύματος AgNPs, εκχυλίσματος φυτού (/ σε νερό) και νιτρικού αργύρου Στο Σχήμα 5 παρατίθενται τα φάσματα του διαλύματος % w/w ζελατίνης A με βάση το νέο διάλυμα νανοσωματιδίων και του σκέτου νέου διαλύματος AgNPs (διαλύτη). Με την προσθήκη της πρωτεΐνης στο διάλυμα δημιουργείται μία νέα, δευτερεύουσα κορυφή γύρω στα 6 nm ήδη από την πρώτη ώρα μετά την παρασκευή του διαλύματος. Η κύρια κορυφή περί τα 5 nm οφείλεται στο φαινόμενο του επιφανειακού πλασμονικού συντονισμού (Surface Plasmon Resonance, SPR) και είναι η κορυφή μεγαλύτερης έντασης στο ορατό φάσμα απορρόφησης. Η δευτερεύουσα κορυφή καθώς και η ανύψωση της βάσης της καμπύλης απορρόφησης οφείλεται, όπως αναφέρθηκε και ανωτέρω, στον σχηματισμό μερικών δομών μεγαλύτερου μεγέθους.
Απορρόφηση ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 5. Στα φάσματα των αραιωμένων αντίστοιχων δειγμάτων που παρουσιάζονται στο Σχήμα 6 διακρίνεται ότι η κύρια κορυφή δεν μετατοπίζεται από τα 46 nm ή μειώνεται η έντασή της με την προσθήκη της ζελατίνης αλλά δεν είναι εμφανής η δημιουργία της δευτερεύουσας κορυφής στα 6 nm. Τέλος, ελήφθησαν φάσματα αυτού του τελευταίου διαλύματος σε βάθος χρόνου (μερικές εβδομάδες) μετά την παρασκευή του για να διαπιστωθεί πιθανή χρονική αλλοίωση. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 7, καμία τέτοια αλλοίωση δεν συνέβη, οπότε μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το διάλυμα παρουσιάζει χρονική σταθερότητα. 3.5 3 % gel. A σε AgNPs Διάλυμα AgNPs.5.5 34 39 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 94 99 4 Σχήμα 5. Νέο διάλυμα νανοσωματιδίων σκέτο και με % gelatin A..8 Αραιωμένο % gel. A σε AgNPs Αραιωμένο διάλυμα AgNPs.6.4. 34 39 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 94 99 4 Σχήμα 6. Αραιωμένα (/ σε νερό) σκέτο και % gelatin A σε νέο διάλυμα AgNPs
ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 5...8.% σε AgNPs την ημέρα παρασκευής.% σε AgNPs επτά μέρες μετά.6.4. 34 39 44 49 54 59 64 69 74 79 84 89 94 99 4 Σχήμα 7. Χρονική εξάρτηση του διαλύματος.% w/w gel. A σε AgNPs 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Με την βοήθεια της φασματοσκοπίας έγινε αντιληπτή η αλληλεπίδραση των AgNPs με τα μόρια ζελατίνης. Επίσης, έγινε πλήρης ταυτοποίηση των ουσιών που εντοπίζονται στο διάλυμα και παρατηρήθηκε το φαινόμενο της συσσωμάτωσης συσχετιζόμενο με οπτικά χαρακτηριστικά των διαλυμάτων. Τα επόμενα στάδια της μελέτης είναι η κατανόηση των δομών Ag σε σχέση με το πρωτεϊνικό πλέγμα στο νέο υβριδικό υλικό, μέσω της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (SEM, TEM) αλλά και των ρεολογικών ιδιοτήτων του. Επιπρόσθετα, η διερεύνηση της συμπεριφοράς του βιοϋλικού παρουσία μικροοργανισμών θα είναι καθοριστική για την ισχύ αλλά και τον μηχανισμό της αντιμικροβιακής δράσης του. 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ []. Kenneth KY Wong, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3. Silver Nanoparticles in Medicine: Is the Panacea Here?. [Online] (5) Available at: http://www.nanomedjournal.com/content/silvernanoparticlesinmed [Accessed 7 March 5] []. Kouvaris, P., Delimitis, A., Zaspalis, V., Papadopoulos, D., Tsipas, S. and Michailidis, N.,. Green synthesis and characterization of silver nanoparticles produced using Arbutus unedo leaf extract. Materials Letters, 76, pp.8-