9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΙΚΡΟΔΟΡΥΦΟΡΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΤΗ ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ ΤΟΥ ΜΠΑΡΜΠΟΥΝΙΟΥ (Mullus surmuletus) Βογιατζή Ε. 1, 2, Μανουσάκη Τ. 1, 3, Αντωνίου Α. 1, Lagnel J. 1, Νταϊλιάνης Θ. 1, Hanel R. 4, Μαγουλάς Α. 1, Τσιγγενόπoυλος Κ. 1 1 Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετική, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών 2 Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής, Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης 3 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης 4 IFM Geomar, Kiel, Germany Περίληψη Tο μπαρμπούνι (Mullus surmuletus) είναι ένα είδος που παρουσιάζει κατανομή από τη Μεσόγειο και τη Μαύρη Θάλασσα έως τις βορειοδυτικές ακτές της Αφρικής και τον Ατλαντικό Ωκεανό. Εμφανίζει υψηλό εμπορικό ενδιαφέρον, με συνέπεια τη βαριά εκμετάλλευσή του στη Μεσόγειο. Για τη μελέτη της πληθυσμιακής δομής στο είδος, δημιουργήθηκε αρχικά μια γενωμική βιβλιοθήκη, εμπλουτισμένη με αλληλουχίες που περιέχουν μικροδορυφορικές επαναλήψεις. Στη συνέχεια, σχεδιάστηκαν εκκινητές, οι οποίοι βελτιστοποιήθηκαν και δοκιμάστηκαν τόσο σε έναν πληθυσμό M.surmuletus, όσο και σε τέσσερα συγγενικά είδη της οικογένειας Mullidae (M. barbatus, U. moluccensis, P. prayensis, M. martinicus). Κατόπιν, οι εκκινητές αυτοί χρησιμοποιήθηκαν για τη γονοτύπιση 18 πληθυσμών M.surmuletus από διαφορετικές περιοχές. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων έδειξαν τη σχεδόν απουσία γενετικής δομής ανάμεσα στους πληθυσμούς του είδους καθώς και τον μη σαφή διαχωρισμό ανάμεσα στους πληθυσμούς του M.surmuletus από Μεσόγειο και Ατλαντικό. Μια πιθανή εξήγηση είναι η γονιδιακή ροή ή μια πρόσφατη εξάπλωση. Λέξεις κλειδιά:.mulllidae, Mullus surmuletus, μικροδορυφορικό DNA, βιογεωγραφία. DEVELOPMENT AND APPLICATIONOF MICROSATELLITE MARKERS IN THE PHYLOGEOGRAPHY OF STRIPED RED MULLET (Mullus surmuletus) Vogiatzi E. 1,2, Manousaki T. 1, 3, Antoniou A. 1, Lagnel J. 1, Dailianis T. 1, Hanel R. 4, Magoulas A. 1, Tsigenopoulos C. 1, 1 Institute of Marine Biology and Genetics, Hellenic Centre of Marine Research 2 Department of Molecular Biology and Genetics, Democritus University of Thrace 3 Biology Department, Univeristy of Crete 4 IFM Geomar, Kiel, Germany Abstract The red stripped mullet (Mullus surmuletus) is a species distributed from the Mediterranean and the Black Sea to the northwest coasts of Africa andthe Atlantic Ocean. It is of considerable economic importance, resulting to its overfishing in the Mediterranean Sea. Using as reference one single sample, a genomic library was developed, consisting of a set of microsatellite-containing sequences. Moreover, primers were designed, improved and tested on a population of M.surmuletus as well as on four other species of the Mullidae family (M. barbatus, U. moluccensis, P. prayensis, M. martinicus). Furthermore, these primers were included in a multiplex used for the genotyping of 18 populations of M. surmuletus from different regions. The analysis results demonstrated the quasi-absence of genetic structure among the populations of the above species as well as no evidence of separation among the populations of M.surmuletus from the Atlantic Ocean and the Mediterranean Sea. A possible explanation might be the extensive gene flow or a recent population expansion. Keywords: Mullidae, Mullus surmuletus, microsatellite DNA, genetic structure, biogeography. 1. Εισαγωγή Τα είδη της οικογένειας Mullidae (goatfishes) παρουσιάζουν παγκόσμια εξάπλωση στα τροπικά και εύκρατα νερά και θεωρούνται πολύ σημαντικά έως πηγή τροφής. Στη Μεσόγειο υπάρχουν τρία -1149-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ από τα δεκαπέντε γένη της οικογένειας: Mullus, Upeneus και Pseudopeneus (Whitehead, 1986). Tο μπαρμπούνι (Mullus surmuletus) και η κουτσομούρα (Mullus barbatus) συναντώνται κυρίως στη Μεσόγειο με παρόμοια κατανομή από τον ανατολικό Ατλαντικό και τις βορειοδυτικές ακτές της Αφρικής έως τη Μαύρη Θάλασσα. Ειδικά στη Μεσόγειο, αποτελούν κύριο στόχο για μικρής κλίμακας και ημι-βιομηχανική αλιεία. Το γένος Upeneus αντιπροσωπεύεται από δύο είδη, το U. pori (brownband goatfish) και το U. moluccensis (goldband goatfish), τα οποία έχουν μια ευρεία κατανομή στον Ινδο-Ειρηνικό ωκεανό και αποίκησαν τη Μεσόγειο μετά τη διάνοιξη της διώρυγας του Σουέζ (1869) ιδρύοντας μεγάλους μόνιμους πληθυσμούς. Το Pseudopeneus prayensis της δυτικής Αφρικής έχει μια ατλαντική κατανομή από το Μαρόκο ως την Ανγκόλα και πρόσφατα βρέθηκε στη δυτική Μεσόγειο. Οι γενετικές μελέτες τα μεσογειακά είδη της οικογένειας βασίστηκαν αρχικά στα αλλοένζυμα (Cammarata et al., 1991; Mamuris, et al., 1998b; Turan, 2006), στα RAPDs, και στους μιτοχονδριακούς δείκτες (Apostolidis et al., 2001; Mamuris et al., 2001) όπως επίσης και σε συνδυασμό των πιο πάνω τεχνικών (Mamuris et al., 1999a; Mamuris et al., 1999b). Πρόσφατα, με σκοπό να μελετηθεί η γενετική δομή τοπικών πληθυσμών κουτσομούρας (M. barbatus), αναπτύχθηκαν δι-νουκλεοτιδικοί μικροδορυφορικοί δείκτες (Garoia et al., 2004; Galarza et al., 2007). Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να ερευνήσει την πληθυσμιακή δομή (genetic structure) και τις βιογεωγραφικές σχέσεις μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών στο μπαρμπούνι, ενός από τα πιο ακριβά και εμπορικά είδη ψαριών στη Μεσόγειο. Ειδικά για το μπαρμπούνι, το υψηλό εμπορικό ενδιαφέρον του έχει οδηγήσει στη βαριά εκμετάλλευση των πληθυσμών του στη Μεσόγειο (Bauchot, 1987). Εάν υπάρχει ή όχι ουσιαστική γενετική δομή είναι ιδιαίτερα σημαντικό όχι μόνο για τη διαχείριση του μπαρμπουνιού αλλά επίσης και στην ανιχνευσιμότητα των προϊόντων των μπαρμπουνιών όπως επίσης και για μια γενική κατανόηση των εξελικτικών διαδικασιών όπως η επιρροή της γεωμορφολογίας, της υδρογραφίας και του τρόπου αναπαραγωγής στη διασπορά και την ειδογένεση στο μεσογειακό περιβάλλον. Συνδυάζοντας διαφορετικούς τύπους γενετικών δεικτών, η πιθανότητα για μια πιο γενική κατανόηση της γενετικής δομής ενός είδους αυξάνει εκθετικά. Η ανάλυση των σύντομων διαδοχικών επαναλήψεων (short tandem repeats ή STRs), αποκαλούμενων επίσης και μικροδορυφορικών δεικτών, είναι η πιο πρόσφατη μέθοδος ανάλυσης στη πληθυσμιακή βιολογία (Goldstein & Schlötterer 1999). Τα μικροδορυφορικά είναι επαναλαμβανόμενα μοτίβα 1-6 βάσεων που βρίσκονται σε όλα τα ευκαρυωτικά αλλά και σε πολλά προκαρυωτικά γονιδιώματα που έχουν αναλυθεί μέχρι σήμερα. Είναι παρόντα και στις περιοχές κωδικοποίησης και χαρακτηρίζονται συνήθως από έναν υψηλό βαθμό πολυμορφισμού (μήκους). Έχουν αποδειχθεί ισχυρά εργαλεία για διαφορετικές εφαρμογές όπως τις ιατροδικαστικές μελέτες DNA, τη γενετική πληθυσμών και τη συντήρηση και διαχείριση των βιολογικών πόρων. 2. Υλικά και Μέθοδοι Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 558 ενήλικα άτομα μπαρμπουνιού (Mullus surmuletus) από 18 διαφορετικές περιοχές (Εικ. 1) Χρησιμοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο εμπλουτισμού (enrichment protocol) για την απομόνωση ενός πλήθους αλληλουχιών που περιέχουν μικροδορυφορικές επαναλήψεις για το M. surmuletus (Tsigenopoulos et al., 2003). To 2o βήμα αφορούσε στο σχεδιασμό μικροδορυφορικών δεικτών (primers) και τη δυνατότητα χρήσης τους σε τέσσερα διαφορετικά είδη της οικογένειας Mullidae: Mullus barbatus (21 δείγματα), Upeneus moluccensis (36 δείγματα), Pseudopeneus prayensis (12 δείγματα), τα οποία συναντώνται στη Μεσόγειο) και το Mulloidichtys martinicus (5 δείγματα). Το 3ο βήμα αφορά στη μελέτη των φυλογεωγραφικών σχέσεων ανάμεσα σε 18 πληθυσμούς του M. surmuletus από τον Ατλαντικό ωκεανό και τη Μεσόγειο. -1150-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Εικ. 1: Χάρτης σταθμών δειγματοληψίας ατόμων M.surmuletus (απεικονίζονται με άσπρο χρώμα στην Ευρώπη και μαύρο στην Ελλάδα). 3. Αποτελέσματα Σχεδιάστηκαν ζεύγη εκκινητών για 20 διαφορετικές αλληλουχίες, οι οποίοι ελέγχθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης, κι από αυτούς επιλέχθηκαν εκείνοι που είχαν τα καλύτερα αποτελέσματα και για τα πέντε είδη (10 τελικό σύνολο). Παραγγέλθηκαν ως σημασμένοι και ακολούθησε βελτιστοποίησή τους με ηλεκτροφόρηση σε αυτόματο αναλυτή αλληλουχιών (ABI sequencer 3700). Στις αναλύσεις που ακολούθησαν, χρησιμοποιήθηκε ενδεικτικά ένας πληθυσμός M.surmuletus (από τη Γραμβούσα, 27 δείγματα) και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τα προγράμματα GENETIX 4.05 (Belkhir et al., 2000) και FSTAT 2.9.3 (Goudet 1995). Πίνακας 1: Οι 10 δείκτες που επιλέχθηκαν, ο αριθμός και το εύρος των αλληλομόρφων για κάθε έναν από αυτούς στα πέντε είδη. Όπου n, ένδειξη για μηδενικά αλληλόμορφα με τη χρήση του προγράμματος MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004) M. surmuletus M. barbatus U. moluccensis P. prayensis M. martinicus Msurm_002 9 208-224 8 212-232 13 192-218 7 194-212 4 212-244 Msurm_008 11 221-245 11n 227-255 - - - - - - Msurm_045 2n 207-209 12 213-249 - - - - - - Msurm_051 15 173-201 6 165-183 14 163-193 - - - - Msurm_056 7 234-246 9 234-250 15 232-262 10 226-248 3 244-250 Msurm_068 13n 227-251 11n 223-265 11n 221-247 - - - - Msurm_073 4n 85-117 4 87-101 15n 79-117 3n 79-83 3 101-123 Msurm_101 5 108-116 3 108-114 1 114 1 114 1 114 Msurm_142 7 171-193 6 153-167 17n 149-193 3 149-153 6 157-189 Msurm_204 5 180-190 6 186-204 16n 190-226 3n 170-174 - - Πίνακας 2: Έλεγχος της ισορροπίας Hardy-Weinberg στα πέντε είδη. Nb of samples Hexp Hobs P(0.95) Mean Alleles / Locus Mullus surmuletus 27 0.5833 0.5462 0.9 7.8 Mullus barbatus 25 0.6149 0.5606 1 7.6 Upeneus moluccensis 36 0.8865 0.7702 1 14.4286 Pseudupeneus prayensis 12 0.5308 0.383 0.8333 4.45 Mulloidichthys martinicus 5 0.464 0.4 0.8 3.4-1151-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Από τους 10 μικροδορυφορικούς δείκτες επιλέχθηκαν για να αναλυθούν οι 6 με την καλύτερη απόδοση, δημιουργώντας ένα multiplex, το οποίο βελτιστοποιήθηκε και δοκιμάστηκε στους 18 πληθυσμούς του M. surmuletus με σκοπό τη γονοτύπισή τους. Τέλος, υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις κατά Nei (1972) και κατασκευάστηκε ένα δενδρόγραμμα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σύνδεσης γειτόνων (Neighbor Joining, Saitou & Nei 1987) (Εικ. 2) Εικ. 2: Δενδρόγραμμα κατασκευασμένο με τη μέθοδο Neighbor-Joining (Saitou & Nei 1987) και τις γενετικές αποστάσεων κατά Nei (1972) των 18 πληθυσμών του M.surmuletus βασισμένο σε δεδομένα 6 μικροδορυφορικών γενετικών τόπων. 4. Συζήτηση Είναι εντυπωσιακός ο υψηλός βαθμός επιτυχούς πολλαπλασιασμού με PCR για μικροδορυφορικούς τόπους από το μπαρμπούνι στα άλλα είδη Mullidae που μελετήθηκαν (Πίν. 1). Αυτό μπορεί να αποτελέσει ένα σημαντικό εργαλείο στην έρευνα της γενετικής δομής των αγρίων πληθυσμών, τη διερεύνηση της γενετικής διαχείρισης τους (conservation genetics) όπως επίσης και στη μελέτη κάθε μελλοντικής αλληλεπίδρασης και υβριδισμού μεταξύ τους. Πράγματι, προηγούμενες εργασίες με τη χρήση άλλων γενετικών μεθόδων είχαν ήδη καταδείξει ότι τα δύο είδη Mullus (M. surmuletus και M. barbatus) είναι πιο απομακρυσμένα γενετικά από το P. prayensis παρά από το U. moluccensis (Mamuris et al., 1999a; Apostolidis et al., 2001) παρά το ότι τα αλλοένζυμα φαινόταν να υποστηρίζουν μια ελαφρώς στενότερη σχέση τους με το P. prayensis (Mamuris et al., 1999a). Η σύγκριση μεταξύ ειδών βασιζόμενη σε αλληλουχίες DNA δύο μιτοχονδριακών γονιδίων (cytb και 16S rrna) οδήγησαν σε μια εκτιμούμενη γενετική απόκλιση από 8.53% μεταξύ M. surmuletus και M. barbatus ως 23.32% μεταξύ P. prayensis και U. moluccensis (Apostolidis et al., 2001). Τέλος, όσον αφορά στη φυλογεωγραφία του μπαρμπουνιού, είναι ευρέως γνωστό ότι τα δραματικά παλαιογεωγραφικά και παλαιοκλιματικά φαινόμενα που συνέβησαν στο Μεσογειακό χώρο (Rögl, 1998; Taviani, 2002; Duggen et al., 2003) έχουν διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξελικτική ιστορία πολλών θαλασσίων ειδών και έχουν διαμορφώσει την παρούσα βιογεωγραφία -1152-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ και βιοποικιλότητα της ιχθυοπανίδας (Hanel, et al., 2002,; Nikula & Väinölä 2003, Bernardi et al., 2004; Costagliola et al., 2004; Valsecchi et al., 2005). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν, μεταξύ των πληθυσμών υπάρχει πολύ μικρή διαφοροποίηση ενώ δεν υπάρχει σαφής ένδειξη διαχωρισμού ανάμεσα στους πληθυσμούς M. surmuletus της Μεσογείου και του Ατλαντικού. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι στους πληθυσμούς του M. surmuletus παρατηρείται πανμιξία, όπως έχει ήδη αναφερθεί και σε άλλα είδη όπως τα Diplodus sargus, Pagellus bogaraveo, Pagrus pagrus και Scomber japonicus (Patarnello et al., 2007). Η απουσία καθαρής γεωγραφικής δομής για το M.surmuletus μπορεί εν μέρει να δικαιολογηθεί από την επίδραση της γονιδιακής ροής ακόμα και σε μεγάλες αποστάσεις, όπως το Αιγαίο και ο Ατλαντικός ωκεανός. Μια περισσότερο πιθανή εξήγηση ίσως είναι μια σχετικά πρόσφατη εξάπλωση που δεν επέτρεψε στους πληθυσμούς να διαφοροποιηθούν πολύ από τα αρχικά αποθέματα. 5. Ευχαριστίες Ευχαριστούμε τους Νότα Περιστεράκη, Λευτέρη Πινάκη, Κώστα Σκαρβέλη, Αγγελική Αδαμίδου, Γιώργο Γκάφα, Σταύρο Χατζηφώτη και Cemal Turan, για τη βοήθεια τους στη συλλογή δειγμάτων. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το έργο Αριστεία του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε (Υπηρεσιακό σχέδιο 2006-08) και το IKYDA 2008. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Apostolidis, A. P., Mamuris, Z., & Triantaphyllidis, C., 2001. Phylogenetic relationships among four species of Mullidae (Perciformes) inferred from DNA sequences of mitochondrial cytochrome b and 16S rrna genes. Biochemical Systematics and Ecology 29:901-909. Bauchot, M.L., 1987. Poissons osseux. In: Fiches FAO d identification pour les besoins de la pêche. (rev. 1). Méditerranée et mer Noire. Zone de Pêche 37, Vol. II, Fischer, W., Bauchot, M.L.,and Schneider, M. (eds.). Rome: Commission des Communautés Européennes and FAO, 891 1421.. Belkhir, K., Borsa, P., Chikhi, L., Raufaste, N. & Bonhomme, F.,1996-2004. GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier (France). Bernardi, G., Bucciarelli, G., Dostagliola, D., Robertson, D.R. & Heiser, J.B., 2004. Evolution of coral reef fish Thalassoma spp. (Labridae). 1. Molecular phylogeny and biogeography. Mar. Biol. 144:369-375. Cammarata, M., Parrinello, N., & Arculeo, M., 1991. Biochemical taxonomic differenciation between Mullus barbatus and Mullus surmuletus (Pisces, Mullidae). Comp. Biochem. Physiol 99 B:719-722. Costagliola, D., Robertson, D.R., Guidetti, P., Stefanni, S., Wirtz, P., Heiser, J.B. & Bernardi, G., 2004. Evolution of coralreef fish Thalassoma spp. (Labridae). 2. Evolution of the eastern Atlantic species. Mar. Biol. 144:377-383. Duggen, S., Hoernle, K., van den Bogaard, P., Rupke, L. & Phipps Morgan, J., 2003. Deep roots of the Mediterranean salinity crisis. Nature 422:602-606. Galarza, J. A., Turner, G. F., Macpherson, E., Carreras-Carbonell, J., & Rico, C., 2007. Cross-amplification of 10 new isolated polymorphic microsatellite loci for red mullet (Mullus barbatus) in striped red mullet (Mullus surmuletus). Molecular Ecology Notes 7:230-232. Garoia, F., Guarniero, I., Piccinetti, C., & Tinti, F., 2004. First microsatellite loci of red mullet (Mullus barbatus) and their application to genetic structure analysis of Adriatic shared stock. Marine Biotechnology 6:446-452. Goldstein, D. & Schlotterer, C. 1999. Microsatellites: evolution and applications. Oxford University Press. Goudet, J., 1995. Fstat version 1.2: a computer program to calculate Fstatistics. Journal of Heredity 86:485-486. Hanel R., Westneat M.W. & Sturmbauer C. 2002., Phylogenetic relationships, evolution of broodcare behavior, and geographic speciation in the Wrasse tribe Labrini. J. Mol. Evol. 55 (6): 776-789. Mamuris, Z., Apostolidis, A. P., Theodorou, A. J., & Triantaphyllidis, C., 1998a. Application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to evaluate intraspecific genetic variation in red mullet (Mullus barbatus). Marine Biology 132:171-178. Mamuris, Z., Apostolidis, A. P., & Triantaphyllidis, C., 1998b. Genetic protein variation in red mullet (Mullus barbatus) and striped red mullet (M. surmuletus) populations from the Mediterranean Sea. Marine Biology 130:353-360. Mamuris, Z., Stamatis, C., Bani, M., and Triantaphyllidis, C., 1999a. Taxonomic relationships between four species of the Mullidae family revealed by three genetic methods: allozymes, random amplified polymorpic DNA and mitochondrial -1153-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ DNA. Journal of Fish Biology 55:572-587. Mamuris, Z., Stamatis, C., & Triantaphyllidis, C., 1999b. Intraspecific genetic variation of striped red mullet (Mullus surmuletus L.) in the Mediterranean Sea assessed by allozyme and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Heredity 83:30-38. Mamuris, Z., Stamatis, C., Moutou, K. A., Apostolidis, A. P. & Triantaphyllidis, C., 2001. RFLP analysis of Mitochondrial DNA to evaluate genetic variation in striped red mullet (Mullus surmuletus L.) and red mullet (Mullus barbatus L.) Populations. Marine Biotechnology 3:264-274. Nei, M., 1972. Genetic distance between populations. American Naturalist 106:283-292. Nikula, R. & Väinölä, R., 2003. Phylogeography of Cerastoderma glaucum (Bivalvia: Cardiidae) across Europe: a major break in the Eastern Mediterranean. Mar. Biol. 143:339-350. Patarnello, T., Volckaert, F. A. M. J., & Castilho, R., 2007. Pillars of Hercules: is the Atlantic-Mediterranean transition a phylogeographical break? Molecular Ecology 16:4426-4444. Rögl, F., 1998. Palaeogeographic considerations for Mediterranean and Paratethys seaways (Oligocene to Miocene). Annal. Nat. Mus. Wien 99A:279-310. Saitou, N., & Nei, M., 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol 4(4):406-425. Taviani, M., 2002. The Mediterranean benthos from late Miocene up to present: ten million years of dramatic climatic and geological vicissitudes. Biol. Mar. Medit. 9:445-463. Tsigenopoulos, C.S., Hellemans, B., Chistiakov, D.A., Libertini, A., Kotoulas, G. & Volckaert, F., 2003. Eleven new microsatellites of the sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Molecular Ecology Notes, 3:352 354. Turan, C., 2006. Phylogenetic relationships of Mediterranean Mullidae species (Perciformes) inferred from genetic and morphological data. Scientia Marina 70:311-318. Valsecchi, E., Pasolini, P., Bertozzi, M., Garoia, F., Ungaro, N., Vacchi, M., Sabelli, B. & Tinti, F., 2005. Rapid Miocene- Pliocene dispersal and evolution of Mediterranean rajid fauna as inferred by mitochondrial gene variation. J. Evol. Biol. 18:436-446. Van Oosterhout, C., Hutchinson, W. F., Wills, D. P. M. & Shipley, P., 2004 micro-checker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes 4:535-538. Whitehead, P.J., Bauchot, M. L., Hureu, J. C., Nielsen, L. & Totronese, E., (Eds),1984-1986. Fishes of the North-eastern Atlantic and the Mediterranean. Vol. I, II, III. UNESCO, Paris: 1-1473. -1154-