E M E D N L C SCIENCES BIOMEDICAL E N T E R Kέντρο Μέντελ για Βιοιατρικές Επιστήμες Συχνότητα Human Papilloma Virus (HPV) στη Κύπρο Βασίλειος Τάνος MD PhD www.mendelcenter.org
Picture taken from leaflet of Wartec: Podophyllotoxin 2
Εργαστηριακή Διαδικασία Φυγοκέντρηση του δείγματος Απομόνωση DNA από 20 mg υγρού βάρους ιζήματος επιθηλιακών κυττάρων διαλυμένου σε 200 μl PBS (Qiagen) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction: PCR) με HPV-ειδικά εναρκτήρια μόρια (My09/My11) H PCR ενισχύει-πολλαπλασιάζει μια συγκεκριμένη περιοχή DNA που καθορίζεται από τα εναρκτήρια μόρια (primers). Τεστ που εμπεριέχουν PCR έχουν μεγάλη ευαισθησία, διότι ο πολλαπλασιασμός γίνεται με γεωμετρική πρόοδο (θεωρητικά μετά από 30 κύκλους PCR η ποσότητα του προιόντος μπορεί να είναι 10 9 φορές μεγαλύτερη από την αρχική). 3
Δείγμα πριν και μετά την πρώτη φυγοκέντρηση Τα σωληνάρια έχουν διαγραμμίσεις που επιτρέπουν την ακριβή μέτρηση του όγκου του ιζήματος (σημαντικό για τη μετέπειτα μέτρηση του ιϊκού φορτίου) 4
Ανίχνευση του Ιού, μέτρηση του ιϊκού φορτίου και τυποποίηση Τα προϊόντα της PCR υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρεση σε πηκτή αγαρόζη (ανίχνευση του ιού) Μια ημι-ποσοτική μέτρηση του ιϊκού φορτίου γίνεται με διαδοχική διαλύση του δείγματος Η τυποποίηση του Ιού γίνεται με κόψιμο του προϊόντος της PCR με ένζυμα περιορισμού (restriction fragment length polymorphism: RFLP σε τουλάχιστον 5 ξεχωριστές αντιδράσεις) και σύγκριση της εικόναςαποτελέσματος με τις γνωστές ή αναμενόμενες in silico εικόνες-αποτελέσματα όλων των τύπων του Ιού. 5
Positive/Negative Screening +ve +ve +ve +ve 6
Ιϊκό Φορτίο (Viral Load) Η ημιποσοτική μέτρηση του ιϊκού φορτίου γίνεται με τον έλεγχο διαδοχικών 10-πλάσιων διαλύσεων (ξεκινώντας με DNA που αντιστοιχεί σε 1 mg υγρού βάρους τραχηλικού ιζήματος). M +ve Very High High Moderate Low Blank 1 0.1 0.01 1 0.1 0.01 1 0.1 0.01 1 0.1 0.01 7
HPV τυποποίηση με RFLP HPV53 + HPV 66 HPV 53 HPV 66 Η μέθοδος RFLP καταλήγει σε τυποποίηση υψηλής ευκρίνειας, με επακριβή καθορισμό του τύπου που μολύνει το δείγμα ακόμα και σε περιπτώσεις επιμόλυνσης από δύο τύπους του ιού. 8
Αλληλούχηση DNΑ 20 προιόντα PCR με διαφορετικές εικόνες RFLP από όλους τους γνωστούς τύπους του Ιού αλληλουχήθηκαν: 2 καίνουργιοι τύποι HPV (>10% διαφορετικοί από όλους τους τύπους) 4 υπότυποι HPV (2-10% διαφορετικοί από τον στενότερο συγγενή) 10 HPV variants (<2% διαφορετικοί από τον στενότερο συγγενή) 4 ανθρώπινες αλληλουχίες που ενισχύονται από τα HPV-ειδικά εναρκτήρια μόρια My09/My11. Η ταυτοποίηση αυτών των αλληλουχιών επιτρέπει την μεγιστοποίηση της εξειδίκευσης του HPV DNA τεστ (απάλειψη των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων): Παρούσα εξειδίκευση του τεστ: Test Specificity=100% 9
Ποιοτικός Έλεγχος Όλα τα δείγματα φυλάσσονται παγωμένα (για μελλοντικούς ελέγχους και σύγκριση του ιϊκού φορτίου σε διαδοχικά δείγματα από την ίδια γυναίκα) Το εργαστήριο έχει ξεκινήσει ένα πρόγραμμα εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου μαζί με δύο εξαίρετα Ευρωπαϊκά εργαστήρια τυποποίησης HPV. Τα αποτέλεσματα των τριών εργαστηρίων για τα ίδια δείγματα ήταν ανάλογα. 10
Επιδημιολογική μελέτη στις Κυπρίες Έτη 2001-2004 Στόχοι Εύρεση των επιπέδων μόλυνσης και των τύπων του Ιού στις Ελληνοκύπριες και Τουρκοκύπριες Μελέτη πιθανών παραγόντων κινδύνου: σεξουαλική συμπεριφορά, κάπνισμα, ιστορικό σεξουαλικά μεταδιδόμενων νοσημάτων κ.ά. 11
Στοιχεία της Επιδημιολογικής Μελέτης 1. Κατά την περίοδο Ιανουάριος 2001 Ιούλιος 2004 ελέγχθηκαν από το εργαστήριο του Κέντρου Μέντελ 786 δείγματα γυναικών εκ των οποίων 521 ΕΚ και 187 ΤΚ (γεννήθηκαν και διαμένουν στην Κύπρο). 2. Λήφθηκαν πλήρη ερωτηματολόγια-έντυπα συγκατάθεσης από 225 ΕΚ και 181 ΤΚ. Για τις υπόλοιπες γυναίκες είναι γνωστό κατά πόσον είχαν κάποιο παθολογικό τεστ Παπανικολάου και αν είχαν κονδυλώματα. 3. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε από το Τμήμα Μαθηματικών και Στατιστικής του Πανεπιστημίου Κύπρου. 12
Ερωτηματολόγιο Έντυπο Συγκατάθεσης Όνομα, ημερομηνία γέννησης, τόπος γέννησης, τόπος διαμονής, συνολικός αριθμό τεστ Παπανικολάου στα οποία υποβλήθηκε και οι ακόλουθοι επιδημιολογικοί παράγοντες: (1) Ημερομηνία και αποτέλεσμα του πιο πρόσφατου τεστ Παπανικολάου, ημερομηνίες και αποτελέσματα προηγούμενων παθολογικών τεστ Παπανικολάου (αν υπήρχαν). (2) Ιστορικό κονδυλωμάτων. (3) Αριθμός διαφορετικών σεξουαλικών συντρόφων (κατά τη διάρκεια της ζωής της). (4) Κάπνισμα (αριθμός τσιγάρων ημερησίως και ετών που κάπνιζε). (5) Ηλικία πρώτης σεξουαλικής επαφής. (6) Ιστορικό άλλων σεξουαλικά μεταδιδόμενων νοσημάτων: έρπης, χλαμύδια, σύφιλη, γονόρροια. (7) Αποτελέσματα κολποσκόπησης και βιοψίας (αν έγιναν). 13
Κύπριες που εξετάσθηκαν κατά τόπο διαμονής 350 300 GC TC 250 200 150 100 50 0 South Nicosia Limassol Larnaka Paphos South Famagusta North Nicosia North Famagusta Kyrenia Morfou Karpasia 14
Κύπριες που εξετάσθηκαν κατά ηλικία και κατά κοινότητα 120 100 Αριθμός Γυναικών 80 60 40 GC TC 20 0 18-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-71 Ηλικία 15
Εξετάσθηκε ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα του πληθυσμού 521 Ελληνοκύπριες (0.3% των 180,000 ηλικίας 18-71), μέση ηλικία=37 [αντιπροσωπεύονται κυρίως οι επαρχίες Λευκωσίας και Πάφου] 187 Τουρκοκύπριες (0.5% των 40,000 ηλικίας 21-65), μέση ηλικία=41 [αντιπροσωπεύεται σχεδόν αποκλειστικά η κατεχόμενη επαρχία Αμμοχώστου συμπεριλαμβανομένης της Καρπασίας] 16
Ανάλυση παραγόντων κινδύνου Οι γυναίκες χωρίστηκαν σε 3 κατηγορίες: Υψηλού κινδύνου (παθολογικό τεστ Παπ, condylomata) Μέτριου κινδύνου (Πολλαπλοί Σεξουαλικοί Σύντροφοι>1, Κάπνισμα, άλλα Σεξουαλικά Μεταδιδόμενα Νοσήματα) Χαμηλού κινδύνου Στις ΕΚ η μόλυνση από HPV παρουσιάζει σημαντική σχέση με τον πιο πάνω διαχωρισμό σε κατηγορίες κινδύνου (p<0.01) Στις TΚ δεν βρέθηκε στατιστική διαφορά 17
Ποσοστό μόλυνσης του γενικού πληθυσμού Ως γυναίκες χαμηλού-μέτριου κινδύνου θεωρούνται αυτές που ουδέποτε είχαν παθολογικό τεστ Παπανικολάου (ASCUS, CIN) και ουδέποτε είχαν κονδυλώματα. Τα επίπεδα μόλυνσης γυναίκων χαμηλού-μέτριου κινδύνου από HPV παρουσιάζουν σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο κοινότητες της Κύπρου: 15% ΕΚ, 27% ΤΚ 18
Πληθυσμιακός Έλεγχος Το μεσόδιαστημα ανάμεσα στα τεστ Παπανικολάου στα οποία υποβάλλεται μια γυναίκα υπολογίστηκε ως το αντίστροφο του (αριθμός τεστ Παπ) / (ηλικία - ηλικία πρώτης σεξ. επαφής) Βρέθηκε σημαντική διαφορά ανάμεσα σε γυναίκες χαμηλού-μέτριου κινδύνου των δύο κοινότητων: ΕΚ: Ένα τεστ Παπ κάθε 2 έτη ΤΚ: Ένα τεστ Παπ κάθε 14 έτη 19
Κονδυλώματα Επίπεδα Εκδήλωσης: ΕΚ (χωρίς παθολογικό τεστ Παπ): 3% ΕΚ (με παθολογικό τεστ Παπ): 10% ΤΚ (χωρις παθολογικό τεστ Παπ): 8% ΤΚ (με παθολογικό τεστ Παπ): 14% Η μόλυνση από HPV σχετίζεται με το ιστορικό κονδυλωμάτων στις ΕΚ και στις ΤΚ (p<0.01). 20
Τύποι του ιού στις ΕΚ Από 521 ΕΚ, οι 145 ήταν HPV-θετικές, εκ των οποίων 31 ήταν επιμολυσμένες από δύο ή περισσότερους τύπους (21%). Συχνότεροι τύποι του ιού (ποσοστά μονής μόλυνσης): HPV6 (19%), HPV16 (15%), HPV66 (13%), HPV53 (11%), HPV31 (5%) Συνολικά ανιχνεύθηκαν 29 τύποι του ιού, συμπεριλαμβανομένων και των δύο καινούργιων τύπων που ανακαλύψαμε στην Κύπρο. 21
Τύποι του ιού στις ΤΚ Από 187 ΤΚ, οι 53 ήταν HPV-θετικές, εκ των οποίων 8 ήταν επιμολυσμένες από δύο ή περισσότερους τύπους (15%). Συχνότεροι τύποι του ιού (ποσοστά μονής μόλυνσης): HPV58 (42%), HPV66 (18%), HPV11 (11%). Συνολικά ανιχνεύθηκαν 12 τύποι του ιού. 22
Σχέση του Αριθμoύ Σεξουαλικών Συντρόφων με τη μόλυνση από HPV 80 70 60 % HPV Θετικές 50 40 30 Series1 Series2 20 10 0 1 2-4 >4 Αρ. Σεξ. Συντρόφων 23
Αριθμός Σεξουαλικών Συντρόφων Στις ΕΚ βρέθηκε ότι αυτές που είχαν πολλαπλούς συντρόφους (πέραν του ενός) είχαν σημαντικά αυξημένη πιθανότητα: Nα είναι μολυσμένες από HPV (p<0.001) Να έχουν νεοπλασία του τραχήλου (p<0.001) Να έχουν κονδυλώματα (p<0.001) Στις TK βρέθηκε στατιστικά σημαντική σχέση των πολλαπλών συντρόφων μόνο με το ιστορικό κονδυλωμάτων (p<0.025), (ο αριθμός γυναικών με παθολογικό τεστ Παπ ήταν μικρός) 24
Κάπνισμα Στις ΕΚ βρέθηκε ότι oı καπνίστριες (26% του πληθυσμού) είχαν σημαντικά αυξημένη πιθανότητα: Nα είναι μολυσμένες από HPV (p<0.001) Να έχουν νεοπλασία του τραχήλου (p<0.001) Καμιά σχέση με το ιστορικό κονδυλωμάτων Στις TK δεν βρέθηκε καμιά στατιστικά σημαντική σχέση (καπνίστριες: 36% του πληθυσμού) 25
Κάπνισμα σαν κοινωνικό φαινόμενο ΕΚ και κάπνισμα και κοινωνικό ρόλο ως παράγοντας κινδύνου: 50% από τις καπνίστριες είχαν πολλαπλούς σεξουαλικούς συντρόφους Σε σύγκριση μόνο 17% των μη καπνιστριών είχαν πολλαπλούς σεξουαλικούς συντρόφους (p<0.001). 26
Ιστορικό Σεξουαλικά Μεταδιδόμενων Νοσημάτων 3% των ΕΚ και 4% των ΤΚ είχαν ιστορικό άλλων Σεξουαλικά Μεταδιδόμενων Νοσημάτων (ΣΜΝ: έρπης ή χλαμύδια ή γονόρροια). Καμία γυναίκα δεν είχε ιστορικό σύφιλης. Στις ΕΚ υπήρχε σχέση του ιστορικού ΣΜΝ με τη μόλυνση από HPV (p<0.05). Στις ΤΚ δεν βρέθηκε στατιστική διαφορά. 27
Ηλικία πρώτης σεξουαλικής επαφής (ΗΠΣΕ) Η μικρή ΗΠΣΕ θεωρείται στη διεθνή βιβλιογραφία ως αυξημένου κινδύνου για μόλυνση από HPV (<16: μέτριου κινδύνου, <14 υψηλού κινδύνου) Η μέση ΗΠΣΕ ήταν 21 ετών και στις δύο κοινότητες. Το ποσοστό γυναικών με ΗΠΣΕ κάτω των 16 ήταν μικρότερο του 2% και στις δύο κοινότητες. Φαίνεται ότι η ΗΠΣΕ δεν αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου στην Κύπρο προς το παρόν: ΗΠΣΕ=19 για γυναίκες κάτω των 30 ετών (4% ΗΠΣΕ<16) ΗΠΣΕ=21 για γυναίκες άνω των 30 ετών (2% ΗΠΣΕ<16) Το αντίστοιχο ποσοστό σε Σκανδιναβικές χώρες >50%! 28
Βαθμός κινδύνου που προσδίδουν οι τύποι του ιού στις ΕΚ Τύπος 6 16 66 53 31 Γυναίκες με Φυσιολογικό Τράχηλο ή Τραχηλίτιδα Γυναίκες με Νεοπλασία Τραχήλου 11 1 7 1 3 10 15 5 8 3 Συμπέρασμα: Στις ΕΚ οι τύποι 16 και 53 είναι υψηλού κινδύνου και οι τύποι 6, 31 και 66 είναι μέτριου κινδύνου για νεοπλασία του τραχήλου. Στη διεθνή βιβλιογραφία ο τύπος 6 θεωρείται χαμηλού κινδύνου για καρκίνο του τραχήλου και οι τύποι 16, 31, 33 και 18 θεωρούνται ως υψηλού κινδύνου. 29
Βαθμός κινδύνου που προσδίδουν οι τύποι του ιού στις ΕΚ Τύπος 6 16 31 53 66 Γυναίκες χωρίς κονδυλώματα Γυναίκες με κονδυλώματα 17 14 5 9 8 4 2 0 0 2 Συμπέρασμα: Στις ΕΚ οι τύποι 6, 16 και 66 είναι μέτριου κινδύνου και οι τύποι 31 και 53 είναι χαμηλού κινδύνου για κονδυλώματα. Στη διεθνή βιβλιογραφία ο τύπος 6 θεωρείται υψηλού κινδύνου για κονδυλώματα. 30
Βαθμός κινδύνου που προσδίδουν οι τύποι του ιού στις ΤΚ Τύπος 11 58 66 Γυναίκες χωρίς Κονδυλώματα Γυναίκες με Κονδυλώματα 2 18 7 3 1 1 Συμπέρασμα: Στις ΤΚ οι τύπος 11 είναι υψηλού κινδύνου και οι τύποι 58 και 66 είναι χαμηλού κινδύνου για κονδυλώματα. Στη διεθνή βιβλιογραφία ο τύπος 11 θεωρείται υψηλού κινδύνου για κονδυλώματα. 31
Συμπεράσματα Ποσοστό μόλυνσης του γενικού πληθυσμού ΕΚ (55/355)= 15%, TΚ (43/162 =) 27% 32