ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΠΙΒΙΩΣΗ TOY ΔΑΚΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ BACTROCERA OLEAE (ROSSI) ΣΕ ΥΨΗΛΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΠΙΒΙΩΣΗ TOY ΔΑΚΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ BACTROCERA OLEAE (ROSSI) ΣΕ ΥΨΗΛΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ ΝΙΚΟΛΕΤΤΑ Γ. ΚΟΥΦΑΛΗ Πτυχιούχος Γεωπόνος του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

Στους γονείς και την αδελφή μου

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 4 ABSTRACT 7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ιστορικό της ελιάς 9 1.2 Η καλλιέργεια της ελιάς 10 1.3 Ο δάκος της ελιάς 12 1.3.1 Κατανομή, μορφολογικά χαρακτηριστικά και σημασία του εντόμου 12 1.3.2 Βιολογία του εντόμου 13 1.3.3 Συμπεριφορά σύζευξης και ρόλος της φερομόνης 16 1.3.4 Παράγοντες που επηρεάζουν την ωοπαραγωγή του εντόμου 17 1.3.5 Παράγοντες που προκαλούν θνησιμότητα των ανήλικων σταδίων 18 1.3.6 Συμβιωτικά βακτήρια του δάκου της ελιάς 19 1.3.7 Καταπολέμηση του δάκου της ελιάς 20 1.4 Σκοπός της διατριβής 23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΟΥ ΔΑΚΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ ΣΕ ΥΨΗΛΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ 2.1 Εισαγωγή 24 2.1.1 Ο ρόλος της θερμοκρασίας στην βιολογία των οργανισμών 24 2.1.2 Αποφυγή των υψηλών θερμοκρασιών 25 2.1.3 Μηχανισμοί αντοχής των εντόμων σε υψηλές θερμοκρασίες 26 2.1.4 Βλάβες που προκαλούνται στα έντομα εξαιτίας των υψηλών θερμοκρασιών 27 2.1.5 Υψηλές θερμοκρασίες και αναπαραγωγική ωριμότητα του δάκου της ελιάς 29 2.1.6 Υψηλές θερμοκρασίες και τεχνικές εξάλειψης εντόμων από τους καρπούς 30 2.2 Υλικά και μέθοδοι 32 2.2.1 Διατήρηση της αποικίας του εντόμου 32 1

2.2.2 Επιβίωση ενήλικων ατόμων μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 34 2.2.3 Επιβίωση αυγών και προνυμφών μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 35 2.2.4 Επιβίωση των νυμφών και εμφάνιση ενήλικων ατόμων μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 36 2.2.5 Μελέτη ωοπαραγωγής των θηλυκών ατόμων και εκκόλαψης των αυγών 36 2.3 Στατιστική Επεξεργασία 38 2.3.1 Σύγκριση ποσοστών επιβίωσης προνυμφών διαφόρων ηλικιών και νυμφών του δάκου της ελιάς 38 2.3.2 Σύγκριση διάρκειας ζωής θηλυκών, αρσενικών και θηλυκών με ασρενικά 38 2.3.3 Σύγκριση μέσης συνολικής ωοπαραγωγής για 12 ημέρες 39 2.4 Αποτελέσματα 40 2.4.1 Επιβίωση ανήλικων σταδίων του δάκου της ελιάς μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 40 2.4.2 Επιβίωση των νυμφών μετά από 2ωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 43 2.4.3 Επιβίωση ενήλικων ατόμων (αρσενικών και θηλυκών) του δάκου της ελιάς μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 44 2.4.4 Ωοπαραγωγή μετά από έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 49 2.5 Συζήτηση 52 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΥ ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟΥ ΣΤΗΝ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΟΥ ΔΑΚΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ ΣΕ ΥΨΗΛΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ 3.1 Εισαγωγή 55 3.1.1 Παράμετροι που επηρεάζουν την αντοχή των εντόμων σε υψηλές θερμοκρασίες 55 3.1.2 Τρόποι που συμβάλλουν στην αύξηση της θερμοαντοχής των εντόμων 56 3.1.3 Τύποι εγκλιματισμού των εντόμων σε υψηλές θερμοκρασίες 57 3.1.4 Παραδείγματα εγκλιματισμού και η σημασία τους 58 3.2 Υλικά και μέθοδοι 60 2

3.2.1 Διατήρηση αποικιών στο εργαστήριο 60 3.2.2 Μελέτη της επίδρασης προηγούμενου εγκλιματισμού στην επιβίωση του δάκου της ελιάς μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 60 3.3 Στατιστική Επεξεργασία 61 3.4 Αποτελέσματα 62 3.4.1 Επίδραση προηγούμενου εγκλιματισμού (0, 1 και 3 ημέρες) στη μέση διάρκεια ζωής ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς 62 3.5 Συζήτηση 66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΕΝΗΛΙΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΓΙΑ ΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΩΡΕΣ ΣΕ ΥΨΗΛΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ, ΜΕ ΚΑΙ ΧΩΡΙΣ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟ ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟ 4.1 Εισαγωγή 68 4.2 Υλικά και μέθοδοι 70 4.2.1 Εργαστηριακά αποικία 70 4.2.2 Προσδιορισμός της θνησιμότητας ενήλικων ατόμων μετά από έκθεση για διαφορετικούς χρόνους σε υψηλή θερμοκρασία 37 C (με και χωρίς εγκλιματισμό) 70 4.3 Αποτελέσματα 72 4.3.1 Επίδραση της έκθεσης ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς σε 37 C στην θνησιμότητά τους, με και χωρίς εγκλιματισμό σε 33 C 72 4.4 Συζήτηση 77 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 78 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 79 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ 85 3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera (Dacus) oleae (Rossi), (Οικογένεια Tephritidae, Τάξη Diptera) είναι ο πλέον σημαντικός εχθρός της ελιάς. Εντοπίζεται κυρίως στην λεκάνη της Μεσογείου και είναι μονοφάγο έντομο καθώς, η προνύμφη αναπτύσσεται αποκλειστικά στο μεσοκάρπιο της καλλιεργούμενης ελιάς και της αγριελιάς. Αναπτύσσει 3-4 γενεές το έτος στις περισσότερες περιοχές της χώρας μας και στη διάρκεια του χειμώνα είναι δυνατόν να συνυπάρχουν στον ελαιώνα όλα τα στάδια του εντόμου, ιδιαίτερα σε περιοχές με ήπιο χειμώνα. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, μελετήθηκε με πειράματα εργαστηρίου, η αντοχή-επιβίωση του δάκου της ελιάς σε υψηλές θερμοκρασίες. Χρησιμοποιήθηκαν ενήλικα άτομα ενός πληθυσμού του εντόμου που προερχόταν από την περιοχή της Θέρμης Θεσσαλονίκης. Συγκεκριμένα, προσδιορίσθηκαν η ικανότητα επιβίωσης μετά από 2ωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες των ενήλικων ατόμων (αρσενικών και θηλυκών), ατόμων ανήλικων σταδίων (αυγά, δηλαδή νεαρά έμβρυα 0-3 ώρες μετά την ωοτοκία και προνύμφες) και κατ επέκταση η ικανότητά τους να ολοκληρώνουν ή μη την προνυμφική τους ανάπτυξη, των νυμφών καθώς και η ωοπαραγωγή των θηλυκών ατόμων μετά από έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες. Διαπιστώθηκε ότι, μετά από έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 38 C και 39 C η μέση διάρκεια ζωής των ενηλίκων μειώθηκε σημαντικά ενώ, σε 40 C και 41 C τα άτομα δεν επιβίωναν. Επίσης βρέθηκε ότι, τα θηλυκά άτομα ήταν ανθεκτικότερα στην επίδραση των υψηλών θερμοκρασιών απ ότι τα αρσενικά. Για παράδειγμα, μετά από έκθεση 2 ωρών σε θερμοκρασία 38 C η μέση διάρκεια ζωής των θηλυκών ήταν 68.1 ημέρες ενώ των αρσενικών ήταν σημαντικά μικρότερη (6.4 ημέρες). Τα ποσοστά επιβίωσης των ανήλικων σταδίων του εντόμου ήταν ιδιαίτερα υψηλά, μετά από 2ωρη έκθεση σε θερμοκρασία 25 C (95% και 62.9% για τα αυγά και τις προνύμφες 3 ου σταδίου αντίστοιχα) ενώ, στους 34 C και 36 C παρατηρήθηκε αξιόλογη μείωση στα ποσοστά επιβίωσης των ανήλικων σταδίων, αλλά μη στατιστικώς σημαντική. Ωστόσο, τα ποσοστά επιβίωσης των ανήλικων σταδίων μειώθηκαν σημαντικά σε θερμοκρασία 38 C και ήταν αντίστοιχα μετά από έκθεση 2 ωρών 2.5% για αυγά (νεαρά έμβρυα 0-3 ώρες μετά την ωοτοκία των ελαιοκάρπων) και 55.2% για τις προνύμφες 3 ου σταδίου. 4

Επίσης διαπιστώθηκε ότι, μετά από 2ωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 38 C και 40 C, τα ποσοστά επιβίωσης των νυμφών ήταν ιδιαίτερα υψηλά (86% και 74% αντίστοιχα). Σε ότι αφορά την αντοχή των ανήλικων σταδίων σε υψηλές θερμοκρασίες φαίνεται ότι, οι νύμφες είναι πιο ανθεκτικές από τα υπόλοιπα ανήλικα στάδια. Συγκεκριμένα, σε θερμοκρασία 40 C τα ποσοστά επιβίωσης των νυμφών ήταν αντίστοιχα 74% και των αυγών και προνυμφών ήταν μηδενικά. Όσον αφορά την μέση συνολική ωοπαραγωγή των θηλυκών ατόμων φαίνεται ότι, η 2ωρη έκθεση των θηλυκών σε θερμοκρασίες 25 C, 36 C και 37 C δεν επηρέασε σημαντικά την ωοπαραγωγή καθώς, ο μέσος όρος αποτιθέμενων αυγών για διάστημα 12 ημερών ήταν αρκετά μεγάλος (157.4, 159.1 και 125.1 αυγά αντίστοιχα). Αντίθετα, μετά από έκθεση των θηλυκών ατόμων σε θερμοκρασία 38 C παρατηρήθηκε μία στατιστικώς σημαντική μείωση στην ωοπαραγωγή (86.7 αυγά). Φαίνεται λοιπόν ότι, η έκθεση των θηλυκών ατόμων σε ιδιαίτερα υψηλές θερμοκρασίες (π.χ. 38 C και μεγαλύτερες) έχει σημαντική επίδραση (κόστος) στον αριθμό των αποτιθέμενων αυγών. Μελετήθηκε επίσης, η επιβίωση ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς (αρσενικά και θηλυκά) σε υψηλές θερμοκρασίες, χωρίς εγκλιματισμό (0 ημέρες) αλλά και με προηγούμενο εγκλιματισμό σε υψηλή θερμοκρασία (33 C) για 1 και 3 ημέρες αντίστοιχα. Βρέθηκε ότι, ο προηγούμενος εγκλιματισμός είχε σημαντική επίδραση στην επιβίωση των εντόμων όταν αργότερα εκτέθηκαν σε 38 C, 38.5 C και 39 C καθώς, η μέση διάρκεια ζωής (μακροζωία) των εγκλιματισμένων εντόμων ήταν μεγαλύτερη από την μέση διάρκεια ζωής των μη εγκλιματισμένων εντόμων. Συγκεκριμένα, για θηλυκά άτομα χωρίς εγκλιματισμό η μέση διάρκεια ζωής μετά από έκθεση σε 39 C ήταν 3.1 ημέρες ενώ, για θηλυκά άτομα με εγκλιματισμό 1 και 3 ημερών η μέση διάρκεια ζωής ήταν 13.5 και 27.1 ημέρες αντίστοιχα. Επίσης, αρσενικά και θηλυκά άτομα που διατηρήθηκαν για 12 ώρες σε 33 C καθώς και άτομα που διατηρήθηκαν για 12 ώρες σε 25 C, εκτέθηκαν για τρία διαφορετικά χρονικά διαστήματα (60, 72 και 84 ώρες) σε θερμοκρασία 37 C. Βρέθηκε ότι, η θνησιμότητα των ατόμων επηρεαζόταν από τον χρόνο (διάρκεια) έκθεσης σε θερμοκρασία 37 C, και ήταν πολύ μικρή μετά από 60 ώρες και ιδιαίτερα υψηλή μετά από 72 και 84 ώρες έκθεσης. Επίσης, η ευαισθησία των αρσενικών ατόμων ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των θηλυκών καθώς, παρουσίαζαν υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις. Τέλος, ο προηγούμενος 5

εγκλιματισμός φαίνεται να έχει αρνητική επίδραση καθώς αυξάνει τα ποσοστά θνησιμότητας. Συμπερασματικά φαίνεται ότι, οι υψηλές θερμοκρασίες επηρεάζουν την επιβίωση των ενήλικων και ανήλικων ατόμων καθώς, και την ωοπαραγωγή και μακροζωία των θηλυκών ατόμων του δάκου της ελιάς. Οι επιδράσεις αυτές των υψηλών θερμοκρασιών, ιδιαίτερα στα ενήλικα άτομα, μπορεί να επηρεάζονται από προηγούμενη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες (εγκλιματισμό). Τα αποτελέσματα μπορεί να βοηθήσουν ως ένα βαθμό στην ερμηνεία πληθυσμιακών μεταβολών του εντόμου στη διάρκεια των θερινών μηνών. 6

Heat tolerance of the olive fruit fly, Bactrocera (Dacus) oleae (Rossi), under laboratory conditions Abstract The olive fruit fly Bactrocera (Dacus) oleae (Rossi) (Diptera: Tephritidae) is a major pest of olives in Mediterranean countries. It is considered as monophagous insect since it grows in the mecocarp of cultivated and wild olive fruits. In most regions of Greece it has 3-4 generations per year. In regions with mild winter, it overwinters as pupa in the soil, adult in the olive groove or larva in the olive fruit (in mesocarp). The experiments of the present work were carried out in the laboratory in the period 2006-2008. The stock colony, was established with adults emerged from field collected infested olive fruits. The experimental flies were grown from egg through pupa in olive fruits and as adults were fed on a liquid diet, at 25 C and LD 16:8. Responses (survival, adult longevity and fecundity) of adults, eggs, different larval instars and pupae after exposure for 2 hours to a series of high temperatures (25 C, 36 C, 37 C, 38 C, 39 C, 40 C and 41 C) were investigated. For adult male insects, high survival percentages were found after exposure for 2h at 25 C, 36 C and 37 C and very low to zero at 38 C to 41 C. For female flies, high survival percentages were found after exposure for 2h at 25 C, 36 C, 37 C and 38 C and very low to zero at 39 C to 41 C. It is therefore, concluded that temperatures in the range from 39 C to 41 C are lethal for flies of both sexes. Also, for eggs (young embryos 0-3 hours after oviposition of olive fruits) high survival percentages were found after exposure for 2h at 25 C and 34 C, very low at 36 C and 38 C and zero at 40 C and 42 C. In additional, for different larval instars high survival percentages were found after exposure for 2h at 25 C, 34 C and 36 C, very low survival percentages at 38 C only for 1 st instar larvae and zero at 40 C and 42 C for other larval instars. It is, therefore, concluded that temperature 38 C is especially lethal for eggs while, for the different larval instars at 38 C were noticed higher survival percentages. High survival percentages were found after exposure for 2h at 25 C, 34 C, 36 C, 38 C and 40 C for pupae and zero percentages at 42 C. Pupae were more resistant to 7

high temperatures than eggs and different larval instars. Specifically, after exposure for 2h at 40 C pupae survival percentages were 74% and 0% for eggs and larvae. When adult flies were exposed for 2h at 36 C and 37 C egg production for the next 12 days was not affected. However, when they were exposed at 38 C for 2h, egg production was significantly lower. We may, therefore, conclude that exposure of the adults flies to very high temperatures has a negative effect on egg production. Longevity of adult males and females was also affected by previous exposure at high temperature (33 C, for 1 and 3 days respectively). When flies were exposed to 39 C, longevity was significantly reduced than when they were exposed to 38 C and 38.5 C. Also, mean longevity of males and females was affected by their duration of exposure to high temperatures. Females lived 13.5 and 27.1 days and males 24.8 and 16 days after exposure at 39 C, with acclimation for 1 and 3 days respectively. Mean female and male longevity at 25 C, was 3.1 and 10.4 days respectively after exposure for 2 hours at 39 C. Mortality percentages of females and males maintained at 37 C were relatively low after 60h, and very high after 72 to 84h. Previous acclimation for 12h at 33 C, did not affect mortality percentages. 8

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ιστορικό της ελιάς Η ελιά φαίνεται ότι, ως αυτοφυές δέντρο ήταν γνωστή στην λεκάνη της Μεσογείου από πολλές χιλιάδες χρόνια. Σύμφωνα με τη μελέτη απολιθωμάτων συμπεραίνουμε ότι, οι γυρεόκοκκοι ελιάς εμφανίζονται στον ελλαδικό χώρο γύρω στο 6.000 π.χ. (Ήπειρος) και το 3.200 π.χ. σε Θεσσαλία και Ανατολική Στερεά. Η ελαιοκαλλιέργεια αρχίζει στην Ελλάδα από την 3 η χιλιετία π.χ. και εντατικοποιείται κατά την νεότερη εποχή του χαλκού από το 1.600 π.χ. έως το 1.100 π.χ. (Θεριός, 2005). Ο ρόλος της ελιάς ήταν πολύ σημαντικός στη ζωή των ανθρώπων. Το λάδι αποτελούσε στην αρχαιότητα βασικό στοιχείο της διατροφής των ανθρώπων και απαραίτητη καύσιμη ύλη για φωτισμό (λύχνοι). Επίσης, το λάδι χρησιμοποιούνταν και για τις θεραπευτικές του ιδιότητες για την αντιμετώπιση, δερματοπαθειών αλλά και ως αντισηπτικό σε τραύματα και εγκαύματα. Οι αρχαίοι Έλληνες θεωρούσαν την ελιά σύμβολο σοφίας, ειρήνης και νίκης και οι νικητές των Ολυμπιακών αγώνων έπαιρναν ως έπαθλο ένα στεφάνι από κλαδί ελιάς. Αργότερα, και η χριστιανική θρησκεία ενσωμάτωσε το λάδι στην τελετουργία της (Θεριός, 2005; Σφακιωτάκης, 2000). Πολλοί υποστηρίζουν ότι, πατρίδα της ελιάς είναι η Μ. Ασία και άλλοι η Αβησσυνία ή η Αίγυπτος. Οι Έλληνες είναι ο πρώτος λαός που επιδόθηκε στην καλλιέργεια της ελιάς και από αυτούς οι Ρωμαίοι απέκτησαν την ελιά λίγο αργότερα. Από την Ελλάδα μεταφέρθηκε στα παράλια της Ιταλίας και Γαλλίας και από την Αίγυπτο στα ΝΔ της Μεσογείου μέχρι την Ισπανία. Από την Ευρώπη, η ελιά μεταφέρθηκε στην Καλιφόρνια (όπου η ελαιοκαλλιέργεια ξεκίνησε στις αρχές του 1.800 μ.χ), νότια Αμερική, Αυστραλία και τα τελευταία 30 χρόνια στην Κίνα (Θεριός, 2005). 9

1.2 Η καλλιέργεια της ελιάς Το γένος Olea περιλαμβάνει τουλάχιστον 30-35 είδη που ανήκουν στην οικογένεια Oleaceae, της υποοικογένειας Oleoideae (χ=23, ο βασικός αριθμός χρωμοσωμάτων των διάφορων ποικιλιών). Η καλλιεργούμενη ελιά (Olea europaea L.) ανήκει στην οικογένεια Oleaceae, το γένος Olea, και προήλθε από τροπικά και υποτροπικά είδη, τα οποία διασταυρώθηκαν κάτω από διαφορετικές κλιματικές συνθήκες. Το είδος Olea europaea L. απαρτίζεται από πολλές ομάδες και από 2.600 ποικιλίες (Θεριός, 2005). Η ελιά είναι δέντρο αείφυλλο, αιωνόβιο, αποκτά ύψος 15-20 μ., στην πράξη όμως με το κλάδεμα αποκτά ύψος 4-5 μ. Το μεγαλύτερο ποσοστό ριζών μιας ελιάς βρίσκεται σε βάθος 60-70 εκ. ενώ οι πιο χονδρές ρίζες συνήθως απαντώνται στα πρώτα 20 εκ. Σε δέντρα μεγάλης ηλικίας αναπτύσσονται ιδιαίτερα χονδροί κορμοί. Ο καρπός της ελιάς είναι δρύπη (Θεριός, 2005). Η καλλιέργεια της ελιάς είναι εφικτή σ όλη την εύκρατη και υποτροπική ζώνη. Το δέντρο μπορεί να αναπτύσσεται και στις τροπικές περιοχές χωρίς όμως να καρποφορεί, γιατί δεν ικανοποιούνται οι ανάγκες σε χαμηλές θερμοκρασίες για την διαφοροποίηση των ανθοφόρων οφθαλμών (Θεριός, 2005; Σφακιωτάκης, 2000). Οι ελαιοκομικές περιοχές έχουν μέση ετήσια θερμοκρασία 15-20 C, ελάχιστη -4 C και μέγιστη 40 C. Θερμοκρασίες κάτω των -10 C μπορούν να προκαλέσουν ζημιά στους βραχίονες ή και σε ολόκληρο το δέντρο της ελιάς. Επίσης, η καλλιέργεια της ελιάς θα πρέπει να αποφεύγεται σε περιοχές στις οποίες επικρατούν ισχυροί άνεμοι και παγετοί (π.χ περιοχές της Β. Ελλάδας). Γενικά, το ελληνικό κλίμα ευνοεί την ανάπτυξη της ελιάς, γιατί είναι ξηρό και θερμό από την άνοιξη ως το φθινόπωρο. Η ελιά μπορεί να αναπτυχθεί σε εδάφη σχετικά ξερά και φτωχά, ασβεστώδη, χαλικώδη και πετρώδη. Τα καταλληλότερα όμως εδάφη για κανονική καρποφορία της ελιάς είναι τα βαθιά αμμοπηλώδη, τα οποία περιέχουν άζωτο, κάλιο, φώσφορο (Ν, Κ, Ρ) και νερό σε αξιόλογες συγκεντρώσεις (Θεριός, 2005; Βασιλακάκης, 2004). Ωστόσο, το δέντρο της ελιάς μπορεί να επιζήσει και σε βραχώδη άγονα εδάφη αλλά καρποφορεί κάθε 2-4 χρόνια και οι αποδόσεις του είναι πολύ μικρές. Η ικανότητα αυτή του δέντρου δικαιολογεί την ύπαρξη του σε άγονες ή ακόμη και βραχώδεις περιοχές σε όλη την Ν. Ελλάδα και τα νησιά μας (Βασιλακάκης, 2004). Η ελιά είναι το δέντρο που καλλιεργείται στην Ελλάδα σε μεγαλύτερη έκταση από κάθε άλλο οπωροφόρο και παράγει την μεγαλύτερη ποσότητα καρπού. Σε 10

παγκόσμια κλίμακα η χώρα μας κατέχει την τρίτη θέση σε παραγωγή ελαιολάδου, με πρώτη την Ισπανία και δεύτερη την Ιταλία και συμμετέχει στην παγκόσμια παραγωγή με ποσοστό 12,5 %. Οι μεγαλύτερες εκτάσεις καλλιέργειας της ελιάς βρίσκονται στην Κρήτη, στα νησιά του Αιγαίου και Ιονίου και στην Πελοπόννησο και το εισόδημα των παραγωγών των περιοχών αυτών εξαρτάται από την ποσότητα του παραγόμενου ελαιολάδου και την τιμή πώλησης (Βασιλακάκης, 2004). Το δέντρο της ελιάς έχει πολλούς σοβαρούς εχθρούς. Επίσης, μερικά βακτήρια και μύκητες προξενούν πολύ σοβαρές ζημιές (Tzanakakis, 2006; Θανασουλόπουλος, 1996). Από τα έντομα, ο σοβαρότερος εχθρός της ελιάς ο οποίος προκαλεί και τις μεγαλύτερες ζημιές, είναι ο δάκος της ελιάς [Bactrocera (Dacus) oleae] (Rossi) (Diptera: Tephritidae). Οι προνύμφες του εντόμου τρέφονται από το μεσοκάρπιο και προκαλούν πρώιμη καρπόπτωση. Το έντομο αυτό λόγω της γρήγορης αύξησης των πληθυσμών του και τις πολλές γενεές που αναπτύσσει στη διάρκεια του έτους είναι δυνατόν να μειώσει την παραγωγή (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Άλλοι σοβαροί εχθροί για την καλλιέργεια είναι, ο πυρηνοτρήτης της ελιάς (Prays oleae) (Bernard) Lesne, Yponomeutidae, που προσβάλλει άνθη, φύλλα, βλαστούς και καρπούς, ο ρυχγχίτης (Rynchites cribripennis) (Desbrochers), Attelabidae, η μαργαρόνια (Palpita unionalis) (Hόbner), Pyralidae, ο φλoιοτρίβης (Phloeotribus scarabeoides) (Bernard), και φλοιοφάγος (Hylesinus oleiperda) F., Scolytidae και το λεκάνιο (Saissetia oleae) (Olivier), Coccidae κ.τ.λ. (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Οι σοβαρότερες ασθένειες της ελιάς είναι ο καρκίνος της ελιάς που προκαλείται από το βακτήριο Pseudomonas syringae pv. savastanoi (Janse) (Βασιλακάκης, 2004), το κυκλοκόνιο που προκαλείται από τον μύκητα Cycloconium oleaginum (Castagne) Hughes, ο οποίος προσβάλλει κυρίως τα φύλλα και προκαλεί φυλλόπτωση, το γλοιοσπόριο (Gleosporium olivarum) (Alm.) που προσβάλλει τον καρπό προκαλώντας σήψη, το καμαροσπόριο της ελιάς (Camarosporium dalmatica) (Thüm), που προσβάλλει τους καρπούς, το βερτιτσίλιο (Verticcilium dahliae) (Kleb.), που προσβάλλει φύλλα και κλαδιά, τα οποία ξεραίνονται και η φόμα της ελιάς (Phoma incompta) (Sacc. & Mart.) (Θανασουλόπουλος, 1996). 11

1.3 Ο δάκος της ελιάς 1.3.1 Κατανομή, μορφολογικά χαρακτηριστικά και σημασία του εντόμου Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera (Dacus) oleae (Rossi), ανήκει στην Οικογένεια Tephritidae της Τάξης Diptera και είναι ο πιο σημαντικός εχθρός της ελιάς (Tzanakakis, 2006). Η γεωγραφική κατανομή του B. oleae περικλείει περιοχές όπου καλλιεργούνται εντατικά ελαιόδεντρα για οικονομικούς λόγους καθώς και περιοχές όπου υπάρχουν ιθαγενή (άγρια) ελαιόδεντρα. Ο δάκος της ελιάς εντοπίζεται κυρίως στην λεκάνη της Μεσογείου, αν και υπάρχουν αναφορές για την παρουσία του και σε άλλες περιοχές όπως στη Νότια και Κεντρική Αφρική, στη Μέση Ανατολή, στη Καλιφόρνια και στη Κεντρική Αμερική. Η παρουσία του δάκου της ελιάς στην Αμερική σχετίζεται με την εισαγωγή ελαιοδέντρων σε περιοχές των ΗΠΑ (Λος Άντζελες, Καλιφόρνια) και το Μεξικό για καλλιεργητικούς σκοπούς, αλλά και με την ικανότητα του εντόμου να αποικίζει γρήγορα νέες περιοχές (Nardi et al., 2005). Ωστόσο, δεν έχει αναφερθεί ακόμη η παρουσία του στην Νότια Αμερική, Αυστραλία και Κεντρική Κίνα (Tzanakakis, 2006). Το ενήλικο έχει μήκος περίπου 5 mm και χρώμα σώματος ανοιχτοκάστανο ως σκοτεινοκάστανο. Ο θώρακας είναι σκοτεινότερος στα νώτα και έχει συνήθως 3 κατά μήκος σκοτεινές γραμμές και υπόλευκο ή υποκίτρινο scutellum όπως επίσης υπόλευκες ή υποκίτρινες κηλίδες στα πλάγια. Οι πτέρυγες στο ενήλικο θηλυκό είναι διαφανείς, ιριδίζουσες, με ένα σκοτεινό στίγμα στην άκρη. Τα θηλυκά φέρουν ευδιάκριτο ωοθέτη στην άκρη της κοιλιάς (Εικ.1). Το αυγό είναι στενόμακρο, οξύ στον ένα πόλο, λευκού χρώματος και εισάγεται με τη βοήθεια του ωοθέτη στο μεσοκάρπιο του ελαιόκαρπου. Η προνύμφη είναι υπόλευκη ή ανοιχτοκίτρινη, τελικού μήκους 7-8 mm, με το πρόσθιο μέρος του σώματος στενότερο από το οπίσθιο και χωρίς κεφαλική κάψα όπως συμβαίνει σε προνύμφες άλλων ειδών της Οικογένειας Tephritidae. Στο πρόσθιο μέρος του σώματος των προνυμφών υπάρχουν μόνο τα στοματικά άγκιστρα, τα οποία είναι σκούρου χρώματος καθώς επίσης και ο υπόλοιπος κεφαλοφαρυγγικός σκελετός. Η νύμφη έχει σχήμα ελλειψοειδές, είναι ανοιχτοκάστανη και έχει ως περίβλημα το σκληρυμένο δερμάτιο της αναπτυγμένης προνύμφης (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). 12

Ο δάκος της ελιάς θεωρείται ένα από τα πιο βλαβερά έντομα στην ελληνική γεωργία και για τον λόγο αυτό κάθε χρόνο το ελληνικό κράτος δαπανά μεγάλα χρηματικά ποσά για την καταπολέμηση του εντόμου όπως και για έρευνες που στοχεύουν στην βελτίωση των μεθόδων καταπολέμησής του (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Εικόνα 1. Ενήλικο θηλυκό του δάκου της ελιάς. 1.3.2 Βιολογία του εντόμου Ο δάκος της ελιάς θεωρείται ότι είναι μονοφάγο έντομο, καθώς η προνύμφη τρέφεται και αναπτύσσεται αποκλειστικά στο μεσοκάρπιο της καλλιεργούμενης ελιάς (Olea europaea) και της αγριελιάς (Olea europaea v.oleaster) (Tzanakakis, 2006). Αντίθετα, τα ενήλικα τρέφονται με ποικίλες υγρές ή στερεές οργανικές ουσίες όπως, νέκταρ, μελιτώματα εντόμων, εκκρίσεις φυτών, γύρη, χυμούς και ιστούς από καταστραμμένους ή αποσυντιθέμενους καρπούς. Οι ουσίες αυτές δεν βρίσκονται μόνο στα ελαιόδεντρα αλλά και σε άλλα φυτά κοντά ή μακριά από τους ελαιώνες (Tsiropoulos, 1977; Tzanakakis, 2006). Στο εργαστήριο, η προνύμφη του δάκου της ελιάς βρέθηκε να τρέφεται και να αναπτύσσεται σε ώριμους καρπούς τομάτας. Μάλιστα, τα αναπτυχθέντα σε τομάτα ενήλικα άτομα παρουσίασαν ικανοποιητική ωοπαραγωγή και γονιμότητα (Navrozidis & Tzanakakis, 2005). Η ικανότητα αυτή των προνυμφών να αναπτύσσονται ικανοποιητικά εκτός ελαιόκαρπου (π.χ σε τομάτες) έχει μεγάλη σημασία, για την διατήρηση και την εκτροφή των αποικιών του δάκου της ελιάς στο εργαστήριο καθώς και για την μαζική παραγωγή εντόμων, τα οποία 13

χρησιμοποιούνται σε προγράμματα βιολογικού ελέγχου ή εξαπόλυσης στειρωμένων εντόμων (Bateman, 1972). Ο αριθμός των γενεών του εντόμου στις χώρες της Μεσογείου κυμαίνεται από 2 έως 5 το χρόνο (Tzanakakis, 2006), ενώ στις περισσότερες περιοχές της χώρας μας αναπτύσσει 3-4 γενεές το έτος (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Συγκεκριμένα, στην Κεντρική Ελλάδα η πρώτη γενεά ξεκινάει τους μήνες Ιούνιο-Ιούλιο και οι επόμενες δύο αναπτύσσονται κατά την διάρκεια του φθινοπώρου ή ακόμη και τον Δεκέμβρη ενώ, στην Κέρκυρα υπάρχει μία επιπλέον γενεά στα τέλη Μαΐου (σύνολο 4 γενεές), στους καρπούς που παρέμειναν στα δέντρα μετά την συγκομιδή των ώριμων καρπών (Tzanakakis, 2006; Fletcher & Kapatos, 1981). Ανάλογα με την περιοχή το έντομο διαχειμάζει ως ενήλικο σε προφυλαγμένες θέσεις ή ως νύμφη (pupa) σε μικρό βάθος στο έδαφος. Σε περιοχές με ήπιο χειμώνα (παράλια νότιας Ελλάδας και ορισμένων νησιών) όταν υπάρχει στα δέντρα κατάλληλος καρπός, είναι δυνατόν να συνυπάρχουν στον ελαιώνα όλα τα στάδια του εντόμου (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Ωστόσο, ο δάκος της ελιάς από αργά την άνοιξη και μέχρι μέσα του καλοκαιριού παρουσιάζει αναπαραγωγική διάπαυση δηλαδή, τα θηλυκά άτομα δεν έχουν ώριμα ωάρια παρόλο που οι θερμοκρασίες μπορεί να είναι κατάλληλες για την αναπαραγωγή του εντόμου (Tzanakakis & Koveos, 1986). Η ωοτοκία πραγματοποιείται όταν ο καρπός έχει αποκτήσει το τελικό του μέγεθος και έχει ωριμάσει (μαλακώσει) αρκετά έτσι ώστε, το ενήλικο θηλυκό να μπορεί να διατρυπήσει τον καρπό με την βοήθεια του ωοθέτη και να αποθέσει τα αυγά του. Στα νότια παράλια της Μεσογείου (Κεντρική Ελλάδα, Νότια Ιταλία και Ισπανία) η ωοτοκία ξεκινάει συνήθως τον Ιούλιο (Tzanakakis, 2006). Το θηλυκό, αφού ανοίξει με τον ωοθέτη του την οπή ωοτοκίας, εισάγει στο μεσοκάρπιο ένα αυγό (Εικ.2). Κατά κανόνα εισάγει ένα αυγό ανά καρπό ωστόσο, σε περιπτώσεις με πολύ υψηλό πληθυσμό ή λίγων καρπών παρατηρείται η απόθεση πολλών αυγών σε κάθε καρπό (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Έχει παρατηρηθεί ότι, τα θηλυκά προτιμούν να ωοτοκούν σε ώριμους καρπούς, οι οποίοι συνήθως είναι οι μεγαλύτεροι σε μέγεθος, σε σχέση με τους μικρούς και μη ώριμους καρπούς. Έχει υπολογιστεί ότι ένα θηλυκό μπορεί να αποθέτει 13-40 αυγά ημερησίως υπό ευνοϊκές συνθήκες και καθ όλη την διάρκεια της ζωής του μερικές δεκάδες (200-250 αυγά) (Tzanakakis, 2006). 14

Εικόνα 2. Θηλυκό που ωοτοκεί σε ελαιόκαρπο. Στο τέλος της ωοτοκίας και πριν το θηλυκό απομακρύνει τον ωοθέτη του, αναρροφά χυμό που εκρέει από την οπή ωοτοκίας. Στη συνέχεια, το θηλυκό απομακρύνει τον συσταλτό του ωοθέτη, επαναφέρει στην στοματική του κοιλότητα τον χυμό που προηγουμένως είχε αναρροφήσει και τον επαλείφει στην επιφάνεια του καρπού γύρω από την οπή. Ο χυμός αυτός, λειτουργεί αποτρεπτικά στα υπόλοιπα θηλυκά να ωοτοκήσουν τον ίδιο καρπό, εκτός και αν υπάρχει μεγάλη πίεση ωοτοκίας, εξασφαλίζοντας με αυτό τον τρόπο όσο το δυνατόν καλύτερες συνθήκες ανάπτυξης για τα ανήλικα στάδια (Girolami et al., 1981; Tzanakakis, 2006). Οι Koveos and Tzanakakis (1990), διατήρησαν ενήλικα θηλυκά άτομα του δάκου της ελιάς ηλικίας 7, 22-23 και 28 ημερών σε φωτοπερίοδο Φ:Σ 16:18 και θερμοκρασία 26 ± 1 C με και χωρίς πρόσβαση σε ελαιόκαρπο. Διαπίστωσαν ότι, τα ενήλικα θηλυκά που δεν είχαν πρόσβαση σε ελαιόκαρπους παρουσίασαν μη ώριμα ωάρια ενώ αντίθετα, τα θηλυκά που είχαν πρόσβαση σε ελαιόκαρπους παρουσίασαν ανάπτυξη των ωαρίων τους κατά 54, 87 και 100% αντίστοιχα. Άρα, η παρουσία των ελαιόκαρπων συσχετίζεται θετικά με την αναπαραγωγική ωριμότητα των θηλυκών ατόμων του δάκου καθώς αποτελούν βασική πηγή αμινοξέων, βιταμινών και άλλων παραγόντων που είναι απαραίτητοι για την ωρίμαση (ανάπτυξη) των ωαρίων. Η προνύμφη ορύσσει στοά στο μεσοκάρπιο και όταν συμπληρώσει την ανάπτυξη της νυμφώνεται το μεν θέρος συνήθως μέσα στον καρπό, το δε φθινόπωρο και το χειμώνα σε μικρό βάθος στο έδαφος. Εάν θα νυμφωθεί στον καρπό ή όχι εξαρτάται από την κατάσταση ωριμότητας του καρπού. Η αναπτυγμένη προνύμφη συνήθως εγκαταλείπει τον καρπό για να νυμφωθεί στο έδαφος όταν ο καρπός έχει ωριμάσει αρκετά. Με ευνοϊκές συνθήκες ο βιολογικός κύκλος του εντόμου 15

συμπληρώνεται σχεδόν σε ένα μήνα. Ο πληθυσμός του δάκου της ελιάς είναι ιδιαίτερα υψηλός το φθινόπωρο και συγκεκριμένα όταν ο καιρός είναι υγρός και σχετικά ζεστός. Συνθήκες που δεν ευνοούν την ανάπτυξη του εντόμου είναι οι ιδιαίτερα υψηλές θερμοκρασίες του θέρους και η χαμηλή ατμοσφαιρική υγρασία (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). 1.3.3 Συμπεριφορά σύζευξης και ρόλος της φερομόνης H σύζευξη στον δάκο της ελιάς πραγματοποιείται τις απογευματινές ώρες (κυρίως το σούρουπο) και είναι παρόμοια με εκείνη που παρατηρείται και σε άλλα δίπτερα της Οικογένειας Tephritidae. Κατά την διάρκεια της σύζευξης, τα αρσενικά άτομα δονούν τις πτέρυγες τους σε μία ομάδα τριχών στην πλευρά του τρίτου κοιλιακού τεργίτη, παράγοντας ένα χαρακτηριστικό ήχο (Tzanakakis, 2006). Όπως έχει διαπιστωθεί σε αρκετά είδη του γένους Bactrocera, τα ενήλικα αρσενικά στην περιοχή της έδρας, έχουν κατάλληλους εκκριτικούς αδένες που σχετίζονται με την έκλυση φερομόνης (Fletcher, 1969). Παρόλα αυτά και σε αντίθεση με ότι συμβαίνει στα περισσότερα είδη της Οικογένειας Tephritidae, στον δάκο της ελιάς η έκλυση της φερομόνης φύλου πραγματοποιείται μόνο από τα θηλυκά άτομα. Η φερομόνη φύλου που παράγεται από τα θηλυκά άτομα είναι μίγμα τεσσάρων συστατικών, με κύριο συστατικό το (R)-(-) ισομερές της ουσίας 1,7-dioxaspiro[5.5]undecane που παρουσιάζει ισχυρή προσελκυστική δράση κυρίως στα αρσενικά (Broumas et al., 2002). Έκλυση της φερομόνης αυτής (ισομερές (S)-(+) της ίδιας ουσίας) παρατηρήθηκε και από τα αρσενικά άτομα όμως η μηδενική ελκυστική δράση ως προς τα θηλυκά άτομα, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι πιθανώς η ουσία αυτή να δρα ως σταθμευτική ή κατευναστική για τα θηλυκά (Haniotakis et al., 1989). Η φερομόνη φύλου παράγεται από αδένες του θηλυκού και αρχίζει να εμφανίζεται από την πρώτη κιόλας ημέρα της ζωής τους. Όταν τα θηλυκά είναι ηλικίας τριών έως έξι ημερών παρατηρείται μία αύξηση στην συγκέντρωση της φερομόνης και η μέγιστη συγκέντρωση καταγράφεται όταν γίνονται εννέα ημερών (Neokosmidi et al., 2008). Έχει παρατηρηθεί ότι τα παρθένα αρσενικά αρχίζουν να ανταποκρίνονται στην φερομόνη που εκλύουν τα θηλυκά όταν είναι ηλικίας 3 ημερών 16

και η μέγιστη ανταπόκρισή τους συμβαίνει μετά την έκτη ημέρα (Haniotakis et al., 1994). Έχει υπολογιστεί ότι κατά την διάρκεια του καλέσματος (calling), το θηλυκό εκλύει ~1.1 μικρογραμμάρια (μ.g) φερομόνης την ημέρα (Neokosmidi et al., 2008). Τις τελευταίες δεκαετίες γίνονται προσπάθειες παραγωγής και χρησιμοποίησης συνθετικής φερομόνης σε τεχνικές όπως η μαζική παγίδευση (φερομονικές παγίδες) και παρεμπόδιση σύζευξης, οι οποίες στοχεύουν στον βιολογικό έλεγχο του δάκου της ελιάς (Broumas et al., 2002; Neokosmidi et al., 2008). Ο Economopoulos (1972) συμπέρανε ότι, τα θηλυκά άτομα μπορούν να συζευχθούν αρκετές φορές στην διάρκεια της ζωής τους (3-4 ή και παραπάνω) και ότι διάφοροι παράγοντες μεταξύ άλλων οι συνθήκες ανάπτυξης, η προέλευση, η ηλικία, η προηγούμενη δραστηριότητα, η διατροφή και η πίεση σύζευξης επηρεάζουν το χρονικό διάστημα μεταξύ δύο συζεύξεων και κατ επέκταση την γονιμότητα του θηλυκού. Βρέθηκε ότι, το χρονικό διάστημα μεταξύ των δύο συζεύξεων ήταν μικρότερο (6-10 ημέρες) για έντομα που διατράφηκαν με ελαιόκαρπους και μεγαλύτερο (12-18 ημέρες) για έντομα που διατράφηκαν σε τεχνητή τροφή. Ωστόσο, σε συνθήκες εργαστηρίου μία μόνο σύζευξη είναι αρκετή για την γονιμοποίηση των περισσοτέρων ωαρίων. Σε αντίθεση με τα θηλυκά, τα αρσενικά είναι πολυγαμικά και μπορούν να συζεύγνυνται καθημερινώς με θηλυκά κατάλληλης ηλικίας και να μεταφέρουν σε αυτά βιώσιμο σπέρμα για αρκετές ημέρες (Tzanakakis, 2006). 1.3.4 Παράγοντες που επηρεάζουν την ωοπαραγωγή του εντόμου Τα θηλυκά άτομα χρησιμοποιούν διάφορα οπτικά και οσφρητικά ερεθίσματα για την επιλογή του κατάλληλου καρπού όπως το σχήμα, το μέγεθος, το χρώμα, την ομαλότητα της επιφάνειας, τα χημικά διεγερτικά και την ύπαρξη κηρωδών ουσιών και με βάση αυτά γίνεται η επιλογή του κατάλληλου καρπού για ωοτοκία (Tzanakakis, 2006; Haniotakis & Voyadjoglou, 1978). Στις χώρες της Μεσογείου έχει παρατηρηθεί ότι, τα θηλυκά άτομα προτιμούν για ωοτοκία τις μεγαλόκαρπες επιτραπέζιες ποικιλίες, οι οποίες έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε νερό, καθώς οι καρποί αυτοί εξασφαλίζουν καλύτερη επιβίωση και ανάπτυξη μεγαλύτερου αριθμού προνυμφών του εντόμου. Ωστόσο, οι μικρόκαρπες ελαιοποιήσιμες ποικιλίες ελιάς, με μικρότερη περιεκτικότητα σε νερό, είναι επίσης 17

κατάλληλοι ξενιστές για τον δάκο της ελιάς (Rice, 2000). Οι Neuenschwander et al. (1985), διαπίστωσαν ότι η δεκτικότητα του καρπού για προσβολή από τον δάκο της ελιάς αυξάνει όταν το βάρος του καρπού είναι πάνω από 3.5 g. Τα ενήλικα άτομα του δάκου της ελιάς μπορούν και προσελκύονται σε μικρές μαύρες σφαίρες που μοιάζουν σε σχήμα και μέγεθος με τους καρπούς-ξενιστές (Tzanakakis, 2006). Οι Katsoyannos and Kouloussis (2001) βρήκαν ότι, οι κίτρινες και οι πορτοκαλί πλαστικές σφαίρες που ήταν καλυμμένες με μία κολλητική ουσία, παγίδευσαν μεγαλύτερους αριθμούς αρσενικών ατόμων απ ότι οι πράσινες σφαίρες, ενώ οι κόκκινες και οι μαύρες σφαίρες παγίδευσαν μεγαλύτερους αριθμούς θηλυκών ατόμων απ ότι οι πράσινες και οι κίτρινες σφαίρες. Τους μικρότερους αριθμούς ατόμων και για τα δύο φύλα παγίδευσαν οι μπλε και οι άσπρες σφαίρες. 1.3.5 Παράγοντες που προκαλούν θνησιμότητα των ανήλικων σταδίων Τα στάδια του δάκου της ελιάς που εκτίθενται περισσότερο στους φυσικούς εχθρούς, είναι αυτά που μπορεί να βρίσκονται στο έδαφος όπως, προνύμφες αμέσως μόλις εγκαταλείπουν τον καρπό, νύμφες και νεοεμφανιζόμενα ενήλικα (Bateman, 1972). Στην Ευρώπη ανάμεσα στους άρπαγες εδάφους, τα μυρμήγκια αποτελούν τον σημαντικότερο παράγοντα θνησιμότητας για τις νύμφες του δάκου της ελιάς. Ωστόσο, έχουν αναφερθεί και άλλοι άρπαγες όπως αράχνες, κολεόπτερα και δερμάπτερα (Bateman, 1972; Orsini et al., 2007). Επίσης, στην Κρήτη και την Ιταλία προσδιορίστηκαν και ορισμένα πτηνά ως παράγοντες πρόκλησης θνησιμότητας των νυμφών, μέσω της κατανάλωσης των καρπών κατά την διατροφή τους (Orsini et al., 2007). Όσον αφορά το αυγό και τις προνύμφες, αυτά είναι σχετικά προστατευμένα στο εσωτερικό του καρπού-ξενιστή, αν και μερικές φορές παρασιτούνται από παθογόνους μικροοργανισμούς, ακάρεα και παράσιτα των μελισσών όπως, το γνωστό άκαρι Varroa jacobsoni (Oudemans), που προκαλεί την Βαρροϊκή ακαρίαση στις μέλισσες (Bateman, 1972; Υφαντίδης, 1995). Σημαντικό ρόλο παίζουν και οι αβιοτικοί παράγοντες όπως, οι υψηλές θερμοκρασίες του καλοκαιριού σε συνδυασμό με την χαμηλή υγρασία εδάφους που 18

αυξάνουν τον κίνδυνο για αφυδάτωση και θνησιμότητα των νυμφών. Επίσης, τους καλοκαιρινούς μήνες παρατηρείται θνησιμότητα των αυγών και των προνυμφών του εντόμου, λόγω των πολύ υψηλών θερμοκρασιών που επικρατούν. Τέλος, τα βαριά εδάφη μειώνουν την επιβίωση των νυμφών, καθώς συγκρατούν αρκετή υγρασία και προκαλούν αύξηση της θνησιμότητας των νεοεμφανιζόμενων εντόμων στην προσπάθεια τους να φτάσουν στην επιφάνεια του εδάφους λόγω της σύστασης τους (Neuenschwander et al., 1981). 1.3.6 Συμβιωτικά βακτήρια του δάκου της ελιάς Σχέσεις συμβίωσης μεταξύ μικροοργανισμών και εντόμων είναι ευρύτερα διαδομένες. Οι συμβιώτες μπορεί να είναι προκαρυωτικοί ή ευκαρυωτικοί οργανισμοί (συνήθως είναι μύκητες ή βακτήρια). Σε ορισμένες περιπτώσεις, ο ξενιστής φιλοξενεί τον συμβιώτη μέσα σε ειδικά κύτταρα που ονομάζονται μυκητοκύτταρα (ενδοκυτταρικοί μικροοργανισμοί), όπως για παράδειγμα συμβαίνει μεταξύ αφίδων και μελών του γένους Buchnera (proteobacteria). Σε άλλες περιπτώσεις, οι συμβιωτικοί μικροοργανισμοί είναι εξωκυτταρικοί και βρίσκονται συνήθως στον πεπτικό σωλήνα (π.χ τερμίτες που φιλοξενούν πρωτόζωα στον πεπτικό τους σωλήνα, για την διάσπαση της κυτταρίνης) (Capuzzo et al., 2005; Τζανακάκης, 1995). Οι συμβιώτες έχουν ένζυμα για την πέψη ορισμένων συστατικών της τροφής του εντόμου, που το έντομο δεν έχει, ή δίνουν στο έντομο ορισμένες βιταμίνες, αμινοξέα ή άλλες θρεπτικές ουσίες που το έντομο δεν μπορεί να συνθέσει, ούτε να πάρει από την τροφή του. Τις ουσίες αυτές, που του παρέχουν οι συμβιωτικοί μικροοργανισμοί, το έντομο τις παίρνει είτε από τον περιβάλλοντα τους συμβιώτες χώρο, είτε πέπτοντας τα κύτταρα των συμβιωτών (Τζανακάκης, 1995). Σύμφωνα με τον Τζανακάκη (1995), η προνύμφη του δάκου της ελιάς έχει την ανάγκη παρουσίας εξωκυτταρικών συμβιωτικών βακτηρίων στον πεπτικό της σωλήνα για να μπορέσει να διασπάσει τις πρωτεΐνες του μεσοκαρπίου της ελιάς σε αμινοξέα. Το ενήλικο έντομο φιλοξενεί το συμβιωτικό βακτήριο, Pseudomonas syringae pv. savastanoi (Smith), σε ειδικό θύλακα που εκβάλλει στον οισοφάγο και σε πτυχές των εσωτερικών τοιχωμάτων του ωοθέτη. Από εκεί, το βακτήριο πηγαίνει στην επιφάνεια του αυγού κατά την διάρκεια της ωοτοκίας και στη συνέχεια εισέρχεται στο 19

εσωτερικό του αυγού μέσω της μικροπύλης. Μετά την εκκόλαψη των αυγών, τα βακτήρια αναπτύσσονται στο πεπτικό σωλήνα της νεαρής προνύμφης και από εκεί μεταφέρονται στο ενήλικο όπου ενσωματώνονται στον οισοφαγικό θύλακα (Capuzzo et al., 2005; Τζανακάκης, 1995). Παρόλο ότι, έχουν απομονωθεί 16 είδη βακτηρίων από τον οισοφαγικό θύλακα του δάκου της ελιάς, εκ των οποίων τέσσερα ανήκουν στο γένος Pseudomonas κανένα δεν ανήκει στο είδος savastanoi. Η παρουσία του είδους Pseudomonas savastanoi δεν αποκλείεται, αλλά ίσως το βακτήριο να αλλάζει μορφή (όταν αλλάζει ο ξενιστής) ή να χάνεται κατά την διάρκεια των απομονώσεων εξαιτίας των ασυνήθιστων θρεπτικών του απαιτήσεων (Capuzzo et al., 2005; Tzanakakis, 2006). 1.3.7 Καταπολέμηση του δάκου της ελιάς Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae (Rossi) είναι ο πιο σημαντικός εχθρός της ελιάς και έχει τεράστια οικονομική σημασία στις χώρες της Μεσογείου. Σε περιπτώσεις μη ελέγχου του εντόμου, η προσβολή μπορεί να προκαλέσει απώλεια της παραγωγής κατά 80% και 100%, στις ελαιοποιήσιμες και επιτραπέζιες ποικιλίες αντίστοιχα (Broumas et al., 2002), πρώιμη καρπόπτωση (Tzanakakis, 2006) και εγκατάσταση του μύκητα Camarosporium dalmatica (Thüm) (Spaeropsis ή Macrophoma dalmatica), που προκαλεί την ξεροβούλα στις άγουρες και την σαποβούλα στις ώριμες ελιές (Θανασουλόπουλος, 1996). Για τον επιτυχή έλεγχο του εντόμου εφαρμόζεται η χημική καταπολέμηση, η οποία πραγματοποιείται με δύο μεθόδους: την «προληπτική» και την «θεραπευτική» ή «κατασταλτική». Η πρώτη μέθοδος πραγματοποιείται με την εκτέλεση δολωματικών ψεκασμών (μόνο σε ένα τμήμα της κόμης του δέντρου) και στοχεύει στην προσέλκυση και την θανάτωση των ενηλίκων, πριν ωοτοκήσουν στον ελαιόκαρπο. Αντίθετα, στη δεύτερη μέθοδο γίνεται πλήρης κάλυψη της κόμης των δέντρων με σκοπό να σκοτωθούν όχι μόνο τα ενήλικα αλλά και οι προνύμφες μέσα στον καρπό (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Η χημική καταπολέμηση βασίζεται κυρίως στην χρήση των οργανοφοσφωρικών εντομοκτόνων (π.χ dimethoate). Επίσης, χρησιμοποιούνται τα πυρεθροειδή (π.χ karate, με δραστική ουσία lambda cyhalothrin) καθώς και η δραστική ουσία spinosad (π.χ success) που 20

έχει απομονωθεί από τον ακτινομύκητα Saccharopolyspora spinosa (Skouras et al., 2007). Ωστόσο, η αλόγιστη χρήση των εντομοκτόνων μπορεί να έχει δυσμενείς επιπτώσεις όπως είναι η μόλυνση του περιβάλλοντος [π.χ. υπόγεια και επιφανειακά νερά μέσω της έκπλυσης και της επιφανειακής απορροής των φυτοπροστατευτικών ουσιών (φ.ο) καθώς και ο ατμοσφαιρικός αέρας μέσω της εξάτμισης των φ.ο], η θανάτωση ωφέλιμων εντομοφάγων εντόμων, οι εξάρσεις πληθυσμών δευτερευόντων εχθρών, τα υπολείμματα των χρησιμοποιούμενων ουσιών στα προϊόντα και τέλος η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα (Alberola et al., 1999). Οι λόγοι αυτοί δημιούργησαν την ανάγκη ανάπτυξης εναλλακτικών μεθόδων καταπολέμησης. Προσπάθειες βιολογικής καταπολέμησης του δάκου της ελιάς πραγματοποιήθηκαν με την εισαγωγή του παρασιτοειδούς Opius concolor (Szepligetti) (Hymenoptera: Braconidae) σε περιοχές όπου αυτό δεν υπήρχε ή με μαζικές εξαπολύσεις, χωρίς ικανοποιητικά αποτελέσματα (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Επίσης, το παρασιτοειδές Psyttalia lounsburyi (Silvestri) (Hymenoptera: Braconidae), χρησιμοποιήθηκε στην Καλιφόρνια σε προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης του δάκου της ελιάς. Αν και τα θηλυκά άτομα του P. lounsburyi αναζητούν ελαιόκαρπους οι οποίοι είναι προσβεβλημένοι με προνύμφες 3 ου σταδίου του δάκου της ελιάς ωστόσο, οι μεγαλύτεροι αριθμοί απογόνων του P. lounsburyi αναπτύσσονται σε προσβεβλημένους ελαιόκαρπους με νεαρές προνύμφες του εντόμου (1 ου και 2 ου σταδίου). Αυτό συμβαίνει γιατί τα θηλυκά άτομα του P. lounsburyi έχουν κοντό ωοθέτη, ο οποίος δεν μπορεί να φτάσει και να αποθέσει αυγά στις προνύμφες 3 ου σταδίου του δάκου της ελιάς, καθώς αυτές τρέφονται βαθύτερα μέσα στον ελαιόκαρπο των καλλιεργούμενων ποικιλιών. Επίσης, ο μέσος όρος των απογόνων του P.lounsburyi στην διάρκεια της ζωής του είναι πολύ μικρός (κυρίως στις καλλιεργούμενες μεγαλόκαρπες ποικιλίες) και το κόστος παραγωγής του είναι αρκετά υψηλό. Η χρησιμοποίηση του παρασιτοειδούς αυτού στην Ευρώπη σε προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης είναι περιορισμένη (Daane et al., 2008). Μεταξύ των βιοτεχνολογικών μεθόδων για την καταπολέμηση του δάκου της ελιάς είναι η μαζική παγίδευση των ενηλίκων, με χρησιμοποίηση διαφόρων τύπων παγίδων όπως τροφικές (τύπου Mc Phail, με ελκυστικό διάλυμα υδρολυμένη πρωτεΐνη ή υδατικό διάλυμα φωσφορικής ή θεϊκής αμμωνίας), χρωματικές (κίτρινες κολλητικές), φερομονικές ή συνδυασμός τους (Τζανακάκης, 1995). Η χρησιμοποίηση κατάλληλων παγίδων μπορεί να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική όταν ο πληθυσμός 21

του δάκου της ελιάς βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα. Όμως, όταν ο πληθυσμός του εντόμου είναι υψηλός, τότε είναι αναγκαίοι οι δολωματικοί ψεκασμοί για την αποτελεσματική προστασία της καλλιέργειας (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Εφαρμογή ενός συνδυασμού διαφορετικών μεθόδων μπορεί να έχουν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η μέθοδος της εξαπόλυσης στειρωμένων εντόμων με ακτίνες γ δοκιμάστηκε στην Χαλκιδική, όπου υπήρχε συνδυασμός δολωματικών ψεκασμών με εβδομαδιαίες εξαπολύσεις στειρωμένων ατόμων. Αν και ο πληθυσμός του εντόμου διατηρήθηκε σε χαμηλά επίπεδα, οι τεχνικές απαιτήσεις (έλλειψη μεθόδου για αποτελεσματική και οικονομική μαζική παραγωγή) και άλλοι λόγοι δεν ευνόησαν την εφαρμογή των μεθόδων αυτών σε άλλες ευρύτερες περιοχές (Τζανακάκης, 1995). Στην μικροβιακή καταπολέμηση χρησιμοποιούνται παθογόνοι μικροοργανισμοί. Το βακτήριο Bacillus thuringiensis (Ishiwata), είναι ένα θετικό Gram βακτήριο που σχηματίζει ένα παρασποριακό κρυσταλλικό έγκλειστο σωμάτιο. Με την κατάποση του βακτηρίου από το δάκο της ελιάς ελευθερώνονται οι δ-ενδοτοξίνες και η διάσπαση τους δίνει τοξίνες επιβλαβείς για τα ενήλικα και τις προνύμφες (Τζανακάκης, 1995; Alberola et al., 1999). Ο Hagen (1966) βρήκε ότι, η προσθήκη της αντιβιοτικής ουσίας στρεπτομυκίνης στην τροφή των ενήλικων ατόμων, προκάλεσε τον θάνατο του συμβιωτικού βακτηρίου μέσα στο σώμα του θηλυκού και αυτό είχε σαν αποτέλεσμα τον έμμεσο θάνατο των προνυμφών, λόγω αδυναμίας πέψης των πρωτεϊνών του μεσοκαρπίου. Τέλος, σε προγράμματα ολοκληρωμένης καταπολέμησης του δάκου της ελιάς μπορούμε να εφαρμόσουμε και καλλιεργητικές τεχνικές όπως για παράδειγμα, συντόμευση του χρονικού διαστήματος που πραγματοποιείται η συγκομιδή καθώς και βελτίωση των συνθηκών αποθήκευσης των συγκομιζόμενων ελαιόκαρπων πρίν υποστούν οποιαδήποτε επεξεργασία (Tzanakakis, 2006). 22

1.4 Σκοπός της διατριβής Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή μελετήθηκε η επίδραση των υψηλών θερμοκρασιών, τόσο στην επιβίωση των διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης του εντόμου (αυγό, προνύμφη, νύμφη) και του ενηλίκου καθώς και στην ωοπαραγωγή των θηλυκών ατόμων. Παράλληλα, μελετήθηκαν η επιβίωση του εντόμου στις υψηλές θερμοκρασίες, χωρίς αλλά και με προηγούμενο εγκλιματισμό σε υψηλές θερμοκρασίες καθώς και η επιβίωση του εντόμου μετά από μακροχρόνια έκθεση για διαφορετικούς χρόνους σε υψηλή θερμοκρασία. Τα αποτελέσματα της ερευνάς μας σε συνδυασμό με τη γνώση των επιδράσεων άλλων αβιοτικών παραγόντων, όπως της σχετικής υγρασίας και της φωτοπεριόδου, μπορεί να συμβάλλουν στην κατανόηση πληθυσμιακών μεταβολών του εντόμου, που συχνά συμβαίνουν στη διάρκεια των θερινών μηνών. 23

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΟΥ ΔΑΚΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ ΣΕ ΥΨΗΛΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ 2.1 Εισαγωγή 2.1.1 Ο ρόλος της θερμοκρασίας στην βιολογία των οργανισμών Η θερμοκρασία είναι ο πιο σημαντικός περιβαλλοντικός παράγοντας που καθορίζει την παρουσία αλλά και την αφθονία των εντόμων, καθώς και των άλλων ποικιλόθερμων ζώων, λόγω των άμεσων ή έμμεσων επιδράσεών της στην ταχύτητα ανάπτυξης (διάρκεια ανάπτυξης), στη θνησιμότητα και την ωοπαραγωγή. Η θερμοκρασία επιδρά στην ταχύτητα ανάπτυξης των ανήλικων σταδίων, στην ωριμότητα των ενηλίκων και στον χρόνο εμφάνισης τους, καθώς και στον συγχρονισμό του βιολογικού κύκλου και των διαφόρων φάσεων της ζωής του εντόμου (ανάπτυξη, αναπαραγωγή, διάπαυση) με τις εποχικές αλλαγές του περιβάλλοντος (Bateman, 1972). Η αύξηση της θερμοκρασίας μέχρι ένα ορισμένο επίπεδο επιταχύνει την ταχύτητα ανάπτυξης ενός οργανισμού και κατ επέκταση μειώνεται η διάρκεια ανάπτυξης ενώ, επάνω από το επίπεδο αυτό την επιβραδύνει (π.χ. η διάρκεια ανάπτυξης των ειδών της οικογένειας Tetranychidae μειώνεται στο εύρος των θερμοκρασιών από 10-30 C και αυξάνεται μεταξύ 33 C και 38 C) (Κωβαίος, 2001). Οι γνώσεις που υπάρχουν για την σχέση μεταξύ της θερμοκρασίας και της ανάπτυξης των εντόμων, χρησιμεύουν στη δημιουργία μοντέλων πρόγνωσης του χρόνου ανάπτυξης και της γεωγραφικής κατανομής των εντόμων σε μία περιοχή. Στα περισσότερα μέρη του κόσμου, οι "μύγες των φρούτων" απαντώνται σε πυκνούς πληθυσμούς το καλοκαίρι, ενώ αντίστοιχα το χειμώνα οι πληθυσμοί τους περιορίζονται. Στα είδη εντόμων που εντοπίζονται σε εύκρατα κλίματα (δηλαδή, βροχερά κλίματα με ήπιους χειμώνες), η απόθεση των αυγών διαρκεί λίγες εβδομάδες το καλοκαίρι, ενώ αντίθετα στα είδη που ζουν σε τροπικά κλίματα (όλες οι εποχές είναι θερμές) η απόθεση των αυγών εκτείνεται από νωρίς την άνοιξη μέχρι αργά το καλοκαίρι, οποτεδήποτε υπάρχουν κατάλληλοι ξενιστές (Bateman, 1972). Γενικά, για τα είδη της οικογένειας Tephritidae, η ανάπτυξη των ανήλικων σταδίων συμβαίνει στο εύρος των θερμοκρασιών 10 C-30 C. Ωστόσο, η επιβίωση 24

τους είναι εφικτή σε ένα μεγαλύτερο εύρος θερμοκρασιών. Φαίνεται ότι, το ανώτερο όριο επιβίωσης ορισμένων ειδών της οικογένειας Tephritidae, ανεξαρτήτως του σταδίου ανάπτυξης είναι οι 45 C ενώ, το κατώτερο όριο μπορεί να διαφέρει μεταξύ των ειδών, με τις νύμφες ορισμένων ειδών που προέρχονται από εύκρατες περιοχές, να επιβιώνουν στον αγρό σε θερμοκρασίες μέχρι και -12 C. Επίσης, η αναπαραγωγική ικανότητα των εντόμων αυτών επηρεάζεται από την θερμοκρασία, με την μέγιστη παραγωγή γαμετών να παρατηρείται μεταξύ των 25 C και 30 C και την ωοτοκία, την απόθεση των αυγών, να πραγματοποιείται μεταξύ 9 C και 16 C. Ωστόσο, η απόθεση των αυγών στον αγρό συχνά αναστέλλεται κατά την διάρκεια των πιο ζεστών ωρών της ημέρας (Bateman, 1972). Όσον αφορά την επιβίωση του δάκου της ελιάς σε χαμηλές θερμοκρασίες διαπιστώθηκε ότι, σχεδόν όλα τα αρσενικά και θηλυκά άτομα που διατηρούνταν ως ενήλικα σε θερμοκρασία 24 C, επιβίωναν μετά από δίωρη έκθεση σε θερμοκρασίες από 0 έως -4 C ενώ, δεν επιβίωναν μετά από δίωρη έκθεση σε θερμοκρασίες χαμηλότερη ή ίση των -7 C (Koveos, 2001). 2.1.2 Αποφυγή των υψηλών θερμοκρασιών Τα έντομα, προκειμένου να επιβιώσουν σε ιδιαίτερα υψηλές θερμοκρασίες ενεργοποιούν μηχανισμούς, τόσο φυσιολογίας όσο και συμπεριφοράς, με τους οποίους αποφεύγουν ή ελαχιστοποιούν τη ζημιά που μπορεί να προκληθεί σε αυτά. Για παράδειγμα, ορισμένα είδη της Οικογένειας Tephritidae μπορούν να αποφεύγουν τις υψηλές θερμοκρασίες κατά την διάρκεια του καλοκαιριού, με μετακίνηση τους από ηλιόλουστα σημεία σε πιο δροσερά και σκιερά μέρη, με αποτέλεσμα η θερμοκρασία του περιβάλλοντος να ελαττώνεται μέσα σε λίγα λεπτά κατά ορισμένους βαθμούς (Denlinger & Yocum, 1998). Ο Fletcher (1987) παρατήρησε ότι, το καλοκαίρι όταν η θερμοκρασία κατά την διάρκεια της ημέρας ανέβαινε πάνω από τους 35 C, τα ενήλικα άτομα του δάκου της ελιάς εγκατέλειπαν τα ελαιόδεντρα και συγκεντρώνονταν στο χαμηλό θαμνώδες υπόστρωμα. 25

2.1.3 Μηχανισμοί αντοχής των εντόμων σε υψηλές θερμοκρασίες Υπάρχουν αρκετοί αβιοτικοί παράγοντες που προκαλούν καταπόνηση (stress) στους οργανισμούς. Μεταξύ αυτών α) η υψηλή θερμοκρασία (θερμική καταπόνηση), β) η υποξία (έλλειψη οξυγόνου από τον αέρα που εισπνέεται), γ) η ανοξία (έλλειψη οξυγόνου στους ιστούς του οργανισμού, δ) διάφορες χημικές ουσίες όπως ethanol, dinitrophenol, cyanide και τέλος παράγοντες που εμποδίζουν την μεταφορά ηλεκτρονίων καθώς και την οξειδωτική φωσφορυλίωση (Jang, 1992). Η χαρακτηριστικότερη φυσιολογική αντίδραση των εντόμων μετά από έκθεσή τους σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες (θερμική καταπόνηση) καθώς και σε μία ποικιλία άλλων συνθηκών καταπόνησης είναι, η σύνθεση ειδικών πρωτεϊνών που είναι γνωστές ως πρωτεΐνες θερμικής καταπόνησης (heat shock proteins, HSPs), ενώ η σύνθεση άλλων πρωτεϊνών αναστέλλεται (Zambetaki et al., 2000; Κωσταντινίδου, 2003). Το φαινόμενο αυτό, γνωστό ως απόκριση σε θερμοπληξία (heat shock response, HSR), απαντάται σε όλους τους οργανισμούς προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς (βακτήρια, ζυμομύκητες, φύκη, φυτά, ψάρια, έντομα και θηλαστικά) (Jang, 1992). Η σύνθεση των πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης (hsps) από τα κύτταρα των εντόμων α) είναι σύντομη και αναστέλλεται μετά το πέρας των αντίξοων συνθηκών, β) συμβάλλει στην διατήρηση της ζωτικότητας και επιβίωσης των κυττάρων, γ) παρεμποδίζει την μετουσίωση των πρωτεϊνών και δ) συμβάλλει στην ανάπτυξη προσωρινής θερμοαντοχής των εντόμων σε υψηλές θερμοκρασίες (Yocum & Denlinger, 1992; Jang, 1992). Επίσης, η σύνθεση των πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης (hsps) μπορεί να διαφοροποιείται ακόμη και μέσα στον ίδιο οργανισμό. Δηλαδή, να συντίθενται διαφορετικές πρωτεΐνες θερμικής καταπόνησης (hsps) στους διαφορετικούς ιστούς και στα διαφορετικά στάδια ανάπτυξης. Για παράδειγμα, στο είδος Sarcophaga crassipalpis (Macquart) (Diptera: Sarcophagidae), κατά την διάρκεια της προνυμφικής ανάπτυξης του εντόμου παράγεται μία πρωτεΐνη (65kDa) στον εγκέφαλο ενώ, κατά την διάρκεια της νύμφωσης παράγεται μία άλλη πρωτεΐνη (72 kda) από τους ίδιους όμως αδένες του εντόμου (Denlinger & Yocum, 1998). Επίσης, η επιβίωση των διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης ενός είδους σε ακραίες-υψηλές θερμοκρασίες εξαρτάται, από την διάρκεια έκθεσης στην συγκεκριμένη υψηλή θερμοκρασία, από τη θερμοκρασία έκθεσης αλλά και από το στάδιο ανάπτυξης του συγκεκριμένου είδους (Jang, 1986). Οι Stephanou et al. (1983) 26

βρήκαν ότι, οι σιελογόνοι αδένες των προνυμφών 3 ου σταδίου της Μύγας της Μεσογείου, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae), παράγουν πρωτεΐνες hsps ως αντίδραση στη θερμική καταπόνηση. Οι πρωτεΐνες αυτές σχετίζονται, με την προστασία των προνυμφών από τις υψηλές θερμοκρασίες και κατ επέκταση από πιθανές βλάβες που πρόκειται να υποστούν ή με την ανάπτυξη θερμοαντοχής των προνυμφών. Η σημαντικότερη πρωτεΐνη hsp που βρέθηκε στην Μύγα της Μεσογείου είναι η 69 kda πρωτεΐνη (με μοριακό βάρος 69,000). Επίσης, βρέθηκαν και άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες ταξινομούνται με βάση τα μοριακά τους βάρη ως εξής: 87, 34, 20, 16, 14, 13 και 12 kda πρωτεΐνες. Πρωτεΐνες θερμικής καταπόνησης με παρόμοια Μ.Β (μοριακά βάρη) έχουν βρεθεί και σε άλλα είδη εντόμων, και ειδικά πρωτεΐνες hsps 69 και 70 kda βρέθηκαν στα γένη Drosophila και Sarcophaga (Jang, 1992). Αντίστοιχα και στο δάκο της ελιάς, Bactrocera oleae (Rossi) (Diptera: Tephritidae), η θερμική καταπόνηση επάγει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων (hsp70, hsp83 και hsp68), η οποία ρυθμίζεται από έναν θερμοπληξιακό παράγοντα (heat shock factor, HSF) και στη συνέχεια πραγματοποιείται η σύνθεση των πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης (hsps), οι οποίες ενισχύουν την αντοχή του δάκου της ελιάς σε υψηλές θερμοκρασίες (Zambetaki et al., 2000). 2.1.4 Βλάβες που προκαλούνται στα έντομα εξαιτίας των υψηλών θερμοκρασιών Η έκθεση των εντόμων σε πολύ υψηλές (ακραίες) θερμοκρασίες προκαλεί τον άμεσο και γρήγορο θάνατο των εντόμων, ενώ η έκθεση τους σε υψηλές αλλά μη θανατηφόρες θερμοκρασίες (συνθήκες καταπόνησης) μπορεί α) να ζημιώσει τα έντομα με ποικίλους τρόπους όπως με είσοδο των εντόμων σε κατάσταση 1 quiescence, αναστολή της έκδυσης ή της μεταμόρφωσης και β) σε ορισμένες 1 Quiescence= προκαλείται από την άμεση επίδραση δυσμενών περιβαλλοντικών παραγόντων, που οι τιμές τους δεν επιτρέπουν ανάπτυξη, αναπαραγωγή ή δραστηριότητα των εντόμων, και διαρκεί όσο οι παράγοντες αυτοί διατηρούνται δυσμενείς. 27

περιπτώσεις επέρχεται ο θάνατος, αλλά πολύ αργότερα (Yocum et al., 1994; Teixeira & Polavarapu, 2005). Για παράδειγμα, η έκθεση νυμφών σε υψηλές (supraoptimal) θερμοκρασίες προκαλεί α) παραμόρφωση των πτερύγων στα είδη Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae), Ephestia cautella και Plodia interpunctellu (Lepidoptera: Pyralidae) και β) μείωση της ωοπαραγωγής ή πρόκληση στειρότητας στα είδη Trogoderma granarium (Coleoptera: Dermestidae) και Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae). Επίσης, η θερμική καταπόνηση στο στάδιο της νύμφης ή των νεοεμφανιζόμενων ενηλίκων (pharate adults) στο είδος Sarcophaga crassipalpis (Diptera: Sarcophagidae), μετατοπίζει τους ημερήσιους κύκλους (κιρκαδικός χρόνος) εμφάνισης των ενηλίκων, από το ξεκίνημα (δηλαδή το ξημέρωμα) στη μέση της φωτόφασης με αποτέλεσμα την αποτυχία εμφάνισης των ενήλικων εντόμων (έξοδος από το νυμφικό περίβλημα) την κατάλληλη χρονική στιγμή (Yocum et al., 1994). Η θερμική καταπόνηση στο στάδιο της νύμφης, λίγο πριν την περάτωση της διάπαυσης, για το είδος Rhagoletis mendax (Curran) (Diptera: Tephritidae), έχει ως αποτέλεσμα ένα ποσοστό 15% του πληθυσμού να παραμένει σε παρατεταμένη διάπαυση και να καθυστερεί η εμφάνιση των ενήλικων ατόμων. Αυτό οφείλεται στο ότι, η θερμική καταπόνηση παρεμποδίζει ένα μέρος της ενδοκρινούς διαδικασίας (τα νευροεκκριτικά κύτταρα του υπεροισοφαγικού γαγγλίου του εντόμου, παράγουν την εγκεφαλική ορμόνη, η οποία τελικά μετατρέπεται στην β εκδυσόνη), η οποία τελικά οδηγεί στην έκκριση της εκδυσόνης και η οποία αποτελεί την κύρια ορμόνη έκδυσης. Ωστόσο παρατηρήθηκε ότι, με εξωγενή εφαρμογή 20-υδροξυεκδυσόνης στα άτομα του R. mendax που είχαν παραμείνει σε παρατεταμένη διάπαυση, το 45% των ατόμων κατάφερε να περατώσει την διάπαυσή του και να εμφανιστούν τα ενήλικα άτομα. Κάτι παρόμοιο έχει διαπιστωθεί και στο είδος Drosophila virilis (Sturtevant) (Diptera: Drosophlilidae), όπου η έκθεση των προνυμφών του σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες εμποδίζει την έκκριση της εγκεφαλικής ορμόνης (προθωρακικοτρόπος ορμόνη), που όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως αποτελεί την βασική ορμόνη έκδυσης με αποτέλεσμα, να καθυστερεί η μεταμόρφωση του εντόμου (Teixeira & Polavarapu, 2005). Ωστόσο, και σε κυτταρικό επίπεδο συμβαίνουν αρκετές αλλαγές ως αντίδραση των εντόμων στην θερμική καταπόνηση. Το μικροπεριβάλλον του κυττάρου (ph και συγκέντρωση ιόντων), τα βιολογικά μόρια (πρωτεΐνες, DNA, RNA, λιπίδια και υδρογονάνθρακες) και η δομή των κυττάρων είναι πολύ ευάλωτα σε θανατηφόρες 28

(υψηλές) θερμοκρασίες. Έχει διαπιστωθεί ότι, τα μακρομόρια (π.χ. πρωτεΐνες, DNA, RNA) είναι περισσότερο ανθεκτικά στην θερμική καταπόνηση απ ότι τα κύτταρα, στη συνέχεια τα κύτταρα είναι περισσότερο ανθεκτικά από τους ιστούς και τέλος οι ιστοί είναι περισσότερο ανθεκτικοί από ολόκληρο τον οργανισμό (Denlinger & Yocum, 1998). 2.1.5 Υψηλές θερμοκρασίες και αναπαραγωγική ωριμότητα του δάκου της ελιάς Στο ύπαιθρο, από αργά την άνοιξη και μέχρι τα μέσα του καλοκαιριού τα ενήλικα θηλυκά άτομα του δάκου της ελιάς βρίσκονται χωρίς ώριμα ωάρια. Αυτό έχει παρατηρηθεί σε πολλές περιοχές της Ελλάδος και της Ιταλίας, αν και οι θερμοκρασίες μπορεί να είναι ευνοϊκές για την αναπαραγωγή του εντόμου και συμβαίνει ανεξάρτητα των ιδιομορφιών που υπάρχουν όπως το γεωγραφικό πλάτος της περιοχής, το υψόμετρο, η σχετική υγρασία, η ποικιλία της καλλιεργούμενης ελιάς στην οποία αναπτύχθηκαν τα έντομα, η ηλικία του δέντρου, η άρδευση και οι υπόλοιπες καλλιεργητικές τεχνικές που εφαρμόζονται (Koveos & Tzanakakis, 1990). Οι Fletcher et al. (1978) κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι, κατά την διάρκεια των καλοκαιρινών μηνών, η υψηλή θερμοκρασία και η χαμηλή σχετική υγρασία σε συνδυασμό με την έλλειψη ελαιόκαρπου, εμποδίζουν την ωρίμαση (ανάπτυξη) των ωαρίων στα θηλυκά άτομα του δάκου της ελιάς. Διαπιστώθηκε στενή και θετική συσχέτιση, μεταξύ της ωριμότητας του ελαιόκαρπου και της ωρίμασης των ωαρίων του δάκου καθώς, οι ώριμοι ελαιόκαρποι αποτελούν βασική πηγή αμινοξέων, βιταμινών και άλλων σημαντικών τροφικών συστατικών που ευνοούν την ωρίμαση των ωαρίων (Fletcher & Kapatos, 1983). Η μη ανάπτυξη των ωαρίων που παρατηρείται στον δάκο της ελιάς στο ύπαιθρο από αργά την άνοιξη μέχρι μέσα του καλοκαιριού, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το έντομο μπορεί να παρουσιάζει αναπαραγωγική διάπαυση το διάστημα αυτό. Σημαντική είναι και η επίδραση της αλλαγής της φωτοπεριόδου στην εμφάνιση της αναπαραγωγικής διάπαυσης του εντόμου. Οι Tzanakakis & Koveos (1986) διαπίστωσαν ότι, η ανάπτυξη (ωρίμαση) των ωαρίων των θηλυκών ατόμων του δάκου της ελιάς δεν συνέβαινε σε ένα μεγάλο ποσοστό, όταν τα ανήλικα στάδια του εντόμου αναπτύχθηκαν σε μικρή διάρκεια φωτόφασης (Φ:Σ 12:12) και σχετικά χαμηλή 29

θερμοκρασία (19 ± 1 C) και στη συνέχεια τα ενήλικα άτομα διατηρήθηκαν σε υψηλότερη θερμοκρασία (25 ± 1 C) και μακράς διάρκεια φωτόφασης (Φ:Σ 16:8). Αντίθετα, όταν τα ανήλικα στάδια του εντόμου αναπτύχθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες όπως και τα ενήλικα (υψηλή θερμοκρασία\μακράς διάρκεια φωτόφασης) ή τα ενήλικα άτομα διατηρήθηκαν σε μικρής διάρκειας φωτόφασης (Φ:Σ 12:12) και χαμηλή θερμοκρασία (19 ± 1 C), η ανάπτυξη των ωαρίων δεν παρεμποδίστηκε. 2.1.6 Υψηλές θερμοκρασίες και τεχνικές εξάλειψης εντόμων από τους καρπούς Πολλά είδη Δίπτερων εντόμων της Οικογένειας Tephritidae προσβάλλουν καρπούς φυτών όπως μπανάνας, παπάγιας, εσπεριδοειδών και αποτελούν σοβαρούς εχθρούς. Οι περισσότερες χώρες ζητούν πιστοποίηση για την απουσία εντόμωνστόχων στα προϊόντα που πρόκειται να εισάγουν, αποτρέποντας έτσι την εξάπλωση βλαβερών εντόμων σε περιοχές όπου αυτά δεν υπάρχουν (Gazit et al., 2004). Στις τεχνικές καταπολέμησης των εντόμων από τους καρπούς που προσβάλλουν, είναι η εμβάπτιση των καρπών σε θερμό νερό καθώς και η έκθεση τους σε θερμό ατμό. Είναι σημαντικό να γνωρίζουμε τη σχέση που υπάρχει μεταξύ της διάρκειας έκθεσης των καρπών, της θερμοκρασίας που πρόκειται να εφαρμοστεί καθώς και της διαφοροποίησης που υπάρχει ως προς την θνησιμότητα των διαφορετικών σταδίων ενός βλαβερού εντόμου ώστε, να μπορέσουμε να προβλέψουμε τον χρόνο (μέσος θανατηφόρος χρόνος, LT 50 ή LT 90 ) που απαιτείται να εκτεθούν οι καρποί στις υψηλές θερμοκρασίες, έτσι ώστε να επιτευχθούν υψηλά επίπεδα θνησιμότητας του βλαβερού εντόμου (Heard et al., 1991). Η σχέση που υπάρχει μεταξύ της έκθεσης σε υψηλές θερμοκρασίες και της θνησιμότητας έχει μελετηθεί σε αρκετά δίπτερα, όπως μεταξύ άλλων στα Anastrepha suspensa (Loew) (Hansen & Sharp, 1998), Ceratitis capitata (Wiedemann), Bactrocera cucurbitae (Coquillett) και Bactrocera dorsalis (Hendel) (Jang, 1991). Επίσης, η σχέση μεταξύ της έκθεσης σε υψηλές θερμοκρασίες και της θνησιμότητας έχει προσδιοριστεί και για το είδος Bactrocera tryoni (Froggatt) (Diptrera: Tephritidae), με εμβάπτιση διαφορετικών σταδίων του εντόμου (διαφορετικά στάδια εμβρυϊκής ανάπτυξης, προνύμφες 1 ου, 2 ου και 3 ου σταδίου) σε θερμόλουτρο με θερμοκρασίες από 44 C έως 48 C. Στη συνέχεια έγινε καταμέτρηση της 30

θνησιμότητας και βρέθηκε ότι, σε θερμοκρασίες μικρότερες των 46 C το πιο ανθεκτικό στάδιο ήταν τα αναπτυγμένα έμβρυα ενώ, σε θερμοκρασίες υψηλότερες των 46 C το πιο ανθεκτικό στάδιο ήταν οι προνύμφες τρίτου σταδίου. Το πιο ευαίσθητο στάδιο ήταν τα νεαρά έμβρυα (ανάπτυξη μόνο 5%), ενώ οι προνύμφες πρώτου και δευτέρου σταδίου παρουσίασαν ενδιάμεση αντοχή μεταξύ του πιο ανθεκτικού και του πιο ευαίσθητου σταδίου. Η σχετική αντοχή των διαφορετικών σταδίων του B. tryoni ίσως να διαφοροποιείται με την θέση στην οποία βρίσκονται μέσα στον καρπό. Για παράδειγμα, οι προνύμφες τρίτου σταδίου βρίσκονται βαθύτερα στο εσωτερικό του καρπού και άρα θανατώνονται πιο δύσκολα απ ότι τα αυγά, τα οποία αποτίθενται σε μικρό βάθος 5mm από την επιφάνεια του καρπού και άρα ο θάνατός τους επέρχεται γρηγορότερα (Heard et al., 1991). Στο κεφάλαιο αυτό της διατριβής, μελετήθηκε η επιβίωση σε υψηλές θερμοκρασίες ενός πληθυσμού του δάκου της ελιάς που προέρχονταν από τη περιοχή Θέρμης της Θεσσαλονίκης. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν, η επίδραση των υψηλών θερμοκρασιών τόσο στην επιβίωση διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης του εντόμου (αυγό, προνύμφη, νύμφη) και του ενήλικου, όσο και στην ωοπαραγωγή των ενήλικων θηλυκών, καθώς και στο ποσοστό εκκόλαψης των προνυμφών. 31

2.2 Υλικά και μέθοδοι 2.2.1 Διατήρηση της αποικίας του εντόμου Μελετήθηκε η αντοχή σε υψηλές θερμοκρασίες διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης του δάκου της ελιάς. Χρησιμοποιήθηκαν άτομα από ένα πληθυσμό που προερχόταν από τη περιοχή Θέρμης της Θεσσαλονίκης. Η αποικία του εντόμου εγκαταστάθηκε στο εργαστήριο με άτομα που εμφανίστηκαν από προσβεβλημένους ελαιόκαρπους, που συλλέχθηκαν τους μήνες Σεπτέμβριο και Οκτώβριο από την περιοχή της Θέρμης. Οι προσβεβλημένοι καρποί διατηρούνταν στο εργαστήριο μέσα σε πλαστικές λεκάνες (19 x 20 cm) και καλύπτονταν με βρεγμένη λινάτσα, ώστε να αποφευχθεί η αφυδάτωσή τους. Οι λεκάνες με τους καρπούς διατηρούνταν σε θερμοκρασία 25 C και φωτοπερίοδο Φ:Σ 16:8 1. Μετά την ολοκλήρωση της προνυμφικής ανάπτυξης, οι νύμφες συλλέγονταν καθημερινά και τοποθετούνταν σε γυάλινα τρυβλία Petri μαζί με μάζα διαβρεγμένου βαμβακιού, σε θερμοκρασία 20 C και φωτοπερίοδο Φ:Σ 16:8. Κάθε μέρα, τα ενήλικα άτομα που εμφανίζονταν, μεταφέρονταν σε ξύλινα κλουβιά με συρμάτινες πλευρές διαστάσεων 30 x 30 x 30 cm σε θερμοκρασία 25 C και φωτοπερίοδο Φ:Σ 16:8. Στα κλουβιά υπήρχε ένα μικρό φιαλίδιο με νερό και πρωτεϊνούχο τροφή που αποτελούνταν από νερό, ζάχαρη και υδρολυμένη μαγιά σε αναλογία 5:4:1 (Εικ. 3) (Moore, 1959). Εικόνα 3. Κλουβί διατήρησης των ενήλικων ατόμων, με πρωτεϊνούχο τροφή και φιαλίδιο με νερό (Φωτογραφία Ν. Κούφαλη). 1 Η συντομογραφία Φ:Σ 16:8 δηλώνει ένα φωτοπεριοδικό κύκλο με διάρκεια φωτόφασης 16 ώρες και διάρκεια σκοτόφασης 8 ώρες. 32

Η ανήλικη ανάπτυξη των ατόμων της εργαστηριακής αποικίας (όπως και των πειραματικών ατόμων) συνέβαινε σε ελαιόκαρπους, που συλλέχθηκαν τον Αύγουστο του 2007 από την περιοχή της Θέρμης και διατηρούνταν μέχρι να χρησιμοποιηθούν σε γυάλινα βάζα στο ψυγείο σε θερμοκρασία 5 C. Ομάδες των 50 περίπου καρπών τοποθετούνταν για ορισμένο χρόνο στη βάση των κλουβιών με τα άτομα της εργαστηριακής αποικίας, ώστε τα θηλυκά να αποθέσουν ένα αυγό σε κάθε καρπό. Στη συνέχεια, οι καρποί στους οποίους είχαν αποτεθεί αυγά διατηρούνταν σε πλαστικές λεκάνες (23 x 30 cm), στο επάνω μέρος των οποίων υπήρχε μάζα διαβρεγμένου χαρτιού ώστε να αποφεύγεται η αφυδάτωση των καρπών, σε θερμοκρασία 25 C και φωτοπερίοδο Φ:Σ 16:8, μέχρι την ολοκλήρωση της προνυμφικής ανάπτυξης (Εικ. 4). Οι εμφανιζόμενες νύμφες συλλέγονταν καθημερινά και τοποθετούνταν σε γυάλινα τρυβλία Petri. Όπως και προηγούμενα τα εξερχόμενα άτομα μεταφέρονταν σε ξύλινα κλουβιά στους 25 C και Φ:Σ 16:8. Εικόνα 4. Λεκάνη διατήρησης ωοτοκημένων ελαιόκαρπων (Φωτογραφία Ν.Κούφαλη). 33

2.2.2 Επιβίωση ενήλικων ατόμων μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες Για την μελέτη της επιβίωσης των ενήλικων ατόμων σε υψηλές θερμοκρασίες χρησιμοποιήθηκαν ενήλικα αρσενικά και θηλυκά άτομα ηλικίας 8-12 ημερών, τα οποία μεταφέρονταν και διατηρούνταν σε μικρά γυάλινα κυλινδρικά φιαλίδια διαστάσεων 8 x 2.6 cm. (ύψος x διάμετρος βάσης) (Εικ. 5). Σε κάθε φιαλίδιο διατηρούνταν 10 άτομα. Τα φιαλίδια με τα άτομα εμβαπτίζονταν σε διάλυμα ενός θερμόλουτρου για δύο ώρες. Στη συνέχεια, τα θηλυκά άτομα μεταφέρονταν σε θερμοκρασία 25 C και Φ:Σ 16:8 σε ατομικά κυλινδρικά πλαστικά κλουβιά διαστάσεων 6.4 x 9.5 x 10 cm (διάμετρος κορυφαίου τμήματος x διάμετρος βάσης x ύψος), στις πλευρές των οποίων υπήρχαν 2 μικρά ανοίγματα καλυμμένα με πλαστικό δίκτυ (τούλι), ώστε να επιτυγχάνεται ο αερισμός στο εσωτερικό (Εικ. 6). Η ατομική διατήρηση των θηλυκών ατόμων έγινε προκειμένου να μελετηθεί, η επίδραση (κόστος) της έκθεσης σε υψηλές θερμοκρασίες στην ωοπαραγωγή και τη διάρκεια ζωής. Εικόνα 5-6. Φιαλίδια που χρησιμοποιήθηκαν για την έκθεση των ατόμων σε διαφορετικές θερμοκρασίες στο διάλυμα του θερμόλουτρου (αριστερά) και ατομικό κλουβί για την διατήρηση των ενήλικων θηλυκών (δεξιά) (Φωτογραφίες Ν. Κούφαλη). 34

Ομοίως, και τα αρσενικά άτομα αμέσως μετά την έξοδο από το θερμόλουτρο, μεταφέρονταν σε θερμοκρασία 25 C και Φ:Σ 16:8 σε κυλινδρικά πλαστικά κλουβιά. Στη βάση των κλουβιών τοποθετούνταν ένα πλαστικό κεσεδάκι με νερό, όπου με την βοήθεια βαμβακιού εξασφαλιζόταν η απαραίτητη ποσότητα νερού. Επίσης, τα έντομα είχαν πρόσβαση και σε πλούσια πρωτεϊνούχο τροφή. Κάθε μέρα (ανά 24 ώρες), καταγραφόταν ο αριθμός των νεκρών και ζωντανών ατόμων (επιβίωση). Οι θερμοκρασίες στις οποίες εκτέθηκαν τα άτομα ήταν 25 C (μάρτυρας), 36 C, 37 C, 38 C, 39 C, 40 C και 41 C. Σε κάθε θερμοκρασία υπήρχαν 4 ομάδες των 10 θηλυκών και 10 αρσενικών ατόμων. Ως νεκρά θεωρούνταν τα άτομα που δεν μπορούσαν να μετακινηθούν μετά την ενόχληση τους με τη βοήθεια ενός λεπτού πινέλου. 2.2.3 Επιβίωση αυγών και προνυμφών μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες Για την μελέτη της επιβίωσης των αυγών και προνυμφών του δάκου της ελιάς σε υψηλές θερμοκρασίες, χρησιμοποιήθηκαν καρποί στους οποίους είχαν αποτεθεί αυγά από ενήλικα θηλυκά της εργαστηριακής αποικίας. Οι καρποί αυτοί διατηρούνταν σε πλαστικές λεκάνες καλυμμένοι με βρεγμένες λινάτσες, σε θερμοκρασία 25 C και Φ:Σ 16:8. Για την μελέτη της αντοχής σε υψηλές θερμοκρασίες των διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης του εντόμου, οι καρποί εκτίθονταν σε μία σειρά διαφορετικών υψηλών θερμοκρασιών (25 C, 34 C, 36 C, 38 C, 40 C και 42 C), αμέσως μετά την ωοτοκία (0-3 ώρες για νεαρά έμβρυα) ή μετά από 5 μέρες (νεαρές προνύμφες 1 ου σταδίου), 7 μέρες (προνύμφες 2 ου σταδίου) και 9 μέρες (προνύμφες 3 ου σταδίου). Για την έκθεση των ατόμων ανήλικων σταδίων σε υψηλές θερμοκρασίες, οι καρποί τοποθετούνταν ανά πέντε σε μικρά γυάλινα κυλινδρικά φιαλίδια (8 x 2 cm) και εκτίθονταν για 2 ώρες σε μία θερμοκρασία με εμβάπτιση των φιαλιδίων στο διάλυμα του θερμόλουτρου. Μετά την έκθεση, οι καρποί μεταφέρονταν σε θερμοκρασία 25 C και Φ:Σ 16:8 σε μικρά πλαστικά κεσεδάκια και καλύπτονταν με διαβρεγμένο χαρτί για την διατήρηση της υγρασίας τους. Στη συνέχεια, ελέγχονταν καθημερινά οι καρποί για την παρουσία οπών εξόδου, οι οποίες δήλωναν την 35

ολοκλήρωση της προνυμφικής ανάπτυξης. Οι θερμοκρασίες που δοκιμάστηκαν ήταν 25 C (μάρτυρας), 34 C, 36 C, 38 C, 40 C και 42 C. Σε κάθε θερμοκρασία και κάθε στάδιο, χρησιμοποιήθηκαν 4 ομάδες των 10 καρπών. 2.2.4 Επιβίωση των νυμφών και εμφάνιση ενήλικων ατόμων μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες Για την μελέτη της επιβίωσης των νυμφών σε υψηλές θερμοκρασίες, χρησιμοποιήθηκαν νύμφες 5 ημερών που είχαν αναπτυχθεί σε ελαιόκαρπο σε θερμοκρασία 25 C και Φ:Σ 16:8. Οι νύμφες τοποθετούνταν ανά δέκα σε μικρά γυάλινα κυλινδρικά φιαλίδια (8 x 2 cm), τα οποία εμβαπτίζονταν στο διάλυμα του θερμόλουτρου για δύο ώρες. Οι νύμφες μετά την έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες, μεταφέρονταν σε γυάλινα τρυβλία Perti μαζί με μάζα διαβρεγμένου βαμβακιού σε θερμοκρασία 20 C και Φ:Σ 16:8 και ελεγχόταν καθημερινά η έξοδος ή όχι των ενήλικων ατόμων από αυτές. Οι θερμοκρασίες που δοκιμάστηκαν ήταν 25 C (μάρτυρας), 34 C, 36 C, 38 C, 40 C και 42 C. Σε κάθε θερμοκρασία χρησιμοποιήθηκαν 5 ομάδες των 10 νυμφών. 2.2.5 Μελέτη ωοπαραγωγής των θηλυκών ατόμων και εκκόλαψης των αυγών Για την μελέτη της ωοπαραγωγής, όσα θηλυκά επιβίωναν μετά την έκθεση τους στις υψηλές θερμοκρασίες μεταφέρονταν ατομικά σε κλουβιά. Στη βάση κάθε κλουβιού, τοποθετούνταν ένας καρπός. Κάθε δύο μέρες καταμετρούνταν ο αριθμός των αποτιθέμενων αυγών (συνολικά για 12 μέρες, δηλαδή πραγματοποιήθηκαν 6 μετρήσεις) και η επιβίωση. Οι καρποί στους οποίους αποτίθονταν αυγά μεταφέρονταν σε πλαστικό βάζο διαστάσεων 6 x 5 x 2.4 cm (διάμετρος κορυφαίου τμήματος x διάμετρος βάσης x ύψος), όπου καλύπτονταν με διαβρεγμένο χαρτί και παρέμεναν σε θερμοκρασία 25 C και Φ:Σ 16:8, μέχρι την εμφάνιση οπών εξόδου προνυμφών (Εικ. 7). Καθημερινά ελέγχονταν οι καρποί για την παρουσία οπών εξόδου, που 36

αποτελούσε κριτήριο εκκόλαψης των αυγών και ολοκλήρωσης της προνυμφικής ανάπτυξης. Εικόνα 7. Πλαστικό βάζο για ατομική διατήρηση των ωοτοκημένων ελαιόκαρπων (Φωτογραφία Ν. Κούφαλη). 37