Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ VEGF, PlGF ΚΑΙ ΑΝΤΙΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ- ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ seng, sflt-1 ΣΤΗΝ ΠΡΟΕΚΛΑΜΨΙΑ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ Δ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Θ. ΑΓΟΡΑΣΤΟΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2012 ΑΡΙΘΜ: 3205 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ VEGF, PlGF ΚΑΙ ΑΝΤΙΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ- ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ seng, sflt-1 ΣΤΗΝ ΠΡΟΕΚΛΑΜΨΙΑ ΣΟΦΙΑΣ Δ. ΜΑΣΟΥΡΑ ΙΑΤΡΟΥ ΜΑΙΕΥΤΗΡΑ- ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2

3

4

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Μ. ΓΚΟΥΤΖΙΟΥΛΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 2. Α. ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Μ. ΓΚΟΥΤΖΙΟΥΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 2. Α. ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 4. Β. ΖΟΥΡΝΑΤΖΗ-ΚΟΪΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 5. Α. ΛΟΥΦΟΠΟΥΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 6. Ν.ΠΡΑΠΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 7. Θ. ΘΕΟΔΩΡΙΔΗΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα». (Νόµος 5343/32, αριθ. 202/2 και ν. 1268/82, αριθ.50 / 8). 5

6

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Β. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 7

8

Στους γονείς µου 9

10

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η προεκλαµψία αποτελεί µια σηµαντική πάθηση της ανθρώπινης κύησης µε συχνότητα 3-7% των κυήσεων. Σχετίζεται µε αυξηµένο ποσοστό µητρικής και εµβρυικής νοσηρότητας και θνησιµότητας. Χαρακτηρίζεται από αύξηση της αρτηριακής πίεσης και λευκωµατουρία µετά την 20η εβδοµάδα της κύησης. Η παρουσία του πλακούντα θεωρείται απαραίτητη για την εκδήλωση της νόσου γεγονός το οποίο επιβεβαιώνεται από την άµεση υποχώρηση των συµπτωµάτων µετά τον τοκετό. Η αιτιολογία της νόσου είναι άγνωστη και αποτελεί αντικείµενο µελέτης παγκοσµίως. Σηµαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της προεκλαµψίας παίζει η παθολογική διείσδυση των τροφοβλαστικών κυττάρων στις σπειροειδείς αρτηρίες του ενδοµητρίου µε αποτέλεσµα την δηµιουργία υποξίας και την απελευθέρωση από τον πλακούντα παραγόντων που έχουν στόχο το ενδοθήλιο της µητρικής κυκλοφορίας. Το δεύτερο στάδιο της πάθησης χαρακτηρίζεται από καταστροφή και δυσλειτουργία του ενδοθηλίου της συστηµατικής κυκλοφορίας της µητέρας µε αποτέλεσµα την εµφάνιση των συµπτωµάτων και των επιπλοκών της νόσου. Το ενδοθήλιο είναι ο µεγαλύτερος αυτοκρινής, παρακρινής και ενδοκρινής αδένας του σώµατός µας που καλύπτει εσωτερικά όλα τα αγγεία. Οι κύριες λειτουργίες του είναι η ρύθµιση του αγγειακού τόνου, της αγγειακής διαβατότητας, η αποτροπή της συσσώρευσης των αιµοπεταλίων και η πρωτεϊονοσύνθεση. Η διαδικασία της αγγειογένεσης συντελείτε καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης και της ενήλικης ζωής. Ο σχηµατισµός νέων αγγείων καθώς και η διατήρηση της φυσιολογικής δοµής και λειτουργίας τους συνεισφέρει σηµαντικά στην τέλεση των φυσιολογικών και παθολογικών βιολογικών διαδικασιών των 11

οργάνων του ανθρώπινου οργανισµού. Υπό φυσιολογικές συνθήκες υπάρχει ισορροπία µεταξύ παραγόντων που προάγουν την αγγειογένεση και ονοµάζονται προ-αγγειογενετικοί (VEGF, PlGF, TGF β) και των αναστολέων τους αντι-αγγειογενετικών παραγόντων (sflt-1, seng). Διαταραχή στην ανάπτυξη και φυσιολογική λειτουργία των αγγείων συµβάλει στην παθογένεια διαφόρων νοσηµάτων. Διαταραχή της αγγειογένεσης υπέρ των αντι-αγγειογενετικών παραγόντων οδηγεί σε δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και των κυττάρων του. Η προεκλαµψία είναι µια από τις παθήσεις που προκύπτει από σηµαντική δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Τα µέχρι τώρα αποτελέσµατα σε ότι αφορά τον ρόλο των αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων στην παθοφυσιολογία της προεκλαµψίας είναι αντικρουόµενα. Η ικανότητα προσδιορισµού αυξηµένων επιπέδων των παραπάνω αντί- αγγειογενετικών παραγόντων καθώς και η µείωση των επιπέδων των αγγειογενετικών παραγόντων λόγω απενεργοποίησης τους στη συστηµατική κυκλοφορία σε ασθενείς µε εγκατεστηµένη προεκλαµψία, καθώς και η συσχέτιση των παραγόντων µεταξύ τους και µε κλινικούς και εργαστηριακούς παράγοντες αποτελεί σηµαντικό βήµα στην διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Οι παραπάνω λόγοι µε ώθησαν στην πραγµατοποίηση αυτής της µελέτης µε σκοπό την εκτίµηση του ρόλου των αγγειογενετικών παραγόντων VEGF και PlGF και των αντι-αγγειογενετικών παραγόντων sflt-1 και seng στην προεκλαµψία. Για τον σκοπό αυτόν µελετήθηκαν 80 γυναίκες. Στις 40 από τις παραπάνω γυναίκες διαγνώσθηκε προεκλαµψία κατά την διάρκεια της παρούσας κύησης (οµάδα µελέτης), οι οποίες νοσηλεύθηκαν στο τµήµα Εµβρυοµητρικής της Δ Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Επιπλέον, συµµετείχαν 40 γυναίκες που δεν εµφάνισαν παθολογία κατά την κύηση και χρησιµοποιήθηκαν ως οµάδα ελέγχου οι οποίες παρακολουθήθηκαν στα 12

εξωτερικά ιατρεία της ίδιας κλινικής. Το εργαστηριακό σκέλος της µελέτης πραγµατοποιήθηκε στο ερευνητικό εργαστήριο της Β Μαιευτικής και Γυναικολογικής κλινικής του ΑΠΘ. Η παρούσα µελέτη αποτελείται από το Γενικό και το Ειδικό µέρος. Το πρώτο µέρος έχει χωριστεί σε τέσσερα κεφάλαια ως εξής: 1. Εισαγωγή 2. Παθοφυσιολογία της Προεκλαµψίας 3. Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες 4. Αντι-αγγειογενετικοι παράγοντες Στο ειδικό µέρος αναπτύσσεται η µεθοδολογία που ακολουθήθηκε, τα αποτελέσµατα, η συζήτηση µε τα συµπεράσµατα, η περίληψη και η βιβλιογραφία. Τη διατριβή αυτή µου ανέθεσαν ο οµότιµος Καθηγητής της Μαιευτικής και Γυναικολογίας κ. Μ. Γκουτζιούλης, ο Αναπληρωτής Καθηγητής της Μαιευτικής και Γυναικολογίας κ. Α. Αθανασιάδης και η Καθηγήτρια της Βιοχηµείας κ. Ν. Βαβάτση-Χριστάκη. Τους εκφράζω τη βαθιά µου ευγνωµοσύνη για την ευκαιρία που µου έδωσαν να ασχοληθώ µε αυτό το ιδιαίτερο κοµµάτι της Μαιευτικής και τους ευχαριστώ για την εµπιστοσύνη που µου έδειξαν, αλλά και για τη συµπαράστασή τους κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της µελέτης. Αισθάνοµαι επίσης, την ανάγκη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την Καθηγήτρια της Μικροβιολογίας κ. Β. Ζουρνατζή για την ουσιαστική υποστήριξη της σε ό,τι αφορά στο εργαστηριακό µέρος της µελέτης και τον Καθηγητή κ. Θ. Αγοραστό για την συνεχή προτροπή του και συµπαράσταση κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της µελέτης. Ευχαριστώ θερµά τα µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής που στην κρίση τους υποβάλλεται αυτή η διατριβή για την διάθεση του πολύτιµου χρόνου τους. 13

Ευχαριστώ τους αγαπηµένους µου γονείς που µε στήριξαν µε την αγάπη και την φροντίδα τους και που στάθηκαν δίπλα µου και µε βοήθησαν να ολοκληρώσω τον στόχο µου. 14

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΠΡΟΕΚΛΑΜΨΙΑ 1.1 Ορισµός...21 1.2 Επιδηµιολογία...21 1.3 Προδιαθεσικοί παράγοντες...22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΡΟΕΚΛΑΜΨΙΑΣ 2.1 Μητροπλακουντική κυκλοφορία...25 2.2 Μετατροπή των σπειροειδών αρτηριών...26 2.2.1 Φυσιολογική µετατροπή...26 2.2.2 Παθολογική µετατροπή...32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΓΕΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 3.1 Εισαγωγικά στοιχεία...35 15

3.2 VEGF...37 3.2.1 VEGFA...38 3.2.2 Ρύθµιση της παραγωγής του VEGF...39 3.2.3 Δράση του VEGF...40 3.2.4 VEGFRs...42 3.3 PlGF...47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΤΙ-ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 4.1 sflt-1...49 4.2 Ενδογλίνη...50 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Σκοπός...57 2. Υλικό και µέθοδος 59 2.1 Οµάδα ασθενών. 59 2.2 Λήψη δειγµάτων 59 2.3 Ποσοτικοί προσδιορισµοί..60 2.3.1 VEGF....60 2.3.2 sflt-1.........61 2.3.3 PlGF......61 16

2.3.4 seng.......62 3. Στατιστική ανάλυση......63 4. Αποτελέσµατα.......65 4.1 Γενικά 65 4.2 Κλινικό- Εργαστηριακά....67 4.3 Αγγειογενετικοί και αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες.69 4.4 Συσχέτιση των VEGF, PlGF και sflt-1 και seng µε την ΑΠ...75 4.5 Περιγεννητική νοσηρότητα...81 4.6 Οµάδα προεκλαµψίας (µελέτης)... 83 5. Συζήτηση.... 93 6. Συµπεράσµατα... 99 Περίληψη...101 Summary...103 Βιβλιογραφία...105 17

18

. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 19

20

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Προεκλαµψία-ορισµός Η προεκλαµψία είναι µία συστηµατική πάθηση µοναδική στο ανθρώπινο είδος [1]. Χαρακτηρίζεται από αύξηση της αρτηριακής πίεσης ( 140/90mmHg) σε δύο µετρήσεις που διαφέρουν µεταξύ τους τουλάχιστον 6 ώρες και λευκωµατουρία (> 300mg/24h) ή ανεύρεση δύο σταυρών ούρων (+2 = 100mg/dl) σε δείγµα ούρων (stick) επί απουσίας ούρων 24ωρου, µετά την 20 η εβδοµάδα της κύησης [2]. Κύηση η οποία επιπλέκεται µε προεκλαµψία χαρακτηρίζεται ως υψηλού κινδύνου. Ο πλακούντας θεωρείται ότι κατέχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου, τα αίτια της νόσου παραµένουν ασαφή, ενώ η πλέον αποτελεσµατική θεραπεία είναι ο τοκετός και η αποµάκρυνση του πλακούντα από την µήτρα. 1.2 Επιδηµιολογία Η προεκλαµψία επιπλοκή το 2-8% των κυήσεων, ενώ η συχνότητά της είναι τρεις φορές συχνότερη στις χώρες του τρίτου κόσµου σύµφωνα µε επιδηµιολογικά δεδοµένα του παγκόσµιου οργανισµού υγείας [3]. Η προεκλαµψία µαζί µε την εκλαµψία ευθύνεται ετησίως για τουλάχιστον 50.000 µητρικούς θανάτους παγκοσµίως. Σε ανάλυση 35.000 µητρικών θανάτων, η υπερτασική νόσος της κύησης ήταν η δεύτερη αιτία µητρικού θανάτου στις αναπτυσσόµενες χώρες και η κύρια αιτία στις χώρες της Λατινικής Αµερικής. Ακόµα και σε χώρες του δυτικού κόσµου οπού το ποσοστό µητρικής θνησιµότητας είναι εξαιρετικά χαµηλό, η προεκλαµψία 21

και η εκλαµψία ευθύνονται για ένα σηµαντικό αριθµό γυναικών που πεθαίνουν κατά την κύηση [4]. Εκτός όµως από την αύξηση της µητρικής νοσηρότητας και θνησιµότητας, η προεκλαµψία συµβάλει σηµαντικά και στην αύξηση της περιγεννητικής νοσηρότητας και θνησιµότητας, αφού αποτελεί την συχνότερη αιτία προωρότητας (< 37 εβδοµάδες), καθώς ευθύνεται για το 40% των ιατρογενών πρόωρων τοκετών. Ακόµη, η ισχυρή συσχέτιση της προεκλαµψίας µε την βραδύτητα της ενδοµήτριας ανάπτυξης του εµβρύου (Intra Uterine Growth Retardation-IUGR) συµβάλει επιπλέον στην αύξηση της περιγεννητικής νοσηρότητας [5]. 1.3 Προδιαθεσικοί παράγοντες Πλήθος παραγόντων οι οποίοι προδιαθέτουν στην εµφάνιση της προεκλαµψίας έχουν ανευρεθεί. Από αυτούς ως οι συχνότεροι έχουν αναφερθεί: η χρόνια υπέρταση, ο σακχαρώδης διαβήτης, η παχυσαρκία (BMI > 30kgr/m²), το αντι-φωσφολιπιδικό σύνδροµο, η χρόνια νεφρική νόσος, καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από αυξηµένη πλακουντική µάζα όπως η πολύδυµη κύηση και η τροφοβλαστική νόσος (µύλη κύηση), το σύνδροµο Down κατά την κύηση και το ιστορικό προεκλαµψίας σε προηγούµενη κύηση [6-8]. Ο δείκτης µάζας-σώµατος (Body Mass Index- ΒΜΙ) φαίνεται επίσης να αποτελεί σηµαντικό προδιαθεσικό παράγοντα στην εµφάνιση της νόσου. Μελέτες έδειξαν ότι η πιθανότητα εµφάνισης προεκλαµψίας είναι διπλάσια σε γυναίκες µε αυξηµένο ΒΜΙ [9,10]. Οι Bianco και συν., έδειξαν ότι γυναίκες µε ΒΜΙ > 35kgr/m², πριν την εγκυµοσύνη είχαν περίπου τέσσερις φορές µεγαλύτερο κίνδυνο εµφάνισης της νόσου σε σύγκριση µε γυναίκες µε ΒΜΙ πριν την εγκυµοσύνη µεταξύ 19 και 27 [11]. Επίσης, όπως προκύπτει από δηµοσιευµένες µελέτες η συχνότητα εµφάνισης της προεκλαµψίας είναι µεγαλύτερη σε πρωτοτόκες 22

από ότι σε πολυτόκες γυναίκες. Πολυτόκες γυναίκες µετά από αλλαγή συντρόφου έχουν συγκρίσιµα ποσοστά προεκλαµψίας µε πρωτοτόκες. Το γεγονός αυτό αποδίδεται σε παράγοντες που πηγάζουν από την αλλαγή της πατρότητας καθώς και από το πιθανό µεγάλο χρονικό διάστηµα µεταξύ των τοκετών [12]. Αν και η απουσία ιστορικού προεκλαµψίας στην οικογένεια είναι ο κανόνας στις περισσότερες περιπτώσεις η παρουσία σε συγγενή πρώτου βαθµού αυξάνει τον κίνδυνο εµφάνισης της νόσου 2-4 φορές [13]. Ιστορικό προεκλαµψίας στην οικογένεια του πατέρα έχει επίσης βρεθεί να αυξάνει τις πιθανότητες [14]. Οι παραπάνω προδιαθεσικοί παράγοντες έχουν κοινό γνώρισµα την αγγειακή βλάβη και την δυσλειτουργία του ενδοθηλίου τόσο της µητρο-πλακουντικής όσο και της συστηµατικής κυκλοφορίας, τα οποία πιθανόν αποτελούν και τον κύριο παράγοντα παθογένειας της νόσου. 23

24

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΡΟΕΚΛΑΜΨΙΑΣ 2.1 Μητροπλακουντική κυκλοφορία Η µήτρα αιµατώνεται κυρίως από τη µητριαία αρτηρία, κλάδο της έσω λαγονίου αρτηρίας (υπογάστριας αρτηρίας), η οποία εισέρχεται στη µήτρα 2 εκατοστά πάνω από τον τράχηλο και διακλαδίζεται στις τοξοειδείς αρτηρίες οι οποίες περιβάλλουν την πρόσθια και την οπίσθια επιφάνειά της και αναστοµώνονται στη µέση γραµµή. Από εκεί εκπορεύονται οι ακτινοειδείς αρτηρίες οι οποίες εισχωρούν στο βάθος της µήτρας έως περίπου το 1/3 του πάχους του µυοµητρίου. Εκεί δίνουν γένεση στις βασικές και στις σπειροειδείς αρτηρίες οι οποίες αρδεύουν το µυοµήτριο, ενώ κατά την κύηση είναι επιπλέον υπεύθυνες για την αιµάτωση του φθαρτού και του µεσολάχνιου χώρου. Περίπου 100 σπειροειδείς αρτηρίες εκβάλουν στο µεσολάχνιο χώρο σε έναν φυσιολογικό και ώριµο πλακούντα ο οποίος αποτελείται από 12 µεγάλες µητρικές κοτυληδόνες και περίπου 40-50 µικρότερες (Εικόνα 1). Κατά τη διάρκεια µιας φυσιολογικής κύησης η αιµατική ροή προς τη µήτρα αυξάνεται έτσι ώστε να µπορούν να καλυφθούν οι θρεπτικές ανάγκες του εµβρύου. Η ρύθµιση της µητριαίας αιµατικής ροής είναι ζωτικής σηµασίας για την καλή κατάσταση του εµβρύου. Σε κύηση µε φυσιολογική πλακουντοποίηση οι αγγειακές αντιστάσεις της αιµατικής ροής προς τη µήτρα ελαττώνονται κατά 700 φορές και η αιµατική ροή προς αυτήν δεκαπλασιάζεται από 60ml/min σε 600 ml/min [15,16]. Η αύξηση της αιµατικής ροής προς τον πλακούντα απαιτεί συγκεκριµένη δοµή και λειτουργία των σπειροειδών αρτηριών. 25

Εικόνα αρτηριών 1. Αιµάτωση του σώµατος της µήτρας µέσω των µητριαίων 2.2 Μετατροπή των σπειροειδών αρτηριών 2.2.1 Φυσιολογική µετατροπή Η εµφύτευση και η δηµιουργία του πλακούντα συµπεριλαµβάνει σηµαντικές αλλαγές στα κύτταρα του στρώµατος του ενδοµητρίου. Η διαδικασία αυτή ονοµάζεται φθαρτοειδής αντίδραση και περιλαµβάνει την αντικατάσταση των ενδοθηλιακών κυττάρων του ενδοµητρίου από διογκωµένα στρωµατικά κύτταρα, µετανάστευση φλεγµονωδών κυττάρων, 26

αυξηµένη αγγειακή διαπερατότητα στο στρώµα και τοπικό οίδηµα. Παράλληλα συντελείτε αλλαγή στη δοµή του συνδετικού ιστού και στη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας. Η διαδικασία αυτή διευκολύνει την µετακίνηση και διείσδυση των τροφοβλαστικών κυττάρων [17]. Ο ανθρώπινος πλακούντας ονοµάζεται αιµοχοριακός καθώς εξασφαλίζει την άµεση επαφή της µητριαίας κυκλοφορίας µε τις χοριακές λάχνες δια µέσου του µεσολάχνιου χώρου [18]. Για να πραγµατοποιηθεί αυτό απαιτείται η τροποποίηση της δοµής των αγγείων της µητριαίας κυκλοφορίας µε αποτέλεσµα την διεύρυνση του αυλού τους και την καταστροφή του µυώδους και ευαίσθητου σε αγγειο-διασταλτικούς παράγοντες τοιχώµατός τους [19]. Η µεταβολή των σπειροειδών αρτηριών σε αγγεία της µητροπλακουντικής κυκλοφορίας προϋποθέτει την διείσδυση των κυττάρων της τροφοβλάστης στο τοίχωµα των αγγείων αυτών. Η διεργασία αυτή ονοµάζεται «φυσιολογική µεταβολή των σπειροειδών αρτηριών». Περιγράφηκε αρχικά από τους Brosens και συν., το 1967 και περιλαµβάνει την µετατροπή του αγγειακού δικτύου σε ένα σύστηµα χαµηλής πίεσης υψηλής ροής το οποίο εξασφαλίζει επαρκή αιµάτωση στον πλακούντα και το αναπτυσσόµενο έµβρυο [19]. Η διαδικασία αυτή επιτελείται σε δύο στάδια. Το πρώτο λαµβάνει χώρα στο πρώτο τρίµηνο της κύησης κατά το οποίο τα εξωλάχνια κυτταροβλαστικά κύτταρα (EVCT) διεισδύουν στο τοίχωµα των αγγείων του φθαρτού, και το δεύτερο, στο δεύτερο τρίµηνο της κύησης, οπού και πραγµατοποιείται µετατροπή των σπειροειδών αρτηριών σε βαθύτερα στρώµατα [20]. Η διείσδυση των EVCT πραγµατοποιείται ελεγχόµενα. Οποιαδήποτε ανωµαλία µεταξύ των παραγόντων που προάγουν ή αναστέλλουν αυτήν την διείσδυση οδηγεί σε παθολογική κατάσταση [21]. Η ικανότητα των κυτταρο-τροφοβλαστικών κυττάρων να διεισδύουν προϋποθέτει αρχικά την αναγνώριση διαφόρων συστατικών της 27

εξωκυττάριας ουσίας (ιντεγκρίνες, καντερίνες) και η διάσπαση αυτής πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια ειδικών πρωτεασών οι οποίες αποδοµούν την εξωκυττάρια ουσία όπως είναι ο ενεργοποιητής του πλασµινογόνου και οι µεταλοπρωτεΐνασες [22]. Η ρύθµιση της διείσδυσης απαιτεί την αλλαγή της σύστασης της εξωκυττάριας ουσίας. Η εξωκυττάρια ουσία αποτελείται από κολλαγόνο Ι, ΙΙΙ, V, VI, φιµπρονεκτίνη, περιαδενική τενασκίνη και λαµινίνη. Η αλλαγή στη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας είναι σηµαντική για την διείσδυση των τροφοβλαστικών κυττάρων. Η προσκόλληση των EVCT στην εξωκυττάρια ουσία απαιτεί την µεσολάβηση υποδοχέων στην κυτταρική µεµβράνη οι οποίοι βοηθούν το κύτταρο να αναγνωρίσει τα συστατικά της και να προσδεθεί σε αυτά. Οι υποδοχείς αυτοί είναι οι καντερίνες και οι ιντεγκρίνες. Αλλαγή στο προφίλ των ιντεγκρινών συµβαίνει καθώς τα τροφοβλαστικά κύτταρα µετατρέπονται από πολλαπλασιαζόµενα σε διάµεσα (στα βαθύτερα στρώµατα του φθαρτού και στις σπειροειδείς αρτηρίες). Έτσι, ενώ τα τροφοβλαστικά κύτταρα αρχικά εκφράζουν στην επιφάνειά τους α6β4 ιντεγκρίνες (υποδοχέας της λαµινίνης που είναι βασικό συστατικό της βασικής µεµβράνης), καθώς µεταναστεύουν εκφράζουν ιντεγκρίνες α5β1 (υποδοχέας της φιµπρονεκτίνης). Όταν µετατρέπονται σε διάµεσους τροφοβλάστες εκφράζουν ανβ1 και ανβ3 (υποδοχέας της βιτρονεκτίνης) [23]. Η προσκόλληση των τροφοβλαστικών κυττάρων στα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας δεν είναι αρκετή για τη διείσδυση τους καθώς για να διαπεράσουν την τρισδιάστατη αρχιτεκτονική της απαιτείται αρχικά η διάσπαση της. Αυτό επιτυγχάνεται µε την βοήθεια των µεταλλοπρωτεϊνασών (ΜΜΡs). Οι µετταλλοπρωτεϊνάσες είναι ιστικές ενδοπρωτεάσες και περιλαµβάνουν 13 µέλη που ανήκουν σε 3 οικογένειες: κολλαγενάσες (ΜΜΡ 1, 8, 3) οι οποίες αποδοµούν το κολλαγόνο τύπου Ι και 28

ΙΙΙ, ζελατινάσες Α και Β (ΜΜΡ 2, 9) οι οποίες αποδοµούν ζελατίνη, κολλαγόνο τύπου ΙV και ελαστίνη και στρωµατολυσίνες (ΜΜΡ 3, 7, 10, 11) οι οποίες παρουσιάζουν ένα ευρύτερο πεδίο δράσης. Η δράση των ενζύµων αυτών ρυθµίζεται από τον βαθµό ενεργοποίησής τους (τα περισσότερα από αυτά εκκρίνονται ως ανενεργείς µορφές) και από την παρουσία ιστικών αναστολέων (Tissue Inhibitors of MetalloProteinase-TIMPs), οι οποίοι εγκρίνονται από τον φθαρτό και από τα τροφοβλαστικά κύτταρα και εµποδίζουν την ενεργοποίηση των ενζύµων [24,25]. Η ακτιβίνη παράγεται από τα κύτταρα του φθαρτού και βρέθηκε πρόσφατα να προωθεί την παραγωγή µεταλλοπρωτεϊνασών από τους τροφοβλάστες [26]. Η διήθηση του τοιχώµατος των σπειροειδών αρτηριών από τα κύτταρα της τροφοβλάστης είναι µια πολύπλοκη διαδικασία. Στο πρώτο τρίµηνο (8-12 εβδοµάδα) της κύησης τα εξωλάχνια κυτταρο-τροφοβλαστικά κύτταρα επενδύουν τµήµατα της εξωτερικής στοιβάδας των τριχοειδών αγγείων ( σπειροειδών αρτηριών) του φθαρτού δηµιουργώντας έτσι ένα περίβληµα γύρω από αυτά. Στη συνέχεια παρατηρούνται συναθροίσεις κυττάρων στο εσωτερικό του αυλού γνωστές ως αγγειακά βουλώµατα (plugs) που αποφράσουν σχεδόν όλα τα τριχοειδή αγγεία του φθαρτού και παραµένουν ως τις αρχές του δευτέρου τριµήνου. Η διαπερατότητα των «βουλωµάτων» αυτών επιτρέπει την εισροή πλάσµατος προς λίµνες αίµατος που δηµιουργούνται από την διείσδυση των αγγείων και που θα αποτελέσουν τους µελλοντικούς µεσολάχνιους χώρους [27]. Η παρουσία τους παρεµποδίζει την κυκλοφορία του µητρικού αίµατος στον µεσολάχνιο χώρο ο οποίος τροφοδοτείται από παράπλευρη κυκλοφορία µέσω αρτηριοφλεβικών αναστοµώσεων που αναπτύσσονται περιφερικά του σηµείου εµφύτευσης [28,29]. Η pο 2 του πλακούντα αν και χαµηλότερη από αυτή του ενδοµητρίου κατά τη διάρκεια του πρώτου τριµήνου (17,9 έναντι 39,6 mmhg), από την 8-12 εβδοµάδα αρχίζει να αυξάνει προοδευτικά φθάνοντας σταδιακά τα επίπεδα της pο 2 του ενδοµητρίου γεγονός που παραπέµπει σε 29

σταδιακή διάλυση των τροφοβλαστικών συναθροίσεων σε αυτή την φάση. Το υποξαιµικό περιβάλλον του πρώτου τριµήνου της κύησης εξασφαλίζει ένα ιδανικό περιβάλλον για τα πρώτα στάδια της οργανογένεσης που προστατεύει το έµβρυο από τις ελεύθερες ρίζες του οξυγόνου [30]. Επίσης το έµβρυο κατά το πρώτο τρίµηνο στερείται αµυντικών µηχανισµών κατά των ελεύθερων ριζών του οξυγόνου µε αποτέλεσµα λόγω της χαµηλής pο 2 να προστατεύονται οι ιστοί του από τις επιβλαβείς επιπτώσεις του. Επίσης τα έµβρυα σε αυτή τη φάση της ανάπτυξής τους έχουν εµβρυική αιµοσφαιρίνη η οποία έχει µεγαλύτερη συγγένεια µε το οξυγόνο σε συνθήκες χαµηλής µερικής πίεσης [31,32]. Η παρουσία των τροφοβλαστικών βυσµάτων θεωρητικά θα συνοδευόταν από συνωστισµό ερυθρών κυττάρων πάνω από αυτά και από την εµφάνιση πολλαπλών θρόµβων. Αυτό όµως δεν συµβαίνει στην πραγµατικότητα εξαιτίας της ενεργοποίησης των µηχανισµών της τοπικής αιµόστασης (θροµβοµοδουλίνη, ιστικός παράγοντας και ενεργοποιητής του πλασµινογόνου), οι οποίοι εξασφαλίζουν την ροή στις σπειροειδείς αρτηρίες και εµποδίζουν την εξαγγείωση µετά την διείσδυση της τροφοβλάστης. Το δεύτερο κύµα διείσδυσης των τροφοβλαστικών κυττάρων στις σπειροειδείς αρτηρίες του µυοµητρίου λαµβάνει χώρα µεταξύ 13 ης και 18 ης εβδοµάδας οπότε και ολοκληρώνεται. Σε αυτήν την φάση µέρος των κυττάρων αποικεί το εσωτερικό τοίχωµα των σπειροειδών αρτηριών που βρίσκονται στο µυοµήτριο και στη συνέχεια όλους τους χιτώνες των αγγείων προκαλώντας έτσι σταδιακή εξαφάνιση των κυττάρων του ενδοθηλίου, των λείων µυϊκών ινών, και του έσω ελαστικού χιτώνα [33]. Ο τελευταίος αντικαθίσταται από εναπόθεση ινικής κάτι το οποίο κάνει το αγγείο να χάσει την ελαστικότητα του. Τα τροφοβλαστικά κύτταρα καθώς διαφοροποιούνται, σταδιακά αποκτούν φαινότυπο ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα αγγεία µετατρέπονται συνεπώς από µικρές µυϊκές αρτηρίες σε διατεταµένα µητροπλακουντικά αγγεία (Εικόνα 2). Η 30

µέση διάµετρος των σπειροειδών αρτηριών αυξάνει από 200-300 µm σε 500µm κατά την κύηση αυξάνοντας έτσι την αιµατική ροή από 100ml/λεπτό σε 500-800ml/λεπτό. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση της αντίστασης των µητριαίων αγγείων και τη συνεχόµενη ροή προς τους µεσολάχνιους χώρους απαραίτητη για την θρέψη του εµβρύου κατά το δεύτερο και τρίτο τρίµηνο της κύησης. Σε µελέτες µε Doppler που έγιναν, η εξαφάνιση των εγκοπών της µητριαίας αρτηρίας, η οποία φυσιολογικά υπάρχει στην αρχή της κύησης, γίνεται λόγω αύξησης της διαστολικής ροής των αγγείων αυτών και λόγω της αύξησης της ροής στους µεσολάχνιους χώρους. Επειδή πολλές φορές η µετατροπή των σπειροειδών αρτηριών αργεί να ολοκληρωθεί, οι εγκοπές στις µητριαίες αρτηρίες µπορεί να υφίστανται ως και την 22 η - 26 η εβδοµάδα [34]. Η ελαττωµατική δηµιουργία αρτηριακού δικτύου στο µυοµήτριο είναι υπεύθυνη για την παραµονή των εγκοπών που παρατηρούνται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως αυτή της προεκλαµψίας. Εικόνα 2. Η φυσιολογική µετατροπή των σπειροειδών αρτηριών µετά τη διείσδυση των τροφοβλαστικών κυττάρων στο τοίχωµα των αγγείων (Biology Online) 31

2.2.2 Παθολογική µετατροπή H προεκλαµψία είναι µία σηµαντική πάθηση της κύησης κατά την οποία ο πλακούντας παίζει σηµαντικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου. Η µητροπλακουντική κυκλοφορία παραµένει σε µία κατάσταση υψηλών αντιστάσεων χαµηλής χωρητικότητας και υψηλών αντιστάσεων µε αποτέλεσµα την ανεπαρκή κάλυψη των αναγκών του εµβρύου σε οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες (Εικόνα 3). Στην προεκλαµψία η διείσδυση των τροφοβλαστικών κυττάρων παραµένει επιφανειακή και τα µητριαία αγγεία δεν υπόκεινται στην φυσιολογική µεταβολή. Εικόνα 3. Παθολογική διείσδυση των τροφοβλαστικών κυττάρων στην προεκλαµψία (McCrae 2003) 32

Το 1972 οι Brosens και συν., ήταν οι πρώτοι που παρατήρησαν ότι στις σπειροειδείς αρτηρίες γυναικών µε προεκλαµψία δεν πραγµατοποιείται η διαδικασία της «φυσιολογικής µετατροπής» [35]. Μια ενδογενής ανεπάρκεια των τροφοβλαστικών κυττάρων πιθανότατα οδηγεί σε απώλεια της διεισδυτικής τους ικανότητας, απουσία έκφρασης των µορίων προσκόλλησης και των ενζύµων που αποδοµούν την εξωκυττάρια ουσία [36,37]. Στην προεκλαµψία το δεύτερο κύµα διείσδυσης είτε δεν συµβαίνει, είτε είναι ηµιτελές και παρατηρήθηκε απουσία των «βουλωµάτων» στο εσωτερικό των σπειροειδών αρτηριών. Η διάµετρος των σπειροειδών αρτηριών του µυοµητρίου και του φθαρτού παραµένει στη φυσιολογική διάµετρο των 200-300mµ µε αποτέλεσµα τη µείωση της µητροπλακουντικής αιµατικής ροής. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι σε γυναίκες οι οποίες αργότερα εµφάνισαν προεκλαµψία η µητροπλακουντική κυκλοφορία ήταν µειωµένη κατά 50-70%. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την ανεπάρκεια και την υποξία του πλακούντα, την εµφάνιση οξειδωτικού stress και την παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου (reactive oxygen species-ras) [38]. Η παθολογική διείσδυση οδηγεί στην απελευθέρωση στη συστηµατική κυκλοφορία από τον υποξαιµικό πλακούντα, παραγόντων που προκαλούν γενικευµένη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Παράγοντες όπως λευκά αιµοσφαίρια, τµήµατα της µεµβράνης των αιµοπεταλίων, ενεργοποιηµένα ουδετερόφιλα, ROS, κυτοκίνες, αυξητικοί παράγοντες και ορµόνες απελευθερώνονται στη συστηµατική κυκλοφορία της µητέρας και είναι υπεύθυνοι για την εκδήλωση των κλινικών συµπτωµάτων της νόσου [39,40]. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα καταστρέφονται ή ενεργοποιούνται, χάνεται η ακεραιότητα των αγγείων µε αποτέλεσµα την αύξηση της διαπερατότητάς τους, την προσέλκυση αιµοπεταλίων, την δηµιουργία θρόµβων, την αύξηση της ανταπόκρισής τους σε αγγειοσυσπαστικές ουσίες και τελικά την αύξηση 33

του αγγειακού τόνου. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την δηµιουργία βλάβης των αγγείων αθηρωµατικού τύπου και την ισχαιµική νέκρωση ιστών όπως ο πλακούντας, το ήπαρ, ο νεφρικός φλοιός και ο εγκέφαλος. Η προεκλαµψία είναι µια πάθηση που ξεκινάει από τον πλακούντα το τελικό όργανο-στόχος όµως είναι το αγγειακό ενδοθήλιο της συστηµατικής κυκλοφορίας της µητέρα. Ουσίες που παράγονται από τον υποξαιµικό πλακούντα είναι υπεύθυνες για την δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και τις επακόλουθες κλινικές επιπτώσεις της νόσου στο καρδιαγγειακό σύστηµα, στους νεφρούς και στον εγκέφαλο. Παραδοσιακά µέχρι τώρα, ο προσδιορισµός των γυναικών σε υψηλό κίνδυνο για ανάπτυξη προεκλαµψίας, γινότανε µε βάση τους προδιαθεσικούς παράγοντες, και την Doppler ροοµετρία. [41]. Σύµφωνα µε τις µετρήσεις Doppler, κυήσεις οι οποίες εµφανίζουν αυξηµένες αντιστάσεις στις µητριαίες αρτηρίες µετά την 25η εβδοµάδα της κύησης έχουν αυξηµένο κίνδυνο για ανάπτυξη προεκλαµψίας και βραδύτητα της ενδοµήτριας ανάπτυξης. Σήµερα, µελετάται µία πληθώρα παραγόντων (PAPP-Α, PP13, VEGF, PLGF, sflt-1, seng, ADMA) και ο ρόλος τους στην παθοφυσιολογία της προεκλαµψίας και ειδικότερα στην δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, κάτι το οποίο όπως αναφέρθηκε παίζει πρωταρχικό ρόλο στην εµφάνιση των κλινικών συµπτωµάτων και των επιπλοκών της νόσου. 34

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 3.1 Εισαγωγικά στοιχεία Η αγγειογένεση είναι µία πολύπλοκη διαδικασία µε πολλά στάδια και αφορά τόσο το ενδοθήλιο όσο και την εξωκυττάρια ουσία. Ο όρος αγγειογένεση αναφέρεται στο σχηµατισµό νέων αγγείων από τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων και σε ορισµένες περιπτώσεις από αρχέγονα ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από τον µυελό των οστών. Η διαδικασία της αγγειογένεσης συντελείτε καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης και της ενήλικης ζωής. Ο σχηµατισµός νέων αγγείων καθώς και η διατήρηση της φυσιολογικής δοµής και λειτουργίας τους συνεισφέρει σηµαντικά στην τέλεση των φυσιολογικών και παθολογικών βιολογικών διαδικασιών των οργάνων του ανθρώπινου οργανισµού. Η φυσιολογική αγγειογένεση είναι απαραίτητη στην ανάπτυξη του εµβρύου κατά την οποία αγγειοβλάστες δηµιουργούν ένα πρωτογενές δίκτυο τριχοειδικών αγγείων. Η διαδικασία αυτή ονοµάζεται αγγειακή διαφοροποίηση (vasculogenesis) [42,43]. Η διαδικασία της αγγειογένεσης ελέγχεται από τον VEGF. Φυσιολογικές βιολογικές λειτουργίες του οργανισµού µας όπως η ωοθηλακιορηξία, η δηµιουργία του πλακούντα και η επούλωση των τραυµάτων βασίζονται στην ολοκληρωµένη και σωστή διαδικασία της αγγειογένεσης [42,44,45]. Διαταραχή στην ανάπτυξη και φυσιολογική λειτουργία των αγγείων συµβάλει στην παθογένεια διαφόρων νοσηµάτων. Αυξηµένη αγγειογένεση µπορεί να οδηγήσει σε τύφλωση, αρθρίτιδα, ψωρίαση, ενώ είναι κύριο 35

χαρακτηριστικό συµπαγών όγκων, κακοηθειών του αίµατος και χρόνιων φλεγµονών. Ανεπαρκής αγγειογένεση µπορεί να οδηγήσει σε ισχαιµία οργάνων όπως η καρδιά και ο εγκέφαλος, σε υπέρταση, προεκλαµψία, αναπνευστική δυσχέρεια και άλλες διαταραχές [46,47]. Υπό φυσιολογικές συνθήκες υπάρχει ισορροπία µεταξύ παραγόντων που προάγουν την αγγειογένεση και ονοµάζονται προ-αγγειογενετικοί και των αναστολέων τους αντι-αγγειογενετικών παραγόντων, καθώς και µεταξύ αυτών και της εξωκυττάριας ουσίας µε την οποία έχουν άµεση αλληλεπίδραση. Διαταραχή της αγγειογένεσης υπέρ των αντιαγγειογενετικών παραγόντων οδηγεί σε δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και των κυττάρων του. Η προεκλαµψία είναι µια πάθηση η οποία ξεκινάει από τον πλακούντα. Το όργανο στόχος τελικά όµως είναι το αγγειακό ενδοθήλιο της συστηµατικής κυκλοφορίας της µητέρας κατά την δεύτερη ή µητρική φάση της πάθησης. Η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από έντονη αγγειοσύσπαση των µητρικών αγγείων, αυξηµένη ευαισθησία και δεκτικότητα των αγγείων σε αγγειοσυσπαστικά ερεθίσµατα καθώς και από αποτυχία της δράσης αγγειοδιασταλτικών µηχανισµών και παραγόντων. Οι πρώτες ενδείξεις ενδοθηλιακής βλάβης στην προεκλαµψία προήλθαν από τις µετρήσεις στον ορό γυναικών παραγόντων ενδεικτικών της ενεργοποίησης του ενδοθηλίου όπως ο παράγοντας von Willebrand, η φιµπρονεκτίνη, η θροµβοµοντουλίνη και η ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ-1) [48-52]. Οι κυριότεροι προ-αγγειογενετικοί παράγοντες περιλαµβάνουν τον ενδοθηλιακό αγγειακό αυξητικό παράγοντα (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF), τον βασικό ινοβλαστικό αυξητικό παράγοντα (Fibroblastic Growth Factor-2 - FGF-2), την ιντερλευκίνη-8 (Interleukin-8 - IL-8), τον πλακουντικό αυξητικό παράγοντα (Placenta Growth Factor - PLGF), τον αυξητικό παράγοντα µετασχηµατισµού Β (Transforming Growth Factor-B - TGF-B) και τις αγγειοποιητίνες 1 και 2 (Ang-1, Ang-2). Κάποιοι από αυτούς 36

δρουν και ως ρυθµιστές της έκφρασης του VEGF, ενώ κάποιοι δευτερογενώς συµβάλλουν στη δηµιουργία καθώς και διαφοροποίηση των αγγείων. Αντίθετα οι αναστολείς της αγγειογένεσης περιλαµβάνουν προϊόντα διαχωρισµού πρωτεϊνών υψηλού µοριακού βάρους, που δεν είναι από µόνοι τους ικανοί να αναστείλουν την αγγειογένεση, όπως για παράδειγµα η αγγειοστατίνη, η διαλυτή µορφή της ενδογλίνης (soluble Endoglin - seng) και η διαλυτή µορφή τυροσινικής κινάσης (soluble fmslike tyrosine kinase-1 - sflt-1). 3.2 VEGF Η οικογένεια των VEGFs περιλαµβάνει έξι διαφορετικές ενώσεις πού αποτελούν πολυδύναµες κυτοκίνες : VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF- D, VEGF-E και PLGF µε κύρια δράση εστιασµένη στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιµοφόρων αγγείων και των λεµφαγγείων [53-56]. Ο VEGF ανακαλύφθηκε το 1971 από την οµάδα του Folkman ως πρωτεΐνη που παράγεται από όγκους µε ισχυρή µιτογόνο δράση [57]. Το 1983 ο Harrold Dvorak και o Donald Senger αναγνώρισαν µια πρωτεΐνη µε ικανότητα να αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα των αγγείων και η οποία ονοµάστηκε Vascular Permeability Factor (VPF) [58]. To 1989 o Napoleone Ferrara χαρακτήρισε την πρωτεΐνη µε ιδιότητες να αυξάνει τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) [59]. Σε µελέτες που ακολούθησαν αποδείχτηκε ότι ο VEGF και ο VPF είναι η ίδια πρωτεΐνη [60]. Ο VEGF είναι ένας από τους βασικούς ρυθµιστές της αγγειογένεσης και της αγγειακής διαπερατότητας. Το πλέον µελετηµένο µέλος της οικογένειας των VEGFs είναι ο VEGF-A. 37

3.2.1 VEGF-A Αποτελεί µία διµερή γλυκοπρωτεΐνη µοριακού βάρους 34-45kDa µε ισχυρή µιτογόνο δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αποτελείται από δύο πεπτιδικές αλυσίδες που ενώνονται µεταξύ τους µε δισουλφιδικό δεσµό και έχει συγγένεια µε την ηπαρίνη. Το υπεύθυνο γονίδιο για την σύνθεσή του βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος 6 (6p21.3). Αποτελείται από οκτώ εξόνια τα οποία ενώνονται από επτά ιντρόνια. Ο VEGF-A έχει 6 ισοµορφές: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 183, VEGF 189 και VEGF 206 [56,61] (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Οι 6 ισοµορφές του VEGF (Wikipedia) Οι αριθµοί αναφέρονται στον αριθµό των αµινοξέων της κάθε ισοµορφής. Η επικρατέστερη µορφή του VEGF-A είναι η VEGF 165. Παράγεται από 38

διάφορα φυσιολογικά ή νεοπλασµατικά κύτταρα και έχει την µορφή οµοδιµερούς (homodimer) µε ικανότητα να δεσµεύει την ηπαρίνη και µοριακό βάρος 45 kda [62]. Οι ισοµορφές -189 και -121 εµφανίζονται σε µια πλειάδα κυττάρων ενώ η -206 είναι σπάνια µορφή που συναντάται µόνο στο ανθρώπινο ηπατικό κύτταρο. Οι ισοµορφές αυτές προκύπτουν από εναλλακτικό µάτισµα του VEGF mrnaκαι έχουν διαφορετικές λειτουργίες στην διαδικασία της αγγειογένεσης [63]. 3.2.2 Ρύθµιση της παραγωγής του VEGF Η έκφραση του γονιδίου του VEGF υπόκειται σε ρύθµιση από παράγοντες όπως η υποξία, διάφοροι αυξητικοί παράγοντες, κυτταροκίνες, ορµόνες, το µονοξείδιο του αζώτου, ογκογονίδια και ογκο-κατασταλτικα γονίδια. [64-69]. Η χαµηλή µερική πίεση του οξυγόνου επάγει την παραγωγή του VEGF µέσω αύξησης της µεταγραφής του καθώς και µέσω σταθεροποίησης του mrna του το οποίο παρουσιάζει αστάθεια σε συνθήκες φυσιολογικής µερικής πίεσης του οξυγόνου. Η µεταγραφή του VEGF mrna σε καταστάσεις υποξίας επιτελείται µέσω του επαγόµενου από τη υποξία παράγοντα HIF-1 και HIF-2 (Hypoxia Inducible Factor). Ο HIF-1 έχει την ικανότητα να συνδέεται µε συγκεκριµένα στοιχεία ανταποκρινόµενα στην υποξία (Ηypoxia response elements-hre) στο γονίδιο του VEGF ενεργοποιώντας µε αυτόν τον τρόπο τη διαδικασία της µεταγραφής. Η αύξηση της συγκέντρωσης του VEGF σε ιστούς µε χαµηλή µερική πίεση του οξυγόνου προκαλεί αύξηση της αγγειογένεσης µε σκοπό την παροχή θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου στα υποξαιµικά κύτταρα [64]. Οι κυριότεροι αυξητικοί παράγοντες που διεγείρουν την παραγωγή του VEGF είναι οι TGF-α TGF-β, EGF, IGF-1, FGF, PDGF [70-72]. 39

Κυτταροκίνες όπως η IL-1 και η IL-6, ορµόνες όπως τα ανδρογόνα, τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη, ογκογονίδια (Ras, Bcl-2, Src, HER2/neu, Bcr/Abl) καθώς και απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων εµπλέκονται στη ρύθµιση της έκφρασης του VEGF [72-75]. 3.2.3 Δράση του VEGF O VEGF αποτελεί τον κύριο ρυθµιστή της δηµιουργίας των αγγείων σε φυσιολογικές καταστάσεις και της νέο-αγγειογένεσης σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις [76,77]. Παράγεται από διάφορα είδη κυττάρων και δρα επί των κυττάρων του ενδοθηλίου. Οι κυριότερες βιολογικές δράσεις του είναι: α). Ενεργοποίηση του πολλαπλασιασµού των ενδοθηλιακών κυττάρων (ΕΚ) και αύξηση της µετανάστευσής τους [63], β). Αύξηση της µικροαγγειακής διαπερατότητας για το πλάσµα και τις πρωτεΐνες του πλάσµατος (vascular permeability factor). Η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας που προκαλεί ο VEGF είναι 50.000 φορές ισχυρότερη από αυτήν που προκαλείται από την ισταµίνη. Επίσης είναι πιθανό η αύξηση αυτή της διαπερατότητας να αποτελεί το πρώτο σηµαντικό βήµα στη διαδικασία της αγγειογένεσης. Κατά τη διαδικασία αυτή η εξαγγείωση πρωτεϊνών του πλάσµατος όπως ινωδογόνο, πλασµινογόνο και παράγοντες της πήξεως δηµιουργούν ένα προσωρινό περιβάλλον στήριξης για τα ενεργοποιηµένα ενδοθηλιακά κύτταρα που αρχίζουν να µεταναστεύουν [78-80]. γ). Προστασία των ενδοθηλιακών κυττάρων και αναστολή της γήρανσής και της απόπτωσής τους [81,82]. δ). Αγγειοδιαστολή και µείωση της αρτηριακής πίεσης µέσω της παραγωγής µονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) από τα ενδοθηλιακά κύτταρα [83,84]. 40

ε). Υπό φυσιολογικές συνθήκες ο VEGF συµµετέχει στις κυκλικές µεταβολές του γυναικείου γενετικού συστήµατος όπως στην ανάπτυξη των ωοθυλακίων, στη δηµιουργία και διάσωση του ωχρού σωµατίου καθώς και στις κυκλικές µεταβολές του ενδοµητρίου [85]. στ). Αύξηση της έκφρασης των µορίων προσκόλλησης VCAM-1 και ICAM-1 στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποίηση ενζύµων που συµµετέχουν στην αποδήµηση της εξωκυττάριας ουσίας. ζ). Μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η µεγάλη σηµασία του VEGF ως ρυθµιστικού παράγοντα της αγγειογένεσης στην εµβρυική ζωή φαίνεται από µελέτες σε πειραµατόζωα που έδειξαν ότι όταν αυτά στερούνται του VEGF (VEGF-A -/-), πεθαίνουν σε εµβρυική ηλικία και οι ετεροζυγώτες ( VEGF-A +/ - ), παρουσιάζουν γενετικές ανωµαλίες και ελαττωµατική αγγειογένεση σε πολλά όργανα [86,87]. Ο VEGF παίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του αγγειακού δικτύου διαφόρων οργάνων µετά τη γέννηση και απενεργοποίησή του οδήγησε σύµφωνα µε µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν από διαφορετικές οµάδες ερευνητών, σε διαταραχή της ανάπτυξης και λειτουργίας καθώς και σε ισχαιµία πολλαπλών οργάνων [87-91]. Ο VEGF εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς µε σποραδική έκφραση (εγκέφαλος, όρχεις, αµφιβληστροειδής), µε µέτρια έκφραση (καρδιά, σκελετικοί µύες) και υψηλή έκφραση (σπείραµα, πάγκρεας, ήπαρ, νεφροί). Ορισµένοι ιστοί είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι στην αναστολή της δράσης του VEGF. Έτσι η αναστολή αυτή στους νεφρούς οδηγεί σε ενδοθηλίωση του σπειράµατος πρωτεϊνουρία και υπέρταση ενώ η εξωγενής χορήγηση επιταχύνει την αποκατάσταση νεφρικών βλαβών σε ποντίκια µε σπειραµατονεφρίτιδα [90]. Αναστολή της δράσης του VEGF οδηγεί σε µορφολογικές και λειτουργικές επιδράσεις στα κύτταρα του αυλού των αγγείων καθώς παίζει σηµαντικό ρόλο στην διατήρηση της οµοιόστασης του φυσιολογικού αγγειακού δικτύου. O Dvorak σε 41

ανασκόπηση της βιβλιογραφίας (2005) αναγνωρίζει τον VEGF-A ως σηµαντικό παράγοντα στη φυσιολογική και στην παθολογική αγγειογένεση η οποία χαρακτηρίζει τους κακοήθεις όγκους, τη διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια, τα νοσήµατα του συνδετικού ιστού, το έµφραγµα του µυοκαρδίου, το αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο και άλλα νοσήµατα [92]. Σε ανάλογα συµπεράσµατα κατέληξαν και άλλοι συγγραφείς [93-95]. 3.2.4 VEGFRs Η δράση του VEGF επιτελείται µέσω της σύνδεσής του µε τους υποδοχείς του. Η οικογένεια των VEGFRs ανήκει στην κατηγορία V των υποδοχέων µε ιδιότητες τυροσινικής κινάσης (RTKs). Αυτοί είναι δια-µεµβρανικοί υποδοχείς µε δράση τυροσινικής κινασης και είναι οι VEGFR-1 (flt-1), VEGFR-2 (flk-1, KDR) και VEGFR-3 (flt-4). Οι VEGFR-1 και VEGFR-2 εκφράζονται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιµοφόρων αγγείων, ενώ ο VEGFR-3 εκφράζεται στα λεµφαγγεία [96,97]. Ο VEGF-A έχει υψηλή συγγένεια σύνδεσης µε τους VEGFR-1 και VEGFR-2, o PLGF και ο VEGF-B µε τον VEGFR-1 και οι VEGF-C και VEGF-D µε τους VEGFR- 2 και VEGFR-3 (Εικόνα 5). Επιπλέον πολλοί συν-υποδοχείς έχουν αναγνωρισθεί, όπως οι νευροπιλίνες (neurophilins) NP-1 και ΝΡ-2 και διάφορες πρωτεογλυκάνες, οι οποίοι παίζουν ρόλο στη µετάδοση του σήµατος µέσω των υποδοχέων VEGFR [98-100]. 42

Εικόνα 5. Οι υποδοχείς VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 (Wikipedia) Ο VEGFR-1( flt-1) συνδέεται µε τους VEGF-A, VEGF-B και PLGF και εκφράζεται εκτός των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων και στα µονοκύτταρα, µακροφάγα και διάφορα άλλα µη ενδοθηλιακά κύτταρα [101]. Ο VEGFR-2 (flk-1) είναι ο κυριότερος και περισσότερο µελετηµένος υποδοχέας και εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα και σε προγονικά κύτταρα του αιµοποιητικού ιστού. Ο VEGFR-3 ρυθµίζει την λεµφαγγειογένεση και η έκφραση του περιορίζεται στα λεµφικά ενδοθηλιακά κύτταρα. [102-103]. Ο VEGFR-1 (flt-1) αποτελείται από 1338 αµινοξέα τα οποία διαχωρίζονται σε 3 τµήµατα: ένα εξωκύτταριο, ένα δια-µεµβρανικό και ένα ενδοκυττάριο τµήµα. Το εξωκυττάριο τµήµα αποτελείται από 7 περιοχές που µοιάζουν µε ανοσοσφαιρίνες και αποτελεί την περιοχή σύνδεσης µε τον παράγοντα (VEGF). Το ενδοκυτταρικό τµήµα περιλαµβάνει την περιοχή µε δράση τυροσινικής κινάσης η οποία ακολουθείται από το καρβοξυτελικό τµήµα του 43

µορίου. Οι υποδοχείς VEGFR-2 και VEGFR-3 παρουσιάζουν 80% οµοιότητα µε τον VEGFR-1 ως προς την περιοχή της κινάσης της τυροσίνης [104]. Οι υποδοχείς VEGFRs υπόκεινται σε εναλλακτική συρραφή (alternative splicing) για να αναπαράγουν περισσότερες της µιας µορφές υποδοχέα [105-107]. Η ελλιπής µορφή του VEGFR-1 - διαλυτός υποδοχέας sflt-1 στερείται την ενδοκυττάρια σηµατοδοτική περιοχή της κινάσης και αποτελεί πιθανό αιτιολογικό παράγοντα της προεκλαµψίας. Η διαλυτή µορφή του VEGFR-2 είναι επίσης αποτέλεσµα εναλλακτικής συρραφής η πρωτεολυτικής διαδικασίας [106] (Εικόνα 6). Εικόνα 6. Σχηµατική αναπαράσταση των υποδοχέων VEGFRs και της διαλυτής µορφής του VEGFR-1 (Cebe-Suarez et al. 2006) Η περιοχή σύνδεσης υποδοχέα-παράγοντα στο εξωκυττάριο τµήµα βρίσκεται µεταξύ της 2 ης και 3 ης περιοχής που µοιάζει µε ανοσοσφαιρίνη (Iglike) στον VEGFR-2 ενώ η περιοχή 2 του VEGFR-2 είναι απαραίτητη για 44

την σύνδεση µε τον VEGF [108-111]. Οι γειτονικές περιοχές έχουν επικουρική δράση και τροποποιούν την αλληλεπίδραση µεταξύ υποδοχέαπαράγοντα [112]. Μετά τη σύνδεση του υποδοχέα µε τον VEGF ακολουθεί διµερισµός του υποδοχέα [113]. Στον VEGFR-2 µελέτες µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο έδειξαν ότι η (Ig-like ) περιοχή 7 ακριβώς δίπλα στην κυτταρική µεµβράνη εµπλέκεται σε οµότυπες αλληλεπιδράσεις του υποδοχέα µε αποτέλεσµα την σταθεροποίηση του διµερούς υποδοχέαπαράγοντα [114]. Η εξωκυττάρια αυτή περιοχή του υποδοχέα έχει τριπλό ρόλο: αποτελεί το σηµείο σύνδεσης µεταξύ υποδοχέα-παράγοντα, συµβάλει στον διµερισµό του υποδοχέα µετά την σύνδεση και διατηρεί τον υποδοχέα σε µορφή µονοµερούς επί της απουσίας του παράγοντα. Η σύνδεση του υποδοχέα µε τον VEGF και η διατήρηση σταθερής της δοµής του συµπλέγµατος αυτού οδηγεί σε δοµικές αλλαγές του κυτταροπλασµατικού τµήµατος του υποδοχέα µε δραστικότητα κινάσης τυροσίνης. Οι δοµικές αυτές αλλαγές ενεργοποιούν έναν καταρράκτη γεγονότων που οδηγούν στην διαδοχική φωσφορυλίωση ενδοκυττάριων τµηµάτων του σε διάφορες θέσεις τυροσίνης και κυρίως στην τυροσίνη 1175 (Υ1175) [115]. Οι φωσφοριλιωµένες τυροσίνες δηµιουργούν σηµεία σύνδεσης (docking sites) για διάφορες ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, όπως η ΡLC-γ (Phospholipaseγ), µε αποτέλεσµα την κατάλυση µιας σειράς ενδοκυττάριων αντιδράσεων που έχουν ως τελικό αποτέλεσµα τον πολλαπλασιασµό, την µετανάστευση και επιβίωση των κυττάρων και την αύξηση της διαπερατότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων [116] (Εικόνα 7). Ανάµεσα σε αυτές είναι η πρωτεϊνική κινάση σερίνης/θρεονίνης (ΑΚΤ), η οποία ρυθµίζει τη µετανάστευση και την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και τον σχηµατισµό τριχοειδών [117-118]. Μια ακόµα πρωτεΐνη που ενεργοποιείται από τον παραπάνω µηχανισµό είναι η κινάση σερίνης/θρεονίνης mtor που ρυθµίζει την αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Οι κυτταρικές λειτουργίες που ρυθµίζονται από τον 45

VEGFR-2 πραγµατοποιούνται µέσω της ενεργοποίησης 3 σηµατοδοτικών οδών όπως: της φωσφατιδυλινοσιτόλης (PI3K) και της άλφασερίνης/θρεονίνης, της ενεργοποιηµένης από µιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΑΡΚ) και τέλος της φωσφολιπάσης-γ (PLC-γ) και της πρωτεϊνικής κινάσης - C (PKC) [115,117]. Εικόνα 7. Σχηµατική αναπαράσταση του µηχανισµού σηµατοδότησης του VEGFR-2 (Sci STKE 2001) Οι ενδοκυττάριες αυτές λειτουργίες προάγουν τη δηµιουργία νέων αγγείων και την διατήρηση τους. Η ενεργοποίηση του VIGOR-1 φαίνεται ότι διεγείρει την κινητικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων χωρίς να παίζει ιδιαίτερο ρόλο στον πολλαπλασιασµό τους. Ενεργοποίηση του VIGOR-1 46

από τον PLGF έχει ως αποτέλεσµα την φωσφορυλίωση του VEGFR-2, πιθανόν µέσω εκτοπισµού, του συνδεδεµένου µε τον VEGFR-1 VEFGΑ κάνοντάς τον µε αυτόν τον τρόπο διαθέσιµο για σύνδεση µε τον VEGFR-2. 3.3 PlGF O PLGF αρχικά αναγνωρίστηκε στον πλακουντικό ιστό από την Persico το 1991 δύο χρόνια µετά από την ανακάλυψη του VEGF-A [119,120]. Ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια των VEGFs και σύµφωνα µε τα µέχρι τώρα δεδοµένα δρα ενισχύοντας και συµπληρώνοντας τη δράση του VEGF. Το γονίδιο που κωδικοποιεί τον PlGF στον άνθρωπο βρίσκεται στο χρωµόσωµα 14q24-q31. Ανήκει σε µια υπερ-οικογένεια αυξητικών παραγόντων µε κοινό χαρακτηριστικό 8 µόρια κυστείνης τα οποία παίζουν ρόλο στη δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών σηµαντικών για την δηµιουργία διµερών µορφών. Μελέτη της τρισδιάστατης δοµής του PlGF έδειξε ότι έχει σηµαντική οµοιότητα µε τον VEGF-A, αν και οι δυο πρωτεΐνες έχουν κατά 42% µόνο κοινή αλληλουχία αµινοξέων στο µόριό τους. Ιδιαίτερα τα αµινοξέα που βρίσκονται στα σηµεία σύνδεσης µε τον υποδοχέα τους διαφέρουν κατά το ήµισυ κάτι το οποίο πιθανότατα αποτελεί και την εξήγηση για τις διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες των δύο πρωτεϊνών. Αν και αρχικά αποµονώθηκε σε πλακουντικό ιστό αργότερα ανιχνεύθηκε και σε άλλους ιστούς όπως στην καρδιά, τους πνεύµονες, τον θυρεοειδή αδένα και τους σκελετικούς µύες [121,122]. Πολλές κυτταρικές σειρές έχουν την ικανότητα να παράγουν PlGF. Τα ανενεργά ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν µικρές ποσότητες αλλά όταν αυτά ενεργοποιηθούν η παραγωγή του PlGF αυξάνεται µε αποτέλεσµα τη ρύθµιση, µέσω του VEGF-A, της αγγειογένεσης. Επίσης, άλλες κυτταρικές σειρές όπως τα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων, φλεγµονώδη κύτταρα, κύτταρα του µυελού των οστών, νευρώνες και καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να παράγουν 47

PlGF όταν είναι ενεργοποιηµένα. Μετά από εναλλακτικό µάτισµα του ανθρώπινου PlGF προκύπτουν 3 ισοµορφές οι οποίες διαφέρουν µεταξύ τους στο µέγεθος και στην ικανότητα σύνδεσής τους: o PlGF-1 (PlGF 131 ), o PlGF-2 (PlGF 152 ) που λόγω µίας αλληλουχίας 21 αµινοξέων στο καρβοξυτελικό του τµήµα έχει την ικανότητα να συνδέεται µε ουσίες όπως η ηπαρίνη και µε τους συν-υποδοχείς neuropillin-1 kai neuropillin-2, και η µακρύτερη ισοµορφή PlGF-3 (PlGF 203 ) που όπως και στην περίπτωση του PlGF-1 λείπει η αλληλουχία των αµινοξέων η οποία προσδίδει την ικανότητα σύνδεσης µε την ηπαρίνη [123-125]. Μία ακόµη ισοµορφή βρέθηκε από τους Yang και συν., PlGF-4 µε όµοια αλληλουχία αµινοξέων µε τον PlGF-3 και µίας επιπρόσθετης περιοχής σύνδεσης µε την ηπαρίνη. Εκφράζεται στα φυσιολογικά ανθρώπινα τροφοβλαστικά κύτταρα και στα ενδοθηλιακά κύτταρα της οµφαλικής φλέβας. Συνδέεται µε τον υποδοχέα flt-1 (VEGFR-1) όχι όµως µε τον υποδοχέα flk-1 (VEGFR-2) [126]. Οι Carmeliet και συν., δηµιούργησαν πειραµατόζωα ( knock-out ) τα οποία δεν είχαν την ικανότητα να παράγουν PlGF. Αν και αυτά ήταν βιώσιµα και διατηρούσαν την ικανότητα να αναπαράγονται είχαν σοβαρές βλάβες που αφορούσαν την διαδικασία της αγγειογένεσης κατά την διαδικασία της φλεγµονής, της ισχαιµίας, του τραυµατισµού, καθώς και εξαγγείωση πλάσµατος και οιδήµατα. Η µελέτη αυτή έδειξε την σηµαντική σχέση συνεργασίας µεταξύ VEGF και PlGF στην διαδικασία της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης [88]. Το γονίδιο που κωδικοποιεί τον PlGF στον άνθρωπο βρίσκεται στο χρωµόσωµα 14q24-q31. Η δράση του ως ενεργοποιητής της αγγειογένεσης πραγµατοποιείται µέσω του ανταγωνισµού του µε τον VEGF-A για σύνδεση µε τον VEGFR-1. Με αυτόν τον τρόπο µεγαλύτερη ποσότητα VEGF-A παραµένει διαθέσιµη για σύνδεση µε τον VEGFR-2 ο οποίος παρουσιάζει µεγαλύτερα ποσοστά φωσφορυλίωσης σε σχέση µε τον VEGFR-1 και εποµένως µεταδίδει ισχυρότερο αγγειογενετικό σήµα [127]. 48

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΤΙ-ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 4.1 sflt-1 Ο sflt-1 είναι ένας παράγοντας που προκύπτει από εναλλακτικό µάτισµα του υποδοχέα VEGFR-1, ο οποίος στερείται το διαµεµβρανικό και κυτταροπλασµατικό τµήµα και δρά ως ισχυρός ανταγωνιστής του VEGF και του PlGF. Παράγεται από αρκετούς ιστούς και από τον πλακούντα. Οι Maynard και συν., έδειξαν ότι περίσσεια sflt-1 είναι ικανή να προκαλέσει βλάβη στο ενδοθήλιο και λευκωµατουρία σε επίπεδα νεφροσικού συνδρόµου ανταγωνίζοντας τη δράση των VEGF και PlGF [128] (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Flt1 και sflt1. H Flt1 αποτελείται από ένα εξωκυττάριο τµήµα απαραίτητο για την σύνδεσή µε τον VEGF και PLGF που αποτελείται απο 7 περιοχές που µοιάζουν µε ανοσοσφαιρίνες. Η sflt1 χαρακτηρίζεται από µια περιοχή 31 αµινοξέων που προκύπτει από εναλλακτικό µάτισµα και στερείται του διαµεµβρανικού και κυτταροπλασµατικού τµήµατος (J Am Soc Nephrol 2004) 49

4.2 Ενδογλίνη Η Ενδογλίνη (CD105) είναι µια οµοδιµερής γλυκοπρωτεϊνη 658 αµινοξέων 180kDa, διαµεµβρανικός επικουρικός υποδοχέας για τον αυξητικό παράγοντα µετασχηµατισµού (transforming growth factor-β ΤGF-β) [129,130]. Αποτελείται από ένα ενδοκυτταρικό τµήµα 561 αµινοξέων, ένα υδρόφοβο διαµεµβρανικό και ένα κυτταροπλασµατικό. Εκφράζεται κυρίως στα κύτταρα του ενδοθηλίου, στα κύτταρα της συγκυτιοτροφοβλάστης του πλακούντα, σε στρωµατικά κύτταρα και σε κάποια αιµοποιητικά κύτταρα [131]. Η ενδογλίνη, όπως και άλλοι παράγοντες στο σύστηµα σηµατοδότησης του ΤGF-b, είναι απαραίτητη για την αγγειογένεση και τη σωστή λειτουργία του ενδοθηλίου [132]. Η υπερ-οικογένεια του ΤGF-β περιλαµβάνει πλειοτροπικές κυτοκίνες που δρούνε ως ρυθµιστές της κυτταρικής ανάπτυξης. Μέλη της οικογένειας του ΤGF-β παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ωρίµανση των αγγείων µε το να ενεργοποιούν την διαφοροποίηση των µεσεγχυµατικών κυττάρων προς λεία µυϊκά κύτταρα ή περικύτταρα και την εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας, ενώ ταυτόχρονα αναστέλλουν τον πολλαπλασιασµό και την µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Ο ΤGF-β είναι ένας πολυδύναµος παράγοντας ανάπτυξης ο οποίος δρα στους περισσότερους ιστούς και επηρεάζει τους περισσότερους τύπους κυττάρων. Η σηµατοδότηση πραγµατοποιείται µέσω διµερών τύπου Ι και τύπου ΙΙ υποδοχέων µε ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης και µιας οικογένειας διαµεσολαβητών τις πρωτεΐνες Smad (Sons-ofmothers-against-decapentaplegic) µε τελικό αποτέλεσµα τη ρύθµιση της αγγειογένεσης και της φυσιολογικής µετατροπής και λειτουργίας σχεδόν όλων των αγγειακών κυττάρων [133,134]. Επίσης υποδοχείς τύπου ΙΙΙ είναι βοηθητικοί υποδοχείς µε µικρή ενδοκυτταρική περιοχή και διαδραµατίζουν έµµεσο ρόλο στη µεταγωγή του σήµατος [130]. Σε αυτούς ανήκει η 50

ενδογλίνη και η Β-γλυκάνη. Οι υποδοχείς αυτοί ρυθµίζουν την πρόσβαση του ΤGF-β στους υποδοχείς που είναι υπεύθυνοι για την µετάδοση του σήµατος και την πρόσδεση του στο σύµπλοκο TBR-I/TBR-II. Ο ΤGF-b όµως έχει διπλή δράση στα κύτταρα του ενδοθηλίου: µπορεί να ενεργοποιήσει αλλά και να απαγορεύσει τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Πειραµατικά µικρές ποσότητες ΤGF-b ενεργοποιούν, ενώ µεγάλες αποτρέπουν τον πολλαπλασιασµό. Σηµαντική είναι επίσης η ενεργοποίηση της συνθετάσης του µονοξειδίου του αζώτου (enos) µέσω της ενδογλίνης και του ΤGF-b που είναι υπεύθυνη για την ρύθµιση του αγγειακού τόνου των αγγείων. Μελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι η απενεργοποίηση γονιδίων του ΤGF-b και σηµαντικών για τη µεταγωγή του σήµατός του παραγόντων όπως η ενδογλίνη, οδηγεί στη θνησιµότητα των εµβρύων σαν αποτέλεσµα πολλαπλών ανωµαλιών που παρατηρούνται στη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και των κυττάρων του αιµοποιητικού ιστού. Μεταλλάξεις στο γονίδιο της ενδογλίνης οδηγεί στη δηµιουργία πολλαπλών αρτηριο-φλεβικών δυσπλασιών και καταστροφή των αγγείων όπως συµβαίνει στην κληρονοµική αιµορραγική τηλεαγγειεκτασία. Μελέτες σε πλακούντες γυναικών µε προεκλαµψία έδειξαν υπερέκφραση της διαλυτής µορφής της ενδογλίνης (seng) [135]. Αυτή η µορφή πιθανόν παράγεται µέσω πρωτεολυτικής διαδικασίας του µορίου της ενδογλίνης και όχι µέσω εναλλακτικού µατισµού όπως η διαλυτή µορφή του VEGFR [136]. Είναι λοιπόν ένα παράγωγο µετά από διάσπαση του µήκους του µορίου της διαµεµβρανικής ενδογλίνης και χαρακτηρίζεται ως ισχυρός αντιαγγειογενετικός παράγοντας. Οι αντι-αγγειογενετικές της ιδιότητες πιθανόν πηγάζουν από το γεγονός ότι έχει την ικανότητα να δεσµεύει στην κυκλοφορία τον ΤGF-b εµποδίζοντας έτσι την σύνδεση του µε τους υποδοχείς του στην κυτταρική µεµβράνη εµποδίζοντας έτσι τις αγγειογενετικές και αγγειοδιασταλτικές του ικανότητες [137]. Πειράµατα µε ανασυνδιασµένη (recombinant) seng προκάλεσαν σε κυοφορούντα ποντίκια 51

κλινικά χαρακτηριστικά όµοια µε εκείνα της προεκλαµψίας στους ανθρώπους. Μελέτες in vitro έδειξαν επίσης ότι η seng µπλοκάρει την ενεργοποίηση της συνθετάσης του µονοξειδίου του αζώτου µέσω του TGF-b σε ενδοθηλιακά κύτταρα [138] (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Σχηµατική αναπαράσταση της συµµετοχής της ενδογλίνης στην ενεργοποίηση του TBR-I και στην ρύθµιση της µετάδοσης του σήµατος του TGF- β Η ικανότητα προσδιορισµού αυξηµένων επιπέδων των παραπάνω αντίαγγειογενετικών παραγόντων καθώς και η µείωση των επιπέδων των αγγειογενετικών παραγόντων λόγω απενεργοποίησης τους στη συστηµατική κυκλοφορία σε ασθενείς µε εγκατεστηµένη προεκλαµψία, αποτελεί σηµαντικό βήµα στην διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Η 52