ΕΝΖΥΜΑ. Γενικά περί ενζύµων

ΕΝΖΥΜΑ Γενικά περί ενζύµων 1

Ιδιότητες των ενζύµων n Tα ένζυµα είναι κυρίως πρωτείνες αλλά υπάρχουν και ριβονουκλεινικά οξέα µε ενζυµική δράση που ονοµάζονται ριβοένζυµα. n Τα ένζυµα είναι βιοκαταλύτες και δεν συµµετέχουν στα προιόντα της αντίδρασης που καταλύουν. n Τα ένζυµα καταλύουν µια βιοχηµική αντίδραση µε µεγάλη ειδικότητα υποστρώµατος και ταχύτητα. 2

Βασικοί όροι της ενζυµολογίας Ένζυµο Ε (enzyme) Υπόστρωµα S (substrate) Προιόν P (product) 3

Ενέργεια ενεργοποίησης σε µια χηµική αντίδραση n Σε ένα διάλυµα µόνο ένα µικρό ποσοστό µορίων έχει την απαιτούµενη ενέργεια να συµµετάσχει σε µια χηµική αντίδραση που δεν καταλύεται. n Για να λάβει χώρα µια χηµική αντίδραση πρέπει τα αντιδρώντα να υπερσκελίσουν το ενεργειακό φράγµα της ενέργειας ενεργοποίησης 4

Τα ένζυµα µειώνουν την ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης µιας αντίδρασης n Η βασική ιδιότητα των ενζύµων είναι να µειώνουν την ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης σε µια χηµική αντίδραση χωρίς όµως να µεταβάλλουν τις άλλες παραµέτρους της αντίδρασης. n Αυτό το επιτυγχάνουν µε την δηµιουργία ενός ή περισσοτέρων µεταβατικών σταδίων 5

Τα ένζυµα µειώνουν την ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης µιας αντίδρασης αλλά.....δεν επηρεάζουν τις θερµοδυναµικές παραµέτρους και την ισορροπία µιας ενζυµικής αντίδρασης και δεν µεταβάλλουν το ΔG της. 6

Οι ενζυµικές αντιδράσεις λαµβάνουν χώρα µε µια ή περισσότερες ενδιάµεσες καταστάσεις ή µεταβατικά στάδια Το µεταβατικό στάδιο µιας ενζυµικής αντίδρασης µπορεί να είναι ένα ή και περισσότερα ανάλογα µε τη φύση του ενζύµου, του υποστρώµατος και του µηχανισµού της ενζυµικής αντίδρασης 7

Οι ενζυµικές αντιδράσεις λαµβάνουν χώρα µε µια ή περισσότερες ενδιάµεσες καταστάσεις ή µεταβατικά στάδια 8

Ανθρακας<->Διαµάντι µια πολύ αργή αντίδραση µε χαµηλό ΔG 9

Γενικές ιδιότητες των ενζύµων n Τα ένζυµα επιτυγχάνουν την διεξαγωγή µιας ενζυµικής αντίδρασης κάτω από πολύ πιο ήπιες συνθήκες σε σύγκριση µε τις αντίστοιχες της οργανικής χηµείας. n Οι ήπιες αυτές συνθήκες είναι χαµηλές θερµοκρασίες (0-37, 100 ο C?), ph γύρω στο ουδέτερο (?) και πίεση ίση µε την ατµοσφαιρική (?) 10

Γενικές ιδιότητες των ενζύµων n Τα υποστρώµατα που συµµετέχουν σε µια ενζυµική αντίδραση είναι συνήθως µικρά σε σχέση µε το µέγεθος του ενζύµου. n Έχουµε όµως µια σειρά ενζύµων που συµµετέχουν στη αποικοδόµηση µεγάλων βιολογικών υποστρωµάτων που είναι τα πολυµερή κυτταρίνη, χιτίνη, άµυλο, νουκλεινικά οξέα κλπ. 11

Ενεργό κέντρο των ενζύµων n Το ενεργό κέντρο ή ενεργός περιοχή είναι µια πολύ περιορισµένη περιοχή του ενζύµου. n Το ενεργό κέντρο είναι δοµικά συντηρηµένο και περιέχει τα ενεργά αµινοξέα που συµµετέχουν στο µηχανισµό αναγνώρισης του υποστρώµατος και της ενζυµικής κατάλυσης. n Στη περιοχή του ενεργού κέντρου µια σειρά αµινοξέων συµµετέχουν µε τις πλάγιες αλυσίδες τους στην ειδική αναγνώριση του υποστρώµατος µε υψηλή εξειδίκευση. 12

Στην ενζυµική κατάλυση µπορούν να συµµετέχουν ένα ή περισσότερα υποστρώµατα. 13

Κατά τη σύνδεση ενζύµου µε υπόστρωµα µπορούν να επέλθουν σηµαντικές δοµικές αλλαγές στο ένζυµο για την προσαρµογή του µε το υπόστρωµα 14

Κατηγορίες ενζυµικών αντιδράσεων Η ενζυµική κατάλυση καλύπτει ένα µεγάλο αριθµό αντιδράσεων όπως: n Υδρολύσεις n Πολυµερισµούς n Οξειδοαναγωγές n Αλδολικές συµπυκνώσεις n Αντιδράσεις µε ελεύθερες ρίζες n Μεταφορά διαφόρων οµάδων (ακυλοµάδων, καρβοξυλοµάδων, αµινοµάδων κλπ) 15

Ταξινόµηση και ονοµατολογία ενζύµων Τα ένζυµα µπορούν να ταξινοµηθούν µε διάφορους τρόπους: n Οξειδοαναγωγάσες: αντιδράσεις οξείδωσης-αναγωγής. n Τρανσφεράσες:αντιδράσεις µεταφοράς οµάδων n Υδρολάσες:υδρολυτικές αντιδράσεις n Λυάσες:προσθήκη σε διπλούς δεσµούς n Ισοµεράσες: ισοµερειώσεις n Συνθετάσες ή λιγάσες:συµπύκνωση δύο µορίων µε σύγχρονη πυροφωσφορική διάσπαση του ATP ή ΝΤP. 16

Ταξινόµηση και ονοµατολογία ενζύµων Πιο συχνά χρησιµοποιούµε τις εξής ονοµασίες κατηγοριών ενζύµων: n Δευδρογενάσες:καταλύουν αφυδρογόνωση n Οξειδάσες:καταλύουν οξείδωση µε µοριακό οξυγόνο ως δέκτη ηλεκτρονίων n Υδροξυλάσες:εισάγουν -ΟΗ στο υπόστρωµα, το Ο του οποίου προέρχεται από µοριακό οξυγόνο. n Οξυγονάσες:διασπούν οξειδωτικά ένα C-C δεσµό µε εισαγωγή ενός µορίου οξυγόνου σο υπόστρωµα. n Φωσφατάσες:καταλύουν την υδρόλυση φωσφορικών εστέρων n Κινάσες:καταλύουν τη µεταφορά φωσφορυλικών οµάδων από ATP ή άλλο NTP. n Μουτάσες:µετακινούν µια φωσφορική οµάδα από ένα υδροξύλιο του µορίου του υποστρώµατος σε άλλο υδροξύλιο του ίδιου µορίου. 17

Συνένζυµα n Πολλά ένζυµα χρειάζονται µη πρωτεινικούς παράγοντες για να δράσουν. n Οι παράγοντες αυτοί ονοµάζονται συνένζυµα και το σύµπλοκο ενζύµου-συνενζύµου ονοµάζεται ολοένζυµο. n Το ένζυµο χωρίς το συνένζυµο ονοµάζεται αποένζυµο. n Τα συνένζυµα δρουν σαν δέκτες ή δότες ηλεκτρονίων ή ακόµη ατόµων και οµάδων που µεταφέρονται κατά την ενζυµική αντίδραση από ή πρός το προιόν 18

Προσθετικές οµάδες Τα συνένζυµα πού είναι ισχυρά συνδεδεµένα µε το αποένζυµο ονοµάζονται προσθετικές οµάδες. 19

Αποένζυµο - ολοένζυµο Τα συνένζυµα πού είναι ισχυρά συνδεδεµένα µε το αποένζυµο ονοµάζονται προσθετικές οµάδες. 20

Η πλέον γνωστή προσθετική οµάδα είναι η αίµη Χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι η αίµη που είναι συνδεδεµένη οµοιοπολικά µε την Cys 14 και Cys 17 της πεπτιδικής αλυσίδας στο κυτόχρωµα. 21

Ταξινόµηση συνενζύµων Πολλά συνένζυµα είναι βιταµίνες ή περιέχουν σαν δραστική οµάδα βιταµίνες (ριβοφλαβίνες, θειαµίνη κλπ). Τα διάφορα συνένζυµα ταξινοµούνται βάσει της δράσης τους n Συνένζυµα µεταφοράς υδρογόνου (ΝAD, NADP, FMN, FAD, ουβικινόνη Q, Λιποϊκό οξύ) n Συνένζυµα µεταφοράς οµάδων (ATP, UDP κλπ) n Συνένζυµα µεταφοράς µονοανθρακικών οµάδων (SAM, THF4) n Συνένζυµα µεταφοράς διανθρακικών οµάδων (CoA) n Συνένζυµα των ισοµερασών και λυασών (UDPP, φωσφορική πυριδοξάλη, πυροφοσφωρική θειαµίνη, Β12-συνένζυµο) 22

Το NAD+ σαν δότης ή δέκτης ηλεκτρονίων Το πλέον γνωστό συνένζυµο είναι το ΝAD + ή NADP + Είναι από τους κυριότερους αποδέκτες ηλεκτρονίων πολλών οξειδωτικών αντιδράσεων του µεταβολισµού. 23

Μεταλλικά ιόντα και ενζυµική κατάλυση n Ένα σηµαντικό ποσοστό ενζύµων περιέχουν ιόντα µετάλλων ισχυρά συνδεδεµένα µε την πρωτείνη και είναι απαραίτητα για την εκδήλωση της ενζυµικής δραστικότητας. n Τα µεταλλικά ιόντα αποτελούν µέρος του ενζυµικού κέντρου του ενζύµου. n Τα πλέον συνηθισµένα ιόντα είναι Zn 2+, Fe 3+, Mg 2+, Mn 2+, Ca 2+, 24

Ορισµός ισοενζύµων n Πρόκειται για ένζυµα που µοιάζουν όσον αφορά τις φυσικές και χηµικές ιδιότητες αλλά δείχνουν διαφορετικές γενετικά καθορισµένες πρωτοταγείς δοµές. n Διαφέρουν στις ιδιότητες που είναι σηµαντικές για τη ρύθµιση της ενεργότητάς τους. n Εµφανίζουν διαφορετική κατανοµή σε διαφορετικούς ιστούς ή όργανα γεγονός που τους δίνει σηµαντική διαγνωστική αξία. 25

Ισοένζυµα-γαλακτική αφυδρογονάση 26

ENZYMA Μέτρησης ενζυµικής δραστικότητας 27

Μέτρηση ενζυµικής ενεργότητας Η µέτρηση ενζυµικής δραστικότητας εξαρτάται από τη: n Φύση της ενζυµικής αντίδρασης. n Φύση προιόντων και αντιδρώντων. Η ενζυµική ενεργότητα µπορεί να προσδιορισθεί φασµατοφωτοµετρικά, µε χρήση ραδιενέργειας, HPLC, MS, NMR κλπ. 28

Βασικές παράµετροι µια ενζυµικής αντίδρασης είναι το ph και η θερµοκρασία του διαλύµατος που λαµβάνει χώρα η αντίδραση 29

Άλλοι παράγοντες που πρέπει να ληφθουν υπόψην στη µέτρηση µιας ενζυµικής ενεργότητας n Ανάγκη παρουσίας µετάλλων n Ανάγκη παρουσίας συνενζύµων n Ανάγκη παρουσίας αναγωγικών παραγόντων n Ανάγκη ιδιαίτερων διαλυµάτων (υδρόφοβα υποστρώµατα, µικκύλια κλπ) n Ανάγκη χορήγησης ενέργειας. n Πίεση και άλλες εξωτικές συνθήκες... 30

Φύση της ενζυµικής αντίδρασης Πολλές ενζυµικές αντιδράσεις χρειάζονται ενέργεια, η οποία µπορεί να παραχθεί από συζευγµένη αντίδραση παραγωγής της 31

ΕΝΖΥΜΑ Ενζυµική κινητική και αναστολή, βασικές αρχές 32

Mοριακή κινητική στο διάλυµα Μικρά µόρια διαχέονται γρηγορότερα από τα µεγάλα. Σε C: 0.5 mm έχουµε 500.000 συγκρούσεις/sec. Σε C: 0.05 mm έχουµε 50.000 συγκρούσεις/sec. 33

Mοριακή κινητική στο κύτταρο Ενδοκυτταρική συγκέντρωση πρωτεϊνών 400 g/l 34

Η ενζυµική αντίδραση ενός υποστρώµατος ακολουθεί κινητική κορεσµού 35

H ταχύτητα µιας ενζυµικής αντίδρασης εξαρτάται από τη [S] για δεδοµένη [E] 36

Καµπύλη προόδου µιας ενζυµικής αντίδρασης 37

Ενζυµικές αντιδράσεις ενός υποστρώµατος- Ανάλυση κατά Michaelis-Menten 38

Ενζυµικές αντιδράσεις ενός υποστρώµατος- Αρχές θεωρίας Michaelis-Menten Παραδοχές Αγνοούµε ότι γίνεται η αντίστροφη αντίδραση P>S Ορίζουµε το V 0 (το 0 προέρχεται από τη σχεδόν µηδενική συγκέντρωση υποστρώµατος) Ο σχηµατισµός ειδικού ενδιάµεσου συµπλόκου ES, ως αναγκαίο για την κατάλυση. 39

Ενζυµικές αντιδράσεις ενός υποστρώµατος- Αρχές θεωρίας Michaelis-Menten Η ταχύτητα της κατάλυσης V o ορίζεται ο αριθµός των µορίων του προϊόντος που σχηµατίζεται/sec και µεταβάλλεται µε τη συγκέντρωση του υποστρώµατος τείνοντας σε µια τιµή που ονοµάζεται V max Η V o µετράται πάντα στις αρχικές συνθήκες της ενζυµικής αντίδρασης (είτε χρονικά, είτε χαµηλή συγκέντρωση S) θεωρόντας ότι δεν υπάρχει αντίστροφη αντίδραση 40

Ενζυµικές αντιδράσεις ενός υποστρώµατος- Ανάλυση κατά Michaelis-Menten 41

Ενζυµικές αντιδράσεις ενός υποστρώµατος- Αρχές θεωρίας Michaelis-Menten n Η σύνδεση του S γίνεται αντιστρεπτά στην ενεργό περιοχή του ενζύµου n Το δεύτερο σκέλος της αντίδρασης µπορούµε να το θεωρήσουµε µη αντιστρεπτό εάν κάνουµε τις µετρήσεις µας αµέσως µετά την προσθήκη του ενζύµου, δηλ. αρχική ταχύτητα n Η ταχύτητα σχηµατισµού του προιόντος P εξαρτάται από τη συγκέντρωση του συµπλόκου ES. n k +1 : k off k -1 :k on,, k s =K m =k -1 /k +1 (όταν κ 2 <<<κ -1 ) 42

Εξειδίκευση των ενζυµικών αντιδράσεων n Δύο είδη εξειδίκευσης Εξειδίκευση σύνδεσης-αναγνώρισης και Εξειδίκευση χηµικής αντίδρασης Η ενζυµική κατάλυση ξεκινά από την αλληλεπίδραση µεταξύ ενζύµου και υποστρώµατος σχηµατίζοντας το (E S σύµπλεγµα) n n n k +1 = k on, είναι η σταθερά της ταχύτητας σχηµατισµού του συµπλόκου E S k -1 = k off είναι η σταθερά της ταχύτητας διάστασης του συµπλόκου E S Η σταθερότητα του E S συµπλόκου σχετίζεται µε την συγγένεια του υποστρώµατος στο ένζυµο, όπως αυτή µετράται από την K s, σταθερά διάστασης του συµπλόκου E S. 43

Ενζυµικές αντιδράσεις ενός υποστρώµατος- Ανάλυση κατά Michaelis-Menten Η ταχύτητα µεταβολής του συµπλόκου ΕS εξαρτάται από την ταχύτητα σχηµατισµού µείον την ταχύτητα διάσπασης του. K 1 είναι η σταθερά δηµιουργίας του συµπλόκου ΕS Κ 2 είναι η σταθερά δηµιουργίας των Ε+P από το σύµπλοκο ΕS K -1 είναι η σταθερά διάσπασης του ES σε Ε και S. 44

Μετασχηµατισµός της εξίσωσης Michaelis-Menten 45

Παράδειγµα υπολογισµόυ Κ m Κ m 1.6 mm V max 4.32*10-6 mm/sec 46

Η φυσική σηµασία της σταθεράς Michaelis-Menten n Η Κ m είναι ο συνδιασµός των τριών σταθερών διαστάσεων κ 1, κ -1, κ 2 n Εάν η [S]= Κ m τότε v o =V max /2 n Η τιµή της Κ m είναι ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του Ε και έχει διαστάσεις M n Η τιµή της Κ m είναι µια ενζυµική σταθερά που ισχύει µόνο κάτω από ορισµένες συνθήκες ph, θερµοκρασίας και δοµής του S. n Η Κ m είναι η σταθερά διάστασης του ES. Όσο πιο µικρό το Κ m τόσο πιό ισχυρή η αλληλεπίδραση µεταξύ E και S. 47

Η φυσική σηµασία της σταθεράς Michaelis-Menten n Όσο µεγαλύτερη είναι η Κ m για ένα S τόσο µεγαλύτερη είναι η [S] για να επιτευχθεί η V max n Όσο µικρότερη είναι η Κ m για ένα S τόσο πιο δραστικό είναι το E για το δεδοµένο S n Η τιµή Κ m µας δίνει την τάξη µεγέθους της [S] στο κύτταρο, παραδεχόµενοι ότι στο κύτταρο οι ενζυµικές αντιδράσεις λαµβάνουν χώρα µε ταχύτητες πλησίον της ½V max. 48

Τι είναι Κ cat K cat είναι ο αριθµός µετατροπής (turnover number) και ορίζεται ως ο αριθµός µορίων υποστρώµατος που µετατρέπονται σε προιόν στη µονάδα του χρόνου από ένα ένζυµο, όταν το ένζυµο είναι πλήρως κορεσµένο. Κ cat έχει τιµές (s -1 ) και ισούται µε κ 2 Εάν η συγκέντρωση των ενεργών κέντρων είναι γνωστή τότε Κ cat υπολογίζεται µέσω της ταχύτητας V max V max =k 2 [E T ] To Κ cat συνήθως κυµαίνεται από 1-10000 s -1 49

Τι είναι k cat /K m n K cat /Κ m είναι το κριτήριο κινητικής τελειότητας µιας ενζυµικής κατάλυσης για διαφορετικά υποστρώµατα. [S]>>K m τότε η V=k cat n [S]<<K m τότε η V εξαρτάται από k cat /K m, [S], [E T ]. Τότε k cat /K m µπορεί να χρησιµοποιηθεί σαν κινητική σταθεράς για την αλληλεπίδραση S και Ε και ως εκ τούτου ως µέτρο της καταλυτικής αποτελεσµατικότητας για το συγκεκριµένο S. n Το ανώτατο όριο της τιµής του K cat /Κ m είναι η σταθερά διάχυσης στις συγκεκριµένες συνθήκες (10 9 Μ -1 s -1 ) 50

Τι είναι Κ cat To Κ cat συνήθως κυµαίνεται από 1-10000 s -1 Κ cat =1: ενζυµική µετατροπή ενός S/sec Κ cat =10000 ενζυµική µετατροπή 10000 S/sec 51

Ενδεικτική σύγκριση ενζυµικών και µη ενζυµικών αντιδράσεων Enzyme Nonenzymatic rate Enzymatic rate Rate acceleration knon (s -1 ) kcat (s -1 ) kcat/knon carbonic anhydrase 1.3 x 10-1 10 6 7.7 x 10 6 chorismate mutase 2.6 x 10-5 50 1.9 x 10 6 Chymotrypsin 4 x 10-9 4 x 10-2 10 7 triosephosphate isomerase 6 x 10-7 2 x 10 3 3 x 10 9 Fumarase 2 x 10-8 2 x 10 3 10 11 carboxypeptidase A 3 x 10-9 578 1.9 x 10 11 adenosine deaminase 1.8 x 10 10 370 2.1 x 10 12 alkaline phosphatase 10-15 10 2 10 17 orotidine 5'-phosphate 2.8 x 10-16 39 1.4 x 10 17 decarboxylase 52

Τροποποίηση της ενζυµικής ενεργότητας Ενεργοποίηση Αναστολή 53

Τροποποίηση της ενζυµικής ενεργότητας 54

Τύποι ενζυµικής αναστολής n Mη αντιστρεπτή n Αντιστρεπτή Συναγωνιστική (competitive) Μη συναγωνιστική (no competitive) Ασυναγώνιστη (un competitive) 55

Τύποι ενζυµικής αναστολής Mη αντιστρεπτή DIPF: διισοπροπυλοφωσφορθορίδιο 56

Συναγωνιστική αναστολή n n Ο συναγωνιστικός αναστολέας στη συναγωνιστική αναστολή παρουσιάζει οµοιότητες δοµής µε το υπόστρωµα και συνδέεται αντιστρεπτά στην ενεργό περιοχή του ενζύµου. Δεν επηρεάζει τη V max της αντίδρασης αλλά αυξάνει την K m 57

Συναγωνιστική αναστολή Δεν επηρεάζει τη V max της αντίδρασης αλλά αυξάνει την K m 58

Mη συναγωνιστική αναστολή Ο αναστολέας δένεται σε διαφορετική θέση στο ένζυµο από ότι το υπόστρωµα. Αύξηση της [S] δεν µπορεί να υπερνικήσει την αναστολή διότι ο αναστολέας ενώνεται µε το ένζυµο σε µια διαφορετική περιοχή από ότι το υπόστρωµα. Έτσι ο αναστολέας µπορεί να ενωθεί µε το ελεύθερο Ε καθώς και το ΕS και µπορεί να δώσει µορφές του ΕS που δεν διασπώνται σε προιόν. 59

Mη συναγωνιστική αναστολή H καταλυτική δράση του ενζύµου είναι κανονική. Η Κ m που δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύµου δεν µεταβάλλεται. Η V max όµως µειώνεται Συνήθως συµβαίνει σε ένζυµα στα οποία η ενζυµική ενεργότητα εξαρτάται από οµάδες που είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της ενεργότητάς του (πχ. -SH και δέσµευση βαρέων µετάλλων) 60

Διαφορά µεταξύ συναγωνιστικής και µη συναγωνιστικής αναστολής 61

Ασυναγώνιστη ενζυµική αναστολή Είναι σπάνια µορφή αναστολής σε ενζυµική αντίδραση µε ένα υπόστρωµα διότι ο αναστολέας συνδέεται αντιστρεπτά µόνο µε το σύµπλοκο ES και όχι και µε το ελεύθερο ένζυµο όπως συµβαίνει στην µη συναγωνιστική αναστολή 62

Ασυναγώνιστη ενζυµική αναστολή Αυξανόµενης της συγκέντρωσης του αναστολέα [Ι] το V max και η Κ m µειώνονται αντίστοιχα 63

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας n Η υψηλή καταλυτική ενεργότητα που έχει εξελιχθεί µέσα από τους αιώνες στη φύση σηµαίνει ότι δεν θα τα αφήσει να τρελλαθούν µέσα/έξω στο κύτταρο n Η ενζυµική ενεργότητα ρυθµίζεται µέσω πολλών παραµέτρων n Θερµοδυναµική n Διαθεσιµότητα ενζύµου n Αλλοστερία (φωσφορυλίωση, τελεστικά µόρια κλπ) n Μετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις n Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών n Ισοένζυµα 64

Αλλοστερική ρύθµιση ένζυµων 65

Αλλοστερική ρύθµιση ένζυµων 66

Kινητική αλλοστερικών ένζυµων n Είναι µια οµάδα ενζύµων η κινητική των οποίων δεν είναι υπερβολική, όπως προβλέπεται από τη θεωρία Michaelis-Menten αλλά σιγµοειδής. n Η κινητική αυτή σηµαίνει ότι όταν δένεται στο Ε το ένα υπόστρωµα τότε επιταχύνεται το δέσιµο του επόµενου S. 67

Kινητική αλλοστερικών ένζυµων 68

Aλλοστερικά ένζυµα 69

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας T R µεταβατικές καταστάσεις n Πολλοί αλλοστερικοί τελεστές επηρεάζουν την ισορροπία µεταξύ δύο διαµορφώσεων n Η µια διαµόρφωση είναι άκαµπτη και ανενεργή και ή άλλη πιο ευέλικτη και ενεργή. n Η άκαµπτη= tight = T κατάσταση n Η ευέλικτη= relaxed = R κατάσταση n Οι αλλοστερικοί τελεστές µετατοπίζουν την ισορροπία µεταξύ R και T 70

Kινητική αλλοστερικών ένζυµων 71

Αλλοστερικά ένζυµα n Τα περισσότερα αλλοστερικά ένζυµα έχουν υποµονάδες που ονοµάζονται επαγωγείς. Το δέσιµο του υποστρώµατος στον ένα επαγωγέα επηρεάζει το δέσιµο του υποστρώµατος στον επόµενο επαγωγέα. n Τα αλλοστερικά ένζυµα επηρεάζονται και από τελεστικά µόρια (effectors) που δένονται σε ειδικές ρυθµιστικές θέσεις του ενζύµου. 72

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Θερµοδυναµική ως ρυθµιστική δύναµη στα ένζυµα ΔG o =ΔH o -TΔS o n ΔG 0 : Μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας n ΔH 0 : Μεταβολή της ενθαλπίας (εσωτερική ενέργεια) n TΔS 0 : Μεταβολή της εντροπίας (τάση προς χάος) ΔH 0 <0 & ΔS 0 >0 ΔG 0 <0 τυχαία αντίδραση ΔH 0 >0 & ΔS 0 <0 ΔG 0 >0 µη τυχαία αντίδραση 73

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Θερµοδυναµική ως ρυθµιστική δύναµη στα ένζυµα n ΔG o =ΔG o +RT lnq n Q=[προϊόντων]/[συγκέντρωση αντιδρώντων] n Q (κάθε στιγµή) είναι διαφορετικός από Κ (κατάσταση ισορροπίας) n Q>Κ αντίδραση προς τα αντιδρώντα n Q<Κ αντίδραση προς τα προϊόντα n Q=Κ αντίδραση σε ισορροπία 74

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Θερµοδυναµική ως ρυθµιστική δύναµη στα ένζυµα n Η ΔG o δεν είναι καθοριστής τυχαιότητας µιας αντίδρασης όπως η ΔG. n Γιαυτό, τοπικές συγκεντρώσεις υποστρωµάτων και προϊόντων καθορίζουν εαν µια ενζυµική αµφίδροµη αντίδραση θα προχωρήσει προς τα αριστερά ή στα δεξια. n Κανόνας: ΔG o < -20 kj mol -1 η αντίδραση είναι µη αµφίδροµη 75

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Διαθεσιµότητα ενζύµων n Το ένζυµο πρέπει να βρίσκεται εκεί που είναι τα αντιδρώντα και πρέπει να παραγχθούν και τα προϊόντα. n Πως ελέγχει το κύτταρο [E] tot? Μεταγραφή (και µετάφραση) Πρωτεϊνική διαδικασία (αποικοδόµηση) Ενδοκυτταρική διαµερισµατοποίηση 76

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Μεταγραφικός έλεγχος n mrnas µε µικρό ή µεγάλο χρόνο ζωής n Εάν µια πρωτείνη αποικοδοµηθεί πρέπει να αντικατασταθεί και αυτό θα γίνει µέσω ελεγχόµενης µεταγραφικής ενεργότητας για τη συγκεκριµένη πρωτείνη n Πολλοί τύποι µεταγραφικών τελεστών Πρωτείνες που αλληλεπιδρούν µε το ίδιο τους το γονίδιο Μικρά µόρια που αλληλεπιδρούν µε τα γονίδια Υποκινητές που ανοίγουν και κλείνουν. 77

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Αποικοδόµηση πρωτεϊνών n Όλες οι πρωτείνες έχουν χρόνο ηµιζωής n Ο χρόνος ζωής των πρωτεϊνών είναι µικρότερος από τις δοµικές πρωτείνες και τα µεµβρανικά κανάλια n Αποικοδοµούνται από πολλά συµβάντα χωρίς εξειδίκευση n Πρωτεοσωµική ενεργότητα που εξειδικευµένα στοχεύει και αποικοδοµεί πρωτείνες 78

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Ενδοκυτταρική διαµερισµατοποίηση n Πρέπει το ένζυµο και τα υποστρώµατα να είναι στην ίδια περιοχή του κυττάρου. n Ενδοµιτοχονδριακές αντιδράσεις απαιτούν ένζυµα, που πρέπει να περάσουν τη διπλή µιτοχονδριακή µεµβράνη n Άρα µεταφορείς είναι επίσης τµήµα της ενεργότητας της ενζυµικής ρύθµισης. 79

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Υποστρώµατα ως αλλοστερικοί τροποποιητές (homotropic allostery) n Παράδειγµα: Η πρόσδεση του O 2 σε µια υποµονάδα της τετραµερικής αιµοσφαιρίνης επάγει αλλαγές στην διαµόρφωση των υποµονάδων που υποβοηθούν την ταχύτερη πρόσδεση Ο 2 στην 2 η, 3 η και 4 η υποµονάδα του O 2. n Έτσι το πρώτο οξυγόνο είναι ο θετικός αλλοστερικό τελεστής των υποµονάδων της αιµοσφαιρίνης n Το φαινόµενο αυτό µπορεί να είναι θετικό ή αρνητικό 80

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Υποστρώµατα ως αλλοστερικοί τροποποιητές (homotropic allostery) 81

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας Άλλοι αλλοστερικοί τελεστές (heterotropic) n Οµοιοπολική τροποποίησς ενός ενζύµου µέσω φωσφορυλίωσης ή άλλων µετα- µεταφραστικών τροποποιήσεων µπορούν να το ενεργοποιήσουν ή να απενεργοποιήσουν. n Συνήθως καταβολικά ένζυµα ενεργοποιούνται από φωσφορυλίωση (κινάσες) και καταβολικά απενεργοποιούνται, αλλά όχι πάντα. n Συµβαίνει και το ανάποδο (φωσφατάσες) 82

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας c-amp-εξαρτώµενη πρωτεϊνική κινάση n Τα ένζυµα κινάσες φωσφορυλιώνουν S/T, Υ πρωτεϊνών στόχων εντός της συνεντικής αλληλουχίας αναγνώρισης R(R/K)X(S*/T*) n Ενδογενής έλεγχος: ρυθµιστική υποµονάδα ή λειτουργική δοµική περιοχή περιέχει µια αλληλουχία που µοιάζει µε την αλληλουχία αναγνώρισης. Η υποµονάδα αυτή δένει και απενεργοποιεί το ενεργό κέντρο της κινάσης n Όταν η ρυθµιστική υποµονάδα δένει camp αποµακρύνεται από την καταλυτική υποµονάδα και ενεργοποιείται η κινάση 83

Ρύθµιση της ενζυµικής ενεργότητας σε µεταβολικά µονοπάτια 84