Ανάπτυξη χημειοφωταυγειομετρικών βιοαισθητήρων για ανάλυση νουκλεϊκών οξέων

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ανάπτυξη χημειοφωταυγειομετρικών βιοαισθητήρων για ανάλυση νουκλεϊκών οξέων ΕΛΕΝΑ Μ. ΣΠΥΡΟΥ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2016

UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF SCIENCE DEPARTMENT OF CHEMISTRY MASTER THESIS Development of chemiluminescent biosensors for nucleic acids analysis ELENA M. SPYROU CHEMIST PATRA 2016 ii

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στο τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, στο εργαστήριο Ενόργανης Χημικής Ανάλυσης, υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ. Θεόδωρου Χριστόπουλου. Για αυτό θα ήθελα να ξεκινήσω τις σύντομες ευχαριστίες μου, εκφράζοντας την ευγνωμοσύνη και τον σεβασμό προς τον κ. Χριστόπουλο. Έμαθα πάρα πολλά κατά την συνεργασία μας, σε όλα τα επίπεδα, και γνώρισα έναν άνθρωπο που μου διεύρυνε τον τρόπο σκέψης και την αντίληψή μου πάνω σε ερευνητικά θέματα αλλά και σε προσωπικές αποφάσεις. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την λέκτορα κ. Δέσποινα Καλογιάννη για τις αμέτρητες συζητήσεις και συμβουλές που χωρίς αυτές, σίγουρα η μεταπτυχιακή εργασία δε θα είχε ολοκληρωθεί σωστά. Ακόμα, εγκάρδιες ευχαριστίες στην κ. Αγγελοπούλου Αικατερίνη για την συμμετοχή της στην τριμελή επιτροπή και για τη βοήθεια της στη διόρθωση της παρούσας εργασίας. Ακολούθως, θα ήθελα να ευχαριστήσω την μεγάλη παρέα που δημιουργήσαμε στο εργαστήριο. Τον υποψήφιο διδάκτορα Ηρακλή Κυριακού και τους μεταπτυχιακούς φοιτητές Μαρία Κουνέλλη, Ανδρέα Γιαννακόπουλο, Σπυριδούλα Χριστοπούλου και Βάσω Μυριδάκη για το άψογο κλίμα που είχαμε καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών σπουδών. Πέρα από τη συνεργασία βέβαια, οι εμπειρίες και οι δυσκολίες που ζήσαμε μαζί θα μας μείνουν όσα χρόνια και αν περάσουν. Νοιώθω ότι έμαθα και σε προσωπικό επίπεδο και ιδιαίτερα Μαρία σε ευχαριστώ για αυτό. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω και να χαιρετήσω όλους του καλούς φίλους που απέκτησα. Είμαι σίγουρη ότι δε θα ήταν τόσο υπέροχα αν δεν ήταν αυτοί. Τέλος θα ήθελα να εκφράσω τις άπειρες ευχαριστίες μου στην οικογένεια μου για τη στήριξη που μου παρέχει όλα αυτά τα χρόνια, πάρα τις τεράστιες δυσκολίες, και που με έχουν κάνει τον άνθρωπο που είμαι. Και για το τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Άκη. Γιατί με βοηθάει να δω και να καταλάβω πράγματα που με κάνουν καλύτερη. Be the change you wish to see in the world. - Mahatma Gandhi iii

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονη ερευνητική δραστηριότητα γύρω από την ανάπτυξη νέων, ταχύτερων και πιο αξιόπιστων αναλυτικών μεθόδων και βιοαισθητήρων για την ταυτοποίηση ή τον ποσοτικό προσδιορισμό νουκλεϊκών οξέων. Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία είχε ως στόχο την ανάπτυξη νέων βιοαισθητήρων DNA είτε για (α) τη γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών είτε για (β) τον προσδιορισμό ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων. Πιο συγκεκριμένα, το Θεωρητικό Μέρος χωρίζεται σε τέσσερα κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 1 παρουσιάζεται γενικά η ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων. Γίνεται εκτενής αναφορά στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αλλά και στους τρόπους ανίχνευσης και ταυτοποίησης των προϊόντων της PCR. Στο κεφάλαιο 2 περιγράφεται ο όρος μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός και παρουσιάζονται τρόποι γονοτύπισης των πολυμορφισμών αυτών. Στο κεφάλαιο 3 παρουσιάζονται οι χημειο(βιο)φωταυγείς ιχνηθέτες και ο τρόπος που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων. Τέλος στο Κεφάλαιο 4 γίνεται εκτενής περιγραφή των βιοαισθητήρων DNA και των τύπων που έχουν αναπτυχθεί μέχρι σήμερα. Το πειραματικό μέρος χωρίζεται σε δύο κεφάλαια. Στο κεφάλαιο 5 παρουσιάζεται η ανάπτυξη βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών με χρήση φαινομένου χημειοφωταύγειας. Περιγράφονται αναλυτικά όλα τα αντιδραστήρια και όργανα που χρησιμοποιήθηκαν, τα στάδια της μεθόδου καθώς και τα αποτελέσματα που προέκυψαν. Τέλος στο Κεφάλαιο 6 παρουσιάζονται οι μελέτες για την ανάπτυξη βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων για ανίχνευση ειδικών μονόκλωνων και δίκλωνων αλληλουχιών. Η ανάπτυξη χημειοφωταυγειομετρικών βιοαισθητήρων είναι ένας κλάδος που έχει αρχίσει τα τελευταία χρόνια να βρίσκει εφαρμογή στην αναλυτική χημεία και είναι η πρώτη φορά που χρησιμοποιείται για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων. Έτσι πιστεύουμε ότι η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία συνέβαλλε και σε ερευνητικό επίπεδο. Λέξεις κλειδιά: Βιοαισθητήρας, Χημειοφωταύγεια, DNA, Μονονουκλεοτιδικός Πολυμορφισμός iv

SUMMARY In recent years there is a continuous increasing research activity towards to the development of new, rapid and reliable analytical methods and biosensors for detection or quantification of nucleic acids. The present master thesis focuses on the development of biosensors both for (a) the single nucleotide polymorphisms genotyping and (b) for detection of specific DNA sequences. More specifically, the theoretical background of this thesis is divided in four chapters. In Chapter 1, it is presented, generally, the analysis of nucleic acids. Extensive reference to the polymerase chain reaction (PCR) and the ways of detection and identification of PCR products are shown. Chapter 2 describes the term single nucleotide polymorphism and it is presented the ways of genotyping these polymorphisms. Chapter 3 presents the chemiluminescent probes and the methods that are used for the analysis of nucleic acids. Finally, Chapter 4 is a comprehensive description of DNA biosensors and biosensors types that have been developed to date. The experimental section is divided in two chapters. In chapter 5, it is described the development of a dry reagent biosensor for detection of single nucleotide polymorphisms, by using chemiluminescence. It is described, in detail, all reagents and instruments used, the stages of the process and the results obtained. Finally in chapter 6, it is presented the studies for the development of a chemiluminescent dry reagent biosensor for detection of single and double stranded nucleotides. In recent years, chemiluminescent biosensors are a field that has started to find application in analytical chemistry, and it is first used for the analysis of nucleic acids. So we believe that this thesis help in research level. Key words: Biosensors, Chemiluminescence, DNA, Single Nucleotide Polymorphisms v

Τριμελής Εξεταστική επιτροπή 1. Καθηγητής Χριστόπουλος Θεόδωρος, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 2. Λέκτορας Καλογιάννη Δέσποινα, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 3. Επίκουρος Καθηγήτρια Αγγελοπούλου Αικατερίνη, Τμήμα Κτηνιατρικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Examination Committee 1. Professor Christopoulos Theodoros, Department of Chemistry, University of Patras 2. Lecturer Kalogianni Despoina, Department of Chemistry, University of Patras 3. Assistant Professor Aggelopoulou Aikaterini, School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki vi

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος iii Περίληψη iv Summary..v Περιεχόμενα.vi Λίστα σχημάτων.xi Θεωρητικό μέρος..1 1. Ανάλυση νουκλεϊκών οξέων...2 1.1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης 2 1.1.1 Απόδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης 3 1.1.2 Η DNA πολυμεράση 4 1.2 Ανίχνευση προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης 4 1.2.1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης.4 1.2.1.1. Ποσοτικοποίηση των ζωνών ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης..6 1.2.2. Ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές..6 1.2.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR).7 1.2.3.1. Ανίχνευση αλληλουχιών DNA μέσω παρεμβολής φθορίζουσων χρωστικών..8 1.2.3.2 Ανίχνευση αλληλουχιών DNA μέσω φθορισμομετρικής δοκιμασίας υβριδοποίησης 9 1.2.3.3. Μοριακοί πυρσοί (Molecular Beacons)..10 1.2.4. Ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης με χρήση εσωτερικού προτύπου..11 1.2.5. Άλλες τεχνικές ανίχνευσης προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.12 vii

2. Μέθοδοι γονοτύπισης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών 13 2.1. Εισαγωγή...13 2.2. Πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικού τμήματος (RFLP)....14 2.3. Αλληλόμορφο ειδική υβριδοποίηση (ASO)...15 2.4. Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT)...16 2.5. Αντίδραση λιγάσης (OLA)..17 3. Χημειο (Βιο-)φωταυγείς ιχνηθέτες σε αναλύσεις DNA..18 3.1. Εισαγωγή 18 3.1.1. Απόδοση της αντίδρασης χημειοφωταύγειας. 18 3.2. Χημειo-/Βιο- φωταυγείς ιχνηθέτες..19 3.2.1. Χημειοφωταυγείς ιχνηθέτες. 19 3.2.1.1. Λουμινόλη. 20 3.2.1.2. Εστέρες της ακριδίνης..21 3.2.2. Ενζυμικοί ιχνηθέτες με χημειοφωταυγειογόνα υποστρώματα..22 3.2.2.1. Υπεροξειδάση.23 3.2.2.2. Αλκαλική φωσφατάση.23 3.2.3. Βιοχημειοφωταυγείς ιχνηθέτες.24 3.2.4. Φωτοπρωτεΐνες.26 3.3. Εφαρμογές στις αναλύσεις DNA...28 4. Βιοαισθητήρες DNA 30 4.1. Εισαγωγή...30 viii

4.2. Ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες DNA.30 4.2.1. Ποτενσιομετρικοί βιοαισθητήρες.31 4.2.2. Αμπερομετρικοί βιοαισθητήρες...32 4.3. Πιεζοηλεκτρικοί Βιοαισθητήρες.32 4.4 Οπτικοί βιοαισθητήρες..33 4.4.1. Οπτικοί βιοαισθητήρες με χρήση οπτικών ινών. 33 4.4.2. Οπτικοί βιοαισθητήρες αποσβενόμενου κύματος..35 4.4.3. Βιοαισθητήρες DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων....36 4.4.3.1 Κατασκευή ζωνών δοκιμασίας...37 4.4.3.2 Οπτική ανίχνευση ζωνών δοκιμασίας.40 Πειραματικό μέρος 40 Υλικά Όργανα...42 Ολιγονουκλεοτίδια 44 Αλληλουχίες γονιδίων.45 5. Ανάπτυξη βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων για ανίχνευση μονονου- κλεοτιδικών πολυμορφισμών με χρήση φαινομένου χημειοφωταύγειας. 46 5.1. Εισαγωγή...46 5.2. Μεθοδολογία..49 5.2.1 Προετοιμασία βιοαισθητήρα...49 5.2.2 Οπτικοποίηση του αισθητήρα με ψηφιακή κάμερα και κάμερα smartphone και κατασκευή ειδικής συσκευής smartphone..50 ix

5.2.3 Σύζευξη μικροσφαιριδίων με ολιγονουκλεοτίδια.. 51 5.2.4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR).52 5.2.5 Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT).52 5.2.6. Χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση του SNP C677T στο MTHFR 54 5.3. Αποτελέσματα-Συζήτηση 55 5.3.1 Οπτική γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών 55 5.3.2. Βελτιστοποιήσεις των παραμέτρων της προτεινόμενης μεθόδου 57 5.3.3. Κλινικά δείγματα..59 5.3.4. Επαναληψιμότητα προτεινόμενης μεθόδου 59 5.3.5. Χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση με χρήση smartphone..61 5.3.6. Γονοτύπιση κλινικών δειγμάτων με χρήση smartphone..62 5.4. Συμπεράσματα 63 6 Ανάπτυξη βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων για χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση ειδικών μονόκλωνων και δίκλωνων αλληλουχιών 65 6.1. Εισαγωγή 65 6.2. Μεθοδολογία..67 6.2.1. Προετοιμασία βιοαισθητήρα..67 6.2.2. Παρασκευή ζωνών δοκιμασίας αντιφλουρεσκεΐνης και αντιδιγοξιγενίνης 68 6.2.3. Προσθήκη F-dUTP και Did-dUTP στα μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια στόχους..68 6.2.4. Ανίχνευση διπλά ιχνηθετημένων μονόκλωνων αλληλουχιών με χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα..69 6.2.5. Προσθήκη biotin-dutp σε ολιγονουκλεοτιδίο στόχο.70 x

6.2.6. Ανίχνευση μονόκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου στόχου με υβριδοποίηση με ιχνηθετημένο ανιχνευτή με φλουρεσκεΐνη..71 6.2.7. Ανίχνευση δίκλωνου συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου στόχου με υβριδοποίηση με ιχνηθετημένο ανιχνευτή με φλουρεσκεΐνη 72 6.2.8. Προσθήκη F-dUTP και Dig-dUTP σε ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές 72 6.2.9. Ανίχνευση προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και του εσωτερικού προτύπου με το βιοαισθητήρα DNA..73 6.3. Αποτελέσματα. 73 6.3.1. Οπτική ανίχνευση μονόκλωνων αλληλουχιών χωρίς υβριδοποίηση..73 6.3.1.1. Μελέτη χημειοφωταυγειομετρικής ανίχνευσης μονόκλωνων αλληλουχιών μέσω αλληλεπίδρασης αντιδιγοξιγενίνης διγοξιγενίνης..74 6.3.1.2. Μελέτη χημειοφωταυγειομετρικής ανίχνευσης μονόκλωνων αλληλουχιών μέσω αλληλεπίδρασης αντιφλουρεσκεΐνης φλουρεσκεΐνης.75 6.3.2. Οπτική ανίχνευση μονόκλωνων και δίκλωνων αλληλουχιών μέσω υβριδοποίησης.76 6.3.2.1. Μελέτη χημειοφωταυγειομετρικής ανίχνευσης μονόκλωνων και δίκλωνων συνθετικών αλληλουχιών μέσω αλληλεπίδρασης αντιφλουρεσκεΐνης φλουρεσκεΐνης.78 6.3.3. Οπτική ανίχνευση δίκλωνων αλληλουχιών προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.79 6.3.3.1. Μελέτη χημειοφωταυγειομετρικής ανίχνευσης προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης μέσω αλληλεπίδρασης αντιδιγοξιγενίνης διγοξιγενίνης.80 6.3.3.2. Μελέτη χημειοφωταυγειομετρικής ανίχνευσης εσωτερικού προτύπου μέσω αλληλεπίδρασης αντιφλουρεσκεΐνης φλουρεσκεΐνης...81 xi

6.3.4. Σύγκριση σημάτων ζώνης σε μονόκλωνο στόχο και δίκλωνο στόχο με ή χωρίς υβριδοποίηση 82 6.4. Συμπεράσματα 84 Βιβλιογραφία....86 xii

Λίστα Σχημάτων Σχήμα 1.1: Στάδια ενός κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. (α) αποδιάταξη των δύο κλώνων, (β) υβριδοποίηση των εκκινητών, (γ) επιμήκυνση των εκκινητών Σχήμα 1.2: (α) Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης στο διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων (β) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και χρώση των ζωνών με βρωμιούχο αιθίδιο Σχήμα 1.3: Η παρεμβολή του βρωμιούχου αιθιδίου σε ένα τμήμα μιας διπλής έλικας του DNA. Η παρεμβαλλόμενη χρώση αυξάνει την απόσταση μεταξύ των διαδοχικών ζευγών βάσεων και διαστρεβλώνει τον φωσφορικό σκελετό Σχήμα 1.4 : Σχηματική απεικόνιση της οργανολογίας ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές Σχήμα 1.5: Στάδια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Σχήμα 1.6:Σχηματική παράσταση της τεχνικής PCR πραγματικού χρόνου Σχήμα 1.7: (α) Δομή ενός μοριακού πυρσού (β) Μηχανισμός λειτουργίας του μοριακού πυρσού (γ) Διάγραμμα έντασης φθορισμού Σχήμα 1.8: Αρχή της μεθόδου σύνθεσης εσωτερικού προτύπου, χρησιμοποιώντας την PCRως συνθετικό εργαλείο Σχήμα 2.1: Σχηματική απεικόνιση του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού Σχήμα 2.2: (α) Αρχή της μεθόδου πολυμορφισμού μεγέθους περιοριστικού τμήματος (β) Ηλεκτροφόρηση ενός αλληλόμορφου που δεν κόπηκε από την περιοριστική ενδονουκλεάση και ενός άλλου που κόπηκε Σχήμα 2.3: Αρχή της μεθόδου της αλληλόμορφο - ειδικής υβριδοποίησης. Η υβριδοποίηση πραγματοποιείται μόνο όταν ο ανιχνευτής είναι πλήρως συμπληρωματικός με τον DNA στόχο. xiii

Σχήμα 2.4: Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. Ο εκκινητής επεκτείνεται από την DNA πολυμεράση μόνο όταν είναι πλήρως συμπληρωματικός με το DNA στόχο που φέρει τη πολυμορφική βάση Σχήμα 2.5: Αρχή της μεθόδου της αντίδρασης λιγάσης. Η DNA λιγάση ενώνει τους δύο ανιχνευτές μόνο εάν είναι πλήρως συμπληρωματικοί με το εκμαγείο DNA Σχήμα 3.1: Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης χημειοφωταύγειας Σχήμα 3.2: (α) Αντίδραση της λουμινόλης (β) ταυτομέρεια του διεγερμένου προϊόντος Σχήμα 3.3: Προτεινόμενος μηχανισμός της αντίδρασης λουμινόλης Σχήμα 3.4: Αντίδραση του εστέρα της ακριδίνης Σχήμα 3.5: Χημειοφωταυγειομετρική αντίδραση της αλκαλικής φωσφατάσης, με χρήση υποστρώματος 1,2-αρυλ-φωσφορικό διοξετάνιο Σχήμα 3.6: Γενική αντίδραση βιοφωταύγειας Σχήμα 3.7: Χημικές δομές των γνωστών λουσιφερινών Σχήμα 3.8: Στη βακτηριακή αντίδραση βιοφωταύγειας, η βακτηριακή λουσιφεράση καταλύει την οξείδωση της FMNH και μιας λιπαρής αλδεΰδης μακράς αλυσίδας με μοριακό οξυγόνο που έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή μπλε- πράσινου φωτός Σχήμα 3.9: Συνοπτική αντίδραση της αικουορίνης Σχήμα 3.10:Βιοφωταυγής αντίδραση της σελεντεραζίνης στην αικουορίνη Σχήμα 3.11: Αρχή χρησιμοποιώντας (α) της μεθόδου σύζευγμα βιοχημειοφωταυγειομετρικής αικουορίνης-ολιγονουκλεοτιδίου δοκιμασίας και (β) αικουορίνης-στρεπταβιδίνης σαν ιχνηθέτη. Σχήμα 3.12: Αρχή χρησιμοποιώντας της σύζευμα μεθόδου αλκαλικής χημειοφωταυγειομετρικής φωσφατάσης με δοκιμασίας (α)αντίσωμα, (β) στρεπταβιδίνη (γ) ολιγονουκλεοτίδιο, ως ιχνηθέτη. Σχήμα 3.13: (α) Αρχή της μεθόδου πολλαπλής χημειοφωταυγειομετρικής δοκιμασίας χρησιμοποιώντας σύζευγμα αικουορίνης με ολιγονουκλεοτίδιο, xiv

υπεροξειδάσης με αντίσωμα, γαλακτοζιδάσης με ολιγονουκλεοτίδιο και αλκαλική φωσφατάση με αντίσωμα.. (β) Αρχή της μεθόδου διπλής χημειοφωταυγειομετρικής δοκιμασίας χρησιμοποιώντας σύζευγμα αικουορίνης με ολιγονουκλεοτίδι και αλκαλική φωσφατάση με αντίσωμα ως ιχνηθέτες Σχήμα 4.1: Γενική αρχή ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων DNA Σχήμα 4.2: Ποτενσιομετρικός βιοαισθητήρας για την ανίχνευση της υβριδοποίησης μεταξύ συμπληρωματικών μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων σε μεμβράνη PVC. Σχήμα 4.3: Αρχή της μεθόδου αμπερομετρικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση ειδικής αλληλουχίας ολιγονουκλεοτιδίου Σχήμα 4.4: Πιεζοηλεκτρικός κρύσταλλος χαλαζία και αναπαράσταση των δονήσεων του Σχήμα 4.5: Σχηματική διάταξη για τη μέτρηση φθορισμού του βρωμιούχου αιθιδίου από οπτικές ίνες που έχουν ακινητοποιημένους ειδικούς ανιχνευτές Σχήμα 4.6: Σχηματική διάταξη για τη μέτρηση φθορισμού ιχνηθετημένων ανιχνευτών Σχήμα 4.7: (α) Σχηματική απεικόνιση ενός βιοαισθητήρα συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (β) Αρχή της μεθόδου του τρόπου απεικόνισης του φαινομένου συντονισμού πλασμονίων Σχήμα 4.8: Σχηματική απεικόνιση του βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. IP: υλικό εμβάπτισης, CP: υλικό απόθεσης, M: μεμβράνη, AP: απορροφητικό υλικό Σχήμα 4.9: Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης στρεπταβιδίνης με ένα μόριο βιοτίνης Σχήμα 4.10: Εκλεκτική αλληλεπίδραση ενός αντισώματος με το αντίστοιχο αντιγόνο Σχήμα 4.11: Δημιουργία δεσμών υδρογόνου μεταξύ αδενίνης και θυμίνης Σχήμα 5.1: Σχηματική απεικόνιση του βιοαισθητήρα νουκλεϊκού οξέος για οπτική γονοτύπιση TS: test spot, CS: control spot, IP: υλικό εμβάπτισης, CP: υλικό εναπόθεσης, M: μεμβράνη, AP: απορροφητικό υλικό xv

Σχήμα 5.2:(α) Σχηματική απεικόνιση του μαύρου κουτιού για την οπτική ανίχνευση των αλληλουχιών DNA με το χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα (1)μάυρο κουτί, (2) ψηφιακή κάμερα, (3) βιοαισθητήρας DNA (β) To 3D μοντέλο της συσκευής του smartphone (1) smartphone (2) θήκη κινητού (3) Θήκη φακού, (4) θήκη βιοαισθητήρα, (5) βιοαισθητήρας, (6) κάλυμμα βιοαισθητήρα. (γ) Αρχή της μεθόδου λήψης του εκπεμπόμενου φωτός του βιοαισθητήρα με χρήση smartphone Σχήμα 5.3: Αντίδραση καρβοξυλομάδας των μικροσφαιριδίων με αμινομάδα του ολιγονουκλεοτίδιου χρησιμοποιώντας το ομοδιλειτουργικό αντιδραστήριο EDC Σχήμα 5.4: Η αρχή της μεθόδου της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή για (α) τον τύπο Ι και (β) τον τύπο ΙΙ βιοαισθητήρα DNA Σχήμα 5.5: Η αρχή της μεθόδου του (α) τύπου 1 και (β) τύπου 2 DNA βιοαισθητήρα Σχήμα 5.6: Γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού για τρία δείγματα ανθρώπινου γενομικού DNA (Ν/Ν: φυσιολογικός, Μ/Μ: ομοζυγώτης για τη μετάλλαξη, Ν/Μ: ετεροζυγώτης για την μετάλλαξη) για τον (α) τύπο 1 και (β) τύπο 2 βιοαισθητήρα Σχήμα 5.7: Βελτιστοποιήσεις μεθόδου (α) Συγκέντρωση συζεύγματος SA-HRP, (β) Χρόνος επώασης υποστρώματος, (γ) Χρόνος έκθεσης πριν τη λήψη φωτογραφίας Σχήμα 5.8: Γονοτύπιση 8 κλινικών δειγμάτων για το μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό του MTHFR Σχήμα 5.9: Επαναληψιμότητα της μεθόδου για (α) τον τύπο Ι και (β) τον τύπο ΙΙ βιοαισθητήρα, για ένα φυσιολογικό δείγμα (Ν/Ν), για ένα ομοζυγώτη για τη μετάλλαξη (Μ/Μ) και έναν ετεροζυγώτη (Ν/Μ) Σχήμα 5.10: Χημειοφωταυγειομετρικές εικόνες για 8 κλινικά δείγματα χρησιμοποιώντας τη κάμερα του smartphone Σχήμα 6.1: Αντιδράσεις επιμήκυνσης βιοτινυλιωμένου ολιγονουκλεοτιδίου με FdUTP και Dig-dUTP. xvi

Σχήμα 6.2 : Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα για ανίχνευση μονόκλωνων αλληλουχιών Σχήμα 6.3 : Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα για ανίχνευση μονόκλωνων ή δίκλωνων αλληλουχιών με υβριδοποίηση Σχήμα 6.4: Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση δίκλωνων αλληλουχιών, προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και εσωτερικού προτύπου Σχήμα 6.5: (α) Εφαρμογή διαδοχικών συγκεντρώσεων μονόκλωνης διπλά ιχνηθετημένης αλληλουχίας στο βιοαισθητήρα που έχει ακινητοποιημένη αντιδιγοξιγενίνη (β) Γραφική παράσταση έντασης της χημειοφωταύγειας ως προς την συγκέντρωση μονόκλωνων αλληλουχιών Σχήμα 6.6: (α) Εφαρμογή διαδοχικών συγκεντρώσεων μονόκλωνης διπλά ιχνηθετημένης αλληλουχίας στο βιοαισθητήρα που έχει ακινητοποιημένη αντιφλουρεσκεΐνη (β) Γραφική παράσταση έντασης της χημειοφωταύγειας ως προς την συγκέντρωση μονόκλωνων αλληλουχιών Σχήμα 6.7: (α) Εφαρμογή διαδοχικών συγκεντρώσεων μονόκλωνης συνθετικής αλληλουχίας στόχος στο βιοαισθητήρα που έχει ακινητοποιημένη αντιφλουρεσκεΐνη (β) Γραφική παράσταση έντασης της χημειοφωταύγειας ως προς την συγκέντρωση του στόχου Σχήμα 6.8: (α) Εφαρμογή διαδοχικών συγκεντρώσεων δίκλωνης συνθετικής αλληλουχίας στόχος στο βιοαισθητήρα που έχει ακινητοποιημένη αντιφλουρεσκεΐνη (β) Γραφική παράσταση έντασης της χημειοφωταύγειας ως προς την συγκέντρωση του στόχου Σχήμα 6.9: (α) Εφαρμογή διαδοχικών συγκεντρώσεων δίκλωνης αλληλουχίας προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στο βιοαισθητήρα που έχει ακινητοποιημένη αντιδιγοξιγενίνη (β) Γραφική παράσταση έντασης της χημειοφωταύγειας ως προς την συγκέντρωση xvii

Σχήμα 6.10: (α) Εφαρμογή διαδοχικών συγκεντρώσεων δίκλωνης αλληλουχίας προϊόντος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στο βιοαισθητήρα που έχει ακινητοποιημένη αντιφλουρεσκεΐνη (β) Γραφική παράσταση έντασης της χημειοφωταύγειας ως προς την συγκέντρωση Σχήμα 6.11: Γραφική παράσταση για σύγκριση 20 nm προϊόντος: (α) διπλά ιχνηθετημένου μονόκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου (β) μονόκλωνου συνθετικού βιοτινυλιωμένου προϊόντος με υβριδοποίηση (γ) δίκλωνου συνθετικού βιοτινυλιωμένου προϊόντος με υβριδοποίηση (δ) δίκλωνου προϊόντος PCR Σχήμα 6.12: Γραφική παράσταση της έντασης της ζώνης σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του προϊόντος. Κόκκινη γραμμή: Μονόκλωνο διπλά ιχνηθετημένο προϊόν χωρίς υβριδοποίηση, Γκρι γραμμή: Μονόκλωνο συνθετικό βιοτινυλιωμένο προϊόν με υβριδοποίηση, Πράσινη γραμμή: Δίκλωνο συνθετικό βιοτινυλιωμένο προϊόν με υβριδοποίηση, Ροζ γραμμή: Δίκλωνο προϊόν αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης με υβριδοποίηση xviii

Θεωρητικό Μέρος 1

Κεφάλαιο 1 Ανάλυση νουκλεϊκών οξέων 1.1 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μία τεχνική που επιτρέπει την ενζυμική σύνθεση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA σε εκατομμύρια αντίγραφα με μια γρήγορη, απλή και αυτοματοποιημένη αντίδραση. Επινοήθηκε από τον Kary Mullis το 1983 (Nobel Prize 1993) και εκμεταλλεύεται την ιδιότητα ενός ενζύμου, της DNA πολυμεράσης, η οποία χρησιμοποιεί μία συγκεκριμένη αλληλουχία DNA σαν εκμαγείο για να συνθέσει ένα συμπληρωματικό κλώνο. Δύο συνθετικά μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια είναι επίσης αναγκαία, οι εκκινητές, οι οποίοι υβριδοποιούνται με το εκμαγείο DNA σε αντίθετες και συμπληρωματικές θέσεις και ορίζουν την περιοχή που θα πολλαπλασιαστεί. Στο μίγμα της αντίδρασης προστίθενται, ακόμα, δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps), MgCl2 και κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα και η αντίδραση πραγματοποιείται σε έναν θερμικό κυκλοποιητή (Brownstein, 2004). Η βασική αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης είναι απλή και περιλαμβάνει μία επαναλαμβανόμενη θερμική διαδικασία τριών σταδίων : (1) αποδιάταξη του δίκλωνου DNA στους 94-98oC, (2) υβριδοποίηση των εκκινητών στους 50-70 oc και (3) επέκταση των εκκινητών στους 72 oc. Κάθε κύκλος διαρκεί 2-5 min και επαναλαμβάνεται 20-45 φορές. (Σχήμα 1.1) Στο πρώτο στάδιο του κύκλου διασπώνται οι δεσμοί υδρογόνου που συγκρατούν τις δύο αλυσίδες DNA. Στο δεύτερο στάδιο οι δύο εκκινητές, ένας ανοδικός και ένας καθοδικός, συγκρατούνται στο αποδιαταγμένο DNA στις αντίστοιχες συμπληρωματικές αλληλουχίες. Ο ανοδικός εκκινητής υβριδοποιείται στον καθοδικό κλώνο του DNA, ενώ ο καθοδικός εκκινητής υβριδοποιείται στον ανοδικό κλώνο αντίστοιχα. Κατά το τρίτο στάδιο, το ένζυμο DNA πολυμεράση καταλύει τη σύνθεση των νέων κλώνων του DNA. H DNA πολυμεράση προσθέτει δεοξυριβονουκλεοτίδια συμπληρωματικά στον κάθε κλώνο του DNA που έχει αποδιαταχθεί και έχει υβριδοποιηθεί με τον εκκινητή μόνο σε κατεύθυνση 5 ->3. 2

3 5 5 3 o T=94-95 C (α) 5 3 3 5 o T=50-65 C (β) 5 3 5 3 5 3 3 5 20-45cycles 5 o (γ) 5 3 T=72 C 3 5 3 3 5 Σχήμα 1.1: Στάδια ενός κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.(pcr) (α) αποδιάταξη των δύο κλώνων, (β) υβριδοποίηση των εκκινητών, (γ) επιμήκυνση των εκκινητών 1.1.1 Απόδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Με το τέλος του πρώτου κύκλου, προκύπτουν δύο αντίγραφα της επιθυμητής αλληλουχίας που λειτουργούν ως εκμαγείο για τον επόμενο κύκλο. Καθώς οι κύκλοι προχωρούν, οι εκκινητές υβριδοποιούνται τόσο με αρχικά μόρια DNA, όσο και με νέο-συντιθέμενες αλυσίδες. Ο θεωρητικός αριθμός των αντιγράφων DNA που παράγονται έπειτα από ν κύκλους είναι 2ν (Schochetman, 1988). Όμως μετά τους πρώτους 10-15 κύκλους, η συγκέντρωση των εκκινητών, του ενζύμου και των δεοξυριβονουκλεοτιδίων, μειώνεται, επειδή ένα μέρος τους καταναλώνεται με αποτέλεσμα να μειώνεται η απόδοση την αντίδρασης και να καταλήγει σε πλατώ. Ένας άλλος λόγος που η αντίδραση πολλαπλασιασμού καταλήγει σε κορεσμό, είναι και η επαναϋβριδοποίηση των κλώνων του εκμαγείου DNA σε υψηλές συγκεντρώσεις (Henrich, 1989). Έτσι η σχέση που προκύπτει για την πορεία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στην εκθετική φάση είναι: P = T(1+E)n, όπου P είναι η ποσότητα προϊόντος που παράγεται από την αντίδραση, Τ είναι η ποσότητα του αρχικού DNA 3

πριν τον πολλαπλασιασμό, n ο αριθμός των κύκλων της PCR, και Ε η μέση απόδοση του κάθε κύκλου της αντίδρασης (0<Ε<1) (Christopoulos, 2006). 1.1.2 Η DNA πολυμεράση Αρχικά η DNA πολυμεράση που χρησιμοποιούνταν στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ήταν η DNA πολυμεράση I του τμήματος Klenow του βακτηριδίου Escherichia coli. Αυτό το ένζυμο είχε βέλτιστη θερμοκρασία δράσης στους 37oC και ήταν ανενεργό στις υψηλές θερμοκρασίες που χρειαζόντουσαν κατά το στάδιο της αποδιάταξης. Έτσι ήταν αναγκαίο να προστίθεται νέο ένζυμο κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου της PCR. Η απομόνωση του θερμοανθεκτικού ενζύμου Taq πολυμεράση από το θερμοφιλικό βακτήριο Thermus aquaticus αυτοματοποίησε τη διαδικασία αλλά και παράλληλα αύξησε την ειδικότητα και την συνολική απόδοση της αντίδρασης. Αυτή η DNA πολυμεράση είναι ανθεκτική σε θερμοκρασίες άνω των 90 oc με αποτέλεσμα όλα τα συστατικά (DNA στόχος, εκκινητές, Taq πολυμεράση, δεοξυριβονουκλεοτίδια και ρυθμιστικό διάλυμα) να προστίθενται από την αρχή της αντίδρασης και ο πολλαπλασιασμός του DNA στόχου να πραγματοποιείται απλά με τη μεταβολή της θερμοκρασίας (Henrich, 1989). 1.2 Ανίχνευση προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Τα προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης μπορούν να ταυτοποιηθούν με διάφορους τρόπους, είτε μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, είτε κατά τη διάρκειά της. 1.2.1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση του DNA σε πηκτή αγαρόζης είναι μία από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες τεχνικές. Πρόκειται για μία τεχνική διαχωρισμού μακρομορίων (DNA, RNA, πρωτεΐνες) με βάση το μέγεθος. O διαχωρισμός γίνεται με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου, έτσι ώστε το αρνητικά φορτισμένο DNA (λόγω των 4

φωσφορικών ομάδων που περιέχει) να κινηθεί προς το θετικό πόλο μέσω μιας πηκτής αγαρόζης. (Σχήμα 1.2). Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, τα προϊόντα βρίσκονται συνήθως σε υδατικό διάλυμα και λόγω του διαφορετικού μεγέθους και φορτίου, τα διάφορα μόρια θα κινηθούν με διαφορετική ταχύτητα μέσω της πηκτής και θα διαχωριστούν σε ζώνες. Τα προϊόντα γίνονται ορατά με χρώση με φθορίζουσα χρωστική, όπως το βρωμιούχο αιθίδιο το οποίο παρεμβάλλεται στη διπλή έλικα του DNA και εκπέμπει φθορισμό όταν εκτεθεί σε UV ακτινοβολία (Σχήμα 1.3) (Chrambach, 1985). (α) (β) Σχήμα 1.2: (α) Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης στο διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων (β) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και χρώση των ζωνών με βρωμιούχο αιθίδιο Σχήμα 1.3: Η παρεμβολή του βρωμιούχου αιθιδίου σε ένα τμήμα μιας διπλής έλικας του DNA. Η παρεμβαλλόμενη χρώση αυξάνει την απόσταση μεταξύ των διαδοχικών ζευγών βάσεων και διαστρεβλώνει τον φωσφορικό σκελετό 5

1.2.1.1. Ποσοτικοποίηση των ζωνών ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης Για να εκτιμηθεί το μέγεθος και η συγκέντρωση του προϊόντος, μόρια γνωστού μεγέθους και συγκέντρωσης ηλεκτροφορούνται παράλληλα τα οποία χρησιμεύουν ως μοριακοί δείκτες. Η χρήση αυτών των δεικτών επιτρέπει, πέρα από τη ταυτοποίηση των προϊόντων, συγκρίνοντας το μέγεθός τους με αυτό των δεικτών, και τον ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων, καθώς μετράται με ειδικό λογισμικό η οπτική πυκνότητα κάθε ζώνης και κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη, με βάση την ένταση των ζωνών του δείκτη. Η ανιχνευσιμότητα της μεθόδου ποικίλει μεταξύ 100 pg και 10ng ανά ζώνη και μεγέθους 100 bp έως 20Kbp. Επειδή το βρωμιούχο αιθίδιο αλληλεπιδρά με τη διπλή έλικα του DNA, η ευαισθησία εξαρτάται και από το μέγεθος του τμήματος του DNA. 1.2.2. Ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές Μία εναλλακτική μέθοδος για το διαχωρισμό των προϊόντων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης είναι η ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές. Σε αυτή τη τεχνική ο διαχωρισμός των μορίων γίνεται με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου στο εσωτερικό τριχοειδών σωλήνων. Ένα τριχοειδές διοξειδίου του πυριτίου μήκους 20-50 cm και εσωτερικής διαμέτρου 25-100 μm, το οποίο είναι πληρωμένο με ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού εκτείνεται μεταξύ δύο δοχείων που περιέχουν το ίδιο διάλυμα. Σε αυτά τα δύο δοχεία προσαρμόζονται δύο ηλεκτρόδια (ανόδου και καθόδου) που συνδέονται με πηγή υψηλής τάσης (10-30 kv). Για να γίνει ο διαχωρισμός, το ένα άκρο του τριχοειδούς μετακινείται από το δοχείο που περιέχει το ηλεκτρόδιο καθόδου, σε άλλο δοχείο που περιέχει το δείγμα. Στη συνέχεια γίνεται εισαγωγή του δείγματος (20-50 nl) και το τριχοειδές επιστρέφεται ξανά στο δοχείο που φέρει το ηλεκτρόδιο καθόδου. Ένα ηλεκτρικό δυναμικό (10-30 kv) εφαρμόζεται μεταξύ των δύο δοχείων του ρυθμιστικού. Οι αναλύτες μετακινούνται μέσω του τριχοειδούς, σύμφωνα με την ηλεκτροφορητική κινητικότητα τους και την ηλεκτροοσμωτική ροή και διαχωρίζονται βάσει μεγέθους. (Σχήμα 1.4) Η ανίχνευση γίνεται με διάφορες 6

μεθόδους ανάλογα με το δείγμα (φασματοφωτομετρία απορρόφησης στο UV, αγωγιμομετρία, φθορισμομετρία). Αφού περάσουν από έναν ανιχνευτή, τα διαχωρισμένα μόρια DNA που εισήχθηκαν, παρουσιάζονται με τη μορφή κορυφών. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του κάθε μορίου και για αυτό είναι δυνατές και ποσοτικές μελέτες. Τυπικά, μια ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές διαρκεί περίπου 20-30min (Stinger, 2005,-Bowser,2005). Σχήμα 1.4 : Σχηματική απεικόνιση της οργανολογίας ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές 1.2.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου αποτελεί εξέλιξη της συμβατικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και έχει ως κύριο χαρακτηριστικό ότι είναι εφικτή η άμεση ταυτοποίηση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των προϊόντων που πολλαπλασιάζονται κατά την αντίδραση, με τη χρήση φθοριζουσών χρωστικών. Η καμπύλη φθορισμομετρικής παρακολούθησης της αντίδρασης με την αύξηση των κύκλων περιλαμβάνει τέσσερα τμήματα: (1) τη γραμμή υποβάθρου (2) την εκθετική φάση, (3) την γραμμική φάση και (4) τη φάση κορεσμού (πλατώ). Αρχικά, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης βρίσκεται στους πρώτους κύκλους και το σήμα του φθορισμού δεν ξεπερνά αυτό του υποβάθρου. Στη συνέχεια, αρχίζει να εμφανίζεται σήμα φθορισμού και στον κύκλο αυτόν έχουμε το λεγόμενο, κατώτερο 7

όριο κύκλου (Ct). Στο τρίτο στάδιο, έχει χαθεί ο εκθετικός χαρακτήρας και η μοριακή ενίσχυση γίνεται γραμμική. Τέλος, στο τελευταίο στάδιο, τα συστατικά της αντίδρασης έχουν εξαντληθεί και η ενεργότητα της Taq DNA πολυμεράσης βρίσκεται στο τέλος της και το σήμα του φθορισμού δεν αυξάνεται πλέον (Σχήμα 1.5) (Jia, 2012). Σχήμα 1.5: Στάδια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Όσο αναφορά τις μεθόδους ανίχνευσης των προϊόντων, έχουν αναπτυχθεί δύο κύριες προσεγγίσεις. Στην πρώτη γίνεται ανίχνευση αλληλουχιών DNA μέσω παρεμβολής φθορίζουσων χρωστικών, ενώ στη δεύτερη γίνεται φθορισμομετρική δοκιμασία υβριδοποίησης είτε μέσω της τεχνικής Taqman είτε μέσω μοριακών πυρσών. 1.2.3.1. Ανίχνευση αλληλουχιών DNA μέσω παρεμβολής φθορίζουσων χρωστικών Σε αυτή τη μέθοδο, χρησιμοποιείται μια χρωστική, συνήθως η SYBR Green I, η οποία συμπλέκεται εκλεκτικά και εκπέμπει φθορισμό, όταν διεγερθεί στα 520 nm. Έτσι, έγινε δυνατή η παρακολούθηση του προϊόντος της PCR σε κάθε κύκλο, μέσω ψηφιακής κάμερας που είναι συνδεδεμένη με τον υπολογιστή. Καθώς ο αριθμός των δίκλωνων μορίων DNA αυξάνεται, αυξάνεται και η ένταση του φθορισμού. Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι η SYBR Green I μπορεί να δεσμευτεί σε οποιοδήποτε μη ειδικό δίκλωνο DNA, ακόμα και σε διμερή εκκινητών, και να δώσει 8

ψευδές σήμα φθορισμού, οπότε είναι κρίσιμη η βελτιστοποίηση των συνθηκών της PCR ώστε να πολλαπλασιάζεται ειδικά, μόνο ο DNA στόχος (Kaltenboeck, 2005). 1.2.3.2 Ανίχνευση αλληλουχιών DNA μέσω φθορισμομετρικής δοκιμασίας υβριδοποίησης Για να εξασφαλιστεί η απαιτούμενη ειδικότητα της μεθόδου, αναπτύχθηκαν φθορισμομετρικές μέθοδοι, οι οποίες βασίζονται στην υβριδοποίηση του προϊόντος της PCR με συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές. Η ανίχνευση σε όλες τις περιπτώσεις βασίζεται στο φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας του φθορισμού (FRET fluorescent resonance energy transfer) Στην πιο διαδεδομένη μέθοδο αυτού του τύπου, χρησιμοποιείται ένα μόριο ανιχνευτής, ο οποίος είναι διπλά ιχνηθετημένος στο 5 -άκρο με ένα φθορίζον μόριοδότη ενέργειας και στο 3 -άκρο με ένα μόριο-δέκτη και εκμεταλλευόμαστε την 5 >3 δράση εξωνουκλεάσης της Taq DNA πολυμεράσης. Όταν ο ανιχνευτής είναι ελεύθερος μέσα στο διάλυμα ή έχει υβριδοποιηθεί στη συμπληρωματική αλληλουχία του εκμαγείου DNA, η απόσταση μεταξύ δότη και δέκτη είναι πολύ μικρή, έχουμε μεταφορά ενέργειας (FRET) και δεν εκπέμπεται φθορισμός από το δότη. Κατά της διάρκεια της επιμήκυνσης, η Taq DNA πολυμεράση υδρολύει το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτή. Πλέον η απόσταση μεταξύ δότη και δέκτη έχει αυξηθεί με επακόλουθη αύξηση της έντασης του φθορισμού. Η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη της ποσότητας της αλληλουχίας που παράγεται σε κάθε κύκλο (Σχήμα 1.6) (Jia, 2012). Σχήμα 1.6: Σχηματική παράσταση της τεχνικής PCR πραγματικού χρόνου 9

1.2.3.3. Μοριακοί πυρσοί (Molecular Beacons) Οι μοριακοί πυρσοί αποτελούν μία εναλλακτική φθορισμομετρική μέθοδο για την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό του προϊόντος PCR. Πρόκειται για ανιχνευτές που αποτελούνται από μια κεντρική ειδική μονόκλωνη αλληλουχία στόχο και από πέντε με επτά συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια που σχηματίζουν ζεύγη βάσεων μεταξύ τους και δημιουργούν τελικά μια φουρκέτα. Στη μία άκρη του ανιχνευτή (συνήθως στο 5 άκρο) υπάρχει μια φθορίζουσα χρωστική, ενώ στο άλλο άκρο είναι συνδεδεμένος ένας αποσβέστης του φθορισμού (Bhadra, 2015). Λόγω της δομής φουρκέτας που σχηματίζεται, ο δότης και ο δέκτης του φθορισμού έρχονται σε πολύ κοντινή απόσταση, προκαλώντας το φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας του φθορισμού (FRET) και έτσι δε παρατηρείται φθορισμός. (Σχήμα 1.7α) Η υβριδοποίηση της ειδικής κεντρικής αλληλουχίας με το DNA στόχο που πολλαπλασιάζεται κατά τους κύκλους της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, οδηγεί σε άνοιγμα της φουρκέτας, οπότε ο δότης με το δέκτη φθορισμού απομακρύνονται, με αποτέλεσμα να έχουμε εκπομπή φθορισμού από το δότη. (Σχήμα 1.7β,γ) Ο διαχωρισμός των δύο κλώνων της φουρκέτας, οφείλεται στο ότι το υβρίδιο του ανιχνευτή με το DNA στόχο είναι πιο μακρύ και σταθερό από ότι το υβρίδιο της αναδίπλωσης (Zereda, 2013). (α) (β) (γ) Σχήμα 1.7: (α) Δομή ενός μοριακού πυρσού (β) Μηχανισμός δράσης του μοριακού πυρσού (γ) Διάγραμμα έντασης φθορισμού (Monroy-Contreras, 2011) 10

1.2.4. Ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης με χρήση εσωτερικού προτύπου Μία διαδεδομένη προσέγγιση της ποσοτικής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, (QPCR), συμπεριλαμβάνει τον ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό μαζί με το DNA-στόχο, και μιας ανταγωνιστικής συνθετικής αλληλουχίας DNA, του εσωτερικού προτύπου. Το εσωτερικό πρότυπο πρέπει να μοιάζει με τον DNA στόχο, αλλά να διαφέρει τόσο, ώστε να μπορεί να γίνει ο διαχωρισμός των δύο αλληλουχιών. Όταν η ανίχνευση γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, συνήθως το εσωτερικό πρότυπο παρασκευάζεται με προσθήκη ή απαλοιφή μιας αλληλουχίας τέτοιου μεγέθους, έτσι ώστε να είναι εφικτός ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός τους. Στη συνέχεια, κάθε δείγμα ογκομετρείται με το εσωτερικό πρότυπο. Αυτό επιτυγχάνεται με προσθήκη μεταβλητών συγκεντρώσεων εσωτερικού προτύπου σε σταθερή συγκέντρωση του DNA στόχου και πραγματοποίηση PCR και ηλεκτροφόρησης. Το ισοδύναμο σημείο υπολογίζεται εκεί όπου οι δύο ζώνες τις ηλεκτροφόρησης (του DNA στόχου και του εσωτερικού προτύπου), μετά από πυκνομετρική ανάλυση, είναι ίσες. Η χρήση του εσωτερικού προτύπου αντισταθμίζει τις διακυμάνσεις που μπορεί να παρουσιάζει η ενίσχυση του DNA στόχου, αλλά και τυχόν αναστολείς που μπορεί να υπάρχουν στην PCR, καθώς επηρεάζουν το ίδιο και το DNA στόχο και το εσωτερικό πρότυπο. Έτσι, η αναλογία των ποσοτήτων των προϊόντων PCR που θα προκύψουν είναι ανάλογες με την αντίστοιχη αναλογία των αρχικών ποσοτήτων DNA. Αυτή η τεχνική όμως έχει το μειονέκτημα της χαμηλής απόδοσης, καθώς απαιτούνται πολλές αντιδράσεις πολλαπλασιασμού. Εναλλακτικά, για να ξεπεραστεί το παραπάνω πρόβλημα, οι δύο αλληλουχίες διαχωρίζονται με δοκιμασία υβριδοποίησης. Σε αυτή την περίπτωση, το εσωτερικό πρότυπο έχει το ίδιο ακριβώς μέγεθος με τον DNA στόχο, αλλά διαφέρει σε μια περιοχή (στο κέντρο συνήθως της αλληλουχίας) 20-25 βάσεων. Για την σύνθεση αυτού του εσωτερικού προτύπου χρησιμοποιείται συνήθως η PCR ως συνθετικό εργαλείο. Πιο συγκεκριμένα, το αρχικό εκμαγείο είναι ο DNA στόχος και δημιουργούνται δύο νέες DNA αλληλουχίες που έχουν μια συμπληρωματική περιοχή μεταξύ τους. Στην συνέχεια, αυτά τα δύο τμήματα, υποβάλλονται σε μία αντίδραση συνένωσης (PCRlike) για να δημιουργήσουν την αλληλουχία του εσωτερικού προτύπου (Σχήμα 1.8.) (Christopoulos, 2006). 11

Σχήμα 1.8: Αρχή της μεθόδου σύνθεσης εσωτερικού προτύπου, χρησιμοποιώντας την PCR ως συνθετικό εργαλείο. 1.2.5. Άλλες τεχνικές ανίχνευσης προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Πέρα από τις τεχνικές που περιγράφηκαν και αποτελούν τις πλέον διαδεδομένες και σύγχρονες για τις ανίχνευση προϊόντων PCR είτε μετά το τέλος της αντίδρασης (ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές, ποσοτική αντίδραση πολυμεράσης με χρήση εσωτερικού προτύπου) είτε κατά τη διάρκεια της (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου με χρήση φθορίζουσων χρωστικών και με φθορισμομετρική υβριδοποίηση), έχουν αναπτυχθεί και άλλες μέθοδοι, μερικές εκ των οποίων είναι: Υγροχρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Χρήση ραδιενεργών ιχνηθετών Χρήση μη ραδιενεργών ιχνηθετών (θα γίνει εκτενής αναφορά στο κεφ. 5 και 6) Αλληλούχιση Δοκιμασίες υβριδοποίησης Βιοαισθητήρες (θα γίνει εκτενής αναφορά στο κεφ. 4 ) 12

Κεφάλαιο 2 Μέθοδοι γονοτύπισης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών 2.1.Εισαγωγή Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms-SNPs) αποτελούν τον πιο κοινό τύπο διαφοροποίησης του DNA. Πρόκειται για διαφοροποίηση μίας μόνο βάσης στην αλληλουχία του DNA (Σχήμα 2.1). Η διαφοροποίηση αυτή προκύπτει με αντικατάσταση μία εκ των τεσσάρων αζωτούχων βάσεων με κάποια άλλη. Αλλαγές συμβαίνουν ανά 1000 βάσεις ανάμεσα στις 3*109 βάσεις του ανθρώπινου γονιδιώματος και υπολογίζεται ότι υπάρχουν πάνω από 1.42 εκατομμύρια SNPs (Sachidanandam, 2001). Επειδή τα SNPs μπορεί να επηρεάσουν τη λειτουργία του γονιδίου, θεωρούνται ως νέοι βιοδείκτες για τη διάγνωση μιας νόσου, για την εκτίμηση γενετικής προδιάθεσης ασθενειών και για φαρμακογενετική εξέταση. Σχήμα 2.1: Σχηματική απεικόνιση του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού Έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι για την γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Οι κυριότερες είναι: Πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικού τμήματος (RFLP) Αλληλόμορφο ειδική υβριδοποίηση με ολιγονουκλεοτίδια (ASO) Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) Αντίδραση λιγάσης (OLA) 13

2.2 Πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικού τμήματος (RFLP) Ο πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικού τμήματος (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP) ήταν μία από τις πρώτες τεχνικές που χρησιμοποιήθηκε στην ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Βασίζεται στην ιδιότητα των περιοριστικών ενδονουκλεασών να κόβουν τη δίκλωνη αλληλουχία σε ειδικά σημεία. Πιο συγκεκριμένα, τα προϊόντα PCR που περιέχουν τον υπό εξέταση πολυμορφισμό κόβονται με συγκεκριμένες περιοριστικές ενδονουκλεάσες που επιλέγονται ειδικά για την αλλαγή βάσης στη θέση του SNP, με αποτέλεσμα το ένζυμο να κόβει το ένα αλληλόμορφο αλλά όχι το άλλο. (Σχήμα 2.2.α) Αυτό έχει ως συνέπεια την αλλαγή στον αριθμό και στο μέγεθος των θραυσμάτων που θα προκύψουν. Έτσι, είναι δυνατή η αναγνώριση του σημείου αλλαγής της βάσης μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, οδηγώντας στην ανίχνευση και στο χαρακτηρισμό του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (Σχήμα 2.2.β). (α) (β) Σχήμα 2.2: (α) Αρχή της μεθόδου πολυμορφισμού μεγέθους περιοριστικού τμήματος (β) Ηλεκτροφόρηση ενός αλληλόμορφου που δεν κόπηκε από την περιοριστική ενδονουκλεάση και ενός άλλου που κόπηκε Λόγω του περιορισμένου αριθμού περιοριστικών ενζύμων, η τεχνική αυτή δεν προσφέρεται για αυτοματοποίηση (Gut, 2001). Επίσης δεν είναι όλες οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες κατάλληλες για κάθε θέση μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού. Ένας δεύτερος περιορισμός της μεθόδου είναι ότι το ένζυμο κόβει το προϊόν PCR και σε άλλα σημεία, δημιουργώντας και πολλά άλλα θραύσματα που δυσκολεύουν την ταυτοποίηση των αλληλουχιών που μας ενδιαφέρουν (Parsons, 1997). 14

2.3. Υβριδοποίηση με αλληλομορφοειδικά ολιγονουκλεοτίδια (ASO) Μία άλλη τεχνική για τη γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών είναι η υβριδοποίηση με αλληλομορφοειδικά ολιγονουκλεοτίδια (Allele specific oligonucleotide hybridization-aso). Σε αυτή την προσέγγιση, σχεδιάζονται δύο ειδικοί ανιχνευτές που υβριδοποιούνται πλήρως με το κάθε αλληλόμορφο. Κάτω από βελτιστοποιημένες συνθήκες, η αλλαγή της μίας βάσης στο κάθε αλληλόμορφο είναι αρκετή για να αποσταθεροποιήσει την υβριδοποίηση και αποτρέπει να ενωθεί ο ανιχνευτής με την αλληλουχία-στόχο. (Σχήμα 2.3) Σε αυτή τη μέθοδο δε γίνεται χρήση κάποιου ενζύμου και έτσι πρόκειται για την πιο απλή μέθοδο γονοτύπισης. Η πρόκληση στην αναγνώριση του κάθε αλληλίου βρίσκεται στο σχεδιασμό των ανιχνευτών και στη βελτιστοποίηση των συνθηκών υβριδοποίησης (Kwok, 2001). Σχήμα 2.3: Αρχή της μεθόδου της υβριδοποίησης με αλληλομορφοειδικά ολιγονουκλεοτίδια. Η υβριδοποίηση πραγματοποιείται μόνο όταν ο ανιχνευτής είναι πλήρως συμπληρωματικός με τον DNA στόχο. Η ανίχνευση των αλληλόμορφων μετά την υβριδοποίηση γίνεται με ακινητοποίηση του ανιχνευτή ή του DNA-στόχου σε στερεή επιφάνεια. Στη πρώτη περίπτωση, ο DNA-στόχος που φέρει την πολυμορφική βάση είναι επισημασμένος, ενώ στη δεύτερη ο ανιχνευτής φέρει ένα μόριο-ιχνηθέτη. Σε κάθε περίπτωση αφού γίνει η υβριδοποίηση, γίνεται έκπλυση της περίσσειας του DNA στόχου ή του ανιχνευτή που δεν έχει αντιδράσει και στη συνέχεια ανίχνευση του ιχνηθέτη. 15

2.4. Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή (Primer Extension Reaction- PEXT) αποτελεί μία πολύ ισχυρή και διαδεδομένη μέθοδο για τη διάκριση αλληλόμορφων. Βασίζεται στην ιδιότητα του ενζύμου DNA πολυμεράση να εισάγει δεοξυριβονουκλεοτίδια μόνο όταν αυτά είναι πλήρως συμπληρωματικά με την αλληλουχία του εκμαγείουdna. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, όμως η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη είναι αυτή στην οποία γίνεται αλληλόμορφο-ειδική επέκταση. Σε αυτή την παραλλαγή χρησιμοποιούνται δύο ειδικοί εκκινητές, καθένας συμπληρωματικός προς το κάθε αλληλόμορφο του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού. Το προϊόν PCR που φέρει την πολυμορφική βάση, χρησιμοποιείται ως εκμαγείο και μόνο όταν είναι πλήρως συμπληρωματικό με τον PEXT εκκινητή, η DNA πολυμεράση τον επιμηκύνει. (Σχήμα 2.4) Η DNA πολυμεράση, που χρησιμοποιείται, δεν έχει δράση εξωνουκλεάσης και έτσι δεν διορθώνει την αλλαγή της μίας βάσης. Η ταυτοποίηση του αλληλίου προκύπτει από τον εάν σχηματίστηκε προϊόν επέκτασης (Kwok, 2001). Η ανίχνευση των προϊόντων αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, γίνεται είτε εισάγοντας απευθείας κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ένα μόριο-ιχνηθέτη (π.χ βιοτίνη), είτε υβριδοποιώντας το προϊόν PEXT με ένα ανιχνευτή ο οποίος είναι επισημασμένος. Σε κάθε περίπτωση όμως γίνεται ανίχνευση του μορίου-ιχνηθέτη. Σχήμα 2.4: Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. Ο εκκινητής επεκτείνεται από την DNA πολυμεράση μόνο όταν είναι πλήρως συμπληρωματικός με το DNA στόχο που φέρει την πολυμορφική βάση 16

2.5 Αντίδραση λιγάσης (OLA) Η αντίδραση λιγάσης (Oligonucleotide Ligation Assay-OLA) είναι επίσης μία τεχνική η οποία έχει χρησιμοποιηθεί για τη γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Βασίζεται στην ιδιότητα της DNA λιγάσης να καταλύει το σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα στη φωσφορική ομάδα που βρίσκεται στο 5 άκρο μιας αλυσίδας και στην υδροξυλομάδα που βρίσκεται στο 3 άκρο μίας άλλης αλυσίδας, μόνο εάν τα ολιγονουκλεοτίδια είναι πλήρως συμπληρωματικά με το εκμαγείο DNA. Η μέθοδος για τη ταυτοποίηση του κάθε αλληλίου περιλαμβάνει το σχεδιασμό τριών ανιχνευτών. Ο ένας είναι κοινός και για τα δύο αλλήλια και οι άλλοι δύο είναι ειδικοί για το κάθε αλληλόμορφο (Hansen, 1995). Έτσι, ο DNA στόχος που φέρει τη πολυμορφική βάση, αφού αποδιαταχθεί, υβριδοποιείται με τους δύο ανιχνευτές (τον κοινό και τον αλληλομορφο-ειδικό), έτσι ώστε το 3 άκρο του ενός να είναι δίπλα στο 5 άκρο του άλλου. Η DNA λιγάση θα συνδέσει τα δύο αλληλόμορφα με φωσφοδιεστερικό δεσμό, μόνο εάν είναι πλήρως συμπληρωματικά με το DNA στόχο. (Σχήμα 2.5) (Kwok, 2001). Σχήμα 2.5: Αρχή της μεθόδου της αντίδρασης λιγάσης. Η DNA λιγάση ενώνει τους δύο ανιχνευτές μόνο εάν είναι πλήρως συμπληρωματικοί με το εκμαγείο DNA. Για την ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης λιγάσης, και οι δύο ανιχνευτές είναι επισημασμένοι. Η μία επισήμανση χρησιμεύει για την ακινητοποίηση του προϊόντος σε στερεή επιφάνεια και η άλλη για ανίχνευση του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (Cao,2001). 17

Κεφάλαιο 3 Χημειο(Βιο)φωταυγείς ιχνηθέτες σε αναλύσεις DNA 3.1. Εισαγωγή Όλες οι χημικές αντιδράσεις συνοδεύονται από ενεργειακές αλλαγές, οι οποίες αποδίδονται συνήθως με μορφή θερμότητας. Ωστόσο, σε ορισμένες αντιδράσεις, η μεταβολή της ενέργειας οδηγεί σε εκπομπή φωτός σε μήκη κύματος μεταξύ του εγγύς υπερύθρου και του εγγύς υπεριώδους. Αυτό το φαινόμενο καλείται χημειοφωταύγεια, και έχει παρατηρηθεί τόσο σε ζώντες οργανισμούς, όσο και σε in vitro αντιδράσεις με συνθετικές ενώσεις. Πιο συγκεκριμένα, κατά τη χημειοφωταύγεια, λαμβάνει χώρα μια χημική αντίδραση, κατά την οποία προκύπτει ένα προϊόν σε διεγερμένη κατάσταση, το οποίο επιστρέφοντας στη βασική του κατάσταση, εκπέμπει φωτόνια (Barnett, 2014). Όταν το φαινόμενο αυτό παρατηρείται σε βιολογικά συστήματα ονομάζεται βιοφωταύγεια. Σχήμα 3.1: Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης χημειοφωταύγειας. Η χημειοφωταύγεια έχει χρησιμοποιηθεί ως αναλυτικό εργαλείο, διότι η εκπομπή φωτός είναι άμεσα συνδεδεμένη με τη συγκέντρωση της ποσότητας του προϊόντος που φωταυγάζει. Εφαρμογές της χημειοφωταύγειας σε υγρή κατάσταση έχουν παρατηρηθεί από τη δεκαετία του 1970 και σε αέρια κατάσταση από τη δεκαετία του 1980. 3.1.1. Απόδοση της αντίδρασης χημειοφωταύγειας Όπως αναφέρθηκε, η χημειοφωταύγεια περιλαμβάνει μια διαδικασία φωταύγειας και μια χημική αντίδραση. Κατά συνέπεια, η παρατηρούμενη εκπομπή φωτός, εξαρτάται από την απόδοση της αντίδρασης, από το ποσοστό των προϊόντων που διεγείρονται, και από την απόδοση της εκπομπής φωτός. Οι περισσότερες χημειοφωταυγείς αντιδράσεις, με εξαίρεση τις ενζυμικές βιοφωταυγείς, έχουν 18

σχετικά χαμηλές κβαντικές αποδόσεις, σε σχέση με τη φωτοφωταύγεια. Παρόλ αυτά, παραμένουν μια ελκυστική εναλλακτική τεχνική στη χημική ανάλυση, εξαιτίας: (1) της βελτίωσης του λόγου σήματος προς θόρυβο λόγω της απουσίας πηγής ακτινοβολίας διέγερσης, (2) της απλής και οικονομικής οργανολογίας, και (3) της αυξημένης ειδικότητας λόγω του περιορισμένου αριθμού αντιδράσεων που καταλύουν και των περιορισμένων υποστρωμάτων τους. Η ενέργεια για τη δημιουργία μιας διεγερμένης κατάστασης προέρχεται από τη χημική αντίδραση. Για εκπομπή φωτός στη περιοχή του εγγύς υπέρυθρου έως του εγγύς υπεριώδους, χρειάζεται ενέργεια της τάξης 130-270 kj*mol-1. Η ενέργεια αυτή προκύπτει είτε από τη διάσπαση ενός δεσμού ή από μεταφορά ηλεκτρονίων. Σε συστήματα που περιλαμβάνουν διάσπαση δεσμού, (π.χ. λουμινόλη), το αντιδραστήριο μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο μια φορά. Αντίθετα, σε μερικές αντιδράσεις μεταφοράς ηλεκτρονίων, που δε περιλαμβάνουν σπάσιμο δεσμού ή αναδιάταξη προϊόντων, τα αντιδραστήρια μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν (Barnett, 2014) (Baldwin, 2013). 3.2. Χημειο/Βιο-φωταυγείς ιχνηθέτες Στην πλειονότητα των χημειοφωταυγών αντιδράσεων λαμβάνει χώρα μια οξείδωση, η οποία παρέχει τη σχετικά υψηλή ενέργεια που χρειάζεται για τη διέγερση. Έχει αναπτυχθεί πληθώρα τέτοιων συστημάτων, που έχουν χρησιμοποιηθεί σε πλήθος μεθόδων ανάλυσης DNA και αποτελούν κοινά αντιδραστήρια για τη διεξαγωγή προσδιορισμών. Στη συνέχεια θα παρουσιαστούν τα πιο κοινά χημειοφωταυγειομετρικά και βιοφωταυγειομετρικά συστήματα, καθώς και ένα παράδειγμα φωτοπρωτεϊνών. 3.2.1. Χημειοφωταυγείς ιχνηθέτες Παρόλο που έχει παρατηρηθεί και μελετηθεί ένας μεγάλος αριθμός χημειοφωταυγών ιχνηθετών, μόνο ένας περιορισμένος αριθμός αντιδραστηρίων είναι υπεύθυνος για τη πλειονότητα των αναλυτικών εφαρμογών. Χαρακτηριστικότερα παραδείγματα χημειοφωταυγειομετρικών ιχνηθετών είναι η 19

λουμινόλη και οι εστέρες της ακριδίνης, ενώ και τα διαρυλοξαλικά, οι διοξετάνες, τα υποαλογονούχα και το τρις(2,2 - διπυριδύλιο) ρουθήνιο έχουν χρησιμοποιηθεί για αυτούς τους σκοπούς (Barnett, 2014). 3.2.1.1. Λουμινόλη Η φύση της χημειοφωταύγειας της 5-αμινο-2,3-διυδρο-1,4-φθαλαζινεδιόνη,γνωστή ως λουμινόλη, αναφέρθηκε πρώτα από τον Albrecht το 1928. Ο χαρακτηρισμός της κινητικής της αντίδρασης μελετήθηκε για περισσότερο από τρεις δεκαετίες. Η λουμινόλη οξειδώνεται σχεδόν ποσοτικά προς το διεγερμένο ιόν του 3- αμινοφθαλικού σε αλκαλικά υδατικά διαλύματα και εκπέμπει φως στα 425nm (Σχήμα 3.2α). Η ταυτότητα των εκπεμπόμενων σωματιδίων επιβεβαιώθηκε από τα φάσματα χημειοφωταύγειας και φθορισμού του 3-αμινοφθαλικού. Ωστόσο, στις εκπομπές φωταύγειας παρατηρήθηκε μια μετατόπιση του μήκους κύματος προς το ερυθρό ανάμεσα σε διαλύτες όπως το νερό (λmax= 420 nm) και το διμεθυλοσουλφοξείδιο (λmax= 500 nm). Η μετατόπιση αυτή από την περιοχή του μπλε στο κιτρινοπράσινο μπορεί να εξηγηθεί από την ταυτομέρεια του διεγερμένου προϊόντος σε απρωτικό διαλύτη πριν από την εκπομπή φωτονίων (Σχήμα 3.2β). (α) (β) Σχήμα 3.2: (α) Αντίδραση της λουμινόλης (β) ταυτομέρεια του διεγερμένου προϊόντος Ο πιο διαδεδομένος προτεινόμενος μηχανισμός της αντίδρασης λουμινόλης περιλαμβάνει την οξείδωση του κυκλικού τμήματος της διακυλ υδραζίνης για να δώσει αζωκινόνη. Στη συνέχεια είναι απαραίτητη η παρουσία ενός οξειδωτικού (συνήθως υπεροξείδιο του υδρογόνου), έτσι ώστε να προκύψει πυρηνόφιλη 20

προσβολή από το ιόν του υπεροξειδίου και να δώσει το διεγερμένο προϊόν (Σχήμα 3.3.). Σχήμα 3.3: Προτεινόμενος μηχανισμός της αντίδρασης λουμινόλης Για να πραγματοποιηθεί η οξείδωση της λουμινόλης είναι απαραίτητος και ένας καταλύτης για να ενεργοποιήσει την αντίδραση. Οι πιο συνηθισμένοι καταλύτες είναι τα ιόντα μετάλλου μετάπτωσης, το εξακυανοσιδηρικό (ΙΙΙ) και οι πρωτεϊνες της αίμης (αιμοσφαιρίνη, υπεροξειδάση, καταλάση και κυτοχρώματα) (Barnett, 2014). Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του οξειδωτικού, του καταλύτη και για παράγωγα που προκύπτουν από την αντίδραση. 3.2.1.2. Εστέρες της ακριδίνης Η σύνθεση και η εφαρμογή των εστέρων της ακριδίνης σε αναλυτικές μεθόδους αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1977. Οι εστέρες της ακριδίνης αντιδρούν με υπεροξείδιο του υδρογόνου σε αλκαλικό περιβάλλον για να αποδώσουν τη Νμεθυλοακριδόνη, σε διεγερμένη κατάσταση, η οποία στη συνέχεια εκπέμπει ακτινοβολία στα 450 nm (Σχήμα 3.4). Η αντίδραση χημειοφωταύγειας μεταξύ του εστέρα της ακριδίνης και του υπεροξειδίου του υδρογόνου δεν απαιτεί καταλύτη. Οι εστέρες της ακριδίνης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό του υπεροξειδίου του υδρογόνου αλλά και σε ανοσοδοκιμασίες και ως ιχνηθέτης σε DNA ανιχνευτές. Καθώς δεν απαιτείται καταλύτης, ο εστέρας της ακριδίνης χρειάζεται χαμηλότερη ενέργεια για να φτάσει στο διεγερμένο προϊόν σε σχέση με 21

την οξείδωση της λουμινόλης και ως εκ τούτου έχει κατώτερα όρια ανίχνευσης. Για να ξεκινήσει η αντίδραση απαιτείται ένα ισχυρά αλκαλικό διάλυμα (ph 12-13), και οι εστέρες της ακριδίνης υφίστανται μια αναστρέψιμη μετατροπή στη μηχημειοφωταυγειογόνο μορφή της ψευδοβάσης, (Σχήμα 3.4) η οποία αποσυντίθεται αργά. Στη συνέχεια, προστίθεται το υπεροξείδιο του υδρογόνου ώστε να μετατραπεί η ψευδοβάση στον εστέρα της ακριδίνης πριν ξεκινήσει η αντίδραση χημειοφωταύγειας σε διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (Barnett, 2014). Σχήμα 3.4: Αντίδραση του εστέρα της ακριδίνης 3.2.2. Ενζυμικοί ιχνηθέτες με χημειοφωταυγειογόνα υποστρώματα Συγκεκριμένα ένζυμα έχουν χρησιμοποιηθεί συχνά ως ιχνηθέτες, επειδή επιτρέπουν την ανάπτυξη ενός ευρέως φάσματος προσδιορισμών. Οι ενζυμικοί ιχνηθέτες προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα ως ιχνηθέτες λόγω της εγγενούς καταλυτικής ενίσχυσή του σήματος, της συμβατότητας με άλλα αντιδραστήρια ανιχνεύσεως, της σταθερότητας, της εξειδίκευσης, της δυνατότητας επιλογής των υποστρωμάτων και της καλώς χαρακτηρισμένη κινητική των αντιδράσεών τους. Οι δοκιμασίες για ένζυμα που βασίζονται στη μέτρηση της εκπομπής φωτός έχουν αυξανόμενη εφαρμογή. Πιο συγκεκριμένα, τα ένζυμα που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε τέτοιες δοκιμασίες είναι η αλκαλική φωσφατάση, η υπεροξειδάση και η γαλακτοσιδάση (Bronstein, 1989). 22

3.2.2.1. Αλκαλική φωσφατάση (ALP) Η αλκαλική φωσφατάση είναι ένα μεταλλοένζυμο, μοριακής μάζας 140 kda, δεσμευμένο σε μεμβράνη και αποτελείται από μια ομάδα ισοενζύμων (Goltzman, 2004). Έχει την ιδιότητα ότι καταλύει την υδρόλυση μιας μονοεστεροποιημένης φωσφορικής ομάδας του υποστρώματος. Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα υποστρώματα για την ανίχνευση της αλκαλικής φωσφατάσης (π-νιτροφαινόλη, λουμινόλη), όμως τα πιο συνηθισμένα είναι τα χημειοφωταυγειογόνα παράγωγα του 1,2- διοξετάνιου. Πιο συγκεκριμένα, τα 1,2-αρυλ-φωσφορικά διοξετάνια, χρησιμοποιούνται σε μια χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση καταλυόμενη από την αλκαλική φωσφατάση σε μια αντίδραση δύο σταδίων. Αρχικά, γίνεται ενζυμική αποφωσφορυλίωση του υποστρώματος, παράγοντας ένα ενδιάμεσο ιόν, το οποίο στη συνέχεια αποσυντίθεται σταδιακώς, δημιουργώντας ένα διεγερμένο προϊόν, το οποίο αποδιεγερόμενο εκπέμπει φως, στα 470 nm για πάνω από 60 min (Σχήμα 3.5) (Kricka,2000-Bronstein, 1989). Σχήμα 3.5: Χημειοφωταυγής αντίδραση της αλκαλικής φωσφατάσης, με χρήση υποστρώματος 1,2-αρυλ-φωσφορικό διοξετάνιο. 3.2.2.2 Υπεροξειδάση (HRP) Η υπεροξειδάση των αγριοραφανίδων (Horseradish Peroxidase) είναι μια αιμοπρωτεΐνη μοριακής μάζας 44 kda, που αποτελείται από την ομάδα της αίμης, 2 ιόντα Ca2+ και 308 κατάλοιπα αμινοξέων. Η ενζυμική της δράση, οφείλεται στην αναγωγή και στην οξείδωση του ατόμου του σιδήρου της αίμης και έτσι μπορεί να καταλύσει την οξείδωση διάφορων ενώσεων χρησιμοποιώντας το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Meunier, 2003). Σε συνδυασμό με το υπεροξείδιο του υδρογόνου διάφορα υποστρώματα έχουν χρησιμοποιηθεί, με επικρατέστερο να είναι το 23

χημειοφωταυγειογόνο μόριο της λουμινόλης. Όπως προαναφέρθηκε, η λουμινόλη οξειδώνεται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου για να προκύψει 3-αμινοφθαλικό σε διεγερμένη κατάσταση (Σχήμα 3.3). Οι εστέρες της ακριδίνης έχουν χρησιμοποιηθεί επίσης ως υποστρώματα της υπεροξειδάσης. 3.2.3. Βιοχημειοφωταυγείς ιχνηθέτες Στην πλειονότητα των χημικών αντιδράσεων βιοφωταύγειας λαμβάνει χώρα η γενική αντίδραση (Σχήμα 3.6) Σχήμα 3.6: Γενική αντίδραση βιοφωταύγειας Ως λουσιφερίνη (luciferin) ορίζεται η φωταυγάζουσα ένωση και ως λουσιφεράση (luciferase) το ένζυμο που προκαλεί την οξείδωση της λουσιφερίνης (Widder, 2014). Υπάρχουν τέσσερα κύρια είδη λουσιφερινών που είναι υπεύθυνα για τις βιοφωταυγάζουσες χημικές αντιδράσεις, κυρίως στο υδάτινο περιβάλλον. Αντίθετα, οι λουσιφεράσες και οι φωτοπρωτεΐνες είναι μοναδικές για κάθε αντίδραση και έχουν διαφορετική προέλευση. Τα κύρια είδη λουσιφερινών είναι η βακτηριακή, των δινοφυκών, της κυπριδίνης και η σελεντεραζίνη (Σχήμα 3.7). 24 Σχήμα 3.7: Χημικές δομές των γνωστών λουσιφερινών

a. Βακτηριακή : Η βακτηριακή φωταύγεια περιλαμβάνει την οξείδωση της φλαβίνης (FMNH) μαζί με μία αλδεΰδη μακριάς αλυσίδας και μια λουσιφεράση δύο υπομονάδων. Στην αντίδραση παρέχονται συνεχώς τα δύο υποστρώματα, με τη μειωμένη φλαβίνη να προέρχεται από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και την αλδεΰδη να ανασυντίθεται με την αναγωγάση των λιπαρών οξέων.η συνεχής τροφοδότηση αυτή επιτρέπει την αδιάκοπη εκπομπή φωτός, φαινόμενο ιδιαιτέρως σπάνιο καθώς η πλειονότητα των βιοφωταυγάζοντων οργανισμών εκπέμπουν ασυνεχές φως (Σχήμα 3.8). Σχήμα 3.8: Στη βακτηριακή αντίδραση βιοφωταύγειας, η βακτηριακή λουσιφεράση καταλύει την οξείδωση της FMNH και μιας λιπαρής αλδεΰδης μακράς αλυσίδας με μοριακό οξυγόνο που έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή μπλε- πράσινου φωτός (Widder, 2014). b. Η λουσιφερίνη των δινοφυκών: Η λουσιφερίνη των δινοφυκών είναι ένα τετραπυρρόλιο παρόμοιο με την χλωροφύλλη που διαφέρει κυρίως στα μεταλλικά ιόντα που φέρει. Έτσι οι δύο ενώσεις θα μπορούσαν να αλληλομετατρέπονται σε ένα κύκλο μέρας νύχτας, όπου τα κύτταρα θα εναλλάσσονται μεταξύ φωτοσύνθεσης και φωταύγειας. Ενδοκυτταρικά, η εκπομπή φωτός από τα δινοφύκη είναι ευαίσθητη στο ph, λόγω δύο παραγόντων. Πρώτον, η τριτοταγής δομή της λουσιφεράσης δείχνει ότι μια αλλαγή στη συγκέντρωση ιόντων H+, προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση του ενζύμου, εκθέτοντας το ενεργό της κέντρο στην λουσιφερίνη, με αποτέλεσμα την παραγωγή φωτός στα 479nm. Επιπλέον η λουσιφερίνη μπορεί να συνδέεται σε μια πρωτεΐνη λουσιφεράση ευαίσθητη στο ph, η οποία συγκρατεί την λουσιφερίνη έως ότου το ph μειωθεί. 25

c. Η λουσιφερίνη της κυπριδίνης: Αυτή η λουσιφερίνη βρίσκεται κυρίως στα κυπρινοειδή οστρακοειδή και στα ψάρια midshipman. Γενικά έχει αποδειχθεί με τη χρήση ισοτόπων αμινοξέων ότι τα όστρακα συνθέτουν τη συγκεκριμένη λουσιφερίνη από τρυπτοφάνη, ισολευκίνη και αργινίνη καταλήγοντας σε μία ιμαδαζοπυραζίνη, αλλά οι λεπτομέρειες της σύνθεσης είναι άγνωστες. d. Σελεντεραζίνη: Η σελεντεραζίνη είναι μια ιμιδαζοπυραζίνη, συντιθέμενη κυρίως από φαινυλαλανίνη και δύο τρυπτοφάνες. Η σελεντεραζίνη και τα ανάλογά της είναι ασταθή σε απρωτικούς διαλύτες, όπως το DMSO ή το DMF εξαιτίας της χημειοφωταύγειας μέσω της αντίδρασης με το οξυγόνο. Το κύριο χαρακτηριστικό της σελεντεραζίνης είναι ότι εμφανίζεται σε συνδυασμό και με λουσιφεράσες και με φωτοπρωτεΐνες (Widder, 2014). 3.2.4. Φωτοπρωτεΐνες Σε εναλλακτικές περιπτώσεις η αντίδραση βιοφωταύγειας καταλύεται από φωτοπρωτεΐνες (photoproteins), στις οποίες οι άλλοι παράγοντες που χρειάζονται για την εκπομπή φωτός (συμπεριλαμβανομένων της λουσιφερίνης και του O 2 ) είναι ενωμένοι σαν μια μονάδα. Οι οργανισμοί με φωτοπρωτεΐνες αντί για λουσιφεράσες, ως κέντρο ελέγχου της εκπομπής φωτός, χρησιμοποιούν είτε μια δεσμευτική πρωτεΐνη, είτε απομονώνουν τις δύο ενώσεις ξεχωριστά για να ελέγξουν την έκθεση της λουσιφερίνης στην οξείδωση (Haddock, 2010). Πιο συγκεκριμένα, οι φωτοπρωτεΐνες αποτελούνται από μία αποπρωτεΐνη και ένα μη ομοιοπολικά δεσμευμένο χρωμοφόρο, που δημιουργείται από συνδυασμό μιας λουσιφερίνης τύπου σελεντεραζίνης και μοριακού οξυγόνου. Απουσία επιπλέον μοριακού οξυγόνου, η δέσμευση των ιόντων ασβεστίου προκαλεί την παραγωγή ορατού φωτός. Η δέσμευση αυτή των ιόντων ασβεστίου, που δρα ως συμπαράγοντας στην περίπτωση αυτή, επιφέρει οξείδωση της σελεντεραζίνης σε διεγερμένο σελεντεραμίδιο αποδίδοντας φως στα 465nm. Η πρώτη φωτοπρωτεΐνη, η aequorin (αικουορίνη), ανακαλύφθηκε, απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε από την υδρομέδουσα Aequorea victoria και στην συνέχεια κλωνοποιήθηκε. Η αικουορίνη συνίσταται από δύο διακριτές μονάδες, την αποαικουορίνη (αποπρωτεΐνη) και την λουσιφερίνη σελεντεραζίνη. Η 26

αποακουορίνη είναι μία πολυπεπτιδική αλυσίδα 189 αμινοξέων και έχει ειδικές θέσεις πρόσδεσης μοριακού οξυγόνου με την μορφή υπεροξειδίου. Εν τέλει οι δύο αυτές διακριτές μονάδες συνδέονται μεταξύ τους αυθόρμητα, σχηματίζοντας την λειτουργική πρωτεΐνη (Σχήμα 3.9) (Shimomura,2005). Επίσης, η αικουορίνη έχει τρεις περιοχές δέσμευσης ιόντων ασβεστίου. Η δέσμευση των ιόντων ασβεστίου προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση της πρωτεΐνης, η οποία καταλύει την οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση της σελεντεραζίνης, από το δεσμευμένο οξυγόνο, παράγοντας το διεγερμένο ενδιάμεσο του σελεντεραμιδίου. Η αποδιέγερση του σελεντεραμιδίου προκαλεί εκπομπή φωτός (Σχήμα 3.10) (Ohmiya, 1996). Σχήμα 3.9: Συνοπτική αντίδραση της αικουορίνης Σχήμα 3.10:Βιοφωταυγής αντίδραση της σελεντεραζίνης στην αικουορίνη 27

3.3. Εφαρμογές στις αναλύσεις DNA Τα χημειο(βιο)φωταυγή συστήματα χρησιμοποιούνται, είτε μόνα τους, είτε με άλλες ενζυμικές αντιδράσεις για την ανίχνευση πολλών αναλυτών, εκμεταλλευόμενοι την υψηλή ανιχνευσιμότητα της χημειοφωταύγειας για τη πραγματοποίηση γρήγορων και ευαίσθητων αναλύσεων. Γενικά, αυτά τα συστήματα έχουν χρησιμοποιηθεί για προσδιορισμό υποστρωμάτων και συμπαραγόντων, για παρακολούθηση αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών και διαμορφωτικών αλλαγών των βιομορίων, για δοκιμασίες που χρησιμοποιούν βιοχημειοφωταυγειογόνα βακτήρια και για απεικόνιση in vitro και in vivo (Roda, 2012). Η εφαρμογή όμως που θα επικεντρωθεί η παρούσα εργασία, όσο σε θεωρητικό όσο και σε πρακτικό υπόβαθρο, είναι οι δοκιμασίες υβριδοποίησης νουκλεϊκών οξέων χρησιμοποιώντας χημειοφωταυγή συστήματα για ανίχνευση. Σε αυτού του είδους τις αναλύσεις χρησιμοποιούνται συνήθως συζεύγματα ενζύμων (αλκαλική φωσφατάση, υπεροξειδάση, γαλακτοσιδάση) με πρωτεΐνες ή ολιγονουκλεοτίδια. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα είναι η χρήση του συζεύγματος της φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης με ολιγονουκλεοτίδιο και με στρεπταβιδίνη (Σχήμα 3.11) και η χρήση συζεύγματος αλκαλικής φωσφατάσης με αντισώματα, ολιγονουκλεοτίδια και στρεπταβιδίνη (Σχήμα 3.12) (Glynou, 2003) (Mavropoulou, 2005) (Toubanaki, 2009) (Emmanouilidou, 2004) (Emmanouilidou, 2003). Επίσης πολλαπλές δοκιμασίες υβριδοποίησης έχουν πραγματοποιηθεί με χρήση πολλών χημειοφωταυγών ιχνηθετών συζευγμένων με ολιγονουκλεοτίδια, αντισώματα ή βιοτίνη (Σχήμα 3.13) (Elenis, 2007) (Tannous, 2003). Στις μελέτες που θα παρουσιαστούν στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η υπεροξειδάση συζευγμένη με στρεπταβιδίνη σε συνδυασμό με το υπόστρωμά της (λουμινόλη και υπεροξείδιο του υδρογόνου) για την ανίχνευση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών μέσω αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και αλληλεπίδραση της στρεπταβιδίνης με τη βιοτίνη. (Κεφάλαιο 5) Το σύζευγμα υπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό μονόκλωνων και δίκλωνων αλληλουχιών. (Κεφάλαιο 6). 28

(α) Σχήμα (β) 3.11: Αρχή χρησιμοποιώντας (α) της μεθόδου σύζευγμα βιοφωταυγειομετρικής δοκιμασίας αικουορίνης-ολιγονουκλεοτιδίου και (β) αικουορίνης-στρεπταβιδίνης σαν ιχνηθέτη. (γ) (α) (β) Σχήμα 3.12: Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικής δοκιμασίας χρησιμοποιώντας σύζευγμα αλκαλικής φωσφατάσης με (α) αντίσωμα, (β) στρεπταβιδίνη (γ) ολιγονουκλεοτίδιο, ως ιχνηθέτη. (α) (β) Σχήμα 3.13: (α) Αρχή της μεθόδου πολλαπλής χημειοφωταυγειομετρικής δοκιμασίας χρησιμοποιώντας σύζευγμα αικουορίνης με ολιγονουκλεοτίδιο, υπεροξειδάσης με αντίσωμα, γαλακτοζιδάσης με ολιγονουκλεοτίδιο και αλκαλική φωσφατάση με αντίσωμα.. (β) Αρχή της μεθόδου διπλής χημειοφωταυγειομετρικής δοκιμασίας χρησιμοποιώντας σύζευγμα αικουορίνης με ολιγονουκλεοτίδιο και αλκαλική φωσφατάση με αντίσωμα ως ιχνηθέτες 29

Κεφάλαιο 4 Βιοαισθητήρες DNA 4.1 Εισαγωγή Η τεράστια ποσότητα γενετικής πληροφορίας που έφερε η αλληλούχιση του γονιδιώματος, δημιούργησε μεγαλύτερη ανάγκη για ανάπτυξη γρήγορων φτηνών και ευαίσθητων αναλυτικών μεθόδων, αισθητήρων και οργάνων με εφαρμογή στη μοριακή διαγνωστική. Αυτές οι αναλυτικές συσκευές, γνωστές ως βιοαισθητήρες, μετατρέπουν μια αντίδραση αναγνώρισης σε αναλυτικό σήμα, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να επεξεργαστεί. Πιο συγκεκριμένα, στη περίπτωση των βιοαισθητήρων DNA, μια αλληλουχία DNA ακινητοποιείται σε στερεή επιφάνεια και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της συμπληρωματικής της αλληλουχίας (DNAστόχου), μέσω υβριδοποίησης. Ο βασικός μηχανισμός, δηλαδή, για την ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών μέσω των βιοαισθητήρων DNA, είναι η εκλεκτική υβριδοποίηση μεταξύ δύο πλήρως συμπληρωματικών αλληλουχιών, που λαμβάνει χώρα κατευθείαν πάνω στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα (Teles, 2008). Οι βιοαισθητήρες DNA διακρίνονται, βάσει του συστήματος ανίχνευσής τους, σε ηλεκτροχημικούς, πιεζοηλεκτρικούς και οπτικούς (Vercouvere, 2002). 4.2. Ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες DNA Στους ηλεκτροχημικούς βιοαισθητήρες, μία μονόκλωνη αλληλουχία DNA ακινητοποιείται σε ένα ηλεκτρόδιο, και γίνεται μέτρηση των αλλαγών των ηλεκτρικών μεγεθών (ένταση ρεύματος, τάση, αγωγιμότητα, αντίσταση) που προκαλούνται από την υβριδοποίηση αυτής με το DNA-στόχο. Έχουν αναπτυχθεί πολλοί βιοαισθητήρες αυτού του είδους που διαφοροποιούνται ανάλογα με το ηλεκτρόδιο που χρησιμοποιείται κάθε φορά, με τον τρόπο ακινητοποίησης του ανιχνευτή, με την αντίδραση υβριδοποίησης και με τον τρόπο ανίχνευσης του υβριδίου που σχηματίζεται. (Lucarelli, 2008) Η γενική αρχή αυτών φαίνεται στο 30

σχήμα 4.1 (Σχήμα 4.1),ενώ μερικά γενικά παραδείγματα παρουσιάζονται παρακάτω. Σχήμα 4.1: Γενική αρχή ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων DNA 4.2.1. Ποτενσιομετρικοί βιοαισθητήρες Σε αυτό το είδος βιοαισθητήρων, το δυναμικό ενός εκλεκτικού ηλεκτροδίου ιόντος παρακολουθείται, συγκριτικά με ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς σε συνθήκες ισορροπίας (μηδενικό ρεύμα). Αλλαγές στο δυναμικό σχετίζονται μέσω της εξίσωσης του Nerst με την ενεργότητα του πρωτεύοντος ιόντος (Grieshaber, 2008). Ένα παράδειγμα ποτενσιομετρικού βιοαισθητήρα DNA δίνεται στο σχήμα 4.2, όπου η αρχή της ανίχνευσης βασίζεται στη διαδικασία υβριδοποίησης της μονόκλωνης αλληλουχίας κοντά σε μια μεμβράνη PVC, η οποία προκαλεί μια μετρήσιμη ανακατανομή της συγκέντρωσης των ιόντων σε διαμοριακές περιοχές (Σχήμα 4.2) (Shishkanova, 2007). Σχήμα 4.2: Ποτενσιομετρικός βιοαισθητήρας για την ανίχνευση της υβριδοποίησης μεταξύ συμπληρωματικών μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων σε μεμβράνη PVC. 31

4.2.2. Αμπερομετρικοί βιοαισθητήρες Οι αμπερομετρικοί βιοαισθητήρες μετρούν ρεύμα που προκύπτει από την οξείδωση ή την αναγωγή ενός ηλεκτρενεργού είδους σε μια χημική αντίδραση. Το ρεύμα, μετρείται είτε υπό σταθερή τάση (αμπερομετρία) είτε υπό μεταβλητή τάση (βολταμετρία). Έτσι, η μέγιστη τιμή του ρεύματος σε ένα εύρος σταθερού δυναμικού είναι ευθέως ανάλογη προς τη συγκέντρωση του αναλύτη. (Grieshaber, 2008) Ένα παράδειγμα αμπερομετρικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση ολιγονουκλεοτιδίου ειδικού για τον προσδιορισμό της β-λακαμάσης στο σταφυλόκοκκο aureus με χρήση υπεροξειδάσης, ενός ηλεκτροδίου επόξυ/γραφίτη και μεμβράνης νάυλον, φαίνεται στο σχήμα 4.3 (Pividori, 2001). Σχήμα 4.3: Αρχή της μεθόδου αμπερομετρικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση ειδικής αλληλουχίας ολιγονουκλεοτιδίου 4.3. Πιεζοηλεκτρικοί βιοαισθητήρες Ως πιεζοηλεκτρικό φαινόμενο ορίζεται η μετατροπή της μηχανικής ενέργειας σε ηλεκτρική και αντίστροφα. Στους βιοαισθητήρες που βασίζονται σε αυτό το φαινόμενο, χρησιμοποιούνται συνήθως κρύσταλλοι από χαλαζία (quartz). Σε αυτή τη μέθοδο, γίνεται εφαρμογή εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου με αποτέλεσμα ο κρύσταλλος διαστέλλεται και συστέλλεται (ταλαντώνεται) ανάλογα με τη περίοδο του ρεύματος. Η διαδικασία της μηχανικής δόνησης που πιεζοκρυστάλλου γίνεται 32

με συχνότητα ίδια με αυτή του ρεύματος δημιουργώντας έτσι ένα ηχητικό κύμα. Η πιεζοηλεκτρική συσκευή αποτελείται από ένα κρύσταλλο, ο οποίος τοποθετείται ανάμεσα σε δύο ηλεκτρόδια χρυσού. Μια διαφορά δυναμικού εφαρμόζεται σε αυτά τα δύο ηλεκτρόδια, με αποτέλεσμα να εμφανίζεται δόνηση του κρυστάλλου σε συγκεκριμένη συχνότητα συντονισμού. Μια μεταβολή της μάζας στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα μπορεί να προκαλέσει μεταβολή της συχνότητας συντονισμού (Σχήμα 4.4) (Junhui, 1997). Μία αλληλουχία DNA με μερικές εκατοντάδες ζευγών βάσεων συνήθως κατέχει ένα επαρκώς υψηλό μοριακό βάρος, έτσι ώστε η αύξηση της μάζας που προκαλείται από τον υβριδισμό μιας αλυσίδας DNA με το συμπληρωματικό ανιχνευτή ο οποίος είναι ακινητοποιημένος στην επιφάνεια ενός πιεζοηλεκτρικό χαλαζία να μπορεί να μεταβάλει τη συχνότητα συντονισμού του (Teles, 2008) (Skladal, 2003). Σχήμα 4.4: Πιεζοηλεκτρικός κρύσταλλος χαλαζία και αναπαράσταση των δονήσεων του. 4.4. Οπτικοί βιοαισθητήρες Οι οπτικοί βιοαισθητήρες έχουν βρει εφαρμογές σε πληθώρα δοκιμασιών και σε διάφορες παραλλαγές. Οι κύριες κατηγορίες οπτικών βιοαισθητήρων DNA που θα αναφερθούν είναι (α) με χρήση οπτικών ινών (β) αποσβενόμενου κύματος και (γ) ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. 4.4.1. Οπτικοί βιοαισθητήρες με χρήση οπτικών ινών Οι βιοαισθητήρες αυτού του τύπου, χρησιμοποιούν μια γυάλινη οπτική ίνα για τη μεταφορά ενός οπτικού σήματος στον ανιχνευτή. Το οπτικό σήμα που προκύπτει από υβριδοποίηση ενός ολιγονουκλεοτιδίου ανιχνευτή με τον DNA στόχο, ανιχνεύεται με χρήση μιας φθορίζουσας χρωστικής, όπως το βρωμιούχο αιθίδιο. Το 33

ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής είναι ακινητοποιημένο στην άκρη της οπτικής ίνας και ο φθορισμός εκπέμπεται όταν η δίκλωνη αλληλουχία που έχει προκύψει από την υβριδοποίηση συμπλέκει τη φθορίζουσα χρωστική και ανιχνεύεται μέσω ολικής ανάκλασης στο εσωτερικό της οπτικής ίνας (Σχήμα 4.5) (Teles 2008) (Piunno, 1995). Πιο σύγχρονες μέθοδοι κάνουν χρήση διπλά ιχνηθετημένων ανιχνευτών, οι οποίοι περιέχουν μια φθορίζουσα χρωστική δότη και ένα μόριο δέκτη. Τα δύο άκρα του ανιχνευτή είναι συμπληρωματικά με αποτέλεσμα να μην παρατηρείται φθορισμός λόγω FRET. Όταν όμως πραγματοποιηθεί υβριδοποίηση με τον DNA στόχο τα δύο άκρα του ανιχνευτή απομακρύνονται με αποτέλεσμα να έχουμε εκπομπή φθορισμού (Σχήμα 4.6) (Liu, 2000) (Steemers, 2000). Σχήμα 4.5: Σχηματική διάταξη για τη μέτρηση φθορισμού του βρωμιούχου αιθιδίου με οπτικές ίνες που έχουν ακινητοποιημένους ειδικούς ανιχνευτές Σχήμα 4.6: Σχηματική διάταξη για τη μέτρηση φθορισμού ιχνηθετημένων ανιχνευτών 34

Οι βιοαισθητήρες που βασίζονται σε οπτικές ίνες είναι κατάλληλοι για σμίκρυνση, λόγω της πολύ μικρής διαμέτρου των ινών. Η διαβίβαση του φωτός σε πολύ μεγάλες αποστάσεις χωρίς να χαθεί σήμα, επιτρέπει την απομακρυσμένη ανίχνευση σε δυσπρόσιτα και επικίνδυνα δείγματα. Η οπτική φύση του σήματος μηδενίζει τις παρεμβολές από ηλεκτρικούς θορύβους. Βασικό μειονέκτημα αυτών των βιοαισθητήρων είναι η χαμηλή σταθερότητα και ότι είναι επιρρεπείς σε παρεμβολές από το εξωτερικό φως. 4.4.2. Οπτικοί βιοαισθητήρες DNA αποσβενόμενου κύματος Οι βιοαισθητήρες αποσβενόμενου κύματος μετρούν μεταβολές οπτικών παραμέτρων (π.χ. δείκτη διάθλασης), που προκύπτουν από μια μοριακή αλληλεπίδραση όπως η υβριδοποίηση του DNA στόχου με ένα συμπληρωματικό ανιχνευτή. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτού του είδους είναι οι βιοαισθητήρες συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (surface plasmon resonance- SPR). Ο συντονισμός επιφανειακών πλασμονίων (SPR) προκύπτει όταν τα πλασμόνια που βρίσκονται στην διεπιφάνεια του κενού ή του αέρα με κάποιο μέταλλο αλληλεπιδρούν ισχυρά με το φως. Στους βιοαισθητήρες που εκμεταλλεύονται αυτό το φαινόμενο, τα ειδικά ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές ακινητοποιούνται σε ειδική επιφάνεια που είναι επικαλυμμένη με λεπτό στρώμα μεταλλικού χρυσού. Στη συνέχεια, γίνεται πρόσπτωση μονοχρωματικής ακτινοβολίας στο φάσμα του ορατού, διαμέσου της υάλου, στην επιφάνεια του χρυσού με αποτέλεσμα να προκαλείται συντονισμός πλασμονίου. Ανάλογα με την οπτική παράμετρο η οποία μετρείται, προκαλείται μεταβολή αυτής ανάλογα με τη μάζα της αλληλουχίας-στόχου που υβριδοποιείται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα (Σχήμα 4.7) (Guedon, 2000). 35

(α) (β) Σχήμα 4.7: (α) Σχηματική απεικόνιση ενός βιοαισθητήρα συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (β) Αρχή της μεθόδου του τρόπου απεικόνισης του φαινομένου συντονισμού πλασμονίων Οι βιοαισθητήρες αυτοί έχουν το πλεονέκτημα ότι μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν αρκετές φορές αλλά βασικό μειονέκτημά τους είναι η χαμηλή ευαισθησία (της τάξης των nm). 4.4.3. Βιοαισθητήρες DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Όλα οι τύποι βιοαισθητήρων που περιγράφτηκαν, χρειάζονται ειδική οργανολογία και στις περισσότερες περιπτώσεις απαιτούν πολλά στάδια έκπλυσης και επώασης. Έτσι έγινε επιτακτική η ανάγκη για ανάπτυξη ενός τύπου βιοαισθητήρα που θα επιτρέπει την οπτική ανίχνευση του DNA χωρίς τη χρήση ενόργανων οργάνων. Αυτού του είδους οι βιοαισθητήρες ονομάστηκαν τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (dry reagent strip) και βασίζονται σε μια διαδικασία ξηρών αντιδραστηρίων πάνω σε μεμβράνες που ελαχιστοποιεί τα στάδια εκπλύσεων και επωάσεων και μειώνει την ανάγκη για υψηλά εκπαιδευμένο χρήστη (Kalogianni, 2009). Η οπτική ανίχνευση γίνεται με έγχρωμα σφαιρίδια, με πιο διαδεδομένη να είναι τα τροποποιημένα νανοσωματίδια χρυσού, ενώ και άλλοι μέθοδοι (νανοσωματίδια άνθρακα, κβαντικές κουκίδες, μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου) έχουν παρουσιαστεί. 36

Ένας τέτοιος βιοαισθητήρας DNA αποτελείται από το υλικό εμβάπτισης (immersion pad), το υλικό απόθεσης (conjugate pad), τη μεμβράνη και το απορροφητικό υλικό (absorbent pad) Κάθε τμήμα τοποθετείται πάνω σε ένα στήριγμα που προσδίδει ακαμψία, με τέτοιο τρόπο ώστε τα άκρα τους να αλληλεπικαλύπτονται και να εξασφαλίζεται η συνεχής ροή (μέσω τριχοειδών δυνάμεων) του διαλύματος ανάπτυξης από το υλικό εμβάπτισης έως και το απορροφητικό υλικό (Σχήμα 4.8) (Kalogianni, 2011). Σχήμα 4.8: Σχηματική απεικόνιση του βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. IP: υλικό εμβάπτισης, CP: υλικό απόθεσης, M: μεμβράνη, AP: απορροφητικό υλικό Το κύριο μέρος αυτού βιοαισθητήρα είναι η μεμβράνη, όπου πάνω σε αυτή γίνεται η ανίχνευση των DNA στόχων. Κατάλληλα αντιδραστήρια ακινητοποιούνται στη μεμβράνη δημιουργώντας τις ζώνες δοκιμασίας, όπου δεσμεύονται οι επιθυμητές αλληλουχίες και παράγοντας ένα οπτικό σήμα 4.4.3.1. Κατασκευή ζωνών δοκιμασίας στη μεμβράνη του βιοαισθητήρα DNA Οι ζώνες δοκιμασίας αποτελούν πολύ σημαντικό κομμάτι για τον βιοαισθητήρα, καθώς απαιτούνται κατάλληλα συστήματα αλληλεπίδρασης μορίων, ώστε να επιτευχθεί η εκλεκτική ανίχνευση των DNA-στόχων. Οι ζώνες δοκιμασίας μπορεί να αντικατασταθούν από ειδικά τροποποιημένα μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου, τα οποία όμως βασίζονται στα ίδια συστήματα ανίχνευσης. Τα συστήματα ανίχνευσης που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι: (α) βιοτίνης-στρεπταβιδίνης, (β) αντιγόνουαντισώματος, (γ) υβριδοποίησης συμπληρωματικών αλληλουχιών. 37

(α) Στην πρώτη περίπτωση, η αλληλεπίδραση βιοτίνης-στρεπταβιδίνης είναι μια από τις ισχυρότερες μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις στη φύση με σταθερά διάσπασης 10-15 (Σχήμα 4.9). Για το λόγο αυτό έχει χρησιμοποιηθεί σε πολυάριθμες αναλυτικές τεχνικές για τους παρακάτω λόγους: Η αλληλεπίδραση είναι πολύ εκλεκτική. Υπάρχουν τέσσερις περιοχές δέσμευσης της βιοτίνης στη στρεπταβιδίνη, κάνοντας πιο εύκολη τη χρήση πολλαπλών βιοτινυλιωμένων τμημάτων. Η βιοτίνη είναι ένα μικρό μόριο (244.31 Da) με αποτέλεσμα όταν ενσωματώνεται σε βιομόρια, χωρίς να επηρεάζει τη βιολογική τους δραστικότητα. Η αλληλεπίδραση βιοτίνης-στρεπταβίδινης, λόγω της ιδιαίτερα χαμηλής σταθερά διαστάσεως, μπορεί να αντέξει σε ιδιαίτερα ακραίες συνθήκες (ph, θερμοκρασίες) χωρίς να επηρεαστεί (Diamandis, 1991). Η αλληλεπίδραση αυτή εφαρμόζεται στους βιοαισθητήρες, ακινητοποιώντας την πρωτεΐνη στρεπταβιδίνη στη μεμβράνη του αισθητήρα μέσω προσρόφησης, ενώ κάποιο από τα αναλυόμενα μόρια επισημαίνεται με βιοτίνη. Σχήμα 4.9: Αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης στρεπταβιδίνης με ένα μόριο βιοτίνης. (β) Το σύστημα αντιγόνου-αντισώματος παρουσιάζει σταθερά διάστασης 10-12-10-13 και αποτελεί επίσης μια πολύ ισχυρή και εκλεκτική αλληλεπίδραση που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ακινητοποίηση και ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών. Κάθε αντίσωμα έχει μοναδικά σημεία αναγνώρισης με τα αντιγόνα. Η σύνδεση περιλαμβάνει τη δημιουργία πολλών μη ομοιοπολικών δεσμών, μέσω ηλεκτροστατικών δυνάμεων, υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και δυνάμεων Van der 38

Waals (Σχήμα 4.10). Στους συγκεκριμένους βιοαισθητήρες, το αντίσωμα ακινητοποιείται στη μεμβράνη και το αντιγόνο ενσωματώνεται στον αναλύτη. Σχήμα 4.10: Εκλεκτική αλληλεπίδραση ενός αντισώματος με το αντίστοιχο αντιγόνο Συνήθως χρησιμοποιούνται μικρά βιολογικά μόρια, όπως τα απτένια διγοξιγενίνη και φλουορεσκεΐνη. Αυτά ενσωματώνονται στον αναλύτη (πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα) και τα αντισώματα έναντι αυτών των απτενίων ακινητοποιούνται στη μεμβράνη. (γ) Αντίστοιχα με τις άλλες δύο περιπτώσεις, κατάλληλα ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να ακινητοποιηθούν στη μεμβράνη των βιοαισθητήρων ξηρών αντιδραστηρίων, τα αναλυόμενα μόρια να επισημανθούν με τη συμπληρωματική αλληλουχία (π.χ. polya-polyt) και να πραγματοποιηθεί υβριδοποίηση με τη δημιουργία δεσμών υδρογόνου (Σχήμα 4.11). Σχήμα 4.11: Δημιουργία δεσμών υδρογόνου μεταξύ αδενίνης και θυμίνης 39

4.4.3.2. Οπτική ανίχνευση των ζωνών δοκιμασίας Όπως προαναφέρθηκε, ο κύριος τρόπος για την οπτική ανίχνευση των ζωνών δοκιμασίας είναι τα τροποποιημένα νανοσωματίδια χρυσού. Τα νανοσωματίδια χρυσύ μπορούν να τροποποιηθούν είτε με προσθήκη είτε με ειδικό αντίσωμα ολιγονουκλεοτιδίου, ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση μέσω των συστημάτων που περιγράφηκαν στη παράγραφο 4.4.3.1 (Glynou, 2003) (Toubanaki, 2009). Εναλλακτικά έχουν χρησιμοποιηθεί τροποποιημένα νανοσωματίδια άνθρακα, τροποποιημένες κβαντικές κουκκίδες και έγχρωμα πλαστικά μικροσφαιρίδια (Kalogianni,2011) (Sapountzi, 2015) (Kalogianni, 2009). Στο επόμενο κεφάλαιο θα αναφερθεί και η ανάπτυξη ενός νέου βιοαισθητήρα ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, που κάνει χρήση χημειοφωταυγειογόνου υποστρώματος και η οπτική ανίχνευση των προϊόντων γίνεται με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (σε θερμοκρασία περιβάλλοντος) ή με smartphone. Αυτή η νέα μέθοδος αποτελεί και τη βασική συνεισφορά αυτής της εργασίας στην ανάπτυξη νέων αναλυτικών μεθόδων για χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA. 40

Πειραματικό μέρος 41

Υλικά- Όργανα Όργανα Επιτραπέζια φυγόκεντρος, Centrifuge 5415D, Eppendorf Ζυγός ακριβείας, Mettler Toledo AB104-5 Θερμικός κυκλοποιητής, Takara Thermal Cycles Dice Κινητό τηλέφωνο, Iphone 4, Apple Λογισμικό ποσοτικοποίησης DNA, Gel analyzer Μαγνητικός αναδευτήρας, Stuart Heat-Stir, CB1662 Πεχάμετρο, 692 ph/ion Meter, Metrohm Πιππέτες, Nichipet EX, Nichiryo Συσκευή απόθεσης αντιδραστηρίων σε TLC πλάκες, Linomat 5, Camag Συσκευή ηλεκτροφόρησης, Power-Pac 300, Biorad Συσκευή περιδίνησης (Vortex), Labnet VX100 Συσκευή υπερκάθαρου νερού Υδατόλουτρο, Bioline Ψηφιακή κάμερα, Dynax 5D, Konica Minolta Αντιδραστήρια-Υλικά Αγαρόζη, AppliChem Αιθανόλη, Merck Απορροφητικό υλικό, Schleicher and Schuell Βιοτινυλιωμένο-16-dUTP, AppliChem Βόειος αλβουμίνη (BSA), Serva Βρωμιούχο αιθίδιο, Research Organics Inc. Γλυκερόλη, Carlo Erba Dig-dUTP, Jena Bioscience Δείκτης μοριακού μεγέθους DNA φχ174 Hae III Digest, Biolabs EDC, Thermo Scientific EDTA, Merck 42

F-dUTP, Jena Bioscience NaOH, Sigma NaN3, Merck NaHCO3, Penta MeOH, Sigma Μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, Whatman MES, AppliChem Μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου που φέρουν ελεύθερες καρβοξυλομάδες, PolySciences SDS, Sigma Σουκρόζη, Sigma Τριφωσφορικοί δεοξυνουκλεοζίτες, Invitrogen Tween-20, Sigma Υλικό εμβάπτισης, Schleicher and Schuell Υλικό απόθεσης, Schleicher and Schuell Υπόστρωμα υπεροξειδάσης, Thermo Scientific Ένζυμα-Αντισώματα Ακροτελική δεοξυνουκλεοτιδυλο τρανσφεράση (TdT), Θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση Phusion Τaq Θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση Phusion Tsp Αντίσωμα αντι-διγοξιγενίνης, Jackhon ImmunoResearch Αντίσωμα αντι-φλουορεσκεΐνης, Biodesigh International Σύζευγμα υπεροξειδάσης με στρεπταβιδίνη, Thermo Scientific Διαλύματα Διάλυμα φωσφορικών PBS : 0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 10mM NaH2PO4, 1.7 mm KH2PO4 σε dd H2O, ph 7.4 Διάλυμα ανάπτυξης 2% γλυκερόλη, 1% BSA, 0.2% Tween σε PBS 43

Διάλυμα ανασύστασης τροποποιημένων μικροσφαιριδίων ΤΕ: 10mM Tris ph 8, 1mM EDTA Ολιγονουκλεοτίδια Πίνακας 1: Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν στις προτεινόμενες μεθόδους Oligonucleotide Name Sequence (5 ->3 ) Size (mer) PCR primers up- TCATCCCTCGCCTTGAACAG 20 GGGAGCTTATGGGCTCTCCT 20 T24 GAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC 49 T24 GAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT 49 tag37- CTTTTCATCTTTTCATCTTTCAATGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGG 48 Normal AGC tag57- CAATATCATCATCTTTATCATTACGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGG Mutant AGT hr- CACAAAACGTACAACTCCTTGG 22 CCATCTTCGGCGACCCAGAA 20 AATGTGGATGGGGGTGGAGTAGAG 24 CTTGCTGAACTTCTGACTACGACT 24 MTHFR downmthfr PEXT primers dt(30)normal dt(30)mutant Probes 48 biotin 6F probe Lec probe Lec IS probe 44

Αλληλουχίες γονιδίων MTHFR: (285 bp) 5 TCATCCCTCG CCTTGAACAG GTGGAGGCCA GCCTCTCCTG CTATTGGCAG GTTACCCCAA AGGCCACCCC GAAGCAGGGA TGACCTGAAG CACTTGAAGG AGAAGGTGTC TGCGGGAG C ACTGTCATCC GCTTTGAGGC CGATTTCATC ATCACGCAGC TTTTCTTTGA GGCTGACACA TTCTTCCGCT TTGTGAAGGC ATGCACCGAC ATGGGCATCA CTTGCCCCAT CGTCCCCGGG ATCTTTCCCA TCCAGGTGAG GGGCCCAGGA GAGCCCATAA 3 ctm6: (61bp) 5 AAGACATAT AGCACGTAT ACCGGATTA CTTCTGGGT CGCCGAAGA TGGCCCGAA AATGCAG 3 tm6: (61bp) 5 CTGCATTTT CGGGCCATC TTCGGCGAC CCAGAAGTA ATCCGGTAT ACGTGCTAT ATGTCTT 3 Lectin: (145 bp) 5 GACGCTATTG TGACCTCCTC GGGAAAGTT ACAACTCAAT AAGGTTGACG AAAACGGCACC CCAAAACCCT CGTCTCTTGG TCGCGCCCTC TACTCCACCC CCATCCACAT TTGGGACAAA GAAACCGGTA GCGTTGCCAG CTTCG 3 Lectin IS: (145bp) 5 GACGCTATTG TGACCTCCTC GGGAAAGTTA CAACTCAATAA GGTTGACGAA AACGGCACCC CAAAACCCTC GTCTCTTGGT CGCGCCAGT CGTAGTCAGA AGTTCAGCAA GTGGGACAAA GAAACCGGTA GCGTTGCCAG CTTCG 3 45

Κεφάλαιο 5. Ανάπτυξη βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων για ανίχνευση μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού με χρήση χημειοφωταύγειας. 5.1. Εισαγωγή Όπως αναφέρθηκε και στο κεφάλαιο 2, ως μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός ορίζεται η αλλαγή σε μία αζωτούχα βάση στο ανθρώπινο γονιδίωμα και αποτελεί την πιο συχνή διαφοροποίηση στο ανθρώπινο DNA. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να επηρεάσουν τη λειτουργία γονιδίων. Έτσι, οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί θεωρούνται νέοι βιοδείκτες για έγκαιρη διάγνωση ασθένειας, για προσδιορισμό της προδιάθεσης ανάπτυξης μίας ασθένειας και στη φαρμακογενετική. Η γονοτύπιση των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών αποτελεί μία μεγάλη πρόκληση στην ανάλυση, καθώς απαιτεί την αναγνώριση μίας μόνο βάσης ανάμεσα στα 3*10 9 ζεύγη βάσεων του ανθρώπινου γονιδιώματος. Τα τελευταία χρόνια, η εξέλιξη της τεχνολογίας έχει οδηγήσει σε μελέτες υψηλής κλίμακας και στην ανάπτυξη μικροσυστοιχιών DNA, που επιτρέπουν την ανάλυση χιλιάδων διαφορετικών μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών παράλληλα. Ενώ αυτά τα νέα συστήματα είναι πολύ χρήσιμα για μελέτες και για έρευνα, είναι φανερό ότι αξιολογούνται βιοαισθητήρων μόνο σε λίγοι καθημερινή DNA μονονουκλεοτιδικών επιλεγμένοι για τη βάση μονονουκλεοτιδικοί στους γονοτύπιση πολυμορφισμών ασθενείς. αυτών αποτελεί μία Έτσι των λογική πολυμορφισμοί η ανάπτυξη συγκεκριμένων και δυναμική εναλλακτική. (Elenis, 2011) Όπως παρουσιάστηκε και στο κεφάλαιο 4, έχουν αναπτυχθεί διάφοροι τύποι βιοαισθητήρων DNA με την πάροδο των χρόνων, καθένας από αυτούς βασιζόμενος σε κάποιες συγκεκριμένες αρχές λειτουργίας. Έτσι έχουν αναπτυχθεί οπτικοί, ηλεκτροχημικοί και πιεζοηλεκτρικοί βιοαισθητήρες. Κανένας από τους υπάρχοντες βιοαισθητήρες, όμως, δε χρησιμοποιεί οπτική ανίχνευση χημειοφωταύγειας σε βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. 46

Γενικώς, οι χημειοφωταυγειομετρικές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια, εξαιτίας της υψηλής ανιχνευσιμότητας, του μεγάλου εύρους και της έλλειψης μη ειδικού σήματος (απουσία ακτινοβολίας διέγερσης) που παρέχουν (Elenis, 2009). Πολλά είδη και μοντέλα έχουν παρουσιαστεί για την ανίχνευση προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, για ποσοτική PCR, για μικροrnas και στη γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Zerefos, 2008). Επίσης έχουν χρησιμοποιηθεί στην ανάλυση νουκλεϊκών οξέων σε φρεάτια μικροτιτλοδότησηςστην τεχνική Southern blotting, και στη γονοτύπιση με πυροφωσφατάση,, (Glynou, 2004) (Verhaegen, 1998) (Cissell, 2008) (Toubanaki, 2009) (Konstantou, 2007) (Azam, 2015; Tenner, 2000) (Woldman, 2009) (Woldman, 2015). Όπως αναφέρθηκε και στο κεφάλαιο 3, κατάλληλα ένζυμα με χημειοφωταυγειογόνα υποστρώματα, όπως η αλκαλική φωσφατάση και η υπεροξειδάση, ή φωτοπρωτεΐνες, όπως η αικουορίνη, έχουν χρησιμοποιηθεί συνήθως για την ανίχνευση του σήματος χημειοφωταύγειας. Ωστόσο, οι χημειοφωταυγειομετρικοί βιοαισθητήρες δεν έχουν εξελιχθεί ακόμα σε μεγάλο βαθμό και έτσι αποτελούν ένα αναπτυσσόμενο πεδίο με νέες εφαρμογές. Οι χημειοφωταυγειομετρικοί βιοαισθητήρες αξιοποιούν το φως που εκπέμπεται από μία αντίδραση χημειοφωταύγειας (βιο- ή χημειοφωταύγειας ή ηλεκτροχημειοφωταύγειας). Το κύριο πλεονέκτημα που προσφέρουν, όπως προαναφέρθηκε, είναι η θεωρητικά υψηλή ανιχνευσιμότητα καθώς τα φωτόνια παράγονται στο σκοτάδι από μία χημική αντίδραση και είναι εύκολα μετρήσιμα, απουσία μη ειδικού σήματος. (Roda, 2015) Επιπλέον, η νέα γενιά ψηφιακών φωτογραφικών μηχανών, έχει οδηγήσει στην ενίσχυση της ποιότητας της εικόνας με αποτέλεσμα να μπορούν οι ψηφιακές μηχανές να χρησιμοποιηθούν σαν ανιχνευτές φωτός. Ειδικότερα, η βελτίωση των αισθητήρων ημιαγωγών οξειδίου του μετάλλου (CMOS) ή των αισθητήρων συζευγμένου φορτίου (CCD), έδωσε τη δυνατότητα στις φωτογραφικές μηχανές, όχι μόνο να μετρούν τα φωτόνια που εκπέμπονται από μία αντίδραση, αλλά επίσης να γίνεται λήψη εικόνας του εκπεμπόμενου φωτός (Zangheri, 2015). Ως αποτέλεσμα, δίνεται η δυνατότητα της αντικατάστασης των πολύπλοκων συστημάτων ανίχνευσης με ένα απλό smartphone ή μια κάμερα ενός tablet. Οι βελτιώσεις στην τεχνολογία CMOS που χρησιμοποιείται στις φωτογραφικές μηχανές 47

smartphone / tablet έχουν οδηγήσει σε βελτιωμένη ποιότητα εικόνας και σε ανώτερες λειτουργίες. Εκτός από τον υψηλότερο αριθμό εικονοστοιχείων, η προσφάτως ανεπτυγμένη αρχιτεκτονική των CMOS και η υψηλή ποιότητα εικόνας, ακόμη και σε συνθήκες χαμηλού φωτισμού, επιτρέπει στις smartphone κάμερες να χρησιμοποιηθούν για ανίχνευση χημειοφωταύγειας. Παρά το γεγονός ότι η ευαισθησία τους εξακολουθεί να είναι χαμηλότερη από τα CCDs, τα smartphones θα μπορούσαν να είναι κατάλληλα για τη μέτρηση αναλυτών, όπως φάνηκε πρόσφατα σε χημειοφωταυγειομετρικούς ανοσοπροσδιορισμούς (Roda, 2015). Οι βιοαισθητήρες χημειοφωταύγειας που έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα βασίζονται κυρίως σε ανοσοδοκιμασίες, ή σε αναλυτικές ψηφίδες (τσιπ) (Zangheri, 2015) (Roda, 2014) (Mirasoli, 2013). Στην παρούσα εργασία, ένας νέος βιοαισθητήρα τύπους ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων περιγράφεται για την ανάλυση νουκλεϊκού οξέος με βάση τη χημειοφωταύγεια. Πιο συγκεκριμένα, η μέθοδος αυτή αξιοποιεί την υπεροξειδάση συζευγμένη με στρεπταβιδίνη και το ανάλογο υπόστρωμα για την αντίδραση χημειοφωταύγειας. Ως μοντέλο σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε, ο προσδιορισμός του γονοτύπου του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού C677T του γονιδίου MTHFR. Το κύριο προϊόν του γονιδίου αυτού είναι ένα ένζυμο κλειδί στο μεταβολισμό του φολικού οξέος, καθώς καταλύει την μετατροπή του 5,10-μεθυλεν-τετραυδροφυλλικού σε 5μεθυλεντετραυδροφυλλικόύ, ένα συνυπόστρωμα για την επαναμεθυλίωση της ομοκυστεΐνης σε μεθειονίνη. Το C677T SNP είναι ένας κοινός πολυμορφισμός του γονιδίου MTHFR. Άτομα με γονότυπο 677CC είναι «φυσιολογικά». Ομοζυγώτες με γονότυπο 677TT, και ετεροζυγώτες με γονότυπο 677CT παρουσιάζουν σημαντική μείωση της δραστικότητας του MTHFR. Μειωμένη δραστικότητα του MTHFR οδηγεί σε υπερομοκυστεϊναιμία, η οποία σχετίζεται με καρδιαγγειακή νόσο. Η χημειοφωταύγεια ανιχνεύεται από μία ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και μια κάμερα smartphone. 48

5.2. Μεθοδολογία 5.2.1. Προετοιμασία βιοαισθητήρα Η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (4 mm x70 mm) αποτελείται από ένα υλικό εμβάπτισης, ένα υλικό εναπόθεσης, μια πλαστικοποιημένη μεμβράνη και ένα απορροφητικό υλικό συναρμολογημένα επάνω σε ένα πλαστικό υπόστρωμα το οποίο παρέχει την απαιτούμενη ακαμψία. Τα τέσσερα τμήματα τοποθετούνται με τέτοιο τρόπο ώστε τα άκρα τους να επικαλύπτονται, για να εξασφαλιστεί η συνεχής ροή (μέσω τριχοειδών φαινομένων) του αναπτυσσόμενου διαλύματος. Δύο τύποι βιοαισθητήρων DNA κατασκευάστηκαν. Ο σχεδιασμός των βιοαισθητήρων φαίνεται στο Σχήμα 5.1. (α) Για τον τύπο Ι, ένα σύζευγμα μικροσφαιριδίων με ολιγονουκλεοτίδιο da(30) ακινητοποιήθηκε, ως κηλίδα δοκιμασίας, στη μεμβράνη του βιοαισθητήρα ως σημείο δοκιμασίας. (β) Για τον τύπο IΙ, δύο συζεύγματα μικροσφαιριδίων με antitag1 ολιγονουκλεοτίδιο και antitag2 ολιγονουκλεοτίδιο ακινητοποιήθηκαν στη μεμβράνη του βιοαισθητήρα ως δύο ξεχωριστές κηλίδες δοκιμασίας στο βιοαισθητήρα. Σχήμα 5.1: Σχηματική απεικόνιση του βιοαισθητήρα νουκλεϊκού οξέος για οπτική γονοτύπιση TS: test spot, IP: υλικό εμβάπτισης, CP: υλικό εναπόθεσης, M: μεμβράνη, AP: απορροφητικό υλικό 49

5.2.2. Οπτικοποίηση του αισθητήρα με ψηφιακή και smartphone κάμερα και κατασκευή κατάλληλου εξαρτήματος του smartphone για την οπτική ανίχνευση. Η οπτικοποίηση της εκπεμπόμενης χημειοφωταύγειας από τους βιοαισθητήρες επιτεύχθηκε με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και με smartphone. Στην πρώτη περίπτωση, ένας απλός σκοτεινός θάλαμος κατασκευάστηκε για την οπτικοποίηση των βιοαισθητήρων. Ο θάλαμος περιέχει οπή για την τοποθέτηση της ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής. Ο βιοαισθητήρας τοποθετείται μέσα στο θάλαμο και γίνεται λήψη φωτογραφίας αμέσως μετά την προσθήκη του υποστρώματος. Η σχηματική απεικόνιση του μοντέλου παρουσιάζεται στο Σχ.5.2.(α). Στη δεύτερη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε ένα iphone 4 με αισθητήρα CMOS και 5 megapixels κάμερα. Ένας επιπλέον φακός 47-460 του οίκου Edmund Optics χρησιμοποιήθηκε για την καλύτερη λήψη του εκμπεμπόμενου σήματος. Με το πρόγραμμα Google Sketch Up σχεδιάστηκε ένα μικρό εξάρτημα ως σκοτεινός θάλαμος για το smartphone και τυπώθηκε σε 3D εκτυπωτή Reify 3D Solus και Makergear Μ2. Το εξάρτημα αποτελείται από τα ακόλουθα μέρη: (i) Μια απλή θήκη για smartphone, (ii) μια θήκη για τους φακούς εστίασης και (iii) μια θήκη και κάλυμμα όπου τοποθετείται ο βιοαισθητήρας. Οι διαστάσεις του καλύμματος του φακού εστίασης είναι 8 mm ύψος και 15 mm εξωτερική διάμετρο και οι διαστάσεις της θήκης του βιοαισθητήρα είναι 4 x 15 x 90 mm. Η ολική διάταξη του εξαρτήματος, μαζί με την αρχή της λήψης του εκπεμπόμενου φωτός του βιοαισθητήρα φαίνονται στο Σχ.5.2.(β,γ). 50

(β) (γ) (α) Σχήμα 5.2:(α) Σχηματική απεικόνιση της διάταξης για την οπτική ανίχνευση των αλληλουχιών DNA με το χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα (1)Θάλαμος, (2) Ψηφιακή κάμερα, (3) Βιοαισθητήρας DNA (β) To 3D μοντέλο της συσκευής του smartphone (1) Smartphone (2) Θήκη κινητού (3) Θήκη φακού, (4) Θήκη βιοαισθητήρα, (5) Βιοαισθητήρας, (6) Κάλυμμα βιοαισθητήρα. (γ) Αρχή της μεθόδου λήψης του εκπεμπόμενου φωτός του βιοαισθητήρα με χρήση smartphone και χρήση του επιπλέον φακού για καλύτερη λήψη του εκπεμπόμενου φωτός 5.2.3. Σύζευξη μικροσφαιριδίων με ολιγονουκλεοτίδια Αρχικά όγκος ίσος με 12.8 μl από τα καρβοξυλιωμένα μικροσφαιρίδια χρησιμοποιείται για την αντίδραση σύζευξης. Τα μικροσφαιρίδια εκπλένονται με 125 μl ρυθμιστικού διαλύματος MES (0.1 Μ, ph 4,5) και φυγοκεντρούνται για 2 λεπτά στις 13000 rpm (15800 g). Η επαναιώρηση των μικροσφαιριδίων γίνεται σε 40 μl ρυθμιστικό διάλυμα MES. Στη συνέχεια προστίθεται 1 μl NH 2 - ολιγονουκλεοτίδιο (400pmol μl-1) και 1.25-μL EDC (0.4 mg *μl-1) και ακολούθως γίνεται επώαση 30-λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με μια ακόμα προσθήκη 1.25 μl EDC (0.4 mg *μl-1) και μία ακόμη επώαση 30 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστίθενται 2 μl από Tween-20 (100 ml* L-1) και το αιώρημα φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις 13000 rpm. Το σύζευγμα των μικροσφαιριδίων με το ολιγονουκλεοτίδιο εκπλένεται δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ-Tween (100 μl ΤΕ + 2 μl Tween-20 (100 ml* L-1)) και φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις 13.000 rpm. Η τελική επαναιώρηση διεξάγεται σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ. 51

Τα ολιγονουκλεοτίδια NH2-dA (30), NH2-antitag1 και NH2-antitag2 χρησιμοποιήθηκαν για την σύζευξη με τα μικροσφαιρίδια και δημιουργία των κηλίδων δοκιμασίας των βιοαισθητήρων και των δύο τύπων. Η αντίδραση σύζευξης φαίνεται στο Σχήμα 5.3 Σχήμα 5.3: Αντίδραση καρβοξυλομάδας των μικροσφαιριδίων με αμινομάδα του ολιγονουκλεοτίδιου χρησιμοποιώντας το ομοδιλειτουργικό αντιδραστήριο EDC 5.2.4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Μετά την απομόνωση του DNA από δείγμα αίματος, με τη χρήση του DNA QIAamp Blood Kit Mini, το γενωμικό DNA υποβλήθηκε σε PCR για την ενίσχυση του γονιδίου MTHFR. Το μίγμα της αντίδρασης (50 μl) περιείχε 1 U Phusion DNA πολυμεράση, 200 μμ από κάθε ένα από τα dntps, 0.3 μμ του κάθε εκκινητή και 2 μl του γενωμικού DNA, 1.5 mm MgCl2 και 1xPhusion HF Buffer. Οι παράμετροι κυκλοποίησης ήταν οι εξής: αρχική αποδιάταξη στους 98 oc για 45 s, 35 κύκλους στους 98 oc (για 10 s), 58 oc (για 15 s), 72 oc (για 10 s) και ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 oc για 5 λεπτά. Τα προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2% και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο ενώ ο ποσοτικός τους προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών. 5.2.5. Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) Για τον τύπο Ι του βιοαισθητήρα, το ενισχυμένο με PCR DΝΑ υποβλήθηκε σε δύο ξεχωριστές ειδικές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, μία με τον φυσιολογικό (Ν) εκκινητή και μία με το μεταλλαγμένο (Μ) εκκινητή. Αμφότεροι οι εκκινητές περιείχαν ένα τμήμα (dt) 24 στο άκρο 5'. Η αντίδραση επέκτασης διεξήχθη σε ολικό όγκο 20 μl και περιείχε 20 mm Tris-HCl (pη 8.4), 50 mm ΚCΙ, 1 U Platinum Tsp DNA 52

πολυμεράση, ~ 100 fmol του ενισχυμένου DNA, 5 pmol του κατάλληλου εκκινητή, 1.5 mm MgSO4, 10 μμ του εκάστοτε των datp, dctp, dgtp, 5 μμ dttp και 5 μμ βιοτινυλιωμένο-dutp. Οι αντιδράσεις επέκτασης πραγματοποιήθηκαν στο θερμικό κυκλοποιητή ως εξής: 95 oc για 3 min και 5 κύκλοι των 95 oc για 15 s, 68 oc για 15 s, 72 oc για 10 s. Για τον τύπο ΙΙ του βιοαισθητήρα, το ενισχυμένο με PCR DΝΑ υποβλήθηκε σε μία αντίδραση επέκτασης εκκινητή, που περιείχε τόσο τον φυσιολογικό (Ν) όσο και τον μεταλλαγμένο (M) εκκινητή. Κάθε εκκινητής περιείχε μια διαφορετική ολιγονουκλεοτιδική αλληλουχία (tag) στο 5 'άκρο (tag-37 για τον φυσιολογικό εκκινητή και tag-57 για τον μεταλλαγμένο εκκινητή). Η αντίδραση επέκτασης πραγματοποιήθηκε σε συνολικό όγκο 20 μl και περιείχε 20 mm Tris-HCl (pη 8,4), 50 mm KCl, 1U Platinum Tsp DNA πολυμεράση, ~ 100 fmol του ενισχυμένου DNA, 5 pmol του κάθε εκκινητή, 1,5 mm MgSO4, 10 μμ του καθενός από τα datp, dctp, dgtp, 5 μμ dttp και 5 μμ βιοτινυλιωμένου-dutp. Η αντίδραση επέκτασης πραγματοποιήθηκε στο θερμικό κυκλοποιητή ως εξής: 95 oc για 3 min και 12 κύκλους 95 oc για 15 s, 68 oc για 15 s, 72 oc για 15 s. Η αντίδραση επέκτασης του εκκινητή διεξάγεται για 15 κύκλους όταν ανίχνευση με τον τύπου ΙΙ χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα γίνεται με την κάμερα smartphone, για ενίσχυση του σήματος. Αυτό πιθανώς οφείλεται στη μειωμένη ευαισθησία της κάμερας smartphone, σε σύγκριση με την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Η αρχή της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή για τα δύο είδη των βιοαισθητήρων DNA παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.4. N primer C G (α) N primer Β Β Β (β) M primer T G C G Β Β Β M primer X T G X Σχήμα 5.4: Η αρχή της μεθόδου της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή για (α) τον τύπο Ι και (β) τον τύπο ΙΙ βιοαισθητήρα DNA 53

5.2.6. Χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση του SNP C677T στο MTHFR Τα προϊόντα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή υποβάλλονται σε ένα τελικό στάδιο αποδιάταξης στους 95oC για 5 λεπτά, για να αποδιαταχθούν οι δύο κλώνοι του DNA και τα αποδιαταγμένα προϊόντα τοποθετούνται αμέσως σε πάγο για 2min. Για την χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση, όγκος 5-μL του αποδιαταγμένου προϊόντος και άλλα 5-μL στρεπταβιδίνης-hrp (1000 αραιωμένο σε διάλυμα 6% γλυκερόλη, 0.2% Tween-20 σε 1xPBS) εναποτίθενται πάνω στην μεμβράνη του βιοαισθητήρα. Ο βιοαισθητήρας στη συνέχεια βυθίζεται σε ένα μικροφυγοκεντικό σωλήνα που περιέχει 250 μl του διαλύματος αναπτύξεως (3% γλυκερόλη, 1% BSA, 0,2% Tween σε 1xPBS). Μετά από 25 λεπτά, ο βιοαισθητήρας απομακρύνεται από το διάλυμα αναπτύξεως και τοποθετείται σε ένα σκοτεινό θάλαμο ή στη συσκευή του smartphone, όπου 10 μl του υποστρώματος υπεροξειδάσης προστίθενται επί της μεμβράνης και η εκπεμπόμενη χημειοφωταύγεια ανιχνεύεται αμέσως είτε από την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή ή το smartphone. Η λήψη της χημειοφωταύγειας έγινε με έκθεση για 10s από την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή, ενώ από το smartphone για 8 s. Μία μπλε κηλίδα σχηματίζεται στη θέση δοκιμής του βιοαισθητήρα που αποδεικνύει την παρουσία του αλληλόμορφου που αντιστοιχεί στο Ν ή Μ εκκινητή. Η αρχή των δύο τύπων βιοαισθητήρα DNA παρουσιάζεται στο Σχήμα. 5.5. (α) (β) Σχήμα 5.5: Η αρχή της μεθόδου του (α) τύπου I και (β) τύπου II DNA βιοαισθητήρα 54

5.3. Αποτελέσματα-Συζήτηση 5.3.1.Οπτική γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών Όπως προαναφέρθηκε, ένας νέος χημειοφωταυγειομετρικός βιοαισθητήρας DNA αναπτύχθηκε για τον οπτικό προσδιορισμό του γονότυπου μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών, με χρήση ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής ή του smartphone ως σύστημα ανίχνευσης. Δύο τύποι βιοαισθητήρα DNA κατασκευάστηκαν. Για τον τύπο Ι, δυο βιοαισθητήρες ανά SNP απαιτούνται, ενώ για τον τύπο II, η γονοτύπιση επιτεύχθηκε με έναν μόνο βιοαισθητήρα, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 5.5. Για το βιοαισθητήρα του τύπου Ι, το προϊόν PCR υποβλήθηκε σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή, η καθεμιά με το έναν αλληλόμορφο-ειδικό εκκινητή (Ν ή Μ). Αμφότεροι οι εκκινητές περιείχαν ένα τμήμα (dt)24 στο 5 άκρο και διέφεραν μόνο σε μία βάση στο 3' άκρο. Λόγω της ειδικότητας της DNA πολυμεράσης, ο εκκινητής επεκτείνεται μόνο αν είναι απόλυτα συμπληρωματικός με την αλληλουχία-στόχο. Βιοτινυλιωμένο-dUTP ενσωματώνεται κατά τη διάρκεια του σταδίου της επέκτασης. Στη συνέχεια, μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης επέκταση εκκινητή, γίνεται αποδιάταξη των δίκλωνων προϊόντων PEXT, και δείγμα από τα προϊόντα τοποθετείται επί της μεμβράνης του αισθητήρα μαζί με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-ηrp και o βιοαισθητήρας βυθίζεται στο διάλυμα αναπτύξεως. O τύπος Ι βιοαισθητήρα κατασκευάστηκε με άμεση ακινητοποίηση μικροσφαιριδίων-da(30) ως κηλίδα δοκιμασίας. Καθώς το δείγμα προχωρά κατά μήκος της ταινίας, το προϊόν επέκτασης ακινητοποιείται από τα μικροσφαιρίδιαda(30) στην κηλίδα δοκιμασίας μέσω (da) / (dt) υβριδοποίησης. Ακολούθως, το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-hrp δεσμεύεται με τα υβρίδια μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης, δημιουργώντας μια χημειοφωταυγειομετρική μπλε κηλίδα μετά την προσθήκη του υποστρώματος του ενζύμου. Ο γονότυπος του κάθε δείγματος λήφθηκε λαμβάνοντας τα αποτελέσματα των δύο βιοαισθητήρων που αντιστοιχούν στο προϊόν επέκτασης του φυσιολογικού (Ν) ή του μεταλλαγμένου εκκινητή (Μ). Έτσι, ένα φυσιολογικός γονότυπος (Ν / Ν γονότυπος) δίνει σήμα χημειοφωταύγειας μόνο για την επέκταση του εκκινητή Ν. Από την άλλη πλευρά, ένας ομοζυγώτης για τη μετάλλαξη (Μ / Μ γονότυπος) δίνει σήμα 55

χημειοφωταύγειας μόνο για την επέκταση του εκκινητή Μ. Ένας ετεροζυγώτης (Ν / Μ γονότυπος) δίνει θετικό αποτέλεσμα και με τους δύο βιοαισθητήρες. Ως αρνητικά δείγματα ελέγχου για τις αντιδράσεις γονοτύπησης ήταν η επέκταση του φυσιολογικού γονότυπου με το μεταλλαγμένο εκκινητή ή του ομοζυγώτη για τη μετάλλαξη γονότυπου με τον φυσιολογικό εκκινητή. Εναλλακτικά, για τον τύπο ΙΙ του βιοαισθητήρα, το προϊόν PCR υποβλήθηκε σε μία μόνο αντίδραση επέκτασης εκκινητή, που περιείχε τόσο τον φυσιολογικό (Ν) όσο και το μεταλλαγμένο (M) εκκινητή. Κάθε εκκινητής περιείχε ένα χαρακτηριστικό τμήμα ολιγονουκλεοτιδίου tag στο 5'άκρο, οι οποίοι διέφεραν μεταξύ τους μόνο σε μία βάση στο 3' άκρο. Ο φυσιολογικός εκκινητής περιείχε το tag (37) και ο μεταλλαγμένος εκκινητής περιείχε το tag (57). Η αρχή της μεθόδου όμως παραμένει η ίδια. Ομοίως, λόγω της ιδιότητας της DNA πολυμεράσης, ο εκκινητής επεκτάθηκε μόνο εάν ήταν απολύτως συμπληρωματικός με την αλληλουχία στόχο. Παρομοίως, βιοτινυλιωμένο-dutp ενσωματώθηκε κατά τη διάρκεια του σταδίου επέκτασης. Ο βιοαισθητήρας τύπου ΙΙ κατασκευάστηκε από άμεση ακινητοποίηση συζευγμάτων των μικροσφαιριδίων-antitag (37) και μικροσφαιριδίων-antitag (57) ως κηλίδες δοκιμασίας 1 και δοκιμασίας 2, αντιστοίχως. Καθώς το δείγμα κινείται, λόγω τριχοειδών φαινομένων κατά μήκος της μεμβράνης, το προϊόν επέκτασης ακινητοποιείται από τη αλληλουχία antitag στη κηλίδα δοκιμασίας μέσω υβριδοποίησης tag / antitag,. Η στρεπταβιδίνη-ηrp ακινητοποιείται με τα υβρίδια μέσω αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης, σχηματίζοντας μια κηλίδα χημειοφωταύγειας μετά την προσθήκη του υποστρώματος. Ο γονότυπος προσδιορίστηκε από τα σήματα των κηλίδων του βιοαισθητήρα που αντιστοιχούν στην αντίδραση επέκτασης του εκκινητή του φυσιολογικού (Ν) και του μεταλλαγμένου εκκινητή (Μ). Έτσι, ένας φυσιολογικός γονότυπος (Ν/Ν γονότυπος) δίνει σήμα χημειοφωταύγειας μόνο για την επέκταση του εκκινητή Ν σχηματίζοντας μια μπλε κηλίδα μόνο στο σημείο δοκιμής 2, ενώ ένας ομοζυγώτης για τη μετάλλαξη (Μ/Μ γονότυπος) δίνει σήμα χημειοφωταύγειας μόνο για την επέκταση του εκκινητή M, σχηματίζοντας μια μπλε κηλίδα μόνο στο σημείο δοκιμής 1. Ο ετεροζυγώτης (Ν/Μ γονότυπος) δίνει σήμα και στις δύο κηλίδες του βιοαισθητήρα. Οι αρνητικοί έλεγχοι περιλαμβάνονται επίσης στις αντιδράσεις γονοτύπισης (αντίδραση επέκτασης ενός φυσιολογικού δείγματος με το μεταλλαγμένο εκκινητή 56

ή ενός μεταλλαγμένου δείγματος με τον φυσιολογικό εκκινητή). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα. 5.6. N/N N M N/M M/M N M N M (α) (β) M M M N N N Σχήμα 5.6: Γονοτύπιση μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού για τρία δείγματα ανθρώπινου γενομικού DNA (Ν/Ν: φυσιολογικός, Μ/Μ: ομοζυγώτης για τη μετάλλαξη, Ν/Μ: ετεροζυγώτης για την μετάλλαξη) για τον (α) τύπο Ι και (β) τύπο ΙΙ βιοαισθητήρα 5.3.2. Βελτιστοποίηση των παραμέτρων της προτεινόμενης μεθόδου Οι μελέτες βελτιστοποίησης επικεντρώθηκαν στο σύστημα ανίχνευσης προκειμένου να εξασφαλιστεί η καλύτερη διάκριση του αλληλόμορφου, μαζί με την υψηλότερη ένταση εκπομπής της χημειοφωταύγειας. Πρώτα απ' όλα, εξετάσαμε την κατάλληλη συγκέντρωση του συζεύγματος στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης, προκειμένου να συμβαδίζει με την ευαισθησία της ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής. Εξετάστηκαν αραιώσεις του συζεύγματος SAHRP από 100 έως 2500 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (6% BSA, 0,2% Tween σε PBS). Η αραίωση 1000 φορές θεωρήθηκε η κατάλληλη επιλογή για αυτή τη μέθοδο. 57

Στη συνέχεια, εξετάστηκε ο χρόνος επώασης του υποστρώματος στα 0, 1, 5 και 10 λεπτά πριν τη φωτογράφιση. Το πιο έντονο σήμα ελήφθη μετά από άμεση λήψη της φωτογραφίας (0 min). Τέλος, εξετάστηκε ο χρόνος έκθεσης της ταινίας για τη λήψη της εικόνας από την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Το διάφραγμα της φωτογραφικής μηχανής αφέθηκε ανοικτό για 5, 10, 20 και 30 δευτερόλεπτα. Ο βέλτιστος χρόνος έκθεσης ήταν τα 10 δευτερόλεπτα, καθώς συνδυάζει την υψηλότερη ένταση χημειοφωταύγειας με το χαμηλότερο σήμα υποβάθρου. Όλες οι μελέτες βελτιστοποίησης φαίνονται στο σχήμα 5.7. (α) 100x 500x (β) (γ) M 5s N N M N N M/M N M 20 s M 30 s 20 s M 10 s 2500x 10 min N/N 10 s M 5s M N 2000x 5 min 1min 0 min N 1500x 1000x N M 30 s Σχήμα 5.7: Βελτιστοποιήσεις μεθόδου (α) Συγκέντρωση συζεύγματος SA-HRP, (β) Χρόνος επώασης υποστρώματος, (γ) Χρόνος έκθεσης πριν τη λήψη φωτογραφίας 58

5.3.3. Κλινικά δείγματα Η προτεινόμενη μέθοδος αξιολογήθηκε με την ανάλυση δειγμάτων αίματος γνωστών γονότυπων με τον βιοαισθητήρα τύπου ΙΙ. Τα αποτελέσματα της γονοτύπισης παρουσιάζονται στο Σχήμα 5.8 και ήταν σε πλήρη συμφωνία με εκείνα που λαμβάνονται με την αλληλούχιση του DNA. Οι κηλίδες δοκιμασίας Μ και Ν αναφέρονται στην παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου και φυσιολογικού, αντίστοιχα. Μία μπλε κηλίδα που σχηματίζεται στο Μ υποδηλώνει την παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου. Μία μπλε κηλίδα που σχηματίζεται μόνο στο Ν υποδηλώνει την παρουσία ενός φυσιολογικού αλληλόμορφου. Δύο μπλε κηλίδες τόσο στο Μ και στο Ν δείχνουν έναν ετεροζυγώτη για την μετάλλαξη. N/N N/N M/M N/M M/M N/N M/M N/M M N Σχήμα 5.8: Γονοτύπιση 8 κλινικών δειγμάτων για το μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό του MTHFR 5.3.4. Επαναληψιμότητα προτεινόμενης μεθόδου Η επαναληψιμότητα του βιοαισθητήρα για τον οπτικό προσδιορισμό του γονότυπου των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών, αξιολογήθηκε αναλύοντας εις τριπλούν, τα προϊόντα επεκτάσεως ενός φυσιολογικού (Ν/Ν), ενός ετεροζυγώτη (N/Μ) και ενός ομοζυγώτη για την μετάλλαξη (Μ/Μ) και με τους δύο τύπους βιοαισθητήρα. Οι εικόνες αναλύθηκαν με το λογισμικό Adobe Photoshop. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 5.9, ενώ η στατιστική ανάλυση παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. 59

(α) N M N M N M N M N M N M N M N M N M N/N M/M N/M (β) N/N N/M M/M M M N N M N Σχήμα 5.9: Επαναληψιμότητα της μεθόδου για (α) τον τύπο Ι και (β) τον τύπο ΙΙ βιοαισθητήρα, για ένα φυσιολογικό δείγμα (Ν/Ν), για ένα ομοζυγώτη για τη μετάλλαξη (Μ/Μ) και έναν ετεροζυγώτη (Ν/Μ) 60

Πίνακας 2: Η πυκνομετρική ανάλυση και η σχετική τυπική απόκλιση (CV%) για τον τύπο Ι και τύπο ΙΙ βιοαισθητήρα για όλα τα είδη δειγμάτων Τύπος Ι Φυσιολογικός Μεταλλαγμένος Ετεροζυγώτης N M N M 26884 78794 26449 25959 25392 93822 24018 28786 27925 95884 28340 23275 4.8 10.4 8.2 10.6 πυκνότητα κηλίδας CV% Τύπος ΙΙ Φυσιολογικός Μεταλλαγμένος Ετεροζυγώτης N M N M 28868 28333 55829 26915 28591 22043 47140 28505 36749 29143 43468 28480 14.8 14.7 13.0 3.3 πυκνότητα κηλίδας CV% 5.3.5. Χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση με χρήση smartphone Για να εξελιχθεί o προτεινόμενος βιοαισθητήρας χημειοφωταύγειας, αξιοποιήσαμε τη νέα γενιά των smartphones που χρησιμοποιούν νέες φωτοδιόδους ως αισθητήρες φωτός και βελτιώνουν τη συλλογή των φωτονίων από μικρή επιφάνεια. Αυτή η καινοτομία επιτρέπει τη βελτίωση της οπτικής απόδοσης, καθιστώντας τα κινητά κατάλληλα για την ανίχνευση πολύ ασθενών οπτικών σημάτων σαν αυτών που παράγουν οι αντιδράσεις χημειοφωταύγειας. Όλα τα παραπάνω, σε συνδυασμό με το εξάρτημα της συσκευής smartphone που κατασκευάστηκε, επιτρέπει την εφαρμογή του προτεινόμενου βιοαισθητήρα και με τη χρήση smartphone. 61

Έτσι, ο χημειοφωταυγειομετρικός βιοαισθητήρας εφαρμόστηκε επίσης για τον προσδιορισμό του γονότυπου των κλινικών δειγμάτων, χρησιμοποιώντας την κάμερα του smartphone, ως σύστημα ανίχνευσης. Κατασκευάστηκε μία συσκευή με έναν εκτυπωτή 3D, η οποία προσαρμόζεται μπροστά από την κάμερα, όπου τοποθετείται ο βιοαισθητήρας. Το εξάρτημα ενώνεται με μια αφαιρούμενη θήκη όπου τοποθετείται το κινητό. 5.3.6. Γονοτύπιση κλινικών δειγμάτων με χρήση smartphone Ο τύπος ΙΙ του βιοαισθητήρα DNA χρησιμοποιήθηκε για την γονοτύπιση κλινικών δειγμάτων χρησιμοποιώντας το smartphone για την ανίχνευση της χημειοφωταύγειας. Ομοίως με την αρχή της μεθόδου με χρήση ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής, τα σημεία δοκιμής Μ και Ν περιείχαν ακινητοποιημένα συζεύγματα antitag ολιγονουκλεοτιδίων με μικροσφαιρίδια. Οι κηλίδες Μ και Ν συμβολίζουν τη παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου και του φυσιολογικού, αντίστοιχα. Μία μπλε κηλίδα παρουσιάζεται μόνο στο Μ όταν πρόκειται για μεταλλαγμένο γονότυπο, ενώ μια μπλε κηλίδα παρουσιάζεται μόνο στο Ν για ένα φυσιολογικό γονότυπο. Η εμφάνιση και των δύο κηλίδων στο Μ και στο Ν υποδηλώνουν έναν ετεροζυγώτη για την μετάλλαξη. Για τη καταγραφή της εικόνας χρησιμοποιήθηκε το iphone 4 με την εφαρμογή pro LongExpo (έκδοση 3.2.2). Ο χρόνος έκθεσης για τη λήψη της εικόνας με το smartphone έχει καθοριστεί στα 8s. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 5.10 και ήταν εφάμιλλα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. 62

N/N N/N M/M N/M M/M N/N M/M N/M M N Σχήμα 5.10: Χημειοφωταυγειομετρικές εικόνες για 8 κλινικά δείγματα χρησιμοποιώντας τη κάμερα του smartphone 5.4. Συμπεράσματα Στη παρούσα βιοαισθητήρας μελέτη, για αναπτύχθηκε τον οπτικό ένας νέος προσδιορισμό χημειοφωταυγειομετρικός του γονότυπου ενός μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού. Κατασκευάστηκαν δύο τύποι βιοαισθητήρα DNA και η προτεινόμενη μέθοδος εφαρμόστηκε επίσης με επιτυχία και σε κλινικά δείγματα γνωστού γονοτύπου. Ο βιοαισθητήρας DNA βασίζεται στην ανίχνευση χημειοφωταύγειας με μια ψηφιακή κάμερα ή smartphone. Η μέθοδος, συνοπτικά περιλαμβάνει (i) την απομόνωση του γενωμικού DNA από δείγματα αίματος, (ii) την ενίσχυση του γονιδίου MTHFR με PCR, (iii) την διάκριση των δύο αλληλόμορφων για το SNP C677T του γονιδίου MTHFR με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και (iv) την ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης με το χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα DNA. Η διαδικασία είναι ταχεία και εξαλείφει πολλαπλά στάδια επώασης και έκπλυσης. Το κόστος της ανάλυσης είναι χαμηλό και δεν απαιτεί εξειδικευμένα όργανα και προσωπικό. Η ανίχνευση με τον βιοαισθητήρα ολοκληρώνεται εντός 25 λεπτών και η οπτικοποίηση των βιοαισθητήρων είναι δυνατή αμέσως μετά την προσθήκη του υποστρώματος. Επιπλέον, τα προϊόντα PCR και τα προϊόντα επέκτασης εφαρμόζονται απευθείας στο βιοαισθητήρα χωρίς προηγούμενο καθαρισμό του DNA μετά την PCR ή μετά την αντίδραση επέκτασης. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να εξελίξουμε την προτεινόμενη μέθοδο και έτσι σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε εξάρτημα για το smartphone, έτσι ώστε η 63

απεικόνιση της χημειοφωταύγειας του βιοαισθητήρα DNA να είναι εφικτή με τη χρήση του, ως φορητού ανιχνευτή. Το μεγάλο πλεονέκτημα των smartphones είναι η κοινή τους χρήση από οποιονδήποτε, ενώ καμία συγκεκριμένη εκπαίδευση και κατάρτιση δεν είναι απαραίτητη για την σωστή χρήση. Η χρήση των smartphones έχει σημειώσει μεγάλη πρόοδο στις αυτο-διαγνωστικές συσκευές. Επιπλέον, η απλότητα του συνδυασμού του προτεινόμενου βιοαισθητήρα DNA με τη συσκευή smartphone διευρύνει τις εφαρμογές της μεθόδου και καθιστά εφικτή την ανάπτυξη και άλλων δοκιμασιών νουκλεϊκών οξέων. Ο επόμενος κύριος στόχος είναι να χρησιμοποιηθεί η προτεινόμενη μέθοδος για την ποσοτικοποίηση του DNA αλληλουχιών. Είμαστε πολύ αισιόδοξοι ότι με τις κατάλληλες βελτιστοποιήσεις η προτεινόμενη μέθοδος θα είναι σταθερή και ακριβής, όχι μόνο για ένα τέστ τύπου «Ναι / Όχι», αλλά και για συγκεκριμένες δοκιμασίες ποσοτικοποίησης για τους στόχους του DNA. 64

Κεφάλαιο 6. Ανάπτυξη βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων για χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση ειδικών μονόκλωνων και δίκλωνων αλληλουχιών 6.1.Εισαγωγή Σε εξέλιξη της προτεινόμενης μεθόδου του κεφαλαίου 5, ξεκίνησαν οι μελέτες για τον ποσοτικό προσδιορισμό ειδικών αλληλουχιών DNA με χρήση του χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη μεθόδων για ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων. Όπως αναφέρθηκε και στο κεφάλαιο 1.2. υπάρχουν διάφορες μέθοδοι ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων. Άλλες βασίζονται σε φθορισμομετρικές μεθόδους χωρίς να ταυτοποιούν την συγκεκριμένη αλληλουχία (ηλεκτροφόρηση, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου με παρεμβολή φθοριζουσών χρωστικών), ενώ άλλες βασίζονται σε δοκιμασίες υβριδοποίησης και επιτρέπουν έτσι και την ταυτοποίηση της αλληλουχίας στόχου (μοριακοί πυρσοί, τεχνική Taqman, βιοαισθητήρες) Η ανάπτυξη βιοαισθητήρων αποτελεί μία πολύ ελκυστική εναλλακτική οδό καθώς επιτρέπει τον προσδιορισμό των αλληλουχιών στόχων, με ταυτόχρονη ταυτοποίηση της αλληλουχίας, αλλά και τη μείωση διάφορων σταδίων εκπλύσεων και επωάσεων. Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο 4 υπάρχουν διάφοροι τύποι βιοαισθητήρων. Οι βιοαισθητήρες ξηρών αντιδραστηρίων είναι ο τύπος που μας απασχόλησε στη παρούσα μεταπτυχιακή εργασία. Ειδικότερα, ο ποσοτικός προσδιορισμός διάφορων ειδικών αλληλουχιών σε βιοαισθητήρα, είναι μια εφαρμογή που φέρει βελτίωσης και εξέλιξης, καθώς έχουν παρουσιαστεί δυσκολίες, κυρίως στην ποσοτικοποίηση της κάθε ζώνης, αλλά και της συσχέτισής της με την αντίστοιχη αρχική συγκέντρωση της αλληλουχίας στόχου (γραμμικότητα). Η αρχή της μεθόδου βασίζεται αρχικά σε ενίσχυση των DNA στόχων με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και εφαρμογή των προϊόντων σε δοκιμασίες υβριδοποίησης για ταυτοποίηση της συγκεκριμένης αλληλουχίας στόχου με ταυτόχρονο προσδιορισμό της συγκέντρωσης του. Για τον ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών σε βιοαισθητήρες ξηρών αντιδραστηρίων έχουν παρουσιαστεί 65

διάφορες μέθοδοι, που έχουν καταλήξει σε βαθμιαία αύξηση του σήματος με την αύξηση της συγκέντρωσης χωρίς όμως να αποτελούν μεθόδους ποσοτικοποίησης (Kalogianni, 2011) (Kalogianni, 2009) (Sapountzi, 2015). Η ποσοτικοποίηση απαιτεί τη δημιουργία μια επαναλήψιμης σχέσης μεταξύ του αναλυτικού σήματος που προκύπτει από το προϊόν αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και την αρχική ποσότητα του DNA στόχου πριν τον πολλαπλασιασμό του. Όμως, μικρές διαφορές που συμβαίνουν κατά την εκθετική φάση του πολλαπλασιασμού του στόχου (αλλαγές στους θερμικούς κύκλους, διαφοροποίηση στα συστατικά της PCR) μπορεί να οδηγήσουν σε τεράστιες αλλαγές στην απόδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Μία μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων, όπως αναφέρθηκε και στη παράγραφο 1.2.4., είναι με τη χρήση εσωτερικού προτύπου. Αυτή η μέθοδος ονομάζεται ποσοτική ανταγωνιστική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (QC-PCR), και περιλαμβάνει τον ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό, μαζί με τον DNA στόχο και μιας ανταγωνιστικής αλληλουχίας σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (εσωτερικό πρότυπο). Όταν τα προϊόντα πρόκειται να ανιχνευτούν με δοκιμασία υβριδοποίησης τότε η ανταγωνιστική αλληλουχία έχει το ίδιο ακριβώς μέγεθος με τον DNA στόχο και διαφέρει σε μια περιοχή 20-25 αζωτούχων βάσεων στο κέντρο περίπου της επιθυμητής αλληλουχίας. Έτσι, σε αυτή τη μέθοδο, ο DNA στόχος πολλαπλασιάζεται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μαζί με το εσωτερικό πρότυπο, στο ίδιο μίγμα αντίδρασης, φέροντας τους ίδιους εκκινητές. Το πλεονέκτημα σε αυτό, έγκειται στο γεγονός ότι οποιαδήποτε διαφοροποίηση στην απόδοση του πολλαπλασιασμού θα επηρεάσει το ίδιο και τον στόχο αλλά και την ανταγωνιστική αλληλουχία. Ως αποτέλεσμα, η αναλογία των προϊόντων πολλαπλασιασμού, είναι ευθέως ανάλογη με την αναλογία των αρχικών ποσοτήτων των δύο αλληλουχιών στο δείγμα (Kalogianni, 2007). Έχουν παρουσιαστεί μέθοδοι ποσοτικής ανταγωνιστικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, σε κυτταρομετρητή ροής για παράδειγμα (Kalogianni,2007), χωρίς να έχει εφαρμοστεί αυτή η τεχνική σε βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων. Στο παρόν κεφάλαιο θα παρουσιαστούν οι πρώιμες μελέτες που έγιναν για την συσχέτιση της έντασης της χημειοφωταύγειας με την ποσότητα (ή συγκέντρωση) της αλληλουχίας στόχου. Αρχικά θα παρουσιαστεί η κατασκευή ζωνών δοκιμασίας 66

με ακινητοποιημένα αντισώματα έναντι της φλουορεσκεΐνης και της διγοξιγενίνης. Στη συνέχεια θα παρουσιαστούν οι αρχές της μεθόδου που εφαρμόστηκαν. Για να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες της μεθόδου, χρησιμοποιήθηκε αρχικά ένα μονόκλωνο διπλά ιχνηθετημένο ολιγονουκλεοτίδιο, ώστε να διαπιστωθεί απλώς η αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος καθώς και η ευαισθησία της ζώνης δοκιμασίας. Έτσι κατασκευάστηκαν διαγράμματα της έντασης της εκπομπής σε σχέση με τη συγκέντρωση της αλληλουχίας στόχου. Επιπλέον, μελετήθηκε και ένας συνθετικός στόχος, 61 νουκλεοτιδίων (ctm6 target). Ο συνθετικός στόχος ήταν είτε μονόκλωνος και υβριδοποιούταν με έναν ανιχνευτή ο οποίος ακινητοποιούταν στον βιοαισθητήρα με αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος, είτε δίκλωνος, οπότε γινόταν πρώτα αποδιάταξη των δύο κλώνων και έπειτα υβριδοποίηση της αλληλουχίας πάλι με τον ίδιο ανιχνευτή. Η συνθετική δίκλωνη αλληλουχία προέκυπτε από υβριδοποίηση δύο συνθετικών μονόκλωνων αλληλουχιών, του DNA στόχου (ctm6) και του συμπληρωματικού της (tm6) και μελετήθηκε για να διαπιστωθεί η παρεμπόδιση του σήματος από τη συμπληρωματική αλληλουχία του στόχου, λόγω συναγωνισμού με τον συμπληρωματικό ανιχνευτή. Για όλα τα παραπάνω, κατασκευάστηκαν επίσης καμπύλες έντασης ζώνης ως προς τη συγκέντρωση. Τέλος ο βιοαισθητήρας εφαρμόστηκε ξεχωριστά για πραγματικό προϊόν αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και το εσωτερικό του πρότυπο και παρουσιάζονται και κάποια συγκριτικά αποτελέσματα και βελτιστοποιήσεις στα αποτελέσματα. Επόμενος στόχος και πρόκληση του κεφαλαίου που θα παρουσιαστεί, είναι η ταυτόχρονη εφαρμογή στο βιοαισθητήρα και του PCR προϊόντος και του εσωτερικού προτύπου, καθώς και βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης που μπορεί να ανιχνευτεί κάτω από τα όρια που θα παρουσιαστούν. 6.2. Μεθοδολογία 6.2.1. Προετοιμασία βιοαισθητήρα Όπως αναφέρθηκε και στη παράγραφο, 5.2.1., η ταινία ξηρού αντιδραστηρίου (4 mm x70 mm) αποτελείται από ένα υλικό εμβάπτισης, ένα υλικό εναπόθεσης, μια πλαστικοποιημένη μεμβράνη και ένα απορροφητικό υλικό συναρμολογημένο σε 67

ένα πλαστικό υπόστρωμα το οποίο παρέχει την απαιτούμενη ακαμψία. Τα τέσσερα τμήματα τοποθετούνται με τέτοιο τρόπο ώστε τα άκρα τους να επικαλύπτονται, για να εξασφαλιστεί η συνεχής ροή (με τριχοειδή δράση) του διαλύματος. Για την παρούσα μελέτη κατασκευάστηκαν βιοαισθητήρες που είχαν ακινητοποιημένες ζώνες αντιφλουρεσκεΐνης (anti-f) και αντιδιγοξιγενίνης (anti-dig). 6.2.2. Παρασκευή ζωνών δοκιμασίας αντιφλουρεσκεΐνης και αντιδιγοξιγενίνης Στην μεμβράνη του βιοαισθητήρα ακινητοποιούνται με προσρόφηση αντισώματα έναντι του απτενίου της φλουρεσκεΐνης (αντιφλουρεσκεΐνη) και αντισώματα έναντι του απτενίου διγοξιγενίνη (αντιδιγοξιγενίνη) ως δύο ξεχωριστές ζώνες δοκιμασίας. Για την ακινητοποίηση της αντιφλουρεσκεΐνης παρασκευάστηκε διάλυμα που περιείχε 150ng*μL-1 αντιφλουρεσκεΐνη, 50mL*L-1 μεθανόλη, 20g*L-1 σουκρόζη σε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα 100mM NaHCO3, ph 8.5. Η τελική ποσότητα αντιφλουρεσκεΐνης που αποτέθηκε στη μεμβράνη ήταν 150ng. Ομοίως, για την ακινητοποίηση της αντιδιγοξιγενίνης παρασκευάστηκε διάλυμα που περιείχε 500ng*μL-1 αντιδιγοξιγενίνη, 50mL*L-1 μεθανόλη, 20g*L-1 σουκρόζη σε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα 100mM NaHCO3, ph 8.5. Η τελική ποσότητα αντιδιγοξιγενίνης που αποτέθηκε στη μεμβράνη ήταν 500ng. Στη συνέχεια η μεμβράνη ξεραίνεται στους 80οC για 1h και οι βιοαισθητήρες διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου. 6.2.3. Προσθήκη F-dUTP και Dig-dUTP στα μονόκλωνα βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια στόχους Τα ολιγονουκλεοτίδια στόχοι επιμηκύνθηκαν με F-dUTP και Dig-dUTP αντίστοιχα, πριν αποτεθούν στο βιοαισθητήρα. Πιο συγκεκριμένα, ένα βιοτινυλιωμένο ολιγονουκλεοτίδιο στόχος, υποβάλλεται σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επιμήκυνσης. (Σχήμα 6.1) Η αντίδραση πραγματοποιείται με το ένζυμο, ακροτελική δεοξυνουκλετιδυλο τρανσφεράση (TdT). Η αντίδραση επιμήκυνσης με το F-dUTP, περιείχε (20 μl) 1xTdT buffer, 20 U από το ένζυμο TdT, 2 mm CoCl2, 0.5 mm καθενός από τα dntps, 0.05 μμ F-dUTP και 2 μμ από τον βιοτινυλιωμένο στόχο. Το μίγμα 68

της αντίδρασης επωάστηκε για 1h στους 37οC και η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 2 μl EDTA 500mM ph 8. Ομοίως πραγματοποιήθηκε και η αντίδραση επιμήκυνσης με το Dig-dUTP, με τη μόνη διαφορά ότι γίνεται προσθήκη 0.05 mm Dig-dUTP. Έτσι προκύπτουν διπλά ιχνηθετημένα ολιγονουκλεοτίδια στόχοι. Η αρχή της αντίδρασης επιμήκυνσης φαίνεται στο σχήμα 6.1. TdT B 3 5 B Dig Dig + DigdUTP, dntps 5 3 5 Dig B 3 TdT + FdUTP, dntps B F F F 5 3 Σχήμα 6.1: Αντιδράσεις επιμήκυνσης βιοτινυλιωμένου ολιγονουκλεοτιδίου με F-dUTP και Dig-dUTP. 6.2.4. Ανίχνευση διπλά ιχνηθετημένων μονόκλωνων αλληλουχιών με χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα. Τα προϊόντα επέκτασης είναι τώρα έτοιμα για να χρησιμοποιηθούν στον χημειοφωταυγειομετρικό βιοαισθητήρα. Για την χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση, 5-μL του διπλά ιχνηθετημένου στόχου, κατάλληλης συγκέντρωσης (0.320 nm), και άλλα 5-μL στρεπταβιδίνης-hrp (1000 αραιωμένο σε διάλυμα PBS που περιέχει 6% BSA και 0.2% Tween-20) εναποτίθενται πάνω στην μεμβράνη του βιοαισθητήρα. Ο βιοαισθητήρας στη συνέχεια βυθίζεται σε ένα μικροφυγοκεντικό σωλήνα που περιέχει 250 μl του διαλύματος αναπτύξεως (2% γλυκερόλη, 1% BSA, 0,2% Tween σε PBS). Μετά από 25 λεπτά, ο βιοαισθητήρας απομακρύνεται από το διάλυμα αναπτύξεως και τοποθετείται σε ένα σκοτεινό θάλαμο, όπου 10 μl του υποστρώματος της υπεροξειδάσης προστίθενται επί της μεμβράνης και η εκπεμπόμενη χημειοφωταύγεια ανιχνεύεται αμέσως με την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Η λήψη της χημειοφωταύγειας έγινε στα 30 s. Μία μπλε ζώνη σχηματίζεται στη θέση δοκιμασίας του βιοαισθητήρα που αποδεικνύει την παρουσία της αλληλουχίας. Η αρχή του βιοαισθητήρα DNA παρουσιάζεται στο Σχήμα 6.2. 69

Substrate Light HRP Β Dig ή F anti-dig ή anti-f Σχήμα 6.2 : Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα για ανίχνευση μονόκλωνων αλληλουχιών χωρίς υβριδοποίηση 6.2.5. Προσθήκη biotin-dutp σε ολιγονουκλεοτίδιο στόχο ctm6 Για τη μελέτη ενός μονόκλωνου συνθετικού στόχου 61 νουκλεοτιδίων με δοκιμασία υβριδοποίησης και χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση, ένα άλλο ολιγονουκλεοτίδιο (ctm6) επιμηκύνθηκε με biotin-dutp, πριν εφαρμοστεί στο βιοαισθητήρα. Πιο συγκεκριμένα, το ολιγονουκλεοτίδιο στόχος, υποβάλλεται σε μια αντίδραση επιμήκυνσης. Η αντίδραση πραγματοποιείται με το ένζυμο, ακροτελική δεοξυνουκλετιδυλο τρανσφεράση (TdT). Η αντίδραση επιμήκυνσης με το biotindutp, περιείχε (20μL) 1xTdT buffer, 20 U από το ένζυμο TdT, 2 mm CoCl2, 0.5 mm καθενός από τα dntps, 0.05 μμ biotin-dutp και 2 μμ από τον στόχο ctm6. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε για 30min στους 37οC και η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 2 μl EDTA 500mM ph 8. 6.2.6. Ανίχνευση μονόκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου στόχου με υβριδοποίηση με ιχνηθετημένο ανιχνευτή με φλουρεσκεΐνη Το μονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο στόχος που επιμηκύνθηκε με biotin-dutp, αρχικά υβριδοποιείται με έναν συμπληρωματικό ανιχνευτή 20 νουκλεοτιδίων (6F probe) ο 70

οποίος είναι ιχνηθετημένος στο 5 άκρο με φλουρεσκεΐνη. Γίνεται, δηλαδή προσθήκη του ολιγονουκλεοτιδίου στόχου κατάλληλης συγκέντρωσης (0.6-20 nm) και 1 pmol του ανιχνευτή και το μίγμα αφήνεται για 15 min στους 37οC. Για την χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση, 5-μL του προϋβριδοποιημένου προϊόντος, και άλλα 5-μL στρεπταβιδίνης-hrp (1000 αραιωμένο σε διάλυμα PBS που περιέχει 6% BSA και 0.2% Tween-20) εναποτίθενται πάνω στην μεμβράνη του βιοαισθητήρα. Ο βιοαισθητήρας στη συνέχεια βυθίζεται σε ένα μικροφυγοκεντικό σωλήνα που περιέχει 250 μl του διαλύματος αναπτύξεως (2% γλυκερόλη, 1% BSA, 0,2% Tween σε 1xPBS). Μετά από 25 λεπτά, ο βιοαισθητήρας απομακρύνεται από το διάλυμα αναπτύξεως και τοποθετείται σε ένα σκοτεινό θάλαμο, όπου 10 μl του υποστρώματος υπεροξειδάσης προστίθενται επί της μεμβράνης και η εκπεμπόμενη χημειοφωταύγεια ανιχνεύεται αμέσως από την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Η λήψη της χημειοφωταύγειας έγινε για 30s. Μία μπλε ζώνη σχηματίζεται στη θέση δοκιμασίας του βιοαισθητήρα που αποδεικνύει την παρουσία της αλληλουχίας. Η αρχή της μεθόδου φαίνεται στο σχήμα 6.3. Substrate Light HRP Β Β F anti-f Σχήμα 6.3 : Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα για ανίχνευση μονόκλωνων ή δίκλωνων αλληλουχιών με υβριδοποίηση 71

6.2.7. Ανίχνευση δίκλωνου συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου στόχου με υβριδοποίηση με ιχνηθετημένο ανιχνευτή με φλουρεσκεΐνη Για να σχηματιστεί και να μελετηθεί ένα δίκλωνο συνθετικό προϊόν, το μονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο στόχος (ctm6) που επιμηκύνθηκε με biotin-dutp, αρχικά υβριδοποιείται με την συμπληρωματική του αλληλουχία (tm6) (61 νουκλεοτίδια). Στην συνέχεια αποδιατάσσεται και υβριδοποιείται με τον ανιχνευτή ο οποίος είναι ιχνηθετημένος με φλουρεσκεΐνη στο 5 άκρο (6F-probe). Γίνεται, δηλαδή προσθήκη του ολιγονουκλεοτιδίου στόχου (ctm6) και της συμπληρωματικής του αλληλουχίας (tm6) κατάλληλης συγκέντρωσης (0.6-20 nm) και 1 pmol του ανιχνευτή και το μίγμα θερμαίνεται στους 95οC για 2 min και αφήνεται για 15 min στους 37οC. Για την χημειοφωταυγειομετρική ανίχνευση, 5-μL του προϋβριδοποιημένου προϊόντος, και άλλα 5-μL στρεπταβιδίνης-hrp (1000 αραιωμένο σε διάλυμα PBS που περιέχει 6% BSA και 0.2% Tween-20) εναποτίθενται πάνω στην μεμβράνη του βιοαισθητήρα. Ο βιοαισθητήρας στη συνέχεια βυθίζεται σε ένα μικροφυγοκεντικό σωλήνα που περιέχει 250 μl του διαλύματος αναπτύξεως (2% γλυκερόλη, 1% BSA, 0,2% Tween σε PBS). Μετά από 25 λεπτά, ο βιοαισθητήρας απομακρύνεται από το διάλυμα αναπτύξεως και τοποθετείται σε ένα σκοτεινό κουτί, όπου 10 μl του υποστρώματος υπεροξειδάσης προστίθενται επί της μεμβράνης και η εκπεμπόμενη χημειοφωταύγεια ανιχνεύεται αμέσως από την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Η λήψη της χημειοφωταύγειας έγινε στα 30s. Μία μπλε ζώνη σχηματίζεται στη θέση δοκιμασίας του βιοαισθητήρα που αποδεικνύει την παρουσία της αλληλουχίας. Επίσης η αρχή της μεθόδου φαίνεται στο σχήμα 6.3. 6.2.8. Προσθήκη F-dUTP και Dig-dUTP σε ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές Σε συνέχεια των μελετών, ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές ειδικά για το γονίδιο της λεκτίνης και του εσωτερικού της προτύπου, επιμηκύνθηκαν με F-dUTP και Dig-dUTP αντίστοιχα, πριν εφαρμοστούν στο βιοαισθητήρα. Πιο συγκεκριμένα, ο ανιχνευτής για το γονίδιο της λεκτίνης, υποβλήθηκε σε μια αντίδραση επιμήκυνσης με DigdUTP, ενώ ο ανιχνευτής για το εσωτερικό πρότυπο της λεκτίνης επιμηκύνθηκε με FdUTP. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε όπως και στη παράγραφο 6.2.6. 72

6.2.9. Ανίχνευση προϊόντων λεκτίνης και του εσωτερικού προτύπου της με τον βιοαισθητήρα DNA. Οι ανιχνευτές που έχουν επιμηκυνθεί με Dig-dUTP και F-dUTP αντίστοιχα, είναι τώρα έτοιμοι για να χρησιμοποιηθούν στην προϋβριδοποίηση με τα κατάλληλα βιοτυνιλιωμένα δίκλωνα προϊόντα. Αρχικά, γίνεται αποδιάταξη του προϊόντος κατάλληλης συγκέντρωσης (2.5nM - 20nM) στους 96οC για 3min και μετά τοποθετείται για 2min στον πάγο. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η ίδια διαδικασία με την παράγραφο 6.2.7. Η αρχή της δοκιμασίας φαίνεται στο σχήμα 6.4. Substrate Light HRP Β Dig ή F anti-dig ή anti-f Σχήμα 6.4: Αρχή της μεθόδου χημειοφωταυγειομετρικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση δίκλωνων αλληλουχιών, προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και εσωτερικού προτύπου 6.3 Αποτελέσματα 6.3.1. Οπτική ανίχνευση μονόκλωνων αλληλουχιών χωρίς υβριδοποίηση Όπως προαναφέρθηκε, για τον οπτικό προσδιορισμό των μονόκλωνων διπλά ιχνηθετημένων αλληλουχιών χρησιμοποιήθηκε ένας χημειοφωταυγειομετρικός 73