«Η ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης στην επαγόμενη από δίαιτα παχυσαρκία»

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Η ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης στην επαγόμενη από δίαιτα παχυσαρκία» Παπακώστα Ευγενία Χημικός Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα 2015

Επιβλέπων Καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής: Κυριάκος Η. Κυπραίος, Καθηγητής Φαρμακολογίας, Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Νικόλαος Τσοπάνογλου, Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Παναγιωτακόπουλος, Επίκουρος Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

Πρόλογος Η ακόλουθη εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά την περίοδο 2013-2015, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνηθεί εάν ο φαινότυπος των ευνουχισμένων μυών με πλήρη έλλειψη του υποδοχέα της LDL σχετιζόταν με τυχόν αλλαγές στη ρύθμιση της πρωτεινοσύνθεση στον λευκό λιπώδη ιστό. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Κυριάκο Κυπραίο, για την ευκαιρία που μου έδωσε να ενταχθώ στην ερευνητική του ομάδα, καθώς και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την αμέριστη καθοδήγησή του και το συνεχές ενδιαφέρον του σε όλη τη διάρκεια της προσπάθειάς μου. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Αν. Καθηγητή κ. Νικόλαο Τσοπάνογλου και τον Επικ. Καθηγητή κ. Γεώργιο Παναγιωτακόπουλο, που με τίμησαν με την συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ευχαριστώ, επίσης, όλα τα μέλη του εργαστηρίου Φαρμακολογίας για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας και κατανόησης. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την μεταδιδάκτορα κ. Κατερίνα Κωνσταντίνου, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, τις πολύτιμες γνώσεις και συμβουλές που συνεχώς μου μετέδιδε, καθώς και τη βοήθεια που μου προσέφερε τόσο σε επιστημονικό όσο και προσωπικό επίπεδο. Επιπλέον, δεν θα μπορούσα να παραλείψω τη φίλη και συνεργάτιδά μου, Μαριλένα Καραβυράκη, για την άψογη συνεργασία μας και για την αμέριστη συμπαράσταση και στήριξή της καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Προς την οικογένειά μου θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου για την ανεκτίμητη συμπαράσταση τους όλα αυτά τα χρόνια των σπουδών μου. 3

Περίληψη Προηγούμενες μελέτες, στο εργαστήριό μας, έχουν δείξει ότι η αντίσταση στην επαγόμενη από δίαιτα παχυσαρκία σχετίζεται με λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ του υποδοχέα της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (LDLr) με την τεστοστερόνη (Τ). Συγκεκριμένα, μετά από 12 εβδομάδες σε δίαιτα υψηλών λιπαρών, ευνουχισμένοι ποντικοί με έλλειψη λειτουργικού LDLr (ldlr -/- ) ανέπτυξαν αντίσταση στην επαγόμενη από την συγκεκριμένη δίαιτα παχυσαρκία, η οποία συνοδεύτηκε από αυξημένο ενεργειακό μεταβολισμό. Επιπλέον, η αυξημένη δαπάνη ενέργειας δείχθηκε να είναι αποτέλεσμα της αυξημένης έκφρασης της πρωτεΐνης αποσύζευξης 1 (UCP1) στον σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό (WAT) αυτών των ποντικών. Δημοσιευμένες εργασίες υποδεικνύουν ότι η mtorc1- εξαρτώμενη ρύθμιση της μετάφρασης μπορεί να επηρεάσει την αντίσταση στην επαγόμενη από δίαιτα παχυσαρκία. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε κατά πόσον ο παρατηρούμενος φαινότυπος των ευνουχισμένων ldlr -/- ποντικών και ειδικά η μαζική αύξηση των επιπέδων της UCP1 στο σπλαχνικό WAT τους, οφείλεται σε αλλαγές στην έναρξη της μετάφρασης, η οποία ρυθμίζεται από την φωσφορυλίωση του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 4Ε και της φωσφωρυλίωσης της συνδετικής με αυτόν πρωτεΐνης 1 (4EBP1), καθώς και με αλλαγές στην επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, η οποία ρυθμίζεται κυρίως από την φωσφορυλίωση της κινάσης 1 της ριβοσωματικής πρωτεΐνης S6 (S6K1). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ταυτόχρονη ανεπάρκεια των Τ και LDLr στο WAT οδήγησε σε καταστολή της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης, ενώ η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας ενεργοποιήθηκε. Ο ευνουχισμός άγριου τύπου, C57BL/6, ποντικών δεν οδήγησε σε τέτοιου είδους αλλαγές. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η μεταβολική ενεργοποίηση του WAT των ευνουχισμένων ldlr -/- ποντικών μπορεί να οφείλεται σε cap-ανεξάρτητους μηχανισμούς έναρξης της μετάφρασης της UCP1. 4

Abstract Our previous studies have shown that resistance to diet-induced obesity is related to a functional cross-talk of the low density lipoprotein receptor (LDLr) with testosterone (T). Specifically, after 12 weeks in high fat diet (HFD), castrated LDLr-deficient (ldlr -/- ) mice developed resistance to diet-induced obesity and increased energy metabolism. Moreover, the elevated energy expenditure was shown to be the result of increased uncoupling protein 1 (UCP1) expression in their white adipose tissue (WAT). In addition, literature data suggest that the mtorc1-dependent regulation of protein translation may affect resistance to dietinduced obesity. In the present study, we investigated whether the lean phenotype of castrated ldlr -/- mice and especially the massive increase in UCP1 protein levels in their WAT, was due to changes in the translation initiation, which is regulated by the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1), as well as in the elongation of the polypeptide chain, which is mainly regulated by the phosphorylation of the ribosomal protein S6 kinase 1 (S6K1). Activation of translation initiation and elongation factors was also evaluated. Our results showed that the simultaneous deficiency of T and LDLr in WAT led to the suppression of cap-dependent translation initiation, whereas the elongation of the polypeptide chain was activated. Castration of wild-type C57BL/6 mice did not reveal any such changes. Our observed results indicate that WAT metabolic activation of castrated ldlr -/- mice, marked by the upregulation of UCP1 protein expression, may involve cap-independent mechanisms of UCP1 translation initiation. 5

Περιεχόμενα Πρόλογος... 3 Περίληψη... 4 Abstract... 5 Εισαγωγή... 8 1. mtor... 8 2. Τα σύμπλοκα του mtor... 9 3. Η ρύθμιση του mtorc1... 11 Παράγοντες που ρυθμίζουν τον mtorc1... 11 Αυξητικοί παράγοντες... 11 Ενεργειακή κατάσταση... 13 Επίπεδα οξυγόνου... 13 Αμινοξέα... 14 4. Η ρύθμιση του mtorc2... 14 5. Οι λειτουργικοι ρολοι του mtorc1... 15 Ο ρόλος του mtroc1 στην αυτοφαγία... 15 Ο ρόλος του mtor στις μεταβολικές νόσους... 15 Ο ρόλος του mtor στη σύνθεση των λιπιδίων... 16 Ο ρόλος του mtor στον μεταβολισμό και τη βιογένεση των μιτοχονδρίων... 17 Ο ρόλος του mtor στη δημιουργία λιπώδους ιστού... 17 Ο ρολος του mtor στη μετάφραση... 19 6. Η μετάφραση του mrna... 19 Έναρξη... 19 Επιμήκυνση... 22 Τερματισμός... 23 7. Η ρύθμιση της μετάφρασης... 23 Ρύθμιση της έναρξης της μετάφρασης μέσω των 4E-BPs... 24 6

Ρύθμιση της επιμήκυνσης της μετάφρασης... 26 8. Cap-ανεξάρτητη έναρξη της μετάφρασης... 27 IRES-εξαρτώμενη μετάφραση... 27 Υπόθεση δράσης του ριβοσώματος ως φίλτρο επιλογής των mrnas που θα μεταφραστούν... 29 mtor και η μετάφραση των TOP mrnas... 29 Σκοπός... 32 Υλικά και Μέθοδοι... 33 9. Πειραματόζωα... 33 Ορχεκτομή Ψευδοχειρουργείο... 34 Θυσίες και λήψη ιστών από τα πειραματόζωα... 35 10. Ομογενοποίηση λευκού λιπώδους ιστού και απομόνωση των total lysates... 36 11. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)... 37 12. Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot)... 40 Αποτελέσματα... 43 13. Έλεγχος παραγόντων που συμμετέχουν στην έναρξη της μετάφρασης... 43 Πρωτεΐνη 1 δέσμευσης του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 4Ε (4E-BP1)... 43 Ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 4E (eif4e)... 44 Ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 2A (eif2a)... 45 14. Έλεγχος παραγόντων που συμμετέχουν στο στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης... 46 Κινάση της ριβοσωματικής πρωτεΐνης S6 (S6K)... 46 Κινάση του ευκαρυωτικού παράγοντα επιμήκυνσης της πρωτεϊνοσύνθεσης eef2 (eef2k)... 47 Συζήτηση... 49 Βιβλιογραφία... 54 7

Εισαγωγή 1. mtor Ο μηχανιστικός στόχος της ραπαμυκίνης (mechanistic/mammalian target of rapamycin mtor) είναι μια εξελικτικά συντηρημένη κινάση σερίνης/θρεονίνης, αποτελείται από 2549 αμινοξέα και έχει μέγεθος 289 kda. Ο mtor ανήκει στην υπεροικογένεια των κινασών που σχετίζονται με την κινάση της 3-φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) kinase-related kinase - PIKK), δεδομένου ότι η καταλυτική περιοχή των κινασών αυτών εμφανίζει υψηλή ομολογία με το C-τελικό άκρο του mtor (171), (120), (97), (154). O mtor αποτελεί στόχο του μορίου ραπαμυκίνη (ή sirolimus), ενός μακρολιδίου που παράγεται από το στέλεχος Streptomyces Hygroscopius το οποίο, αρχικά, έγινε γνωστό λόγω των αντι-πολλαπλασιαστικών ιδιοτήτων του (96). Ο mtor εντοπίστηκε για πρώτη φορά στο ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae (63) και αργότερα στο ανθρώπινο οστεοσάρκωμα, το ήπαρ, τα Τ κύτταρα (12), και άλλα ευκαρυωτικά κύτταρα (5), (7). Ο mtor ανταποκρίνεται σε έναν μεγάλο αριθμό ερεθισμάτων που περιλαμβάνουν ορμόνες (π.χ. ινσουλίνη), αυξητικούς παράγοντες (π.χ. αυξητικοί παράγοντες τύπου ινσουλίνης (insulin-like growth factors - IGFs), θρεπτικά συστατικά (π.χ. αμινοξέα), τα ενεργειακά επίπεδα του κυττάρου (όπως αντικατοπτρίζονται από τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ATP) και τα επίπεδα του οξυγόνου, με σκοπό τη ρύθμιση του κυτταρικού μεταβολισμού, της ανάπτυξης, του πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης (Εικόνα 1) (179), (96). Εικόνα 1: Οι ρυθμιστές του mtor και οι λειτουργίες του 8

Για την ενίσχυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης, ο mtor διεγείρει αναβολικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν την πρωτεϊνική σύνθεση και, όπως πρόσφατα δεδομένα δείχνουν, λειτουργεί ως ένας σημαντικός ρυθμιστής της παραγωγής ενέργειας στα μιτοχόνδρια (179), (96). Επιπλέον, ο mtor αναστέλλει την αυτοφαγία, μια διαδικασία που μπορεί να εξαλείψει τα μιτοχόνδρια (47), (67), (81), (89). Ανακαλύψεις που επετεύχθησαν την τελευταία δεκαετία αποκαλύπτουν πως το μονοπάτι του mtor ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια ποικίλων κυτταρικών διαδικασιών, όπως ο σχηματισμός όγκων και η αγγειογένεση, η αντίσταση στην ινσουλίνη, η δημιουργία λιπώδους ιστού και η ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων και απορυθμίζεται σε ασθένειες όπως ο καρκίνος και ο διαβήτης τύπου 2 (95). Για την ακρίβεια, η σηματοδότηση του mtor ενεργοποιείται σε πληθώρα κακοηθειών είτε σαν επακόλουθο της αδρανοποίησης μεταλλάξεων σε ογκοκατασταλτικά γονίδια (π.χ. PTEN, TSC1/2, NF1, LKB1) είτε σαν αποτέλεσμα της υπερενεργοποίησης ογκογονιδίων (π.χ. AKT, PI3K) (185). Τελευταία, έχουν περιγραφεί στον καρκίνο πολυάριθμες μεταλλάξεις του mtor που οδηγούν σε υπερενεργοποίησή του (53). Οι παρατηρήσεις αυτές έχουν προσελκύσει ευρύ επιστημονικό και κλινικό ενδιαφέρον για τον mtor. 2. Τα σύμπλοκα του mtor Η αλληλεπίδραση του mtor με διαφορετικές πρωτεΐνες οδηγεί στον σχηματισμό δύο δομικά και λειτουργικά διακριτών πολυπρωτεινικών συμπλόκων, τo σύμπλοκο 1 του mtor (mtor complex 1 - mtorc1) και το σύμπλοκο 2 του mtor (mtor complex 2 - mtorc2) (185). Τα σύμπλοκα αυτά αποτελούνται από πρωτεΐνες που ελέγχουν τη σηματοδότηση του mtor, εμφανίζουν διακριτή υποκυτταρική κατανομή και ρυθμίζουν την εξειδίκευση των υποστρωμάτων (66). Η διαφορά των δυο συμπλόκων έγκειται στη σύστασή τους, στους υποκείμενους στόχους τους (120) και στην ευαισθησία τους στην ραπαμυκίνη (144). Η επίδραση της ραπαμυκίνης στη σηματοδότηση του mtor είναι πολύ πιο περίπλοκη από την προσδοκώμενη και, ακόμα και 20 χρόνια μετά την ανακάλυψη του mtor, η κατανόηση του μηχανισμού δράσης της βρίσκεται ακόμα σε εξέλιξη (86), (180). Θεωρείται, ότι πιθανόν ο τρόπος δράσης της να εντοπίζεται στην επίδραση της στην δομική ακεραιότητα του mtorc1, καθώς επίσης και στην αλλοστερικού τύπου μείωση της ενεργότητας κινάσης του mtorc1 (13), (17), (18). Η ραπαμυκίνη δεν επηρεάζει άμεσα αυτή καθαυτή την καταλυτική δραστηριότητα του mtor, αλλά αντιθέτως διαταράσσει τον σχηματισμό του συμπλόκου mtor-πρωτεΐνη, εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο τη σηματοδότηση από τον mtor (9), (86). Μόνο το σύμπλοκο mtorc1 είναι ευαίσθητο σε 9

βραχυπρόθεσμη αγωγή με ραπαμυκίνη, (86), ενώ η παρατεταμένη χρήση της επηρεάζει την ενεργότητα και των δύο συμπλόκων (149). Τα σύμπλοκα mtorc1 και mtorc2 μοιράζονται κάποια κοινά πρωτεϊνικά συστατικά (77), (87), (134), (84), αλλά μπορούν να διακριθούν κατά κύριο λόγο από τα μοναδικά συστατικά τους (Εικόνα 2Α και 2Β). Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη RAPTOR (Regulatory- Associated Protein of mtor) (86), (57) και ο ανταγωνιστής υποστρώματος PRAS40 (prolinerich Akt substrate 40 kda) βρίσκονται αποκλειστικά στο σύμπλοκο mtorc1 (172), (125), (42), (24), (41). Η πρωτεΐνη RAPTOR δρα ως ικρίωμα για τον mtor, δεσμεύοντας πρωτεΐνες φέρουσες το απαραίτητο μοτίβο πρόσδεσης στο mtor (TOR signaling (TOS) motif ) και κατευθύνοντάς τες στην καταλυτική περιοχή του mtor (61), (86). O PRAS40 ρυθμίζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ mtor και RAPTOR και ελέγχει αρνητικά τη σηματοδότηση του mtor, εμποδίζοντας την πρόσβαση των υποστρωμάτων του (172). Από την άλλη, η πρωτεΐνη RICTOR (rapamycin-insensitive companion of TOR) (148), η πρωτείνη msin1 (mammalian stress-activated protein kinase interacting protein 1) (44), (76) και η PRR5/PROTOR (proline-rich protein 5/protein observed with RICTOR) αποτελούν αποκλειστικά συστατικά του mtorc2 (175), (131). Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση κάθε συστατικού των συμπλόκων επηρεάζει τη δραστηριότητα και τη λειτουργία τους (22), (1), (109). Εικόνα 2: A) Τα συστατικά του συμπλόκου mtorc1, B) Τα συστατικά του συμπλόκου mtorc2 10

Με τη σειρά τους, τα δύο σύμπλοκα φωσφορυλιώνουν διαφορετικά υποστρώματα, καταλύοντας έτσι διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες (43). Η ενεργοποίηση του mtorc1 οδηγεί στη φωσφορυλίωση ενός αριθμού υποστρωμάτων όπως οι δεσμευτικές στον ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης της μετάφρασης 4E (eif4e) πρωτεΐνες (eukaryotic translation initiation factor 4E (eif4e)-binding proteins (4E-BPs)), οι κινάσες της ριβοσωματικής πρωτεΐνης S6 (S6Ks), η πρωτεΐνη LARP1, η πρωτεΐνη Atg13 (Autophagyrelated protein 13), οι κινάσες ULK1/2, και άλλα υποστρώματα. Μέσω όλων αυτών των υποστρωμάτων, ο mtorc1 επιτυγχάνει τη διέγερση αναβολικών διεργασιών που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό (96), καθώς και με τη ρύθμιση της μετάφρασης, της μεταγραφής ριβοσωμικού (rrna) και μεταφορικού RNA (trna), τη βιογένεση ριβοσωμάτων και λυσοσωμάτων, τη σύνθεση λιπιδίων και την αυτοφαγία (43). Στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους, o mtorc2 φωσφορυλιώνει ένα συντηρημένο μοτίβο στις πρωτεινικές κινάσες Akt, SGK (Serum/glucocorticoidregulated kinase) και κάποιες ισομορφές της PKC (Protein kinase C ), αυξάνοντας έτσι τη δράση τους ως κινάσες (156). Μέσω αυτών, και πιθανότατα άλλων στόχων, η σηματοδότηση του mtorc2 θεωρείται ότι προωθεί την κυτταρική επιβίωση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μεταβολισμό και τη ρύθμιση της οργάνωσης του κυτταροσκελετού (144). 3. Η ρύθμιση του mtorc1 Η δράση της mtor κινάσης μέσα στο σύμπλοκο του mtorc1 επηρεάζεται από ποικιλία θρεπτικών συστατικών, όπως τα αμινοξέα, τα επίπεδα γλυκόζης και οξυγόνου, τα κυτταρικά επίπεδα ενέργειας, και πολλούς αυξητικούς παράγοντες, κυτταροκίνες και ορμόνες. Τα σήματα που προκύπτουν από όλους τους παραπάνω παράγοντες, χρειάζονται την Rheb (RAS homolog enriched in brain ) μια μικρή G πρωτεΐνη που σχετίζεται με την Ras (Ras-related small G protein - Rheb), η οποία όταν είναι δεσμευμένη με GTP είναι υπεύθυνη για την εκ των άνω (upstream) ενεργοποίηση του mtorc1 (71). Παράγοντες που ρυθμίζουν τον mtorc1 Αυξητικοί παράγοντες Οι αυξητικοί παράγοντες διεγείρουν τον mtorc1 μέσω της ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών της ινσουλίνης και των RAS πρωτεϊνών. Η διέγερση των μονοπατιών αυτών οδηγεί σε φωσφορυλίωση του TSC2 (Tuberous Sclerosis Complex 2) 11

συμπλόκου από την Akt (74), (138), από την ERK1/2 (Extracellular-signal-regulated kinase Εικόνα 3: Η ρύθμιση του mtorc1 μέσω αυξητικών παραγόντων (Από: Tchevkina E and Komelkov A. Protein Phosphorylation as a Key Mechanism of mtorc1/2 Signaling Pathways. In: Protein Phosphorylation in Human Health, edited by Huang C. InTech, 2012.) 1/2) (107), και από την κινάση S6K1 (145), και οδηγεί σε απενεργοποίηση του συμπλόκου TSC1/2 και κατ επέκταση ενεργοποίηση του mtorc1. Το TSC είναι ένα ετεροδιμερές που απαρτίζεται από το TSC1 (γνωστό και ως hamartin) και το TSC2 (γνωστό και ως tuberin) και δρα σαν πρωτεΐνη που ενεργοποιεί τη GTPάση (GTPase-activating protein - GAP) (120). Η αναστολή του TSC συμπλόκου ενεργοποιεί την GTPάση, αυξάνοντας τα επίπεδα του GTP, και κατά συνέπεια του συνδεδεμένου με GTP Rheb, το οποίο άμεσα πλέον αλληλεπιδρά με τον mtorc1 για να διεγείρει την δραστηριότητά του (105), (147). Ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου ο Rheb ενεργοποιεί τον mtorc1 παραμένει ακόμα άγνωστος. Το TSC1/2, ως μια Rheb-ειδική πρωτεΐνη που ενεργοποιεί την GTPάση, ρυθμίζει αρνητικά το μονοπάτι του mtorc1, καθώς καθιστά τον Rheb ανενεργό (75), (160). Μεταλλάξεις που απενεργοποιούν το σύμπλοκο TSC1/2 προκαλούν οζώδη σκλήρυνση, μια ασθένεια που σχετίζεται με την εμφάνιση πολλαπλών καλοηθών όγκων που αποτελούνται από μεγεθυμένα και αποδιοργανωμένα κύτταρα (27). Επιπρόσθετα, η ενεργοποίηση της Akt από τους αυξητικούς παράγοντες μπορεί να ενεργοποιήσει τον mtorc1 ανεξάρτητα του TSC1/2, προωθώντας την φωσφορυλίωση και την απομάκρυνση του PRAS40 από τον mtorc1 (147), (170), (172). Η δέσμευση της ινσουλίνης στον αντίστοιχο υποδοχέα της κυτταρικής επιφάνειας, προάγει τη δράση κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα της ινσουλίνης, τη στρατολόγηση του υποστρώματος 1 του υποδοχέα της ινσουλίνης (insulin receptor substrate 1 - IRS1), την παραγωγή τριφωσφωρικής 3,4,5-φωσφατιδυλοινοσιτόλης (phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate-ΡΙΡ3) μέσω ενεργοποίησης της PI3K, και εν τέλει την στρατολόγηση και ενεργοποίηση της Akt στην πλασματική μεμβράνη. Σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, η ενεργοποίηση του mtorc1 καταστέλλει ισχυρά τον άξονα PI3K-Akt άνωθεν της PI3K. Η 12

ενεργοποίηση της S6K1 από τον mtorc1 προωθεί τη φωσφορυλίωση του IRS1 και μειώνει τη σταθερότητά του (60). Αυτό το αυτό-ρυθμιζόμενο μονοπάτι έχει αποδειχθεί πως παίζει σημαντικό ρόλο τόσο σε μεταβολικές ασθένειες όσο και στην ογκογένεση (110). Ενεργειακή κατάσταση Η ενεργειακή κατάσταση του κυττάρου σηματοδοτεί το mtorc1 μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από την ΑΜΡ (AMP-activated protein kinase - AMPK), τον κύριο αισθητήρα ενδοκυτταρικής ενέργειας (59). Ως απόκριση στην ελάττωση της ενέργειας (χαμηλή αναλογία ATP/ADP), η AMPK ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει το TSC2, κάτι που οδηγεί σε ελάττωση της ενεργοποίησης του mtorc1 (75). Επιπλέον, η AMPK μπορεί να μειώσει την δραστηριότητα του mtorc1, ως απόκριση στη μειωμένη ενέργεια, μέσω άμεσης φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης RAPTOR (56). Επίπεδα οξυγόνου Τα επίπεδα οξυγόνου επιδρούν στον mtorc1 μέσω πολλαπλών μονοπατιών (176). Ενδιαφέρον ωστόσο παρουσίαζει η πρόσφατη παρατήρηση ότι, υπό συνθήκες ήπιας υποξίας, η επακόλουθη μείωση των επιπέδων της ATP ενεργοποιεί την AMPK, η οποία με τη σειρά της προάγει την ενεργοποίηση του TSC1/2 και αναστέλλει το σηματοδοτικό μονοπάτι του mtorc1 (Εικόνα 4) (6), (104). Εικόνα 4: Η επίδραση της έλλειψης ενέργειας και οξυγόνου στον mtorc1 (Από: Tchevkina E and Komelkov A. Protein Phosphorylation as a Key Mechanism of mtorc1/2 Signaling Pathways. In: Protein Phosphorylation in Human Health, edited by Huang C. InTech, 2012.) 13

Αμινοξέα Τα αμινοξέα αντιπροσωπεύουν ένα ισχυρό σήμα θετικής ενεργοποίησης του mtorc1 (54). Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει πως η λευκίνη, ένα αμινοξύ απαραίτητο για την ενεργοποίηση του mtorc1, μεταφέρεται μέσα στα κύτταρα με έναν εξαρτώμενο από τη γλουταμίνη τρόπο (122). Ο μηχανισμός μέσω του οποίου τα ενδοκυτταρικά αμινοξέα εν συνεχεία σηματοδοτούν τον mtorc1, παραμένει αδιευκρίνιστος για πολλά χρόνια. Η ενεργοποίηση του mtorc1 από αμινοξέα, είναι γνωστό πως είναι ανεξάρτητη από το σύμπλοκο TSC1/2, λόγω του γεγονότος ότι ο mtorc1 παραμένει ευαίσθητος στη στέρηση αμινοξέων ακόμα και σε κύτταρα που δε διαθέτουν TSC1/2 (123). Πρόσφατα έχει επίσης δειχτεί πως οι RAG πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση του mtorc1 μέσω των αμινοξέων (Εικόνα 5) (88), (146), (95). Υπό την παρουσία αμινοξέων, οι RAG πρωτεΐνες προσδένονται στο RAPTOR και προάγουν την επανατοποθέτηση του mtorc1 από συγκεκριμένες θέσεις σε όλο το κυτταρόπλασμα προς τη περιοχή γύρω από τον πυρήνα όπου βρίσκεται ο Rheb ενεργοποιητής του (146). Εικόνα 5: Ο ρόλος των αμινοξέων στην ενεργοποίηση του mtorc1 (Από: Bar-Peled L, Schweitzer LD, Zoncu R and Sabatini DM. Ragulator is a GEF for the rag GTPases that signal amino acid levels to mtorc1. Cell 150: 1196-1208, 2012) Η φυσική αποσύνδεση του mtorc1 από τον Rheb υπό συνθήκες στέρησης αμινοξέων, θα μπορoύσε να εξηγήσει γιατί οι ενεργοποιητές του Rheb (π.χ. αυξητικοί παράγοντες) δεν είναι ικανοί να διεγείρουν τη σηματοδότηση του mtorc1 υπό έλλειψη αμινοξέων (95). 4. Η ρύθμιση του mtorc2 Συγκριτικά με τον mtorc1, η upstream ρύθμιση του mtorc2 είναι λιγότερο κατανοητή (124). Η σηματοδότηση του mtorc2 είναι ανεξάρτητη από την παρουσία θρεπτικών συστατικών, αλλά διεγείρεται από αυξητικούς παράγοντες, φαινομενικώς μέσω μιας PI3K-εξαρτώμενης συνεργασίας του mtorc2 με ριβοσώματα (184). Οι αυξητικοί 14

παράγοντες, επίσης, επάγουν τη μετατόπιση του mtorc2 στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου, η οποία εφάπτεται στα μιτοχόνδρια (mitochondria-associated ER membrane - MAM), ένα χαρακτηριστικό υποδιαμέρισμα του ενδοπλασματικού δικτύου (11). Πιο αναλυτικά, σε αυτό το υποδιαμέρισμα, έχει δειχθεί ότι το mtorc2 ελέγχει την ακεραιότητα του MAM και τη μιτοχονδριακή λειτουργία με τρόπο εξαρτώμενο από την Akt (120). 5. Οι λειτουργικοι ρολοι του mtorc1 Ο ρόλος του mtroc1 στην αυτοφαγία O mtorc1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο ως αρνητικός ρυθμιστής στη διαδικασία της αυτοφαγίας. Πρόκειται για μια ευκαρυωτική ομοιοστατική διαδικασία, κατά την οποία ποικίλα κυτταροπλασματικά συστατικά, όπως κατεστραμένα οργανίδια και ενδοκυτταρικοί παθογόνοι παράγοντες, αποδομούνται μέσα στα λυσοσώματα (99). Ο mtorc1, ως απόκριση στην ελαττωμένη σηματοδότηση από αυξητικούς παράγοντες, στην ασιτία, και άλλες μεταβολικές ή/και τοξικές αντιξοότητες (82), επάγει την αυτοφαγία μέσω του σχηματισμού των φαγοφόρων, μέσα στα οποία οι λυσοσωμικές υδρολάσες αποδομούν τα στοχευμένα υποστρώματα (165). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, ο σχηματισμός των φαγοφόρων αναστέλεται από τον mtorc1, ο οποίος άμεσα αλληλεπιδρά και φωσφορυλιώνει το σύμπλοκο της Ulk1 κινάσης που απαιτείται για την έναρξη της αυτοφαγίας (67), (81). Ο ρόλος του mtor στις μεταβολικές νόσους Στα θηλαστικά, η μετάβαση από κατάσταση νηστείας σε κατάσταση σίτισης επηρεάζει τα επίπεδα θρεπτικών συστατικών και αυξητικών παραγόντων της κυκλοφορίας. Κατά συνέπεια, με τη σειρά τους οι αλλαγές αυτές καθορίζουν τον προσανατολισμό των ιστών προς αναβολικές ή καταβολικές διαδικασίες. Για παράδειγμα, υψηλά επίπεδα θρεπτικών συστατικών και αυξητικών παραγόντων οδηγούν στη σύνθεση γλυκογόνου στον μυ και στο ήπαρ, πρόσληψη λιπιδίων στο λιπώδη ιστό, ενώ μια μείωση των επιπέδων θα προκαλέσει καταβολισμό των πρωτεϊνών στον μυ, γλυκονεογένεση στο ήπαρ, και λιπόλυση στο λιπώδη ιστό. Καθώς το μονοπάτι του mtor αποκρίνεται στα επιπέδα θρεπτικών στοιχείων και αυξητικών παραγόντων, ο ρόλος τους στη ρύθμιση του μεταβολισμού έχει προκαλέσει έντονο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια (96). Εμπόδιο στην περαιτέρω κατανόηση του ρόλου του mtor στη ρύθμιση του μεταβολισμού in vivo αποτελεί η εμβρυική θνησιμότητα 15

που προκαλείται από την ολική απενεργοποίηση βασικών στοιχείων του μονοπατιού της σηματοδότησης (46), (55), (76), (121), (153), (178). Η χρήση πειραματόζωων με στοχευμένη απενεργοποίηση στοιχείων της σηματοδοτικής οδού του mtor σε συγκεκριμένους ιστούς αναμένεται να αναδείξει νέες και πρωτότυπες λειτουργίες του mtor στον έλεγχο του μεταβολισμού (96). Ο ρόλος του mtor στη σύνθεση των λιπιδίων Τελευταία έχει ξεκινήσει να εκτιμάται ο ρόλος του mtorc1 στη ρύθμιση της σύνθεσης λιπιδίων, η οποία είναι απαραίτητη στην κυτταρική ανάπτυξη και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (95). Σε μεγάλο βαθμό, ο mtorc1 δρα μέσω των μεταγραφικών παραγόντων που αποτελούν πρωτεΐνες που δεσμεύονται στο στοιχείο απόκρισης των στερολών (sterol regulatory element binding protein 1/2 - SREBP1/2) και οι οποίες ελέγχουν την έκφραση πολυάριθμων γονιδίων που συμμετέχουν στη σύνθεση τριγλυκεριδίων, λιπαρών οξέων και χοληστερόλης (96). Η αναστολή του mtorc1 προκαλεί μείωση των επιπέδων του SREBP1/2, καθώς επίσης και γονιδίων που επάγουν την λιπογένεση (34), (101), (137), (171). Επιπλέον, φαίνεται να ρυθμίζει τη λειτουργία των SREBP μέσω διαφόρων μηχανισμών, που περιλαμβάνουν, τουλάχιστον σε κάποιους κυτταρικούς τύπους, την κινάση 1 της ριβοσωματικής πρωτεΐνης S6 (S6 kinase 1 - S6K1) (34), (102), (171). Ακόμα, ο mtorc1 φωσφορυλιώνει την Lipin-1, αποτρέποντας την είσοδο της στον πυρήνα και, κατά συνέπεια, την καταστολή των SREBP1/2 (135), ενώ επίσης προάγει την έκφραση και τη δραστηριότητα του γάμμα υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξειδιοσωμάτων (peroxisome proliferator-activated receptor γ - PPAR-γ), του κύριου ρυθμιστή του λιπώδους ιστού (90), (182). Εικόνα 6: Ο ρόλος του mtorc1 στη σύνθεση των λιπιδίων. (Από: Mathieu Laplante and David M. Sabatini, mtor signaling in growth control and disease, Cell. 2012 April 13; 149(2): 274 293) 16

Ο ρόλος του mtor στον μεταβολισμό και τη βιογένεση των μιτοχονδρίων Έχει δειχθεί ότι τόσο ο μιτοχονδριακός μεταβολισμός όσο και η μιτοχονδριακή βιογένεση ρυθμίζονται από τη δράση του mtorc1. Αναστολή του mtorc1 από τη ραπαμυκίνη, οδηγεί σε μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, της κατανάλωσης οξυγόνου και των επιπέδων ATP στο κύτταρο και αλλάζει το αποτύπωμα των φωσφωρυλιωμένων μιτοχονδριακών πρωτεϊνών (151). Πιο συγκεκριμένα, ο mtorc1 στοχεύει στο ίδιο το μιτοχονδριακό DNA προκαλώντας αύξηση του μιτοχονδριακού DNA αλλά και της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούνται στο μιτοχονδριακό DNA και εμπλέκονται στον οξειδωτικό μεταβολισμό. Αυτό, εν μέρει, διεκπεραιώνεται διαμεσολαβώντας στην πυρηνική συσχέτιση μεταξύ του συνενεργοποιητή 1α του PPAR-γ (PPAR-γ coactivator 1α - PGC1α) και του μεταγραφικού παράγοντα Ying-Yang 1 (YY1), ρυθμίζοντας έτσι τη μιτοχονδριακή βιογένεση και την οξειδωτική λειτουργία (28). Επιπλέον, όπως αρμόζει σε ένα μονοπάτι που οδηγεί σε κατανάλωση ενέργειας, το μονοπάτι του mtorc1 ρυθμίζει θετικά τη μιτοχονδριακή παραγωγή ATP. Συγκεκριμένα, ο mtorc1 αυξάνει την γλυκολυτική ροή μέσω ενεργοποίησης της μεταγραφής και της μετάφρασης του παράγοντα 1α που επάγεται από την υποξία (hypoxia inducible factor 1α - ΗF1α), ενός θετικού ρυθμιστή πολλών γλυκολυτικών γονιδίων (16), (34), (72), (98). Ο ρόλος του mtor στη δημιουργία λιπώδους ιστού Έχει πια εκτιμηθεί πως το σηματοδοτικό μονοπάτι του mtor διαδραματίζει ένα βασικό ρόλο στη διαδικασία σχηματισμού λιπώδους ιστού, της πιο σημαντικής αποθήκης ενέργειας στα θηλαστικά (96), (94). Η υπέρμετρη συσσώρευση λευκού λιπώδους ιστού (White Adipose Tissue - WAT) αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης μεταβολικών δυσλειτουργιών όπως αντίσταση στην ινσουλίνη, διαβήτης τύπου 2, καρδιαγγειακές παθήσεις και καρκίνος. Ο ρόλος του μονοπατιού του mtor στον λιπώδη ιστό έχει μελετηθεί in vitro και in vivo (26). Πειράματα σε ιστοκαλλιέργειες έχουν δείξει πως η αναστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού του mtorc1, γενετικά ή με χρήση ραπαμυκίνης, παρεμποδίζει τη λιπογένεση, ενώ άλλα πειράματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού του mtorc1, μέσω απενεργοποίησης του TSC2, προάγει τη διαφοροποίηση του λιπώδους ιστού (182). Αυτό το αποτέλεσμα επιτελείται, εν μέρει, από την πρωτεΐνη 4E-BP1, η οποία αποτελεί υπόστρωμα του mtorc1, μέσω ρύθμισης της μετάφρασης του κύριου ρυθμιστή της λιπογένεσης, του PPAR-γ (94). Ποντίκια με εξειδικευμένη έλλειψη του RAPTOR στον λιπώδη ιστό (raptor ad-/- ), μιας πρωτεΐνης απαραίτητης για τη λειτουργία του mtorc1, είναι αδύνατα, παρουσιάζουν αντίσταση στην επαγόμενη από δίαιτα υψηλών λιπαρών παχυσαρκία και διαθέτουν 17

μικρότερα και λιγότερα λιποκύτταρα (136). Ένα τέτοιο αποτέλεσμα υποδεικνύει και in vivo τον σημαντικό ρόλο του mtorc1 στον μεταβολισμό του λιπώδους ιστού. Ωστόσο, αντίθετα με ό,τι παρατηρήθηκε σε κύτταρα με ανενεργό mtorc1, τα ποντίκια με εξειδικευμένη έλλειψη του RAPTOR στον λιπώδη ιστό (raptor ad-/- ) παρουσιάζουν φυσιολογικά επίπεδα του PPAR-γ στον λευκό λιπώδη ιστό, υποδηλώνοντας πως in vivo είναι πιθανή η συμμετοχή και άλλων παραγόντων στη ρύθμιση της έκφρασης του PPAR-γ. Η ισχνότητα των συγκεκριμένων ποντικιών οφείλεται σε ενισχυμένη κατανάλωση ενέργειας, η οποία επιτυγχάνεται με αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης από την κυτταρική αναπνοή μέσω αύξησης της πρωτεΐνης UCP1 (uncoupling protein 1) στον λευκό λιπώδη ιστό (136). Ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση πως μύες με έλλειψη της πρωτεΐνης 4E-BP1 (Eif4ebp1 -/- ), πρωτεΐνη που μέσω της φωσφορυλίωσής της από τον mtorc1 συμμετέχει στη ρύθμιση της μετάφρασης, εμφανίζουν μειωμένο λευκό λιπώδη ιστό καθώς και αύξηση του μεταβολικού ρυθμού, σε σχέση με ζώα αγρίου τύπου. Επιπλέον, φαίνεται πως στο λευκό λιπώδη ιστό των συγκεκριμένων ζώων, τα οποία τρέφονται με δίαιτα χαμηλών λιπαρών, υπάρχουν κύτταρα που εκφράζουν την μιτοχονδριακή αποσυζευκτική πρωτεΐνη UCP1 (168). Ποντίκια με πλήρη έλλειψη ενός ακόμα υποστρώματος του mtorc1, της κινάσης S6K1, παρουσιάζουν επίσης μείωση του λευκού λιπώδους ιστού και αδύνατο φαινότυπο, ακόμα και όταν τρέφονταν με δίαιτα υψηλών λιπαρών (169). Η αύξηση του λιπώδους ιστού, που αποτελεί χαρακτηριστικό της παχυσαρκίας, αποτελεί τον βασικότερο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη και διαβήτη τύπου 2 και ο mtorc1 είναι ιδιαίτερα ενεργός σε ιστούς παχύσαρκων τρωκτικών (85), (167), (169). Αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης, προφλεγμονωδών κυτταροκινών και θρεπτικών συστατικών στην κυκλοφορία αντιπροσωπεύουν τις κινητήριες δυνάμεις που πιθανόν να προωθούν τη δραστηριότητα του mtorc1 σε παχύσαρκα ζώα. Εκτός από την ανωτέρω περιγραφόμενη, άμεση συμβολή του mtorc1 στη αύξηση του λευκού λιπώδους ιστού, η ενεργοποίηση τoυ mtorc1 προάγει την αντίσταση στην ινσουλίνη του λιπώδους ιστού μέσω της S6K1 διαμεσολαβούμενης αναστολής της σηματοδότησης στη ινσουλίνης (169). Η μείωση της δράσης της ινσουλίνης στον λιπώδη ιστό, είναι πιθανό να επιδεινώνει τη συστημική αντίσταση στην ινσουλίνη με την προώθηση της απελευθέρωσης ελεύθερων λιπαρών οξέων από τα λιποκύτταρα, την έκτοπη εναπόθεση λίπους και τη λιποτοξικότητα (29). Από την άλλη, ποντίκια με εξειδικευμένη έλλειψη του mtorc2 στον λιπώδη ιστό, παρουσιάζουν φυσιολογική μάζα λίπους (93), αλλά και μια ανωμαλία στη φωσφορυλίωση 18

της AKT στον λιπώδη ιστό, ή οποία μεταφράζεται ως αύξηση της λιπόλυσης και των επιπέδων των ελεύθερων λιπαρών οξέων στη κυκλοφορία. Ο ρολος του mtor στη μετάφραση Η cap-εξαρτώμενη πρωτεϊνική σύνθεση αποτελεί μακράν την πιο καλά χαρακτηρισμένη διεργασία που ελέγχεται από τον mtorc1. Ο mtorc1 φωσφορυλιώνει άμεσα την δεσμευμένη στον παράγοντα έναρξης της μετάφρασης των ευκαρυωτικών κυττάρων 4Ε πρωτεΐνη 1 (eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1-4E- BP1) καθώς και την κινάση S6K1, οι οποίες με τη σειρά τους προάγουν την cap-εξαρτώμενη πρωτεινοσύνθεση (reviewed in (108)). Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης 4E-BP1 προλαμβάνει την πρόσδεση αυτής στον εναρκτήριο παράγοντα eif4e, επιτρέποντας σε αυτόν να συμμετέχει στον σχηματισμό του συμπλέγματος eif4f, το οποίο είναι απαραίτητο για την έναρξη της cap-εξαρτώμενης μετάφρασης. Η ενεργοποίηση της S6K1 οδηγεί, μέσω πολλών ενδιάμεσων μορίων, σε αύξηση της βιογένεσης του mrna, καθώς και σε επαγωγή του σταδίου της επιμήκυνσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας κατά την μετάφραση (96). Έρευνες που έχουν βασιστεί στη χρήση αναστολέων του ενεργού κέντρου του mtor, οι οποίοι αναστέλλουν εξ ολοκλήρου τη λειτουργικότητά του, δείχνουν πως οι αναστολείς αυτοί μειώνουν σημαντικά τα επίπεδα της cap-εξαρτώμενη πρωτεϊνοσύνθεσης σε πολλαπλασιαζόμενα κυττάρα καλλιέργειας, υποδεικνύοντας έτσι την κρισιμότητα του ρόλου του mtor στη ρύθμιση της μετάφρασης (164), (181). 6. Η μετάφραση του mrna Η διαδικασία της μετάφρασης του mrna πραγματοποιείται μέσω τριών φάσεων έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμός με τη φάση της έναρξης να είναι αυτή που υπόκειται το μεγαλύτερο μέρος της ρύθμισης (79), (155). Έναρξη Η έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης συντελείται στα εξής στάδια: i.τα ευκαρυωτικά mrnas διαθέτουν στο 5 άκρο τους την επονομαζόμενη cap δομή, η οποία περιλαμβάνει μια 7-μέθυλο-γουανίνη συνδεδεμένη με το mrna με μια 5-5 τριφωσφορική γέφυρα. Αρχικά, η δομή αυτή συνδέεται με τον ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης eif4e, πραγματοποιώντας έτσι την πρώτη επαφή μεταξύ του mrna και των παραγόντων που συμμετέχουν στη διαδικασία της μετάφρασης (51). Ο παράγοντας eif4e, με τη σειρά του, προσδένεται στον παράγοντα eif4g, μια πρωτεΐνη-ικρίωμα, η οποία επίσης συνδέεται με την πρωτεΐνη PABP (poly(a)-binding protein) και τον παράγοντα 19

έναρξης eif4a, μια RNA ελικάση. Η συνεργασία του παράγοντα eif4g με πρωτεΐνες που συνδέονται στα 5 και 3 άκρα του mrna (eif4e και PABP, αντίστοιχα) οδηγεί στην αναδίπλωση του mrna, ενισχύοντας έτσι τη μετάφρασή του. Το σύμπλεγμα που περιλαμβάνει τους παράγοντες έναρξης eif4e, eif4a, και eif4g ονομάζεται eif4f (Εικόνα 7). Επιπλέον, ο παράγοντας eif4g προσδένεται με τον παράγοντα έναρξης eif3, ο οποίος με τη σειρά του, εγκαλεί τη μικρή ριβοσωματική υπομονάδα 40S στο mrna (45). Εικόνα 7: Ο σχηματισμός του εναρκτήριου συμπλόκου eif4f (Από: Preiss T and Hentze W. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. Bioessays 25: 1201-1211, 2003.) ii. Ταυτόχρονα με την σύνδεση των παραπάνω παραγόντων έναρξης στο mrna, πραγματοποιείται ο σχηματισμός του προ-εναρκτήριου συμπλόκου 43S PIC (pre-initiation complex), μέσω της μεταφοράς του εναρκτήριου trna (Met-tRNAi) στην P θέση της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Η μεταφορά του στη θέση αυτή, γίνεται ως μέλος του τριμερούς συμπλόκου, το οποίο επιπλέον περιέχει τον εναρκτήριο παράγοντα eif2 και GTP (Εικόνα 8) (140). Εικόνα 8: Σχηματισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου 43S PIC (Από: Kong J and Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet 13: 383-394, 2012.) 20

iii. Εν συνεχεία, το προ-εναρκτήριο σύμπλοκο 43S PIC αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο eif4f προάγοντας τον σχηματισμό του προ-εναρκτήριου συμπλόκου 48S PIC (133). iv. Αμέσως μετά, το 48 PIC σαρώνει καθοδικά το mrna, ελέγχοντας τις διαδοχικές τριπλέτες, καθώς αυτές εισέρχονται στην P θέση, ως προς την συμπληρωματικότητά τους για το εναρκτήριο αντικωδικόνιο Met-tRNAi. Καθώς το αντικωδικόνιο αυτό είναι συνδεδεμένο στο σύμπλοκο 48 PIC μέσω μιας προσδεδεμένης με GTP μορφής του παράγοντα eif2, η εύρεση ενός συμβατού κωδικόνιου AUG δίνει το έναυσμα για την αναστολή της σάρωσης και την μη αναστρέψιμη υδρόλυση του GTP στο τριμερές σύμπλοκο eif2-gtp-met-trnai (Εικόνα 9) (133). v. Με την απελευθέρωση του προσδεμένου με GDP παράγοντα eif2 και άλλων εναρκτήριων παραγόντων, η μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα 60S έρχεται να συμμετάσχει στον σχηματισμό του εναρκτήριου συμπλόκου 80S, το οποίο θα δεχτεί το κατάλληλο trna στην Α θέση του ριβοσώματος και θα συνθέσει τον πρώτο πεπτιδικό δεσμό (Εικονα 9) (133). Εικόνα 9: Σχηματική αναπαράσταση του σχηματισμού του εναρκτήριου συμπλόκου 80S (Από: Kong J and Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet 13: 383-394, 2012.) 21

Επιμήκυνση Η διαδικασία της επιμήκυνσης ξεκινά όταν το τριμερές σύμπλοκο, που αποτελείται από τον ευκαρυωτικό παράγοντα επιμήκυνσης eef1a, ένα άμινοακυλο-trna και GTP, προσδένεται στο εναρκτήριο σύμπλοκο 80S κοντά στην θέση Α του ριβοσώματος, επιτρέποντας την ανάπτυξη αλληλεπιδράσεων μεταξύ του άμινοακυλο-trna και του κωδικόνιου της Α θέσης. Ο προσδεμένος με GTP παράγοντας eef1 στη συνέχεια υδρολύεται και απελευθερώνεται (128). Το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης του ριβοσώματος καταλύει τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού μεταξύ των δυο αμινοξέων (119), με αποτέλεσμα την ύπαρξη ενός από-ακετυλιωμένου trna στην θέση P και ενός πεπτίδυλο-trna στη θέση Α, το οποίο διαθέτει ένα επιπλέον αμινοξύ. Την εξαρτώμενη από GTP μετατόπιση του ριβοσώματος κατά μήκος του mrna προάγει ο παράγοντας επιμήκυνσης eef2, ο οποίος συνδεδεμένος με GTP εισέρχεται στο ριβόσωμα και μετατοπίζει το πεπτίδυλο-trna από την θέση Α στη θέση P του ριβοσώματος. Ταυτόχρονα, το από-ακετυλιωμένο trna μετατοπίζεται στη θέση Ε και στη συνέχεια απελευθερώνεται από το ριβόσωμα (35), ενώ ο παράγοντας eef2-gtp υδρολύεται και απελευθερώνεται. Έτσι, το ριβόσωμα είναι πλέον έτοιμο να δεχτεί το επόμενο τριμερές σύμπλοκο (Εικονα 10). Ο παράγοντας eef1a συνδέεται και πάλι με GTP, μέσω του παράγοντα eef1b, προκειμένου να μπορέσει να συμμετάσχει στον σχηματισμό ενός νέου τριμερούς συμπλόκου (128). Εικόνα 10: Η επιμήκυνση της μετάφρασης (Από: Walsh D and Mohr I. Viral subversion of the host protein synthesis machinery. Nat Rev Microbiol 9: 860-875, 2011.) 22

Τερματισμός Ο τερματισμός της μετάφρασης συμβαίνει όταν το τέλος της αλληλουχίας του mrna φτάνει στο ριβόσωμα και το κωδικόνιο τερματισμού (UAA / UGA / UAG) εισέλθει στην Α θέση. Ο τερματισμός στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς καταλύεται από δυο πρωτεινικούς παράγοντες (erf1 και erf3) οι οποίοι φαίνεται να συνεργάζονται κατά της διάρκεια αυτής της διαδικασίας (Εικόνα 11) (157), (183), (3). Εικόνα 11: Ο τερματισμός της πρωτεϊνοσύνθεσης (Από: Graille M and Seraphin B. Surveillance pathways rescuing eukaryotic ribosomes lost in translation. Nat Rev Mol Cell Biol 13: 727-735, 2012.) 7. Η ρύθμιση της μετάφρασης Η ρύθμιση της μετάφρασης του mrna διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη παραγωγή πρωτεϊνών. Πράγματι, η προσφορά της είναι σημαντικότερη από αυτή της ρύθμισης της σύνθεσης του mrna, της αποικοδόμησής του ή της διατήρησης ισορροπίας μεταξύ των διεργασιών σύνθεσης και αποικοδόμησης των πρωτεϊνών (152). Πιο συγκεκριμένα, ο έλεγχος της μετάφρασης του mrna, συγκριτικά με τη ρύθμιση των επιπέδων του mrna, επιτρέπει την τοπική ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης σε συγκεκριμένες περιοχές του κυττάρου, καθώς και την χρονική ρύθμισή της ως απόκριση σε συγκεκριμένα ερεθίσματα και συνθήκες (45). Όπως συμβαίνει με κάθε διεργασία που συντελείται σε πολλές στάδια, έτσι και η μετάφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς μπορεί να ρυθμιστεί σε διάφορα επίπεδα. Ωστόσο, είναι γενικά πιο αποτελεσματική η ρύθμιση του αρχικού σταδίου των περίπλοκων 23

μονοπατιών, και συνήθως σε αυτό το στάδιο επικεντρώνεται και η ρύθμιση της μετάφρασης (111). Οι παράγοντες eif2 και eif4e είναι γνωστό πως διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έναρξης της μετάφρασης. Η δράση του eif2 ελέγχεται από τον ρυθμό ανακύκλωσης του GTP, και επομένως από την διαθεσιμότητα του eif2β (65). Η λειτουργία του eif4e εξαρτάται από την ενσωμάτωσή του στον παράγοντα eif4f, η οποία αναστέλλεται από τις πρωτεΐνες 4E-BPs (51). Και οι δυο αυτοί μηχανισμοί ρύθμισης, υπόκεινται σε ρυθμιστική φωσφορυλίωση και έτσι μπορούν να παρέχουν έναν γρήγορο και αναστρέψιμο τρόπο διατήρησης της κυτταρικής ομοιόστασης, ως απόκριση σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα (140). Ρύθμιση της έναρξης της μετάφρασης μέσω των 4E-BPs Οι πρωτεΐνες 4E-BPs, οι οποίες είναι μικρού μοριακού βάρους αναστολείς της μετάφρασης, αποτέλεσαν έναν από τους πρώτους στόχους του mtorc1 που ταυτοποιήθαν (58), (18), και για τον λόγο αυτό είναι πια πολύ καλά χαρακτηρισμένες. Η δράση τους έγκειται στην πρόσδεσή τους στον εναρκτήριο παράγοντα eif4e, εμποδίζοντας έτσι τον σχηματισμό του συμπλόκου eif4f, το οποίο υπο φυσιολογικές συνθήκες καταλύει την πρόσδεση του προεναρκτήριου συμπλόκου 43 PIC στην cap δομή του mrna (Εικόνα 12) (2). Εικόνα 12: Ρύθμιση της έναρξης μέσω του παράγοντα 4E-BP1 (Από: Kong J and Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet 13: 383-394, 2012.) Η οικογένεια των 4E-BP πρωτεϊνών περιλαμβάνει τρία μέλη: την 4E-BP1, την 4E-BP2 και την 4E-BP3 (103), (130), (62), (69), (30), (31), (139). Οι τρεις αυτές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από 3 διαφορετικά γονίδια αλλά παρουσιάζουν υψηλό βαθμό ομολογίας 24

και ρυθμίζονται κατά κύριο λόγο με τον ίδιο τρόπο. Η πρόσδεση των 4E-BPs στον eif4e ρυθμίζεται μέσω της διαδοχικής φωσφορυλίωσης των τεσσάρων θέσεων φωσφορυλίωσης που διαθέτουν, με την εξής σειρά: Thr46, Thr37, Thr70 και Ser65 (50), (52), (64). Η αυξημένη φωσφορυλίωση, προάγει την αποδέσμευση των 4E-BPs και ως εκ τούτου αυξάνει την μεταφραστική δραστηριότητα (92). Η ρύθμιση της έναρξης της μετάφρασης μέσω των 4E-BPs είναι απαραίτητη για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Η δράση των 4E-BPs ελέγχεται από ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια, τα οποία σχετίζονται με πρωτεινικές κινάσες. Για παράδειγμα, ο παράγοντας 4E-BP1 συμμετέχει με κομβικό τρόπο σε σηματοδοτικά μονοπάτια που διαμορφώνουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ως απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες και θρεπτικά συστατικά (61), (142). Η φωσφορυλίωση των 4E-BPs ρυθμίζεται από πολυάριθμα περιβαλλοντικά ερεθίσματα του κυττάρου (όπως αμινοξέα, ορμόνες, αυξητικοί παράγοντες), τα οποία είναι γνωστό πως ενεργοποιούν το σηματοδοτικό μονοπάτι του mtorc1, όπως αμινοξέα, ορμόνες, αυξητικοί παράγοντες. Εικόνα 13: Ρύθμιση της φωσφορυλίωσης του 4E-BP1 μέσω του mtorc1 (Από: Mamane Y, Petroulakis E, LeBacquer O and Sonenberg N. mtor, translation initiation and cancer. Oncogene 25: 6416-6422, 2006.) 25

Φαρμακολογικοί παράγοντες που επηρεάζουν είτε άμεσα (π.χ. ραπαμυκίνη και ATPμιμούμενοι αναστολείς του mtor), είτε έμμεσα το μονοπάτι του mtorc1 (164), (38), (48), (23), (40), μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν προκειμένου να ρυθμίσουν τη φωσφορυλίωση των 4E-BPs. Η χρήση της ραπαμυκίνης εμποδίζει τη φωσφορυλίωση στη θέση Ser65, αλλά δεν αποτρέπει τη φωσφορυλίωση των θέσεων Thr37/46 και Thr70 (50), (32). Σε γενικές γραμμές, η ραπαμυκίνη αποτελεί έναν ασθενή αναστολέα της λειτουργίας του 4E-BP1, και επομένως δεν επηρεάζει σημαντικά τον σχηματισμό του συμπλόκου eif4f και κατ επέκταση την πρωτεινική σύνθεση. Τα τελευταία χρόνια, παρατηρείται μια αύξηση στη χρήση μιας διακριτής κατηγορίας αναστολέων του mtor, οι οποίοι διαθέτουν έναν εναλλακτικό τρόπο δράσης και βελτιωμένες ανασταλτικές ιδιότητες, συγκριτικά με την ραπαμυκίνη. Οι ATP-μιμούμενοι αναστολείς με εξειδίκευση στο ενεργό κέντρο του mtor (e.g. Torin-1, PP242, AZD8055, Ku- 0063794 and respective derivatives) (164), (38), (48), (23), χρησιμοποιούνται σήμερα ευρέως σε βιοχημικές και φαινοτυπικές έρευνες για το μονοπάτι του mtor. Σε πλήρη αντίθεση με την ραπαμυκίνη, οι ATP-μιμούμενοι αναστολείς του mtor αναστέλλουν αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση όλων των θέσεων των 4E-BPs, σταματώντας έτσι τον σχηματισμό του παράγοντα eif4f και αναστέλλοντας τη πρωτεινοσύνθεση (68), (163). Ρύθμιση της επιμήκυνσης της μετάφρασης Μέχρι τώρα, η έρευνα σχετικά με τον έλεγχο της μετάφρασης έχει εστιαστεί κυρίως στη μελέτη του ελέγχου της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης. Ωστόσο, φαίνεται να συνειδητοποιείται όλο και πιο έντονα η σημαντικότητα της ρύθμισης του ενεργειακά δαπανηρότερου σταδίου της επιμήκυνσης, για την διατήρηση της κυτταρικής ενέργειας. Η ρύθμιση της επιμήκυνσης πραγματοποιείται ως απόκριση σε ενεργειακές αλλαγές του κυττάρου, καθώς και σε αλλαγές στα επίπεδα θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου. Είναι αξιοσημείωτο πως και εδώ το μονοπάτι του mtor διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρυθμιστικό ρόλο (43). Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των παραγόντων της επιμήκυνσης μπορούν να επηρεάσουν τις λειτουργίες τους. Μια τέτοια τροποποίηση είναι η φωσφορυλίωση του παράγοντα eef2 στη Thr56. Η φωσφορυλίωση αυτή καθιστά τον παράγοντα eef2 ανίκανο να υποστηρίξει την πρωτεινοσύνθεση, καθώς φαίνεται πως ο φωσφορυλιωμένος παράγοντας έχει μειωμένη συγγένεια ως προς το ριβόσωμα (19), γεγονός που εξηγεί την παρατήρηση πως ο φωσφορυλιωμένος eef2 δεν έχει βρεθεί συνδεδεμένος με πολυσώματα (143). Η φωσφορυλίωση του eef2 ελέγχεται από το μονοπάτι του mtorc1. Οι αυξητικοί 26

παράγοντες μειώνουν τη φωσφορυλίωση του eef2, προωθούν αποτελεσματικά τη σύνδεση του με το ριβόσωμα και ως εκ τουτου προάγουν το στάδιο της επιμήκυνσης. Η δράση αυτή μπορεί να εξουδετερωθεί με τη χρήση ραπαμυκίνης (37). Ωστόσο, η ρύθμιση του eef2 από τον mtorc1 δεν είναι άμεση. Η φωσφορυλίωση του παράγοντα αυτού καταλύεται από την κινάση του eef2 (eef2k), η δράση της οποίας ρυθμίζεται από τον mtorc1 και του στόχους του S6K1 και CDK1 (43). Η eef2k κινάση είναι μια φωσφοπρωτείνη. Τουλάχιστον τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης ελέγχονται από τον mtor, όπως έχει φανεί από την ευαισθησία τους στη ραπαμυκίνη και/ή στην έλλειψη αμινοξέων (η οποία οδηγεί σε αποφωσφορυλίωσή του) (Εικόνα14) (14), (15). Η θέση Ser366 φωσφορυλιώνεται από την S6K1 και η φωσφορυλίωση σε αυτή τη θέση προκαλεί την απενεργοποίηση της eef2κ κινάσης σε χαμηλές συγκεντρώσεις ασβεστίου (173). Επίσης, η φωσφορυλίωση στις θέσεις Ser359 και Ser78 και στις δυο περιπτώσεις οδηγεί σε απενεργοποίηση της eef2k κινάσης (91), (15). Εικόνα 14: Ρύθμιση της επιμήκυνσης μέσω του mtorc1 (Από: Takei N and Nawa H. mtor signaling and its roles in normal and abnormal brain development. Front Mol Neurosci 7: 28, 2014.) 8. Cap-ανεξάρτητη έναρξη της μετάφρασης IRES-εξαρτώμενη μετάφραση Ο τυπικός cap-εξαρτώμενος τρόπος έναρξης της μετάφρασης, που ήδη αναφέρθηκε, δεν αντιπροσωπεύει εξ ολοκλήρου την πρωτεινική σύνθεση στα ευκαριωτικά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, η έναρξη της μετάφρασης μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί μέσω μιας cap-ανεξάρτητης διαδικασίας, κατά την οποία αλληλουχίες μέσα στο mrna ενεργοποιούν 27

τον μηχανισμό μετάφρασης, συχνά εξαλείφοντας την ανάγκη για πολλούς εναρκτήριους παράγοντες (eif) (Εικόνα 15). Εικόνα 15: Cap-εξαρτώμενη και IRES-εξαρτώμενη μετάφραση (Από: Filbin ME and Kieft JS. Toward a structural understanding of IRES RNA function. Curr Opin Struct Biol 19: 267-276, 2009.) Αυτός ο τύπος έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης συμβαίνει ανεξάρτητα από το 5 άκρο του mrna, και ονομάζεται «εσωτερική έναρξη της μετάφρασης» (internal initiation of translation) ενώ οι συγκεκριμένες RNA αλληλουχίες είναι γνωστές ως internal ribosome entry sites (IRESs) (33), (36), (78), (8) Οι IRESs ανακαλύφθηκαν αρχικά στις 5 αμετάφραστες περιοχές (5 UTRs) δυο ιικών RNAs, και αποτελούνται από υψηλά συντηρημένες αλληλουχίες RNA. Η μεταγενέστερη ανακάλυψη των IRESs σε πολλά άλλα ιικά RNAs, καθώς και σε ποικιλία ευκαρυωτικών mrnas, αποκάλυψε μια ουσιαστική ποικιλομορφία στην εξαρτώμενη από τις IRESs μετάφραση και στη δομή των συγκεκριμένων αλληλουχιών (39). Γενικά, οι IRESs αλληλουχίες δεν απαιτούν τη χρήση του εναρκτήριου παράγοντα eif4e, αλλά χρειάζονται άλλους eifs προκειμένου να εγκαλέσουν τη μικρή ριβοσωματική υπομονάδα 40S (33). Επιπλέον, οι IRESs διεγείρονται από κάποιους διαφορετικούς παράγοντες ενεργοποίησης (IRES transactivating factors (ITAFs)), πιθανότατα προκειμένου να σταθεροποιήσουν τις ενεργές διαμορφώσεις τους. Οι IRESs του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) απαλλάσσονται εξ ολοκλήρου από τον παράγοντα eif4f, συνδέονται απευθείας στην υπομονάδα 40S, και χρειάζονται μόνο τον παράγοντα eif3 και είτε τον eif2/eif5 είτε τον eif5b, ώστε να συνδεθεί το εναρκτήριο trna με το αντίστοιχο κωδικόνιο στην IRESs αλληλουχία και έτσι να σχηματιστεί το προεναρκτήριο σύμπλοκο 48S PIC (132), (162). 28

Υπόθεση δράσης του ριβοσώματος ως φίλτρο επιλογής των mrnas που θα μεταφραστούν Η πρωταρχική λειτουργία των ριβοσωμάτων είναι να αποκωδικοποιούν τα mrnas σε πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Ωστόσο, αυτή η περιγραφή θεωρείται πλέον υπερβολικά απλοϊκή. Συσσωρευμένα στοιχεία στην βιβλιογραφία υποδεικνύουν ότι τα ίδια τα ριβοσώματα δύναται να επηρεάσουν τη σχετική αποτελεσματικότητα με την οποία τα διάφορα mrna μεταφράζονται. Η αντίληψη ότι τα ριβοσώματα έχουν ρυθμιστικές ικανότητες εκφράστηκε πριν από περισσότερο από μια δεκαετία με την υπόθεση δράσης του ριβοσώματος ώς φίλτρο επιλογής των mrna που θα μεταφραστούν κάθε φορά (114). Πράγματι, διάφορες μελέτες υποστηρίζουν αυτή την ιδέα και έχουν δείξει ότι η μετάφραση κάποιων mrnas επηρεάζεται από διακριτές αλληλεπιδράσεις συνδέσεως αυτών με το rrna ή τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες (115). Πιο συγκεκριμένα, μια βασική παρατήρηση που ενισχύει την υποθέση του δράσης του ριβοσώματος ώς φίλτρο επιλογής των mrna που θα μεταφραστούν ήταν το εύρημα ότι μεγάλοι αριθμοί mrnas περιέχουν τμήματα που είναι είτε παρόμοια ή συμπληρωματικά προς αλληλουχίες εντός των 18S ή 28S rrnas (113), (166), (70), (20), (126), (21), (112), (117), (150), (127). Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζουν σθεναρά έναν πρωτότυπο πιθανό μηχανισμό με τον οποίο θα μπορούσαν τα mrnas να αλληλεπιδρούν άμεσα με τις ριβοσωματικές υπομονάδες, για παράδειγμα μέσω mrnarrna ζευγαρώματος βάσεων μεταξύ συμπληρωματικών αλληλουχιών νουκλεοτιδίων. Επιπλέον, διάφορες εργασίες δείχνουν ότι εντός ενός οργανισμού, τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα σε διάφορους κυταρικούς τύπους ή σε διοφορετικά αναπατυξιακά στάδια ποικίλλουν από πλευράς πρωτεϊνών και rrna αλληλουχιών που εμπεριέχουν (141). Αυτά τα ευρήματα ενισχύουν ισχυρά το ενδεχόμενο ότι δομικά διαφορετικοί πληθυσμοί ριβοσωμάτων μπορεί να ποικίλλουν και ως προς την ικανότητά τους να μεταφράσουν ειδικά υποσύνολα των mrnas. Όλα τα ανωτέρω υποστηρίζουν ότι πράγματι εναλλακτικοί της cap-εξαρτώμενης μετάφρασης μηχανισμοί μπορούν να λειτουργήσουν παρακάμπτοντας στην ουσία τα στάδια της μετάφρασης που είναι εξαιρετικά υψηλής ενεργειακής δαπάνης και να οδηγήσουν στην μετάφραση μηνυμάτων απαραίτητων για την επιβίωση του κυττάρου ειδικά σε συνθήκες έλλειψης ενέργειας ή θρεπτικών στοιχείων. mtor και η μετάφραση των TOP mrnas Πρώιμες μελέτες από τους Jefferies et al. (80) και Terada et al. (161), έδειξαν αρχικά πως η ραπαμυκίνη προκαλεί καταστολή της μετάφρασης αυτής της συγκεκριμένης ομάδας ΤΟΡ mrnas. Όμως, η κρισιμότητα του μονοπατιού του mtor στον έλεγχο της μετάφρασης 29

των TOP mrnas είναι εμφανής και σε μελέτες άλλων ομάδων ΤΟΡ mrnas, που δεν κωδικοποιούν στοιχεία της μεταφραστικής μηχανής. Πιο συγκεκριμένα, μελέτες του Meyuhas και συνεργατών του έχουν επιβεβαιώσει περαιτέρω ότι μιτογόνα (π.χ. ινσουλίνη), αυξητικοί παράγοντες, καθώς και τα επίπεδα οξυγόνου και των θρεπτικών συστατικών (π.χ. αμινοξέα) συγκλίνουν όλα στο μονοπάτι του mtor για τη ρύθμιση της μετάφρασης των όλων των TOP mrnas (159), (158), (129), (118). Τα TOP mrnas περιέχουν ένα συγκεκριμένο cis-ρυθμιστικό στοιχείο που ονομάζεται ΤΟΡ μοτίβο. Πρόκειται για μια αλληλουχία 4-14 πυριμιδινών μεταβλητής σύνθεσης, που βρίσκεται αμέσως μετά την cap-δομή (m7gppp). Κατά κανόνα, τα TOP mrnas ξεκινούν με ένα νουκλεοτίδιο κυτοσίνης στη θέση +1 (m7gpppc), σε αντίθεση με όλα τα υπόλοιπα κυτταρικά mrnas που ξεκινούν με ένα νουκλεοτίδιο γουανοσίνης (83). Η αντικατάσταση της κυτοσίνης αυτής στη θέση +1 από κάποιο άλλο νουκλεοτίδιο, καταργεί τον μεταφραστικό έλεγχο από το TOP μοτίβο (100). Αυτή η μικρή πολυπυριμιδινική ακολουθία συναντάται σε mrnas που κωδικοποιούν όλες τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες, τους παράγοντες επιμήκυνσης, έναν αριθμό εναρκτήριων παραγόντων, καθώς και κάποιους μεταφραστικούς παράγοντες (116). Η σύνθεση των στοιχείων που συμμετέχουν στην πρωτεινοσύνθεση αποτελεί μια ενεργειακά δαπανηρή διαδικασία, γι αυτό και απαιτεί αυστηρό έλεγχο. Το TOP μοτίβο επιτρέπει τη συντονισμένη καταστολή της παραγωγής ποικίλων μεταφραστικών στοιχείων σε καταστάσεις ενεργειακής ανεπάρκειας ή χαμηλής διαθεσιμότητας θρεπτικών συστατικών, έτσι ώστε οι πόροι αυτοί να χρησιμοποιηθούν αντ αυτού σε διαδικασίες που εξασφαλίζουν την συντήρηση των κυττάρων. Πράγματι, το ΤΟΡ μηνύματα δεν ανιχνεύονται στα πολυσώματα (ενεργά ριβοσώματα) σε συνθήκες καταστολής της κυτταρικής αύξησης ή συνθήκες υστέρησης οξυγόνου ή θρεπτικών στοιχέιων (106), (49). Έρευνα του Thoreen et al. υποστηρίζει πως ο mtor ρυθμίζει επιλεκτικά τη μετάφραση των TOP mrnas μέσω του εναρκτήριου συμπλόκου eif4f. Συμπερασματικά υποστηρίζουν πως καθώς ο παράγοντας eif4e έχει μειωμένη συγγένεια για τα TOP mrnas, η πρόσδεση των 4E-BPs στον eif4e επηρεάζει τη μετάφρασή τους περισσότερο απ ότι για άλλα mrnas (163). Ωστόσο, σε μια άλλη μελέτη, έλλειψη των 4E-BP1/2 δεν αποδείχχθηκε ικανή να εμποδίσει την μεταφραστική καταστολή των 5_TOP mrnas που είχε επηχθεί από υποξία ή θρεπτική υστέρηση (118). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση του eif4e δεν μπορεί να προσφέρει προστασία των ΤΟΡ μηνυμάτων από την δράση αναστολέων των mtor (73). Επιπλέον, η S6K1 θεωρήθηκε, αρχικά, πως μπορεί να ελέγχει τη μετάφραση των TOP mrnas. Παρόλο που ο ίδιος ο mtor αποτελεί «μόριο-κλειδί» για στον μεταφραστικό 30

έλεγχο των TOP mrnas, η κινάση S6K1 και το υπόστρωμά της (η ριβοσωματική πρωτεΐνη S6) δεν είναι απαραίτητες στη διαδικασία αυτή (159). Συμπερασματικά, ο τρόπος με τον οποίο ο mtorc1 ελέγχει τη μετάφραση των ΤΟΡ mrnas παραμένει άγνωστος αν και η συγκεκριμένη δράση του πρέπει να επανεξεταστεί και να επανεκτιμηθεί. 31

Σκοπός Μελέτες σε ευνουχισμένους μύες με πλήρη έλλειψη του υποδοχέα της LDL έδειξαν αντίσταση των μυών στην επαγόμενη από δίαιτα παχυσαρκία, βελτιωμένο γλυκαιμικό προφίλ και αυξημένο ενεργειακό μεταβολισμό. Η αύξηση της ενεργειακής κατανάλωσης δείχθηκε ότι οφειλόταν σε αυξημένη έκφραση της αποσυζευκτικής πρωτεΐνης 1 (Uncoupling protein 1 UCP1) στον λευκό λιπώδη ιστό των ευνουχισμένων ζώων, συγκριτικά με τα αντίστοιχα ψευδοχειρουργημένα ζώα (25). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνηθεί εάν ο φαινότυπος των ευνουχισμένων μυών με πλήρη έλλειψη του υποδοχέα της LDL σχετιζόταν με τυχόν αλλαγές τόσο στο στάδιο της έναρξης της μετάφρασης, το οποίο ρυθμίζεται μέσω της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης 4E-BP1, όσο και στο στάδιο της επιμήκυνσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, το οποίο ρυθμίζεται μέσω της φωσφορυλίωσης της κινάσης S6K1. Επίσης, διερευνήθηκε η ενεργοποίηση παραγόντων που συμμετέχουν στα δυο αυτά στάδια της πρωτεϊνοσύνθεσης. 32

Υλικά και Μέθοδοι 9. Πειραματόζωα Στη παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν πειραματικά μοντέλα μυών με έλλειψη του υποδοχέα της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (ldlr -/- ) καθώς επίσης και φυσιολογικoί μύες οι οποίοι εκφράζουν το πλήρες γονιδίωμα, οι C57BL/6. Η προμήθεια των πειραματόζωων έγινε από την εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, www.jax.org). Χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί μύες ηλικίας 10-12 εβδομάδων, οι οποίοι φυλάσσονταν σε ξεχωριστά κλουβιά (ένα πειραματόζωο ανά κλουβί) με απεριόριστη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Οι μύες βρίσκονταν υπό συνθήκες δωδεκάωρου κύκλου φωτός και σκότους. Κάθε ομάδα μυών (ldlr -/- και C57BL/6) αποτελούνταν από 8 αρσενικούς μύες και χωρίστηκε σε δύο υποομάδες, με παρόμοια επίπεδα γλυκόζης νηστείας, παρόμοιο σωματικό βάρος, και παρόμοια επίπεδα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων πλάσματος. Η μια υποομάδα των ldlr -/- (4 μύες) και των C57BL/6 μυών (4 μύες) υποβλήθηκε σε ψευδοχειρουργείο (Sham operated animals), ενώ η δεύτερη υποομάδα κάθε είδους (4 μύες) υποβλήθηκε σε ορχεκτομή (Castrated animals). Ακολούθησε περίοδος ανάρρωσης 4 εβδομάδων υπό συμβατική δίαιτα (Standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG), απαραίτητη για την απομάκρυνση της τεστοστερόνης που υπάρχει στο πλάσμα των ορχεκτομηθέντων μυών, και αμέσως μετά οι δύο ομάδες τοποθετήθηκαν σε δίαιτα δυτικού τύπου (Mucedola SRL, Milano, Italy) για περίοδο 12 εβδομάδων (εβδομάδα 0). Με την ολοκλήρωση των 12 εβδομάδων οι μύες θυσιάστηκαν και πραγματοποιήθηκε λήψη αίματος και απομόνωση του λευκού λιπώδους ιστού (Εικόνα 16). Το συγκεκριμένο πείραμα επαναλήφθηκε συνολικά τρεις φορές. Παρακάτω περιγράφονται αναλυτικά οι διαδικασίες των χειρουργείων και των θυσιών. 33

Εικόνα 16: Πειραματικός σχεδιασμός Ορχεκτομή Ψευδοχειρουργείο Υλικά: Ηλεκτρική ξυριστική μηχανή Αντισηπτικό διάλυμα ιωδιούχου ποβιδόνης 10%, Betadine Νυστέρι τύπου 21 Ανατομική λαβίδα, βελονοκάτοχος Απορροφήσιμο ράμμα Safil Quick μεγέθους 4.0 Μη απορροφήσιμο ράμμα Dafilon μεγέθους 4.0 Αναισθητικό διάλυμα ισοφλουρανίου (CP Pharma, Burgdorf, Germany) Combivet anesthesia system (CV30 301 Digi, Rothacher Medical Gmbh, Switzerland) Πειραματική πορεία: Οι μύες αναισθητοποιήθηκαν με τη χρήση ισοφλουράνιου και τοποθετήθηκαν σε επιτραπέζια πλάκα σε ύπτια θέση. Το όσχεο ξυρίστηκε με ηλεκτρική ξυριστική μηχανή καταλείποντας ένα καθαρό χειρουργικό πεδίο. Εφαρμόστηκε τοπικά διάλυμα ιωδιούχου ποβιδόνης 10% και εκτελέστηκε μέση τομή επί του οσχέου μήκους περίπου 0,5 εκ. Μετά την αναγνώριση, ακολούθησε έλξη των όρχεων από την τομή με τη χρήση ανατομικής λαβίδας, έως ότου παρασκευάστηκαν αυτοί και ο σπερματικός τόνος. Μετά την απολίνωση του σπερματικού τόνου, με χρήση απορροφήσιμου ράμματος στο κεντρικότερο δυνατό σημείο, απομακρύνθηκε όλος ο ορχικός ιστός. Εκτελέστηκε, δηλαδή, αποκοπή του απολινωμένου τμήματος άμεσα περιφερικότερα της απολίνωσης. Η ίδια διαδικασία 34

επαναλήφθηκε και για τους δύο όρχεις (και στις δύο περιπτώσεις οι χειρισμοί έγιναν από την ίδια τομή). Εφαρμόστηκε τοπικά αντισηπτικό διάλυμα ιωδιούχου ποβιδόνης. Ακολούθησε σύγκλιση των χειλέων του τραύματος με τη χρήση μη απορροφήσιμου ράμματος και διακοπή της χορήγησης αναισθητικού. Για τα ψευδοχειρουργεία ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία, με τη διαφορά ότι δεν εκτελέστηκε πλήρης παρασκευή των όρχεων και έλξη τους για αποφυγή τραυματισμών. Επιπλέον, αντί της απολίνωσης και της εκτομής των όρχεων, τοποθετήθηκε ποσότητα απορροφήσιμου ράμματος, παρεμφερής με αυτή που χρησιμοποιήθηκε για την απολίνωση των όρχεων. Θυσίες και λήψη ιστών από τα πειραματόζωα Υλικά: Ισοφλουράνιο (AEranne Isoflurane, USP, NDC 10019-773-40, Baxter, USA) Σωληνάκια συλλογής αίματος (Microtubes for pediatric blood collection CB1000, Sarstedt, D-51588 Numbrecht, Germany) 70% αιθανόλη (Ethanol, K43147583 209, Merck, Germany) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Πειραματική πορεία: Έπειτα από νηστεία 16 ωρών, κάθε πειραματόζωο τοποθετήθηκε σε δοχείο που κλείνει ερμητικά και το οποίο περιείχε βαμβάκι εμποτισμένο με ισοφλουράνιο, προκειμένου να αναισθητοποιηθεί. Όταν το ζώο ήταν αναίσθητο, ακολουθούσε αφαίρεση του οφθαλμού με λαβίδα και λήψη αίματος μέσω του περικογχικού φλεβικού κόλπου (περίπου 600-800μl) σε ειδικά σωληνάκια συλλογής αίματος, τα οποία περιείχαν EDTA αντιπηκτικό. Το αίμα φυλασσόταν σε πάγο. Στη συνέχεια, τα ναρκωμένα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω αυχενικής μετατόπισης. Κάθε ζώο τοποθετήθηκε σε χειρουργικό τραπέζι με την κοιλιακή πλευρά προς τα πάνω, η οποία αποστειρώθηκε με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% και στην συνέχεια ανοίχθηκε με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι, προκειμένου να αποκαλυφθεί και να απομονωθεί ο λευκός λιπώδης ιστός (white adipose tissue WAT). Ο ιστός τοποθετήθηκε σε τρυβλίο όπου ξεπλύθηκε με διάλυμα PBS 1x, και τέλος τοποθετήθηκε σε πλαστικά σωληνάκια και φυλάχθηκε στους -80 ο C. Τέλος, ακολουθούσε φυγοκέντρηση του αίματος στις 4.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ο C, ώστε να διαχωριστεί το πλάσμα από τα κυτταρικά στοιχεία του αίματος. Το πλάσμα συλλεγόταν σε πλαστικά σωληνάκια και φυλασσόταν στους -20 ο C. 35

10. Ομογενοποίηση λευκού λιπώδους ιστού και απομόνωση των total lysates Υλικά: Διάλυμα RIPA Αποστειρωμένα σωληνάκια Γυάλινο σωληνάκι ομογενοποίησης και έμβολο Πίνακας 1: Σύσταση διαλύματος RIPA Συστατικά Σύσταση διαλύματος RIPA NaCl Tris-HCl 1M, ph 7,4 150mM 50mM Sodium deoxylcholate 0,5% SDS 0,1% EDTA 1mM Triton X-100 1% Protease inhibitor cocktail (Cat# BWR1018, Biospes) 1% Phosphatase inhibitor cocktail II (Cat#BWF1016, Biospes) 1% Πειραματική πορεία: Οι ιστοί που είχαν απομονωθεί ζυγίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε γυάλινο σωληνάκι ομογενοποίησης με έμβολο μαζί με διάλυμα RIPA. H αναλογία ιστού με διάλυμα RIPA ήταν περίπου 1,15mL RIPA / gr ιστού. Η ομογενοποίηση πραγματοποιήθηκε μηχανικά. Το ομογενοποίημα που προέκυψε από κάθε δείγμα μεταφέρθηκε σε αποστειρωμένο σωληνάκι και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 10.000g για 10min στους 4 ο C. Το υπερκείμενο που προέκυψε από τη φυγοκέντρηση αποτελεί το total lysate, οπότε μεταφέρθηκε σε νέο αποστειρωμένο σωληνάκι και αποθηκεύτηκε στους -80 ο C. Προσδιορισμός συνολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Lowry Ο προσδιορισμός της συνολικής πρωτεΐνης κάθε δείγματος είναι απαραίτητος προκειμένου να φορτωθούν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα κατά την ηλεκτροφόρηση που θα ακολουθήσει. Ο προσδιορισμός αυτός έγινε με τη μέθοδο Lowry και χρησιμοποιώντας ειδικό kit (Bio-Rad Laboratories, Inc, DC Protein Assay Kit II). 36

11. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Αρχή της μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό υποδιατακτικές συνθήκες είναι γρήγορη, ευαίσθητη και έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα. Μέσω αυτής επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός πρωτεϊνών διαφορετικού μοριακού βάρους, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης, σε κυτταρικά δείγματα ή δείγματα ιστών. Το απορρυπαντικό SDS (δωδεκακυλο-θειικό νάτριο) που χρησιμοποιείται, αποτελεί έναν ανιοντικό παράγοντα που καταστρέφει σχεδόν όλες τις μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις μιας φυσικής πρωτεΐνης. Επιπλέον, η προσθήκη μερκαπτοαιθανόλης οδηγεί σε αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών. Τα ανιόντα του SDS δεσμεύονται στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, προσδίδοντάς τους ένα ισχυρά αρνητικό φορτίο, το οποίο είναι συνήθως πολύ μεγαλύτερο από το αρχικό φορτίο της φυσικής πρωτεΐνης, επομένως το αρχικό φορτίο καθίσταται αμελητέο. Έτσι, ο μόνος παράγοντας που απομένει για να διαχωρίσει αυτές τις πρωτεΐνες είναι μόνο το μέγεθός τους σε σχέση με το μέγεθος των πόρων της πηκτής (10). Το πολυακρυλαμίδιο αποτελεί μία καθαρά συνθετική ύλη, που βασίζεται στον ρυθμιζόμενο πολυμερισμό και σταυροσύνδεση (cross-linking) ενός μίγματος ακρυλαμιδίου και Ν, Ν' -μεθυλενο-δισακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός εκκινεί με την προσθήκη ελευθέρων ριζών. Οι δύο πιο κοινοί καταλύτες που ενεργούν ως πηγή ελευθέρων ριζών είναι το υπερθεϊικό αμμώνιο (APS) και η μονοφωσφορική ριβοφλαβίνη. Η διάσπασή του καταλύεται από βάση και προωθείται από την προσθήκη της βάσης Ν, Ν'-τετραμεθυλενοδιαμίνης (ΤΕΜΕD). Η πηκτή πολυακρυλαμιδίου αποτελείται από δύο επιμέρους τμήματα, την πηκτή επιστοίβασης (stacking gel), που συμβάλλει στην συσσώρευση των πρωτεϊνών ώστε όλες να ξεκινήσουν από το ίδιο σημείο, και την πηκτή διαχωρισμού (separating gel) στην οποία πραγματοποιείται ο διαχωρισμός. Υλικά: Συσκευή κατακόρυφης ηλεκτροφόρησης (Biorad) και τροφοδοτικό σταθερής έντασης (E-C, Apparatus Corporation) Glass Plates (Spacer Plates with 1.5 mm spacer, 1653312, Bio-Rad, USA) Glass Plates (Short Plates, 1653308, Bio-Rad, USA) Prestained Protein Marker, Broad Range (#P7708S, Biolabs, New England) 37

Διαλύματα 10x TG Buffer: 30,3g Tris + 144g glycine + ddη 2 Ο μέχρι το 1L 10x Running Buffer: 100 ml TG buffer 10x + 10 ml SDS 10% + 890 ml ddh2o 30% (w/v) ακρυλαμίδιο / 0.8% (w/v) δισ-ακρυλαμίδιο: 75g high grade acrylamide + 2g bis-acrylamide + ddh 2 O μέχρι τα 250ml Ισοπροπανόλη (2-Propanol, 131090, Panreac Quimica Sau, Barcelona, Spain) 20% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS, ART. NR. 4360.2, Carl Roth GmbH): 20g SDS + 80 ml ddh2o Tris-HCl 1.5 M, ph 8,8 Tris-HCl 1 M, ph 6,8 20% (w/v) Υπερθειϊκό αμμώνιο (Ammonium Persulfate, APS, BP179-100, Fisher Scientific, USA) (20 g APS + 100 ml ddh2o) N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine (TEMED, T7024, Sigma-Aldrich, USA) Sample loading buffer: 1mL Tris-ΗCl ph 6.8 + 0.31g Dithiothreitol + 0.4g SDS + 20mg Bromophenol Blue + 2mL Glycerol + 1.55mL ddh 2 O Πειραματική πορεία: Προετοιμασία των πηκτών Η διαδικασία ξεκινάει με την προετοιμασία των δύο πηκτών, σε ξεχωριστούς σωλήνες falcon (50mL), ως εξής: Πίνακας 2: Συστατικά των πηκτών Separating Gel (12%) Stacking Gel (5%) ddh 2 O (7,35mL) Ακρυλαμίδιο / δις-ακρυλαμίδιο (9mL) Tris-HCl ph 8,8 (5,7mL) SDS 10% (225μL) APS 10% (225μL) TEMED* (9μL) ddh 2 O (5,1mL) Ακρυλαμίδιο / δις-ακρυλαμίδιo (1,245mL) Tris-HCl ph 6,8 (945μL) SDS 10% (75μL) APS 10% (75μL) TEMED* (7,5μL) *Το TEMED προστίθεται πάντα τελευταίο, καθώς είναι αυτό που καταλύει τον πολυμερισμό. Μόλις η πηκτή διαχωρισμού ετοιμαστεί και πριν προλάβει να πολυμεριστεί, τοποθετείται ανάμεσα στις δύο γυάλινες πλάκες. Με την προσθήκη ισοπροπανόλης απομακρύνονται τυχόν φυσαλίδες από την επιφάνεια της πηκτής. Όταν η πηκτή 38

πολυμεριστεί, η ισοπροπανόλη αποχύνεται και προστίθεται η πηκτή επιστοίβαξης μαζί με μια οδοντωτή μήτρα με 15 εσοχές, οι οποίες θα σχηματίσουν τα κελία στα οποία θα φορτωθούν τα δείγματα (Εικόνα 17). Όταν ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός των πηκτών, οι πλάκες με τις πηκτές τοποθετούνται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, και προστίθεται το 1x Running Buffer (Εικόνα 18). Εικόνα 17: Προετοιμασία πηκτής πολυακρυλαμιδίου (από http://www.di.uq.edu.au/sparqsdspage) Εικόνα 18: Διάταξη ηλεκτροφόρησης (από http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/protein_methods.htm) Προετοιμασία των δειγμάτων και φόρτωμα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Σε σωληνάκια eppendorf, τα δείγματα προς ηλεκτροφόρηση αραιώθηκαν με ddh 2 O και κατάλληλη ποσότητα 4x Sample Loading Buffer, έτσι ώστε σε κάθε δείγμα η τελική συγκέντρωση του Sample Loading Buffer να είναι 1x και να περιέχονται 20μg πρωτεΐνης. Τα αραιωμένα δείγματα τοποθετήθηκαν για 4 λεπτά σε συσκευή θέρμανσης, στους 100 ο C, και μετά από 10 λεπτά φυγοκεντρήθηκαν για περίπου 30 δευτερόλεπτα. Τα αραιωμένα δείγματα φορτώθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, ξεκινώντας με 5μL από τον μάρτυρα στο πρώτο κελί της πηκτής. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα 90 Volt για περίπου 90 λεπτά. 39

Για τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών ζωνών προχωράμε σε ανοσοαποτύπωση κατά Western όπως περιγράφεται ακολούθως. 12. Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) Αρχή της μεθόδου Οι πρωτεΐνες που έχουν διαχωριστεί στην πηκτή μεταφέρονται (με ηλεκτροαποτύπωση) σε μια επιφάνεια που τις κάνει να αντιδρούν πιο εύκολα με το αντίσωμα που προστίθεται στη συνέχεια. Η επιφάνεια αυτή είναι μια μεμβράνη PVDF, πάνω στην οποία οι πρωτεΐνες δεσμεύονται μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Το αντίσωμα που προστίθεται (πρωτοταγές αντίσωμα), είναι ειδικό για τις πρωτεΐνες που μας ενδιαφέρουν. Το σύμπλοκο αντισώματος-αντιγόνου που σχηματίζεται στην επιφάνεια της μεμβράνης ανιχνεύεται με την προσθήκη ενός δεύτερου αντισώματος ειδικού για το πρώτο (δευτεροταγές αντίσωμα). Το δευτεροταγές αντίσωμα είναι επίσης συνδεδεμένο με το ένζυμο της υπεροξειδάσης, το οποίο όταν αντιδρά με το υπεροξείδιο του υδρογόνου προκαλεί χημειοφωταύγεια. Έτσι, η αντίδραση αυτή δίνει ένα φωτεινό σήμα ανάλογο με την ποσότητα της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει (10). Υλικά: Συσκευή και κασέτα μεταφοράς Μεμβράνη μεταφοράς (Porablot PVDF membrane, REF 741260, Macherey-Nagel, Germany) Διηθητικό χαρτί Κασέτα εμφάνισης του φιλμ Kodak film 13cm x 18cm (Biomax Xar Film) Διαλύματα Μεθανόλη (Methanol for analysis, I557009, Merck, Germany) 1x Transfer Buffer: 100mL TG buffer 10x + 200mL Methanol + 10mL SDS 10% + 690mL ddh 2 O 10x TBS Buffer: 60.57g Tris + 87.66g NaCl + ddh 2 O μέχρι το 1L 1x TBST Buffer: 100mL TBS 10x + 2mL Tween-20 + 898mL ddh 2 O BSA 5%: 2.5g BSA + 50mL TBST 1x ECL: 10 ml Luminol 1.25 mm ph 8.5 + 10 μl p-coumaric acid 68 mm + 30 μl hydrogen peroxide 3% Developer (P7042-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Fixer (P7167-1GA, Sigma-Aldrich, USA) 40

Διάλυμα Developer: 828 ml Developer + 3.8 L ddh2o Διάλυμα Fixer: 828 ml Fixer + 3.8 L ddh2o Πρωτοταγές αντίσωμα (αραίωση: 1:1000, 4ml BSA 5% + 5μl αντισώματος) Δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση: 1:2000, 6ml TBST 1x + 3μl αντισώματος) Goat anti-rabbit IgG, (Santa Cruz Biotechnology Inc.) Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω πρωτοταγή αντισώματα: 1. Phospho - 4E-BP1 (Thr37/46) Antibody (Cell Signaling, #9459S) 2. 4E-BP1 (53H11) Rabbit mab, (Cell Signaling, #9644P) 3. Phospho - eif4e (Ser 209) Antibody (Cell Signaling, #9741P) 4. eif4e (C46H6) Rabbit mab (Cell Signaling, #2067P) 5. Phospho - eif2alpha (S51) Rabbit Ab (Cell Signaling, #9721BC) 6. eif2a Rabbit Ab (Cell Signaling, #5324) 7. Phospho - p70 S6 Kinase (Thr421/Ser424) Antibody (Cell Signaling, #9204S) 8. p70 S6 Kinase Antibody (Cell Signaling, #9202S) 9. Phospho eef2k (S366) Rabbit Ab (Cell Signaling, #3691BC) 10. eef2k Antibody (Cell Signaling, #3692S) Πειραματική πορεία: 1. Μεταφορά των πρωτεϊνών στη μεμβράνη PVDF Η διαδικασία ξεκινάει με ενεργοποίηση της μεμβράνης PVDF σε διάλυμα μεθανόλης, ενώ στη συνέχεια εμβαπτίζεται σε Transfer buffer 1x. Στην κασέτα μεταφοράς, με κατεύθυνση από την κάθοδο προς την άνοδο, τοποθετούνται τα ακόλουθα (αφού πρώτα εμβαπτιστούν όλα σε Transfer buffer 1x): Σφουγγαράκι 5 κομμάτια διηθητικού χαρτιού Πηκτή πολυακρυλαμιδίου Μεμβράνη PVDF 5 κομμάτια διηθητικού χαρτιού Σφουγγαράκι. Με προσοχή, αφαιρούνται τυχόν φυσαλίδες που βρίσκονται ανάμεσα στα παραπάνω υλικά, και στη συνέχεια η κασέτα μεταφοράς κλείνει κ μεταφέρεται στη συσκευή μεταφοράς, στην οποία έχει προστεθεί Transfer buffer 1x. Τέλος, εφαρμόζεται ηλεκτρικό ρεύμα 30 Volt για περίπου 16 ώρες (over night) στους 4 ο C. 2. Ανοσοαποτύπωση Η μεμβράνη που πλέον περιέχει τις πρωτεΐνες υφίσταται 2 πλύσεις με διάλυμα 1x TBST για 5 λεπτά υπό ανάδευση. Πριν την χρήση των αντισωμάτων, είναι απαραίτητη 41

η διαδικασία blocking της μεμβράνης. Αυτό σημαίνει ότι τα σημεία της μεμβράνης στα οποία δεν υπάρχουν πρωτεΐνες, πρέπει να μπλοκαριστούν από κάποια πρωτεΐνη ώστε να εμποδιστεί η μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων στα σημεία αυτά. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται διάλυμα BSA 5%, στο οποίο η μεμβράνη επωάζεται για 2 ώρες, σε θερμοκρασία δωματίου και πάνω σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Με το πέρας των 2 ωρών η μεμβράνη επωάζεται υπό ανάδευση με 4mL πρωτοταγούς αντισώματος (αραίωση 1:1000) για περίπου 16 ώρες (over night) στους 4 ο C. Στη συνέχεια, η μεμβράνη πλένεται 4 φορές των 15 λεπτών υπό ανάδευση σε διάλυμα 1x TBST πριν επωαστεί σε 6mL δευτεροταγούς αντισώματος (αραίωση 1:2000) για 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και υπό ανάδευση. Τέλος, ακολουθούν 4 15λεπτες πλύσεις με διάλυμα 1x TBST υπό ανάδευση. 3. Αυτοραδιογραφία Σε σκοτεινό θάλαμο, η μεμβράνη επωάζεται για 1 λεπτό σε διάλυμα ECL και εν συνεχεία τοποθετείται σε κασέτα εμφάνισης ανάμεσα σε δυο πλαστικές διαφάνειες. Πάνω από αυτές, τοποθετείται το φιλμ και η κασέτα κλείνει για μερικά δευτερόλεπτα ή λεπτά (ανάλογα με το πόσο φωτεινό διακρίνεται το σήμα πάνω στην μεμβράνη). Ακολούθως, το φιλμ βυθίζεται σε διάλυμα Developer (για περίπου 1 λεπτό), ξεπλένεται με νερό και τέλος βυθίζεται σε διάλυμα Fixer μέχρι να γίνει διαυγές. Εικόνα 19: Μηχανισμός ανίχνευσης των πρωτεϊνών στην ανοσοαποτύπωση κατά Western Blot (από http://www.leinco.com/general_wb) 42

Αποτελέσματα Η ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης πραγματοποιείται κατά ένα μεγάλο μέρος, μέσω της φωσφορυλίωσης των διαφόρων παραγόντων που συμμετέχουν στα στάδια της. Γνωρίζοντας πως το σύμπλοκο του mtorc1, που λειτουργεί ως κινάση που συμμετέχει στη φωσφορυλίωση αυτών των παραγόντων τόσο στο στάδιο της έναρξης όσο και στο στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης, ελέγχθηκαν τυχόν αλλαγές στα επίπεδα της φωσφορυλίωσης κάποιων εξ αυτών των παραγόντων, μεταξύ των πειραματικών μας καταστάσεων. Ο προσδιορισμός των επιπέδων των πρωτεϊνών έγινε με την μέθοδο SDS-PAGE και Western Blot, όπως περιγράφεται στις παραγράφους 11 και 12. Οι εικόνες που προέκυψαν ποσοτικοποιήθηκαν με το πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας ImageJ, με μέτρηση της έντασης κάθε ζώνης του φιλμ αυτοραδιογραφίας. 13. Έλεγχος παραγόντων που συμμετέχουν στην έναρξη της μετάφρασης Από τους πρωτεϊνικούς παράγοντες που συμμετέχουν στο στάδιο της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, επιλέχθηκαν να ελεγχθούν ως προς τα επίπεδα φωσφορυλίωσης οι παράγοντες: 4E-BP1, eif4e και eif2a. Πρωτεΐνη 1 δέσμευσης του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 4Ε (4E-BP1) Αρχικά, στην ομάδα ελέγχου (C57BL/6 μύες) δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα φωσφορυλιωμένου 4E-BP1 μεταξύ των ορχεκτομηθέντων και ψευδοχειρουργημένων ζώων. Αντίθετα, στην ομάδα των ldlr -/- μυών, παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των δύο υποομάδων στα επίπεδα του φωσφορυλιωμένου 4E-BP1. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική (p<0,05) μείωση της φωσφορυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης στα ευνουχισμένα ζώα (Εικόνα 20). 43

Εικόνα 20: A) Αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση κατά Western για την ολική και τη φωσφορυλιωμένη στη θέση Thr37/46 4E-BP1 πρωτεΐνη, στο σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό από ψευδοχειρουργημένα και ευνουχισμένα φυσιολογικά (C57BL/6) και ldlr -/- ποντίκια. 20μg ολικής πρωτεΐνης από τον σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό των πειραματόζωων αναλύθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Β) Ημιποσοτικοποίηση της σχετικής φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης 4E-BP1. Ανοσοαποτυπώσεις κατά Western από τρία διαφορετικά πειράματα (8 διαφορετικά δείγματα/πειραματική κατάσταση/πείραμα) ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες (Aurbitrary Units, AU) ανά μg ολικής πρωτεΐνης και εκφράζουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση του μέσου όρου τριών διαφορετικών πειραμάτων. Ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 4E (eif4e) Τόσο η ομάδα ελέγχου όσο και η ομάδα των ldlr -/- μυών δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης του εναρκτήριου παράγοντα eif4e, μεταξύ των ορχεκτομηθέντων και ψευδοχειρουργημένων ζώων (Εικόνα 21Α και 21Β). Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι τα ολικά επίπεδα του παράγοντα eif4e εμφανίζουν στατιστικώς σημαντική μείωση στην περίπτωση των ευνουχισμένων ldlr -/- μυών. (21Α και 21C) 44

Εικόνα 21: A) Αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση κατά Western για την ολική και τη φωσφορυλιωμένη στη θέση Ser209 eif4e πρωτεΐνη, στο σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό από ψευδοχειρουργημένα και ευνουχισμένα φυσιολογικά (C57BL/6) και ldlr -/- ποντίκια. 20μg ολικής πρωτεΐνης από τον σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό των πειραματόζωων αναλύθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Η ανάκτηση της ολικής πρωτεΐνης στις μεμβράνες πιστοποιήθηκε με τη χρήση ειδικού για μύες αντισώματος έναντι της β-tubulin και όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν ως προς το αντίστοιχο για κάθε μια σήμα ανοσοαποτύπωσης για την β-tubulin. Β) Ημιποσοτικοποίηση της σχετικής φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης eif4e. C) Ημιποσοτικοποίηση των ολικών επιπέδων της πρωτεΐνης 4E. Ανοσοαποτυπώσεις κατά Western από τρία διαφορετικά πειράματα (8 διαφορετικά δείγματα/πειραματική κατάσταση/πείραμα) ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες (Aurbitrary Units, AU) ανά μg ολικής πρωτεΐνης και εκφράζουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση του μέσου όρου τριών διαφορετικών πειραμάτων. Ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 2A (eif2a) Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι ο συγκεκριμένο εναρκτήριος παράγοντας δεν εμφανίζει στατιστικά σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα φωσφορυλίωσής του, μεταξύ των υποομάδων sham-castrated και για τις δύο πειραματικές ομάδες (Εικόνα 22). 45

Εικόνα 22: A) Αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση κατά Western για την ολική και τη φωσφορυλιωμένη στη θέση Ser51 eif2a πρωτεΐνη, στο σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό από ψευδοχειρουργημένα και ευνουχισμένα φυσιολογικά (C57BL/6) και ldlr -/- ποντίκια. 20μg ολικής πρωτεΐνης από τον σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό των πειραματόζωων αναλύθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Β) Ημιποσοτικοποίηση της σχετικής φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης eif2a. Ανοσοαποτυπώσεις κατά Western από τρία διαφορετικά πειράματα (8 διαφορετικά δείγματα/πειραματική κατάσταση/πείραμα) ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες (Aurbitrary Units, AU) ανά μg ολικής πρωτεΐνης και εκφράζουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση του μέσου όρου τριών διαφορετικών πειραμάτων. 14. Έλεγχος παραγόντων που συμμετέχουν στο στάδιο της επιμήκυνσης της μετάφρασης Για τη μελέτη του σταδίου της επιμήκυνσης της πρωτεϊνοσύνθεσης επιλέχθηκαν να ελεγχθούν ως προς τα επίπεδα της φωσφορυλίωσής τους οι παράγοντες: S6K και eef2k. Κινάση της ριβοσωματικής πρωτεΐνης S6 (S6K) Τα αποτελέσματα δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αλλαγή στα επίπεδα φωσφορυλίωσης μεταξύ των δυο υποομάδων (Sham Castrated) στην ομάδα των 46

C57BL/6 μυών. Αντιθέτως, οι μύες με έλλειψη του LDLr αλλά και της τεστοστερόνης εμφάνισαν στατιστικώς σημαντική (p<0,05) μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης της S6K (Εικόνα 23). Εικόνα 23: A) Αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση κατά Western για την ολική και τη φωσφορυλιωμένη στη θέση Thr421/Ser424 S6K πρωτεΐνη, στο σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό από ψευδοχειρουργημένα και ευνουχισμένα φυσιολογικά (C57BL/6) και ldlr -/- ποντίκια. 20μg ολικής πρωτεΐνης από τον σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό των πειραματόζωων αναλύθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Β) Ημιποσοτικοποίηση της σχετικής φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης S6K. Ανοσοαποτυπώσεις κατά Western από τρία διαφορετικά πειράματα (8 διαφορετικά δείγματα/πειραματική κατάσταση/πείραμα) ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες (Aurbitrary Units, AU) ανά μg ολικής πρωτεΐνης και εκφράζουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση του μέσου όρου τριών διαφορετικών πειραμάτων. Κινάση του ευκαρυωτικού παράγοντα επιμήκυνσης της πρωτεϊνοσύνθεσης eef2 (eef2k) Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα που προέκυψαν και για την κινάση eef2k, καθώς μόνο στην ομάδα των ldlr -/- μυών παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε μείωση της φωσφορυλίωσης της κινάσης eef2k στα ορχεκτομηθέντα ζώα σε σχέση με 47

τα ψευδοχειρουργημένα. Οι δυο υποομάδες της ομάδας ελέγχου δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντική αλλαγή στα επιπέδα φωσφορυλίωσης της eef2k (Εικόνα 24). Εικόνα 24: A) Αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση κατά Western για την ολική και τη φωσφορυλιωμένη στη θέση Ser366 eef2k πρωτεΐνη, στο σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό από ψευδοχειρουργημένα και ευνουχισμένα φυσιολογικά (C57BL/6) και ldlr -/- ποντίκια. 20μg ολικής πρωτεΐνης από τον σπλαχνικό λευκό λιπώδη ιστό των πειραματόζωων αναλύθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Β) Ημιποσοτικοποίηση της σχετικής φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης eef2k. Ανοσοαποτυπώσεις κατά Western από τρία διαφορετικά πειράματα (8 διαφορετικά δείγματα/πειραματική κατάσταση/πείραμα) ποσοτικοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες (Aurbitrary Units, AU) ανά μg ολικής πρωτεΐνης και εκφράζουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση του μέσου όρου τριών διαφορετικών πειραμάτων. 48

Συζήτηση Για να διερευνήσουμε τη συσχέτιση του φαινοτύπου αντίστασης στη διατροφικά επαγόμενη παχυσαρκία των ευνουχισμένων ldlr -/- μυών μέσω της ρύθμισης της πρωτεϊνοσύνθεσης, ελέγξαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης παραγόντων, οι οποίοι εμπλέκονται στη ρύθμιση αυτή μέσω της συμμετοχής τους στα στάδια της έναρξης και της επιμήκυνσης της μετάφρασης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η ρύθμιση του σταδίου της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης, αποτελεί το κύριο ρυθμιστικό στοιχείο της μετάφρασης και ελέγχεται κατά βάση από τον ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης eif4e αλλά και οποιοδήποτε άλλο παράγοντα ελέγχει την ενεργότητα αλλά και τα επίπεδα του eif4e (51). Στην παρούσα εργασία παρατηρήθηκε ότι αν και στον λευκό λιπώδη ιστό των ευνουχισμένων ldlr -/- μυών δεν εμφανίστηκε στατιστικώς σημαντική αλλαγή στα επίπεδα φωσφορυλίωσης, άρα και στην ενεργότητα του eif4e (Εικόνα 21Β), τα ολικά επίπεδα του eif4e ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένα συγκριτικά με τα ψευδοχειρουργημένα ζώα του ίδιου κλώνου. Επιπλέον, η αλλαγή αυτή δεν εμφανίστηκε κατά τη σύγκριση ευνουχισμένων και ψευδοχειρουργημένων C57BL/6 ποντικών έχοντων τον πλήρη γονότυπο (Εικόνα 21Γ). Στο ίδιο πλαίσιο σκέψης, ο παράγοντας που ελέγχει τη διαθεσιμότητα του eif4e προς φωσφορυλίωση και κατά συνέπεια προς ενεργοποίηση της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης, ο 4E-BP1, βρέθηκε να παρουσιάζει μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης στον λευκό λιπώδη ιστό των ευνουχισμένων ldlr -/- ποντικών συγκριτικά με τους ψευδοχειρουργημένους ποντικούς του ίδιου κλώνου, γεγονός που μεταφράζεται σε αυξημένη δέσμευση μορίων eif4e πάνω σε μόρια του 4E-BP1, φαινόμενο που μειώνει την διαθεσιμότητα ελεύθερου eif4e προς φωσφορυλίωση και άρα ενεργοποίηση της capεξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης (2). Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, η ενεργοποίηση μέσω φωσφορυλίωσης του εναρκτήριου παράγοντα eif2a, ο οποίος αποτελεί μέρος του τριμερούς συμπλόκου, δεν επηρεάζεται από την έλλειψη τεστοστερόνης ούτε στους ldlr -/- αλλά ούτε και στους αγρίου τύπου C57BL/6 ποντικούς. Ενδιαφέρον σε αυτό το σημείο παρουσιάζει το γεγονός ότι, ενώ η διαθεσιμότητα του eif4e ελέγχεται μέσω του 4E-BP1 από τον mtorc1 και αλλάζει κατά τρόπο ώστε να μειώνεται η διαθεσιμότητα του eif4e προς ενεργοποίηση της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης στον λευκό λιπώδη ιστό ευνουχισμένων ldlr -/- ποντικών, ο eif2a, ο οποίος δεν υπόκειται σε κανενός είδους έλεγχο από τον mtorc1 δεν επηρεάζεται από την έλλειψη της τεστοστερόνης σε κανέναν από τους δύο κλώνους που ελέχθησαν στην παρούσα μελέτη. 49

Οι ανωτέρω παρατηρήσεις σαφώς υποδεικνύουν ότι η λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ του LDLr και της τεστοστερόνης επί της ρύθμισης της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης αφορά τη ρύθμιση της ενεργότητας του mtorc1, η οποία στην ταυτόχρονη έλλειψη LDLr και τεστοστερόνης θα πρέπει να μειώνεται οδηγώντας κατά συνέπεια και σε καταστολή της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης στο συγκεκριμένο μοντέλο ζώων. Ωστόσο, η ενδεχόμενη καταστολή του mtorc1 θα πρέπει σε μια τέτοια περίπτωση να συνοδεύεται και από καταστολή της επιμήκυνσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στην προσπάθεια επιβεβαίωσης του ανωτέρω συμπεράσματος, στην παρούσα μελέτη ελέχθηκε εάν η ταυτόχρονη έλλειψη LDLr και τεστοστερόνης επηρεάζει και τυχόν mtorc1-εξαρτώμενα στοιχεία ρύθμισης του σταδίου επιμήκυνσης της μετάφρασης. Η ρύθμιση του σταδίου της επιμήκυνσης επιτυγχάνεται μέσω των κινασών S6K1/2 και eef2k, με την S6K1/2 να βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του mtorc1 και η ίδια ακολούθως να ελέγχει την φωσφορυλίωση και άρα την ενεργότητα της eef2k. Στο μοντέλο των ευνουχισμένων ldlr -/- μυών, παρατηρήθηκε μείωση των φωσφορυλιωμένων επιπέδων και για τις δυο αυτές κινάσες, συγκριτικά με τα ζώα που δεν είχαν έλλειψη τεστοστερόνης, γεγονός που υποδεικνύει και αυξημένη φωσφορυλίωση του παράγοντα επιμήκυνσης eef2 από την eef2k. Καθώς, είναι γνωστό πως, η φωσφορυλίωση του παράγοντα eef2 τον καθιστά ανίκανο να υποστηρίξει την επιμήκυνση της πρωτεϊνοσύνθεσης (19) τα αποτελέσματά μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι κατά την ταυτόχρονη έλλειψη LDLr και τεστοστερόνης το στάδιο της επιμήκυνσης καταστέλλεται. Όπως έχει προαναφερθεί, η ταυτόχρονη καταστολή του σταδίου της capεξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης και του σταδίου επιμήκυνσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας σχετίζονται με συνθήκες έλλειψης σημαντικών τροφικών παραγόντων (π.χ. αμινοξέων) ή/και ενέργειας από τα κύτταρα (23), (38), (40), (45), (48), (68), (163), (164), καταστάσεις κατά τις οποίες θεωρείται ότι το κύτταρο επιβιώνει χρησιμοποιώντας εναλλακτικούς τρόπους (cap-ανεξάρτητους) έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης προκειμένου να παράξει επιλεγμένες και σημαντικές για την επιβίωση πρωτεΐνες (49), (106). Η συσχέτιση της ποσότητας του λευκού λιπώδους ιστού με την ρύθμιση της μετάφρασης, έχει ήδη υποδειχθεί από μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν ζωικά μοντέλα με έλλειψη ρυθμιστικών παραγόντων της μετάφρασης. Πιο συγκεκριμένα, μύες με έλλειψη της πρωτεΐνης 4E-BP1 παρουσιάζουν αύξηση του μεταβολικού τους ρυθμού, μείωση του λευκού λιπώδους ιστού (WAT), καθώς και αυξημένη έκφραση της αποσυζευκτικής πρωτείνης 1 (Uncoupling protein 1) στο WAT (168). Ομοίως, η πλήρης 50

έλλειψη της κινάσης S6K1 σε ποντίκια, προάγει τη μείωση του λευκού λιπώδους ιστού τους, ακόμα και όταν τρέφονταν με δίαιτα υψηλών λιπαρών (169). Η καταστολή της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης μέσω της απενεργοποίησης του συμπλόκου έχει ήδη υποδειχθεί σε μελέτες αναστολέων του mtor. Ενδιαφέρον ωστόσο παρουσιάζει το γεγονός ότι ορισμένοι μόνο αναστολείς του mtorc1 εμφανίζουν αποδοτική καταστολή της cap-εξαρτώμενης έναρξης της μετάφρασης. Πιο συγκεκριμένα, οι Feldman et al. στα πλαίσια ελέγχου της επίδρασης ειδικών αναστολέων οι οποίοι συνδέονται στο σημείο πρόσδεσης του ATP στον mtor, γνωστοί και ως TOR kinase domain inhibitors (TORKinibs) καθώς ουσιαστικά επεμβαίνουν στο καταλυτικό κέντρο της κινάσης mtor αποτρέποντας την δέσμευση του ΑΤΡ, επί των σηματοδοτικών μονοπατιών του mtor, έδειξαν πως σε καλλιέργειες L6 μυικών κυττάρων η χορήγηση αυτών των αναστολέων και ειδικά του PP242 ανέστειλε τη φωσφορυλίωση της κινάσης S6K και του υποστρώματός της (S6) καθώς και τη φωσφορυλίωση των δύο από τις τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης του παράγοντα 4E-BP1. Επιπλέον, υπό την επίδραση του PP242 και όχι της ραπαμυκίνης παρατηρήθηκε αυξημένη πρόσδεση του 4Ε-BP1 στον εναρκτήριο παράγοντα eif4e καθώς και σημαντική μείωση της cap-εξαρτώμενης, αλλά όχι της IRES-εξαρτώμενης, μετάφρασης (38). Τα αποτελέσματα αυτά και σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι η ταυτόχρονη έλλειψη του LDLr και της τεστοστερόνης μπορεί να οδηγήσει σε αναστολή του mtorc1 στην ουσία μέσω έλλειψη ενέργειας με την μορφή του ΑΤΡ (Εικόνα 25). Εικόνα 25: Υποθετικό μοντέλο λειτουργικής αλληλεπίδρασης μεταξύ LDLr και τεστοστερόνης. 51