ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗΣ ΣΕ ΦΥΛΛΑ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ (WESTERN BLOTTING)

ΤΕΙ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗΣ ΣΕ ΦΥΛΛΑ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ (WESTERN BLOTTING) ΧΡΥΣΑ ΒΟΓΙΑΤΖΑΚΗ Δρ Κτηνίατρος Επιστημονικός Συνεργάτης ΤΕΙ Αθήνας ΑΘΗΝΑ 2013

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) i Πίνακας Περιεχοµένων Σελίδα Πίνακας Περιεχοµένων...i Γενικά...1 Αρχή της µεθόδου...2 Σκοπός της µεθόδου...5 Στάδια της µεθόδου...6 Εκτίµηση αποτελέσµατος...10 Οργανολογία Western Blotting...11 Προτεινόµενη βιβλιογραφία...14 Συνδέσεις στο Internet...16

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 1 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗΣ ΣΕ ΦΥΛΛΑ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ (WESTERN BLOTTING) Γενικά Η ανάπτυξη µεθόδων µεταφοράς των πρωτεϊνών που έχουν διαχωριστεί µε ηλεκτροφόρηση, από το πήκτωµα σε µεµβράνη καθώς και η εντόπισή τους από ανιχνευτές υψηλού µοριακού βάρους (π.χ. αντισώµατα), άνοιξε νέους ορίζοντες στην ανίχνευση των αντιγόνων. Η µέθοδος της µεταφοράς ονοµάζεται γενικά blotting (αποτύπωση), διότι το πρότυπο των ζωνών στη µεµβράνη είναι ακριβές αντίγραφο (αποτύπωµα) των µορίων που βρίσκονται στο πήκτωµα. Αρχικά η τεχνική αναπτύχθηκε το 1975 από τον Ed. Southern για την ανάλυση θραυσµάτων DNA διαχωρισµένων σε πήκτωµα αγαρόζης κατόπιν παθητικής µεταφοράς τους σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης. Η ανίχνευση των θραυσµάτων DNA είναι δυνατή µε RNA ή cdna. Η ανάλυση µορίων RNA µε µία παρόµοια τεχνική έγινε γνωστή ως αποτύπωση τύπου Northern (Northern Blotting), ενώ η µεταφορά πρωτεϊνών σε µεµβράνες ονοµάζεται αποτύπωση τύπου Western (Western Blotting). Χρησιµοποιείται όµως και ο όρος ανοσοαποτύπωση (Immunoblotting) για να περιγραφεί η µεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωµα στη νιτροκυτταρίνη και στη συνέχεια η ανίχνευσή της µε τη χρησιµοποίηση αντισωµάτων. Ο Towbin και οι συνεργάτες του (1979) µετέφεραν τις πρωτεΐνες από πήκτωµα πολυακρυλαµίδιου σε µεµβράνες νιτροκυτταρίνης µε εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου. Ακολούθησε ανοσολογική αντίδραση µε ειδικά αντισώµατα σηµασµένα µε ένζυµα (υπεροξειδάση), χρωστικές (φλουορεσκεΐνη) ή ραδιενέργεια (I 125 ).

2 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Αρχή της µεθόδου Η µέθοδος αποτύπωσης πρωτεϊνών Western βασίζεται στην ακινητοποίηση αντιγόνων σε µεµβράνες και στην ανίχνευσή τους µε τη βοήθεια σηµασµένων αντισωµάτων (µε ένζυµο, ραδιοϊσότοπο ή χρυσό). Η ακινητοποίηση των αντιγόνων γίνεται συνήθως πάνω σε φύλλα νιτροκυτταρίνης, η οποία διατηρεί τις ιδιότητες των ακινητοποιηµένων αντιγόνων. Τα αντιγόνα αφού διαχωριστούν µε ηλεκτροφόρηση (Σχήµα 1) µεταφέρονται και ακινητοποιούνται µε ηλεκτροµεταφορά από το πήκτωµα στη µεµβράνη (Σχήµα 2). Σχήµα 1: ιαχωρισµός µε ηλεκτροφόρηση. Σχήµα 2: Μεταφορά από το πήκτωµα στο φύλλο νιτροκυτταρίνης. Ακινητοποίηση των αντιγόνων.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 3 Μετά την ακινητοποίηση των αντιγόνων στη στερεή φάση ακολουθεί η ανοσολογική αντίδραση µε άµεση ή έµµεση δοκιµασία (όπως ακριβώς στην ανοσοενζυµική δοκιµασία ELISA). Η µέθοδος Western Blotting είναι µέθοδος ποιοτικού προσδιορισµού και εφαρµόζεται µόνο σε πρωτεΐνες. Επιτρέπει το χαρακτηρισµό των πρωτεϊνών ενός µίγµατος µετά από τον ηλεκτροφορητικό τους διαχωρισµό και τη µεταφορά τους επάνω σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης. Συνδυάζει την αναλυτική ικανότητα της ηλεκτροφόρησης µε την ευαισθησία και ειδικότητα των ανοσολογικών µεθόδων και έτσι αναλύονται σε µεγάλο βαθµό τα αντιγόνα ή τα αντισώµατα. Άµεση δοκιµασία Με την άµεση δοκιµασία εντοπίζονται τα αντιγόνα χρησιµοποιώντας σηµασµένο αντίσωµα.

4 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Έµµεση δοκιµασία Με την έµµεση δοκιµασία (η πλέον χρησιµοποιούµενη) ανιχνεύονται αντισώµατα. Είναι µέθοδος δύο σταδίων: 1) πρώτη επώαση του φίλτρου νιτροκυτταρίνης µε τα υπό εξέταση βιολογικά υγρά που περιέχουν ειδικά αντισώµατα (Σχήµα 3). Σχήµα 3: Πρώτη επώαση του φύλλου νιτροκυτταρίνης. 2) δεύτερη επώαση µε αντι-ανοσοσφαιρίνη σηµασµένη µε κατάλληλο ιχνηθέτη (Σχήµα 4). Σχήµα 4: εύτερη επώαση του φύλλου νιτροκυτταρίνης. Στο τέλος ανιχνεύεται η ενζυµική ενεργότητα µε κατάλληλο υπόστρωµα ή η συνδεµένη ραδιενέργεια µε αυτοραδιογραφία.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 5 Σκοπός της µεθόδου Η µέθοδος Western Blotting συγκρινόµενη µε τις κλασικές τεχνικές όπως: Ο ανοσοφθορισµός. Η ELISA. Η αιµοσυγκόλληση. Η ανοσοδιάχυση. Η αντίθετη ανοσοηλεκτροφόρηση. αν και είναι πιο πολύπλοκη και χρονοβόρα µέθοδος, η οποία αναπτύσσεται εξολοκλήρου στο εργαστήριο, αποτελεί µέθοδο αναφοράς για την επιβεβαίωση των αποτελεσµάτων των παραπάνω µεθόδων και επιτρέπει την ανίχνευση ειδικών αντισωµάτων κατά πρωτεϊνών παρασίτων.

6 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Στάδια της µεθόδου Η µέθοδος ολοκληρώνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1: ιαχωρισµός των πρωτεϊνών ενός µίγµατος µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης ή καλύτερα σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδιου (Σχήµα 5). Ο διαχωρισµός γίνεται είτε ανάλογα µε το ισοηλεκτρικό τους σηµείο (ισοηλεκτρικός εστιασµός), είτε ανάλογα µε το µοριακό τους βάρος (ηλεκτροφόρηση παρουσία του ιοντικού αντιδραστηρίου SDS). Οι διαχωρισµένες πρωτεΐνες µε ηλεκτροφόρηση SDS PAGE µεταφέρονται από το πήκτωµα του πολυακρυλαµίδιου στη µεµβράνη της νιτροκυτταρίνης µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου. Στάδιο 2: Ηλεκτροφορητική µεταφορά των πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη. Σχήµα 5: Αντιγόνο του παρασίτου L. infantum ΜΒ 78 kda, που υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδιου (SDS PAGE) (στήλες 2, 3). Στήλη 1 µοριακά βάρη αναφοράς.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 7 Το πήκτωµα τοποθετείται στη µεµβράνη νιτροκυτταρίνης. Κάτω από τη µεµβράνη και πάνω από τη νιτροκυτταρίνη τοποθετείται ειδικό χαρτί χρωµατογραφίας (σύστηµα sandwich). Σχόλια: 1. Πριν την έναρξη των χειρισµών το πήκτωµα, το φύλλο νιτροκυτταρίνης και το χαρτί χρωµατογραφίας εµποτίζονται σε διάλυµα µεταφοράς. 2. εν πρέπει να εγκλωβιστούν φυσαλίδες αέρα ανάµεσα στο πήκτωµα και τη µεµβράνη. Το σύστηµα sandwich τοποθετείται σε ειδική θήκη από Plexiglas και στη συνέχεια στη συσκευή ηλεκτροφόρησης για την πραγµατοποίηση της µεταφοράς των πρωτεϊνών στη νιτροκυτταρίνη στους 4 o C. Σχόλια: 1. Ο χρόνος µεταφοράς εξαρτάται από το πάχος του πηκτώµατος. 2. Η µεταφορά µπορεί να γίνει και µε απλή διάχυση, αλλά η εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου δίνει τα πιο ικανοποιητικά αποτελέσµατα, ιδιαίτερα στην περίπτωση πρωτεϊνών µεγάλου µοριακού βάρους. Στάδιο 3: Εντόπιση των ακινητοποιηµένων πρωτεϊνών στη νιτροκυτταρίνη µε ειδικά αντισώµατα. Τεµαχισµός της νιτροκυτταρίνης, η οποία φέρει σε ολόκληρο το πλάτος τις ίδιες πρωτεϊνικές ζώνες, σε επιµήκεις λωρίδες. Κορεσµός όλων των ελεύθερων περιοχών της νιτροκυτταρίνης που είναι ικανές να αντιδράσουν µε άλλες πρωτεΐνες. Σχόλιο: Ο κορεσµός γίνεται µε πρωτεΐνη που δεν αλληλεπιδρά µε τα υπό εξέταση αντισώµατα (άπαχο γάλα 5%, BSA 3%, ορό ζώου 5% στον οποίο παράχθηκε η αντι-ανοσοσφαιρίνη). Επώαση των λωρίδων µε τα υπό εξέταση δείγµατα (π.χ. ορό αίµατος). Τα ειδικά αντισώµατα προσδένονται στις θέσεις της νιτροκυτταρίνης, όπου βρίσκονται τα αντιγόνα (Σχήµα 4). Τρεις εκπλύσεις των λωρίδων για την αποµάκρυνση των µη προσδεµένων αντισωµάτων.

8 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Προσθήκη αντι-ανοσοσφαιρίνης συζευγµένης µε ένζυµο (ή ραδιοϊσότοπο ή χρυσό), η οποία αναγνωρίζει το σύµπλοκο αντιγόνου αντισώµατος. Τρεις εκπλύσεις των λωρίδων. Επώαση των λωρίδων µε κατάλληλο ενζυµικό υπόστρωµα. Παραγωγή έγχρωµου αδιάλυτου προϊόντος στις ζώνες όπου υπάρχουν τα ανοσοσυµπλέγµατα (Σχήµα 6). Σχήµα 6: Εφαρµογή του σταδίου της ανοσολογικής αντίδρασης στο αντιγόνο που υποβλήθηκε σε SDS PAGE αναγωγή (Σχήµα 5). Τα ειδικά αντισώµατα προσδέθηκαν στη ζώνη του ακινητοποιηµένου στη νιτροκυτταρίνη αντιγόνου και η σύνδεση ανιχνεύθηκε µε τη χρήση DAB. Ένζυµο Η υπεροξειδάση χρησιµοποιείται ευρύτατα λόγω του χαµηλού κόστους. Η αλκαλική φωσφατάση παρουσιάζει µεγαλύτερη ευαισθησία και είναι δυνατή η χρήση ειδικού υποστρώµατος µε ιδιότητες χηµειοφωταύγειας.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 9 SDS (sodium dodecyl sulfate, θειικό δωδεκυλικό νάτριο) Ιοντικό αποδιατακτικό αντιδραστήριο. Με την επίδραση του SDS οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται µερικώς και εναποτίθενται στην πεπτιδική αλυσίδα ιόντα θειικού δωδεκυλικού νατρίου (αρνητικά φορτία). Ο αριθµός των αρνητικών φορτίων που αποτίθενται είναι ανάλογος µε το µήκος της πεπτιδικής αλυσίδας. Ενζυµικό υπόστρωµα Για την υπεροξειδάση συνιστάται η χρήση των εξής υποστρωµάτων: ιαµινοβενζιδίνη (DAB). 4-χλωρο-1-ναφθόλη. Η χρώση χάνει την αρχική της ένταση, όταν η λωρίδα της νιτροκυτταρίνης στεγνώσει. Για να φωτογραφηθεί η νιτροκυτταρίνη βυθίζεται σε αποσταγµένο H 2 O, οπότε η ένταση των λωρίδων επανέρχεται. Σχόλιο: Η DAB είναι φωτοευαίσθητη και καρκινογόνος ουσία. Ο χειρισµός της απαιτεί τη χρησιµοποίηση γαντιών σε χώρο χαµηλού φωτισµού. εν πρέπει να εισπνέεται (αν απαιτείται ζύγιση της ουσίας, αυτή θα πρέπει να γίνεται µε µάσκα και σε απαγωγό).

10 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Εκτίµηση αποτελέσµατος Γίνεται δυνατή η ορατή ταυτοποίηση αντιγόνων µε βάση το µοριακό τους βάρος, τα οποία αναγνωρίζονται από τα ειδικά αντισώµατα που βρίσκονται στους εξεταζόµενους ορούς. Σχόλια: Η εκτέλεση της ανοσολογικής αντίδρασης σε µεµβράνες νιτροκυτταρίνης είναι ουσιαστικά τροποποίηση της µεθόδου ELISA. ιαφέρει µόνο το είδος της στερεής φάσης, δηλαδή η πλάκα από πολυστυρένιο αντικαθίσταται µε τη µεµβράνη νιτροκυτταρίνης. Η τεχνική εφαρµόζεται σύµφωνα µε την περιγραφή των Towbin και συν. (1979). Η ευαισθησία της µεθόδου εξαρτάται από το σύστηµα ανίχνευσης. Συζεύγµατα µε αλκαλική φωσφατάση ανιχνεύουν πρωτεΐνη από 5 pg 100 pg, συζεύγµατα µε υπεροξειδάση από 50 pg, ενώ συζεύγµατα µε χρυσό από 10 pg 100 pg. Οι επίτοποι του αντιγόνου που αναγνωρίζονται είναι γραµµικοί, επειδή κατά την ηλεκτροφορητική µεταφορά των πρωτεϊνών παρουσία SDS γίνεται µερική µετουσίωσή τους. Σήµερα κυκλοφορούν εµπορικές προτυποποιηµένες διαδικασίες (kits) ανοσοαποτύπωσης, όπου έχουν πραγµατοποιηθεί τα στάδια της ηλεκτροφόρησης των παρασιτικών αντιγόνων, της ηλεκτροµεταφοράς σε φύλλο νιτροκυτταρίνης καθώς και ο κορεσµός των µη ειδικών θέσεων σύνδεσης. Η µέθοδος συνεχίζεται από το στάδιο της ανοσολογικής αντίδρασης µε την προσθήκη των υπό εξέταση ορών.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 11 Οργανολογία Western Blotting Η οργανολογία του Western Blotting για το στάδιο της ανοσολογικής αντίδρασης περιλαµβάνει τα παρακάτω: 1) Στατώ και δείγµατα ορών προς εξέταση. 2) Πιπέττες. 3) Ρύγχη πιπεττών. 4) Φύλλα νιτροκυτταρίνης (σε λωρίδες) µε ακινητοποιηµένο αντιγόνο στη συσκευασία τους.

12 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 5) Λαβίδα συγκράτησης των λωρίδων νιτροκυτταρίνης. 6) Συσκευή για την τοποθέτηση των λωρίδων νιτροκυτταρίνης. 7) Συσκευή ανάδευσης των λωρίδων νιτροκυτταρίνης. 8) οχείο απόρριψης άχρηστων αντικειµένων που περιέχει βιολογικά υλικά.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 13 9) ιηθητικό χαρτί για την τοποθέτηση των λωρίδων νιτροκυτταρίνης και την εκτίµηση του αποτελέσµατος. 10) Κωνική φιάλη µε ρυθµιστικό διάλυµα. 11) ιάλυµα ενζυµικού υποστρώµατος. 12) Ογκοµετρικός κύλινδρος µε απιονισµένο H 2 O.

14 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Προτεινόµενη βιβλιογραφία Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002), Molecular Biology of the Cell, 4 th edition, New York and London: Garland Science. Berg J.M., Tymoczko J.L. and Stryer L. (2002), Biochemistry, New York: W. H. Freeman and Co. Brogden K.A., Guthmiller J.M., (Editors) (2002), Polymicrobial Diseases, Washington (DC): ASM Press. Del Giudice P., Marty P., Lacour J.P., Perrin C., Pratlong F., Haas H., Dellamonica P., Le Fichoux Y., Cutaneous leishmaniasis due to Leishmania infantum. Case reports and literature review, Arch Dermatol. 1998 Feb., 134(2):193-8. Jamison D.T., Breman J.G., Measham A.R., Alleyne G., Claeson M., Evans D.B., Jha P., Mills A., Musgrove P. (Editors) (2006), Disease Control Priorities in Developing Countries, 2 nd edition, Washington (DC): IBRD/The World Bank and Oxford University Press. Janeway C.A., Travers P., Walport M., Shlomchik M. (2001), Immunobiology 5 th edition, New York and London: Garland Science. Koskiniemi M., Lappalainen M., Hedman K., Toxoplasmosis needs evaluation. An overview and proposals, Am. J. Dis Child. 1989 Jun., 143(6):724-8. Schantz P.M., Improvements in the serodiagnosis of helminthic zoonoses, Vet Parasitol. 1987 Jul., 25(2):95-120. Siracusano A., Buttari B., Delunardo F., Profumo E., Margutti P., Ortona E., Rigano R., Teggi A., Critical points in the immunodiagnosis of cystic echinococcosis in humans, Parassitologia. 2004 Dec., 46(4):401-3. Southern E.M., Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, J Mol Biol. 1975 Nov 5, 98(3):503-17.

Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) 15 Towbin H., Staehelin T. and Borgon J. (1979), Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354.

16 Ανίχνευση Πρωτεϊνών Με Τη Μέθοδο Της Ανοσοαποτύπωσης Σε Φύλλα Νιτροκυτταρίνης (Western Blotting) Συνδέσεις στο Internet Western blot diagnosis of vivax malaria with multiple stage-specific antigens of the parasite. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=retrieve&db=pubmed&list_uid s=11441504&dopt=abstract Improving Diagnosis of Disease in Newborns. http://www.pamf.org/research/immunology/newborns.html Brock, Βιολογία των µικροοργανισµών: Γλωσσάριο. http://www.cup.gr/downloads/pdf/brock GLOSSARIO.pdf Πανεπιστήµιο Κρήτης, Σχολή Επιστηµών Υγείας, Τµήµα Ιατρικής In Vitro Μελέτη της Επίδρασης του TNFa στον κυτταροσκελετό σπειραµατικών επιθηλιακών κυττάρων (ποδοκυττάρων). http://dlib.libh.uoc.gr/dienst/repository/2.0/body/uch.med.phd/2002vardaki/pdf Πανεπιστήµιο Κρήτης, Σχολή Επιστηµών Υγείας, Τµήµα Ιατρικής Επιδηµιολογική έρευνα του πυρετού Q (c.burnetti) στον ζωικό και ανθρώπινο πληθυσµό της Κύπρου µε τη χρήση του συστήµατος µηχανογραφηµένης χαρτογράφησης http://dlib.libh.uoc.gr/dienst/repository/2.0/body/uch.med.phd/2001loukaides/doc