QUANTA Lite TM β 2 GPI Screening ELISA 708660 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM β 2 GPI Screening ELISA 708660 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM β 2 GPI Screen είναι μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ποιοτική ανίχνευση των αντισωμάτων IgG, IgM και IgA στη β 2 γλυκοπρωτεΐνη I (β 2 GPI) στον ανθρώπινο ορό. Τα β 2 GPI αντισώματα χρησιμοποιούνται ως βοήθημα στη διάγνωση ορισμένων αυτοάνοσων θρομβωτικών διαταραχών, όπως εκείνες που είναι δευτερεύουσες στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) ή άλλες παρόμοιες με το λύκο διαταραχές. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα έχουν συσχετιστεί άμεσα με τη φλεβική και αρτηριακή θρόμβωση. 1-5 Τα ευρήματα αυτά παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά σε μελέτες του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ), μια νόσος όπου πολλά συμπτώματα της συμπεριλαμβάνουν θρομβώσεις. 6,7 Πρόσφατες μελέτες 8-12 έχουν δείξει ότι ένας συμπαράγοντας (cofactor) 50kD απαιτείται για τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα, τα οποία παράγονται στους ασθενείς με ΣΕΛ, για να συνδεθούν στη καρδιολιπίνη. Αυτός ο συμπαράγοντας έχει οριστεί ως β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι αλλά είναι επίσης γνωστός και ως απολιποπρωτεΐνη Η. 8,12,13,14 Ενώ η β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι θεωρείται in vitro αναστολέας της ενδογενούς οδούς του μηχανισμού πήξης, 15 της ADPεξαρτώμενης συγκόλησης των αιμοπεταλίων, 16 και της δραστικότητας της προθρομβινάσης από ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, 17 ο φυσιολογικό της ρόλος δεν είναι ακόμα απόλυτα διευκρινισμένος. Είναι πλέον γνωστό ότι τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα από ασθενείς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο αναγνωρίζουν μια τροποποιημένη δομή της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι και όχι την καρδιολιπίνη, την φυσιολογική (native) β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι ή κάποιον επίτοπο που να είναι δομικά κοινός στην καρδιολιπίνη και στην β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι. 8-12 Ο Galli et al 9 και ο Viard et al 18 ανεξάρτητα μεταξύ τους ήταν οι πρώτοι που ανέφεραν ότι τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα που προέρχονται από ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα κατευθύνονται έναντι του μορίου της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι. O Koike 11 and Matsuura 12 έδειξαν πέρα από κάθε αμφιβολία ότι το μόριο της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι είναι το αντιγόνο έναντι του οποίου παράγονται και συνδέονται τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα και επιπλέον έδειξαν ότι τα φωσφολιπίδια χρησιμεύουν κυρίως ως σύνδεσμος της β 2 γλυκοπρωτεΐνη Ι στη στερεά φάση. Είναι γνωστό ότι οι κλασικές δοκιμασίες αντισωμάτων έναντι των αντικαρδιολιπινών μπορεί να αποδώσουν ψευδή θετικά αποτελέσματα εξαιτίας της διασταυρωμένης αντιδραστικότητας των φωσφολιπιδίων με ορισμένα δείγματα μολυσματικών ασθενειών, κυρίως της σύφιλης, καθώς και ορισμένα άλλα αντισώματα, όπως με το δίκλωνο DNA. 2,3 Εξαλείφοντας το φωσφολιπίδιο από την στερεά κατάσταση και χρησιμοποιώντας μόνο β 2 GPI, η δοκιμασία καθίσταται πιο ειδική για τον εντοπισμό δυνητικών αιμοπηκτικών προβλημάτων. Αυτή η βελτιωμένη ειδικότητα έχει αποδειχτεί από διάφορες ομάδες. 11,12,16,17,19,20,21,22 Η δοκιμασία αντισωμάτων β 2 GPI είναι μια χρήσιμη και ειδικότερη ανάλυση για χρήση σε συνδυασμό με την κλασική δοκιμασία αντισωμάτων έναντι των καρδιολιπινών και τη δοκιμασία για κύτταρα λύκου, με σκοπό την υποβοήθηση της διάγνωσης θρόμβωσης σε πάσχοντες που ανήκουν σε ομάδες κινδύνου. Αντισώματα έναντι β 2 GPI τάξης IgG βρέθηκαν σε 17 από 47 πάσχοντες από ΣΕΛ (36%). 18 Εννέα από αυτούς τους 47 πάσχοντες από ΣΕΛ είχαν εκδηλώσει θρόμβωση και 8 (89%) είχαν το αντίσωμα έναντι β 2 GPI Οι Hisham, et al. 20 βρήκαν τα αντισώματα έναντι β 2 GPI τάξης IgG σε άλλους 5 πάσχοντες (100%) με τουλάχιστον 2 καταγεγραμμένες κλινικές εκδηλώσεις αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου (APS). Και οι 5 πάσχοντες έχουν ταξινομηθεί ως έχοντες υψηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων έναντι β 2 GPI. Οκτώ στους 14 πάσχοντες (57%) που ταξινομήθηκαν ως έχοντες χαμηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων έναντι β 2 GPI είχαν εκδηλώσει τουλάχιστον 1 θρομβωτικό επεισόδιο. Οι Tsutsumi, et al. 22 βρήκαν αντισώματα IgG και IgM έναντι β 2 GPI σε ποσοστό 10.1% και 5.8% αντιστοίχως για 308 τυχαία επιλεγμένους πάσχοντες από ΣΕΛ Ιαπωνικής καταγωγής. Η συχνότητα εμφάνισης των αντισωμάτων IgG έναντι β 2 GPI ήταν μεγαλύτερη σε πάσχοντες με ιστορικό θρόμβωσης. Αυτή η ερευνητική ομάδα ανέφερε επίσης ότι από 15 πάσχουσες με καθ έξη αποβολές ποσοστό 20% βρέθηκε θετικό για το αντίσωμα IgG έναντι β 2 GPI. Απέδειξαν επίσης ότι οι πάσχοντες με ιστορικό θρόμβωσης παρουσίαζαν μεγαλύτερη πιθανότητα να βρεθούν θετικοί για το IgM έναντι β 2 GPI και ότι οι συγκεντρώσεις του αντισώματος ήταν υψηλότερες στην ομάδα με θρόμβωση σε σύγκριση με τις ομάδες που δεν έπασχαν από θρόμβωση. Από τις 15 πάσχουσες χωρίς ιστορικό αποβολών, καμία δεν βρέθηκε θετική σε IgM έναντι β 2 GPI. Οι Cabiedes, et al. 23 μελέτησαν 94 πάσχοντες από ΣΕΛ. Από αυτούς, 39 παρουσίασαν κλινικές εκδηλώσεις APS. Ο συσχετισμός των κλινικών εκδηλώσεων APS ήταν πιο έκδηλος με τα αντισώματα έναντι β 2 GPI σε σχέση με τη θετικότητα στη συμβατική δοκιμασία ACA (αντι-κεντρομεριδιακών αντισωμάτων). Τα αντισώματα IgG έναντι β 2 GPI βρέθηκαν στους ορούς 16 από 18 πασχόντων (89%) από APS. Από τους 22 πάσχοντες που ήταν θετικοί για ACA, αλλά χωρίς κλινικές εκδηλώσεις αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου, κανένας τους δεν ήταν θετικός σε β 2 GPI. Οι Cerrato, et al. 24 βρήκαν αντισώματα IgG anti -β 2 GPI στο 87.5% μιας ομάδας 32 πασχόντων με ιστορικό θρόμβωσης (APS). Σε ποσοστό 71.9% αυτής της ομάδας των 32 πασχόντων βρέθηκαν αντισώματα IgM antiβ 2 GPI. Οι Sebastiani, et al. 25 εντόπισαν αντισώματα IgG anti-β 2 GPI σε 110 πάσχοντες (20.3%) και IgM σε 109 πάσχοντες (20,1%) από σύνολο 542 πασχόντων από ΣΕΛ. Η παρουσία anti-β 2 GPI συσχετίστηκε στενά με το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (p < 10-5 ). Επίσης απέδειξαν ότι τα αντισώματα IgG και IgM έναντι β 2 GPI συσχετίζονταν με την αρτηριακή και την φλεβική θρόμβωση. 1

Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο αντιγόνο της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι είναι συνδεδεμένο στά πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στά πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντισώματα της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgGAM αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgGAM αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο β 2 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα β 2 ) 3. β 2 GPI Decision Point (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο β 2 GPI, προαραιωμένο, 1.2ml 4. β 2 GPI Screening Control (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο β 2 GPI, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgGAM (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgGAM, 1 φιαλίδιο χρώματος κίτρινος, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml ΠΡΟΣΟΧΗ 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 26 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 2

5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 β 2 GPI Screen ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος β 2 GPI Decision Point Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος β 2 GPI Screening Control Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgGAM (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 3

4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgGAM συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού β 2 GPI Screening Control θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού β 2 GPI Decision Point η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου β 2 GPI Screening Control θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου β 2 GPI Decision Point θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός β 2 GPI Screening Control την εγκυρότητα της διαδικασίας.ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 4

Υπολογισμός Αποτελεσμάτων 1. Υπολογίστε τη μέση τιμή σε όλες τις εις διπλούν μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων. 2. Συγκρίνετε τη μέση απορρόφηση κάθε δείγματος με αυτήν του σημείου απόφασης. Όλα τα δείγματα που είναι ίσα με ή μεγαλύτερα από αυτή την απορρόφηση στο σημείο απόφασης δυνητικά περιέχουν αντισώματα IgG, A ή M β 2 GPI ή κάποιο συνδυασμό. Συνιστάται να επαναληφθεί αυτή η εξέταση των δειγμάτων για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων συγκεντρώσεων αντισωμάτων IgG, IgM και IgA έναντι αντικαρδιολιπινών. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Τα δείγματα που βρέθηκαν θετικά με το QUANTA Lite TM β 2 GPI Screening ELISA πρέπει να εξεταστούν ξανά για ειδικά IgG, IgM ή IgA έναντι β 2 GPI και να καθοριστούν οι μονάδες SGU, SMU ή SAU. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αναμένονται ορισμένα ψευδή θετικά αποτελέσματα κατά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με το β 2 GPI Screen και τις ειδικές δοκιμές αντισωμάτων IgG, IgA και IgM έναντι αντικαρδιολιπινών. Για τη δοκιμασία ανίχνευσης έχει προβλεφθεί ένας μικρός βαθμός υπερευαισθησίας ως περιθώριο, ώστε να διασφαλιστεί ότι θα εντοπιστούν ακόμα και τα ασθενή θετικά δείγματα. Επιπλέον, ορισμένα δείγματα μπορεί να έχουν χαμηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων IgG, IgA και IgM έναντι αντικαρδιολιπινών ώστε να βρεθούν κάτω από τη θετική οριακή τιμή κάθε μεμονωμένης εξέτασης. Ωστόσο το πρόσθετο αποτέλεσμα μπορεί να έχει θετικά αποτελέσματα για την ανάλυση β 2 GPI Screen. Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η κλινική σημασία της ανίχνευσης των αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι σε άλλα νοσήματα πέραν του ΣΕΛ είναι ακόμα υπό διερεύνηση. 2. Όταν δίνεται αρνητικό αποτέλεσμα σε συνδυασμό με θετικά κλινικά στοιχεία προτείνεται η περαιτέρω διερεύνηση με επιπλέον ορολογικές εξετάσεις όπως τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα και το αντιπηκτικό του λύκου. 3. Η ανεύρεση αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι δεν μπορεί να θεωρηθεί διαγνωστικός δείκτης. Τα θετικά αποτελέσματα θα πρέπει να αξιολογούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά στοιχεία. 4. Η θεραπευτική αγωγή δεν μπορεί να βασίζεται μόνο στην ανεύρεση αντισωμάτων της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. 5. Θα πρέπει να αναμένεται ότι ορισμένα δείγματα μπορέι να είναι θετικά ως προς τα αντισώματα καρδιολιπίνης αλλά αρνητικά για τα αντισώματα έναντι της β 2 γλυκοπρωτεΐνης Ι. Η συγκεκριμένη δοκιμασία είναι πιο ειδική για θρομβωτικές καταστάσεις. Η δοκιμασία ανεύρεσης αντισωμάτων έναντι της καρδιολιπίνης μπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω διασταυρούμενων αντιδράσεων με αντισώματα dsdna ή με αντισώματα ορισμένων μολυσματικών ασθενειών. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Τιμές Ένα σύνολο 186 φυσιλογικών δειγμάτων αναλύθηκαν με το κιτ διαλογής QUANTA Lite β 2 GPI Screening ELISA. Έντεκα δείγματα ή 5,9% ήταν θετικά. Εννέα από αυτά τα 11 θετικά δείγματα βρέθηκαν θετικά για μία ή περισσότερες τάξεις (IgG, IgA, IgM) όταν εξετάστηκαν με τα ειδικά κιτ QUANTA Lite β 2 GPI. Ο πραγματικός αριθμός των ψευδών θετικών αποτελεσμάτων διαλογής σε σύγκριση με τα ειδικά κιτ IgG, IgM και IgA είναι 2 ή 1,1%. Αυτός ο φυσιολογικός πληθυσμός ήταν ηλικίας 15-69 ετών και περίπου 20% άνδρες και 80% γυναίκες. Σχέση Eυαισθησίας και Ειδικότητας Συμφωνία των αποτελεσμάτων δοκιμασίας διαλογής με τα ειδικά αποτελέσματα IgG, IgA και IgM Όλα τα δείγματα από τις κλινικές μελέτες αναλύθηκαν με τα ειδικά κιτ IgG, IgM και IgA β 2 GPI καθώς και με το κιτ δοκιμασίας διαλογής. Τα αποτελέσματα παρατείθονται στον παρακάτω πίνακα. β 2 GPI Screen Αποτελέσματα + - + 110 1 Σχετική Ευαισθησία 99.1% IgG, IgA ή IgM Σχετική Ειδικότητα 98.1% β 2 GPI Αποτελέσματα - 4 205 Σχετική Δράση 98.5% Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Ο παρακάτω πίνακας συνοψίζει τις διάφορες κλινικές μελέτες που διενεργήθηκαν με τη δοκιμασία διαλογής QUANTA Lite β 2 GPI Screening ELISA. Ομαδα ΑσθενΩων Αριθμος Δειγμάτων Αριθμος Θετικός Ποσοστό (%) Aντιφοσφολιπιδικό σύνδρομο 42 37 (88.1) Μολυσματικο 6 0 (0.0) ΣΕΛ 1 1* (100.0) Φυσιολογικοί 186 11** (5.9) *Αυτό το δείγμα ήταν θετικό για τις τάξεις IgG και IgA αντισωμάτων β 2 GPI **Εννέα από αυτά τα 11 δείγματα βρέθηκαν θετικά για ένα ή περισσότερα αντισώματα IgG, IgA ή IgM β 2 GPI. 5

Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα ακριβείας και αναπαραγωγικότητας μετρήθηκαν με την εξέταση αρνητικού δείγματος, του σημείου απόφασης (Decision Point) και ορού ελέγχου διαλογής (Screening Control) με έξι ξεχωριστές αναλύσεις σε έξι συνεχείς ημέρες. Η μέση τιμή του αρνητικού δείγματος ήταν 0,098, του σημείου απόφασης ήταν 0,530 και του ορού ελέγχου διαλογής ήταν 1,47. Τα αποτελέσματα ανάμεσα στις εξετάσεις και κατά τη διάρκεια της εξέτασης παρουσιάζονται στον πίνακα παρακάτω. Οι υπολογισμοί βασίστηκαν στην οπτική πυκνότητα (OD). Αρνητικό Decision Point Screening Control SD CV SD CV SD CV Ολικό 0.009 9.5% 0.068 12.7% 0.164 11.2% Εντός μετρήσεων 0.008 8.2% 0.012 2.3% 0.034 2.3% Μεταξύ μετρήσεων 0.009 9.3% 0.020 3.8% 0.025 1.7% Βιβλιογραφία 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: 1211-1214, 1983. 2. Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S. Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: 193-199, 1984. 3. Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: 1081-1087, 1986. 4. Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: 152-156, 1985. 5. McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: 193-280, 1991. 6. Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: 591-609, 1985. 7. Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: 486-489, 1986. 8. McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 - glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4120-4124, 1990. 9. Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: 1544-1547, 1990. 10. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: 177-178, 1990. 11. Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: 671-672, 1991. 12. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fugimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: 3885-3891, 1992. 13. Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 - GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: 1217-1221, 1991. 14. Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: 1086-1091, 1985. 16. Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: 109-114, 1987. 17. Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: 142-149, 1986. 18. Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: 181-186, 1992. 19. Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: 305-313, 1995. 20. Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: 2233-2237, 1995. 6

21. Roubey, R.A. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: 1444-1454, 1996. 22. Tsutsumi, A. et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: 1466-1474, 1996. 23. Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, 1995. 24. Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, 1996. 25. Sebastiani, G.D. et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, 1996. 26. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628660GRC August 2009 Revision 5 7