ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ 1-(3-ΔΕΟΞΥ-3-ΦΘΟΡΟ-5-5-ΑΚΕΤΥΛΟ-5- ΘΕΙΟ-β-Ο-ΞΥΛΟΦΟΥΡΑΝΟΖΥΛΟ) ΝΟΥΚΛΕΟΣΙΔΙΟΥ ΘΥΜΙΝΗΣ ΜΕ ΠΙΘΑΝΗ ΑΝΤΙ-ΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ 1-(3-ΔΕΟΞΥ-3-ΦΘΟΡΟ-5-5-ΑΚΕΤΥΛΟ-5- ΘΕΙΟ-β-Ο-ΞΥΛΟΦΟΥΡΑΝΟΖΥΛΟ) ΝΟΥΚΛΕΟΣΙΔΙΟΥ ΘΥΜΙΝΗΣ ΜΕ ΠΙΘΑΝΗ ΑΝΤΙ-ΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΣΟΥΚΑΛΑ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΛΑΡΙΣΑ 2006

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ 1-(3-ΔΕΟΞΥ-3-ΦΘΟΡΟ-5-Δ-ΑΚΕΤΥΑΟ-5- ΘΕΙΟ-β-ϋ-ΞΥΛΟΦΟΥΡΑΝΟΖΥΑΟ) ΝΟΥΚΛΕΟΣΙΔΙΟΥ ΘΥΜΙΝΗΣ ΜΕ ΠΙΘΑΝΗ ΑΝΤΙ-ΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ο OAc ΤΣΟΥΚΑΛΑ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΛΑΡΙΣΑ 2006

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ 1-(3-ΔΕΟΞΥ-3-ΦΘΟΡΟ-5-Δ-ΑΚΕΤΥΑΟ-5- ΘΕΙΟ-β-ϋ-ΞΥΛΟΦΟΥΡΑΝΟΖΥΛΟ) ΝΟΥΚΑΕΟΣΙΔΙΟΥ ΘΥΜΙΝΗΣ ΜΕ ΠΙΘΑΝΗ ΑΝΤΙ-ΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ο OAc ΤΣΟΥΚΑΛΑ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΛΑΡΙΣΑ 2006 2

Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ & ΠΛΗΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Ειλικη Συλλογή «Γκρίζα Βιβλιογραφία» Αριθ. Εισ.: Ημερ. Εισ.: Δωρεά: Ταξιθετικός Κωδικός: 4842/1 12/09/2006 Π.Θ. ΠΤ- ΒΒ 2006 ΤΣΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ 004000087770

Στους γονείς μου, (Βασίλη icai Μαρία 3

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Κομιώτης Δημήτρης - Επίκουρος Καθηγητής Οργανικής Χημείας του Τμήματος Βιοχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Αγγελής Γιώργος - Διδάσκων ΠΔ 407 του Τμήματος Βιοχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Κοντού Μαρία - Λέκτορας του Τμήματος Βιοχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Τμήματος Βιοχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή Οργανικής Χημείας κ. Κομιώτη Δημήτρη. Αισθάνομαι υποχρεωμένη να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στον κ. Κομιώτη που μου έδειξε εμπιστοσύνη προσφέροντάς μου τη δυνατότητα να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο θέμα. Η επιστημονική και συνάμα εύστοχη κριτική του, οι πολύτιμες συμβουλές του, η υπομονή του, η ενθάρρυνση και η καθοδήγησή του συνέβαλαν στη σωστή διεκπεραίωση των πειραματικών διαδικασιών αλλά και στη διαμόρφωση των σκέψεών μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον διδάσκων Π.Δ. 407 Αγγελή Γιώργο καθώς και την Υποψήφια Διδάκτωρ Μαντά Στέλλα για την άψογη συνεργασία, την ηθική υποστήριξη καθώς και τη φιλία με την οποία με περιέβαλαν. Ωφελήθηκα αρκετά από τις χρήσιμες συμβουλές και τη σωστή καθοδήγησή τους κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της εργασίας. Τέλος, να ευχαριστήσω και όλους όσους συνέβαλαν άμεσα ή έμμεσα στην διεκπεραίωση της εργασίας αυτής. 4

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ον υδατάνθρακες αποτελούν μια από τις τέσσερις κύριες κατηγορίες βιομορίων και απαντούν σε κάθε ζωντανό οργανισμό. Οι υδατάνθρακες είναι αλδεϋδικές ή και κετονικές ενώσεις με πολλαπλές υδροξυλικές ομάδες. Αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό της οργανικής ύλης επάνω στη γη λόγω των πολλαπλών ρόλων τους σε κάθε μορφή ζωής. Τροποποιημένοι υδατάνθρακες απαντούν στα μόρια του DNA που μεταφέρουν γενετικές πληροφορίες, άλλοι συνιστούν μέρος του περιβλήματος των κυττάρων, ενώ άλλοι χρησιμοποιούνται ως φάρμακα. Τα τροποποιημένα νουκλεοσίδια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιική και αντικαρκινική χημειοθεραπεία. Έχει διαπιστωθεί ότι πολλά φυσικά αντιβιοτικά με σημαντική αντιική και αντικαρκινική δράση περιέχουν στη δομή τους νουκλεοσίδια συνδεδεμένα με ολιγοσακχαρίτες. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον δόθηκε στη μελέτη φθορο-θειονουκλεοσιδίων προκειμένου να βρεθούν νέα αντικαρκινικά, αντιικά, ή αντί-hiv φάρμακα με μεγαλύτερη εκλεκτικότητα και λιγότερα ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα έναντι των έως τώρα χρησιμοποιούμενων ενώσεων. Η προσθήκη φθορίου καθώς και του θείου στο μόριο του σακχάρου αποδείχθηκε να είναι μια καλή μέθοδος ενίσχυσης της βιολογικής δράσης. 5

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 Εισαγωγή... 7 1.1 Υδατάνθρακες... 7 1.2 Νουκλεοσίδια... 9 1.3 Τρόπος δράσης νουκλεοσιδίων... 10 1.4 Νουκλεοσιδικά ανάλογα... 13 1.4.1 Zidovudine ή azidothymidine... 13 1.4.2. DDI didanosine...15 1.4.3 DDC zalcitabine...15 1.4.4. Τριφθοριοθυμιδίνη...16 1.5 Φθορονουκλεοσίδια...16 1.6 Θειονουκλεοσίδια...17 2 Ειδικό μέρος / Σκοπός - Στόχος... 19 3 Σύνθεση φθορο-θειονουκλεοσιδίων... 23 3.1 Γενικές μέθοδοι... 23 3.1.1 Χρωματογραφία χάρτου... 23 3.1.2 Χρωματογραφία στήλης... 23 3.1.3 Ξήρανση διαλυτών... 23 3.1.4 Ταυτοποίηση ενώσεων... 23 4 Πειραματική διαδικασία... 24 4.1 Σύνθεση 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-a-D-xylofuranose...24 4.2 Σύνθεση 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-5-O-tosyl-a-D-xylofuranose..25 4.3 Σύνθεση 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-5-0,-acetyl-5-deoxy-a-Dxylofuranose...25 4.4 Σύνθεση 3-deoxy-3-fluoro-l,2-Di-0-acetyl-5-,S'-acetyl-5-deoxy-D-xylofuranose..26 4.5 Σύνθεση l-(3-deoxy-3-fluoro-5- -acetyl-5-thio- β-d- xylofuranosyl) thymine....27 5 Ταυτοποίηση με NMR...28 6 Ταυτοποίηση με IR... 29 7 Αποτελέσματα - Συζήτηση... 30 8 Βιβλιογραφία...32 6

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Υδατάνθρακες Οι υδατάνθρακες είναι αλδεϋδικές ή κετονικές ενώσεις με πολλαπλές υδροξυλικές ομάδες. Τα σάκχαρα με πέντε άτομα άνθρακα καλούνται πεντόζες. Οι ανοικτές αλυσίδες των ενώσεων αυτών κυκλοποιούνται σε δακτυλίους. Γενικά, μια καρβονυλική ένωση αντιδρά με μια αλκοόλη για να σχηματίσει μια ημιακετάλη (εικόνα 1). Η πρωτονίωση του καρβονυλικού οξυγόνου πολώνει έντονα το καρβονύλιο και... Μ *... -"'Vv...Ενεργοποιεί την καρβονυλική ομάδα για πυρηνόφιλη προσβολή από το μονήρες ζεύγος ηλεκτρονίων του οξυγόνου της αλκοόλης Απόσπαση ενός πρωτονίου οδηγεί σε ένα τετραεδρικό ενδιάμεσο, μια ουδέτερη ημιακετάλη Εικόνα 1. Μηχανισμός σχηματισμού ημιακετάλης 0) 7

Στη φρουκτόζη για παράδειγμα, η κετονική ομάδα στον C-2 του τύπου της ανοικτής αλυσίδας είναι σε θέση να αντιδράσει με την υδροξυλική ομάδα του C-5 για να σχηματιστεί μια ενδομοριακή ημιακετάλη. Ο πενταμελής δακτύλιος του σακχάρου καλείται φουρανόζη, λόγω της ομοιότητας του με το φουράνιο (εικόνα 2). Εικόνα 2. Φουράνιο (9> Κατά την κυκλοποίηση της φρουκτόζης δημιουργείται ένα πρόσθετο ασύμμετρο κέντρο. Ο άνθρακας C-2 μετατρέπεται σε ένα ασύμμετρο κέντρο στο δακτύλιο. Μπορεί να προκύψουν δύο δομές. Η et-d-φρουκτοφουρανόζη και η /λϋ-φρουκτοφουρανόζη. Ο χαρακτηρισμός α σημαίνει ότι το υδροξύλιο που συνδέεται στον C-2 βρίσκεται κάτω από το επίπεδο του δακτυλίου, ενώ β σημαίνει ότι βρίσκεται πάνω από το επίπεδο του δακτυλίου. Ο άνθρακας C-2 καλείται ανωμερής και έτσι οι μορφές α και β καλούνται ανωμερείς. Ο πενταμελής δακτύλιος της φουρανόζης δεν είναι επίπεδος. Οι δακτύλιοι φουρανόζης μπορούν να είναι πτυχωμένοι έτσι ώστε τα τέσσερα άτομα να είναι στο ίδιο επίπεδο και το πέμπτο εκτός του επιπέδου αυτού (εικόνα 3). Εικόνα 3. Μορφή φακέλου της β-ο-ριβόζης <9> Αυτή η διαμόρφωση καλείται μορφή φακέλου γιατί η δομή αυτή μοιάζει με ανοιχτό φάκελο με το πίσω μέρος ανασηκωμένο. Οι δακτύλιοι της φουρανόζης είναι σε θέση να αλληλομετατρέπονται ταχύτατα σε διαφορετικές στερεοδιατάξεις και είναι αρκετά ευέλικτοι, γεγονός που εξηγεί την επιλογή όπως ως συστατικών του RNA και DNA. (9,0)

1.2 Νουκλεοσίδια Την περίοδο αυτή, οι έρευνες εστιάζονται κυρίως στο σχεδίασμά, τη σύνθεση και την αξιολόγηση μικρών μορίων ως πιθανούς αντικαρκινικούς, αντιβακτηριακούς και αντιικούς παράγοντες και έδειξαν ότι τα σημαντικότερα αντιικά φάρμακα είναι τα νουκλεοσίδια και τα ανάλογα νουκλεοσιδίων.(3) Πολλά φυσικά αντιβιοτικά με σημαντική αντιική και αντικαρκινική δράση περιέχουν στη δομή τους νουκλεοσίδια συνδεδεμένα με ολιγοσακχαρίτες. Τα σάκχαρα ενώνονται με τις αμίνες με γλυκοσιδικούς δεσμούς. Ο ανωμερής άνθρακας του σακχάρου είναι σε θέση να ενωθεί με το άζωτο μιας αμίνης με ένα Ν- γλυκοσιδικό δεσμό. Το νουκλεοσίδιο, αποτελείται από μία βάση πουρίνης ή πυριμιδίνης ενωμένη στη θέση Γ μιας πεντόζης με /λν-γλυκοσιδικό δεσμό. (2> Ο αποφασιστικής σημασίας παρόμοιος τρόπος γλυκοσιδικής σύνδεσης είναι προφανής σε πολλά βασικά μακρομόρια, όπως νουκλεοτίδια, RNA και DNA. Οι Ν-γλυκοσιδικοί δεσμοί σε όλα τα φυσικά μακρομόρια έχουν στερεοδιάταξη β(9> (εικόνα 4). Εικόνα 4. Αδενοσίνη (9> 9

1.3 Τρόπος δράσης νουκλεοσιδίων Η σύνθεση των νουκλεοσιδίων συνήθως πραγματοποιείται ενδοκυτταρικά. Μπορούν επίσης να εισέλθουν στα κύτταρα με παθητική διάχυση. Αυτό επιτρέπει στα ανάλογα νουκλεοσιδίων με αντιική ή και αντικαρκινική δράση να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία πολλών ασθενειών.(4> Προκειμένου να προκαλέσει κάποια δράση το φάρμακο πρέπει πρώτα να αλληλεπιδράσει με ένα μοριακό στόχο. Ο στόχος για τα περισσότερα φάρμακα είναι μία πρωτεΐνη, ή τα νουκλεϊκά οξέα.(1) Οι πιο κοινοί τύποι πρωτεϊνών με τους οποίους αλληλεπιδρούν τα φάρμακα είναι οι υποδοχείς, οι δίαυλοι ιόντων, τα ένζυμα και τα μόρια μεταφορείς. Τα νουκλεοσιδικά ανάλογα αποτελούν μικρά μόρια που αποτελούν σύνθετες ενώσεις, χημικά τροποποιημένες εκδόσεις των φυσικών νουκλεοσιδίων και που στοχεύουν αποτελεσματικά τις ιικές πολυμεράσες. Οι ιικές πολυμεράσες, συχνά είναι ειδικά διαμορφωμένες έτσι ώστε να αποτελούν στόχο για έναν ειδικό αντιικό παράγοντα. Η συγκεκριμένη μέθοδος ενίσχυσε την παραγωγή των ειδικών αντιικών φαρμάκων. (5'6'7) Τα φυσικά νουκλεοσίδια τροποποιούνται στα κύτταρα για να παραγάγουν τα νουκλεοτίδια, τα οποία χρησιμοποιούνται από τις πολυμεράσες ως βασικές δομικές μονάδες γενετικού υλικού DNA και RNA. Μιμούμενα το ρόλο των φυσικών νουκλεοσιδίων, τα αντιικά φάρμακα νουκλεοσιδίων, γενικά ενσωματώνονται στην αντιγραφή των ιικών γονιδιωμάτων από τις ιικές πολυμεράσες. Αυτό το γεγονός εξασθενίζει τη σύνθεση ή τη λειτουργία του ιικού γονιδιώματος που προκύπτει και επομένως καταστέλλει την αντιγραφή του ιού. (6) Τα ανάλογα νουκλεοσιδίων στην πραγματικότητα είναι προφάρμακα, δεδομένου ότι πρέπει να φωσφορυλιωθούν στην 5 - θέση του υδατάνθρακα από τις κυτταρικές κινάσες για να μπορέσουν να δράσουν κι αυτό είναι το εισαγωγικά κλειδί στην επιλεκτικότητά τους.(8) Η φωσφορυλίωση των ανάλογων νουκλεοσιδίων στο κύτταρο, τα ενεργοποιεί και ανταγωνίζονται με τα φυσικά νουκλεοτίδια για τη σύνθεση νουκλεϊνικών οξέων. Επειδή η αντιγραφή των νουκλεϊνικών οξέων είναι κοινή για όλες τις μορφές ιών, τα ανάλογα νουκλεοσιδίων ενδεχομένως έχουν ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών στην αντιική θεραπεία. Επειδή οι φωσφορυλιωμένες ενώσεις ιονίζονται συνήθως στο σώμα λόγω του διαφορετικού ph στα διάφορα διαμερίσματα, δεν μεταφέρονται εύκολα μέσω των 10

κυτταρικών μεμβρανών. Οι ενεργές μορφές των νουκλεοτιδίων αποτελούν τριφωσφορικά άλατα, με όλες τις αντικαταστάσεις φωσφορικών στην 5 - θέση από ειδικές ιικές-κινάσες που συχνά καταλύουν την πρώτη 5 - φωσφορυλίωση των ανάλογων νουκλεοσιδίων, με την επόμενη φωσφορυλίωση από τις κυτταρικές κινάσες. Αυτό μπορεί να οδηγήσει στη συσσώρευση των ανάλογων φωσφορυλιωμένων νουκλεοτιδίων κυρίως στα κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιό. Τα τμήματα των νουκλεϊνικών οξέων διαμορφώνονται από τις κυτταρικές πολυμεράσες, οι οποίες συνδέουν το 5 - νουκλεοτίδιο στην ομάδα 3 -υδροξυλίου ενός άλλου νουκλεοτιδίου. Στα αυτή τη διαδικασία, απελευθερώνεται πυροφωσφορική ομάδα (ΡΡϊ), και οι δύο ζάχαρες συνδέονται με φωσφοδιεστερική γέφυρα. (9 Ι0 η) Το σάκχαρο, είναι η μερίδα του νουκλεοσιδίου που χρησιμεύει ως υπόστρωμα για τις κινάσες και τις πολυμεράσες που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων και την επιμήκυνση των αλυσίδων. Εάν ένα ανάλογα νουκλεοτιδίων δεν έχει μία ομάδα 3 - υδροξυλίου, δεν μπορεί να ενωθεί με την 5 - φωσφορική ομάδα του επόμενου νουκλεοτιδίου, κι αυτό παρεμποδίζει αποτελεσματικά την επιμήκυνση της αλυσίδας (εικόνα 13). Εικόνα 5. Τερματισμός αλυσίδας Τα ανάλογα νουκλεοσιδίων αναμένονται να είναι αποτελεσματικά ενάντια στις περισσότερες εάν όχι σε όλες τις μορφές ιών.(,0) Η ειδικότητά τους έγκειται στο ότι ο ιός μπορεί με το ένζυμο του να ενεργοποιήσει τη δράση του φαρμάκου ή/ και στο ότι οι ιικές πολυμεράσες μπορεί να είναι πολύ πιο ευαίσθητες στη δράση του φαρμάκου από ότι στα αντίστοιχα ένζυμα του κυττάρου ξενιστή. <Ι2)

Επιπλέον, το ένζυμο του ιού δεν αποτελεί ειδική σύνδεση με το υπάρχον υπόστρωμα, σε αντίθεση με το ένζυμο του κυττάρου ξενιστή. Αυτό σημαίνει ότι το ένζυμο του ιού μπορεί να δρα και σε φάρμακα ανάλογων νουκλεοσιδίων (διαφορετικό υπόστρωμα) και να τα φωσφορυλιώνει, ενώ το κύτταρο ξενιστή θα τα αφήνει ανεπηρέαστα εφόσον δεν είναι εφικτή η σύνδεση ενζύμου - υποστρώματος.(ι2,13) Οι ιοί μπορούν να αντιμετωπιστούν εκλεκτικά με φάρμακα νουκλεοσιδίων και ανάλογων νουκλεοσιδίων και η εκλεκτική αναστολή τους, γίνεται (α) με την αναστολή ειδικών σταδίων της πορείας αναπαραγωγής του ιού, όπως η προσκόλληση του ιού σε κάποιον κυτταρικό υποδοχέα, η διείσδυση του στο κύτταρο, η αποβολή του περιβλήματος και η απελευθέρωση και (β) με την κατά προτίμηση αναστολή κάποιων σταδίων τα οποία είναι κοινά με το κύτταρο του ξενιστή και περιλαμβάνουν τη μεταγραφή και τη μετάφραση. (1> Τα νουκλεοσίδια μπορούν να ενεργήσουν με διαφορετικούς μηχανισμούς: μπορούν να αναστείλουν τη δράση των βασικών ενζύμων στο μεταβολισμό των νουκλεϊνικών οξέων ή και μπορούν να ενσωματωθούν στα πρόσφατα συντεθειμένα νουκλεϊνικά οξέα προκαλώντας τον τερματισμό των αλυσίδων ή την παραγωγή μη λειτουργικών βιομορίων. Το πιο κοινό αποτέλεσμα των ενεργειών αυτών είναι ο κυτταρικός θάνατος, ο οποίος μπορεί να είναι επιθυμητός όσον αφορά τη θεραπεία του καρκίνου και των αυτοάνοσων ασθενειών. Επιπλέον, οι ενώσεις που μπορούν να στοχεύσουν επιλεκτικά στα βακτηριακά ή στα προερχόμενα από ιό ένζυμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιβακτηριακοί ή αντιικοί παράγοντες.(1) 12

1.4 Νουκλεοσιδικά ανάλογα Οι έρευνες που έγιναν μέχρι σήμερα στη δημιουργία φαρμάκων με αντιική και αντικαρκινική δράση, αφορούσαν τη χρήση ανάλογων νουκλεοσιδίων που είχαν για σάκχαρο μία πεντόζη. Ακολούθως, παρατίθενται μερικά από τα αντιικά φάρμακα που συντέθηκαν και των οποίων έχει μελετηθεί η δράση. 1.4.1 Zidovudine ή azidothymidine (ΑΖΤ : 3' -Azido-2 -deoxythymidine) To Zidovudine (εικόνα 5) αποτελεί ένα στοματικό και ενέσιμο φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των μολύνσεων με τον ιό της ανθρώπινης επίκτητης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1). Πρωτοσυντέθηκε από τον Jerome Horowitz το 1964. ανήκει σε μία κατηγορία φαρμάκων που αποκαλείται αντίστροφοι ανασταλτικοί παράγοντες της τρανσκριπτάσης, που περιλαμβάνει επίσης τα zalcitabine (Hivid), stavudine (Zerit), didanosine (Videx), και lamivudine (Epivir).(!4) Ο Η2Νχ Εικόνα 6. ΑΖΤ, 3' -Azido-2'-deoxythymidine <14> Η αντίστροφη τρανσκριπτάση, είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί ο ιός για να συνθέσει το νέο DNA. To Zidovudine εμποδίζει τη δράση της αντίστροφης τρανσκριπτάσης, την παραγωγή του DNA και κατά συνέπεια και των νέων ιών. Τα κυτταρικά ένζυμα μετατρέπουν το Zidovudine στην ενεργή του μορφή, 5'- τριφωσφορικού άλατος (εικόνα 6). 13

Εικόνα 7. Στη θυμιδίνη προστίθενται τρία φωσφορικά οξέα. Το ένα προστίθεται από το ιικό ένζυμο και τα υπόλοιπα δύο από τα κυτταρικά ένζυμα.<15) Ο τερματισμός της αλυσίδας του DNA, είναι αποτέλεσμα της απουσίας της ομάδας του 3'-υδροξυλίου στο Zidovudine, το οποίο καθιστά αδύνατη τη σύνδεση άλλων νουκλεοτιδίων. Μελέτες έδειξαν ότι ο τερματισμός των αλυσίδων αποτελεί τον παράγοντα της ανασταλτικής επίδρασης (Ι5,Ι6) (εικόνα 7). 5' 3' 5 Εικόνα 8. Ανάλογα νουκλεοσιδίων στο τερματισμό αλυσίδων η6) 1 Λ

1.4.2 DDI ή didanosine Ο Εικόνα 9. DDI m To DDI (εικόνα 9) αποτελεί ένα νουκλεοσιδικό ανάλογο με αντιική δράση, αναστέλλοντας την αντιγραφή των ρετροιών όπως του HIV, παρεμποδίζοντας τη δράση του ενζύμου της αντίστροφης τρανσκριπτάσης.(ι8> 1.4.3 DDC zalcitabine To DDC ή διδεοξυκυτιδίνη (εικόνα 10) έχει παρόμοια δράση με το ΑΖΤ και αποτελεί νουκλεοσιδικό ανάλογο που δρα ενάντια στον HTV. (Ι9) Εικόνα 10. DDC <19) 15

1.4.4 Τριφθοριοθυμιδίνη Ο OH Εικόνα 11. Τριφθοριοθυμιδίνη <19> Η τριφθοριοθυμιδίνη (εικόνα 11) ενσωματώνεται στο ιικό και το κυτταρικό DNA, σχηματίζοντας ένα παραποιημένο DNA. Η τριφθοριοθυμιδίνη, είναι ένα φθοριωμένο ανάλογο θυμιδίνης. Ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση από κυτταρικά ένζυμα, σχηματίζοντας ένα τριφωσφορυλιωμένο παράγωγο. Το ενεργοποιημένο παράγωγο αναστέλλει τον ιό απλού έρπητα (HSV : Herpes Simplex Vims). Προκαλεί αναστολή της θυμιδιλικής συνθετάσης και της ιικής (και κυτταρικής) DNA πολυμεράσης και ενσωματώνεται στο DNA του ιού και του κυττάρου, προκαλώντας διαταραχή στη δομή του DNA. Προκλινικές μελάτες δείχνουν πως είναι μεταλλαξιογόνος και τερατογόνος/79/1 Στην αναζήτηση νέων και αποτελεσματικών φαρμάκων στην κατηγορία των νουκλεοσιδίων, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει αποτελέσει η σύνθεση και η αξιολόγηση της βιολογικής δράσης των φθορο- και θειο- νουκλεοσιδίων, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στην βιοχημεία, την ιατρική χημεία και τη φαρμακολογία. 1.5 Φθορονουκλεοσίδια Τα φθοριωμένα νουκλεοσίδια υιοθετούνται ως πειραματικοί αντιικοί και αντιογκογονικοί παράγοντες/20'1 Η ικανότητα αντικατάστασης του υδρογόνου με το φθόριο αλλάζει ελάχιστα τη λειτουργία του νουκλεοσιδίου, παράλληλα προσδίδει σταθερότητα στο μόριο, αυξάνει την ηλεκτραρνητικότητα του, το λιπόφιλο χαρακτήρα του και κατά συνέπεια την αποτελεσματικότητά του ως φάρμακο. 16

Πρόσφατα, φθοριωμένα νουκλεοσίδια βρέθηκαν να είναι αποτελεσματικά όχι μόνο σε περιπτώσεις λευχαιμίας αλλά και καρκινωμάτων, όπως το καρκίνωμα του κόλον καθώς και του ήπατος. Έρευνες έδειξαν ότι το 1-(2-όεοξυ-2-φθορο-/?-ϋ-αραβινοφουρανοζυλο) νουκλεοσίδιο της κυτοσίνης (FAC) (εικόνα 12) έχει ανασταλτικά αποτελέσματα σε μία σειρά κυττάρων με λευχαιμία καθώς και σε μία σειρά κυττάρων καρκινώματος του κόλον.(24) Εικόνα 12. 1-(2-δεοξυ-2-φθορο-/?-0~αραβινοφουρανοζυλ)κυτοσίνη, YAC(24> Επιπλέον, τα 2-φθορο-5-ιοδο-αραβινοσυλο νουκλεοσίδια της κυτοσίνης και της ουρακίλης έχουν χαρακτηριστεί για την αντιική τους δράση έναντι του κυτταρομεγαλοϊού που προσβάλλει τον άνθρωπο (HCMV: Human cytomegalovirus) και του απλού ιού του έρπητα (HSV: Herpes Simplex Virus)/25'1 1.6 Θειονουκλεοσίδια Τα θειο-σάκχαρα, 5-θειο-πυρανόζες και οι 4-θειο-φουρανόζες, έχουνε ενδιαφέρουσες χημικές και βιολογικές ιδιότητες. Το πρώτο παράδειγμα ενός φυσικού θειο-σακχάρου ταυτοποιήθηκε το 1984 ως μέρος του αντιβιοτικού albomycin. Το 1987, η 5-θειομαννόζη, απομονώθηκε από τα θαλάσσια σφουγγάρια Clathria pyramida και το 1 -δέοξυ παράγωγό της είναι ένας ανταγωνιστικός ανασταλτικός παράγοντας της ζύμης a-dγλυκοσιδάσης. Πρόσφατα το Salacinol και Kotalanol τα οποία απομονώθηκαν από το βότανο Salacia reticulata, αποδείχθηκε ότι είναι ισχυροί ανασταλτικοί παράγοντες των εντερικών α-γλυκοσιδασών. Όπως τα θειο-σάκχαρα έτσι και τα θειονουκλεοσίδια παρουσιάζουν ενδιαφέρουσες αντιβιοτικές, αντιικές και αντινεοπλασματικές ιδιότητες. Για παράδειγμα, τα νουκλεοσίδια D και Ε-2-δέοξυ-4-θειοπυριμιδίνη παρουσιάζουν αντικαρκινικές ιδιότητες. Σήμερα, ένα 4-θειονουκλεοσίδιο, η 3TC ([Lamivudine) είναι ένα αντί-hiv φάρμακο όταν 17

χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με το 3' -azido-2',3 -dideoxythymidim (ΑΖΤ) και ανασταλτικός παράγοντας του ενζύμου της αντίστροφης τρανσκριπτάσης, με την ίδια δράση όπως και το ΑΖΤ. Επειδή η 3TC έχει την L-διαμόρφωση της πεντοφουρανόζης, ποικίλα ανάλογα πεντοφουρανόζης έχουν συντεθεί και εξεταστεί για αντιικές και άλλες βιολογικές ιδιότητες. ΝΗ2 γ^ν Εικόνα 13. 3TC, 2-3,-dideoxy-3'-thiac\tidinc Προηγούμενες έρευνες έδειξαν ότι ανάμεσα σε ποικίλα 5 -αλκυλοθειονουκλεοσίδια, η 5 - αιθυλοθειο-5 -δεοξυθυμιδίνη είναι ένας μη ανταγωνιστικός αναστολέας της κυτταροπλασματικής κινάσης της θυμιδίνης (C-TK), του απαραίτητου προάγγελου στις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ενδιαφέρουσα όμως είναι και η δράση του αναλόγου αυτού σε L1210 κύτταρα λευχαιμίας/2) Ο ΟΗ Εικόνα 14. 5 - αιθυλο0ειο-5'-όεοξυθυμιδί\τ/2^ 18

2.EIAIKO ΜΕΡΟΣ Στόχος-σκοπός μελέτης Τα αντιβακτηριακά, αντιικά και αντιογκογονικά φάρμακα περιλαμβάνονται μεταξύ των πιο σημαντικών θεραπευτικών ανακαλύψεων του εικοστού αιώνα και έχουν αλλάξει δραστικά τη θεραπευτική αγωγή πολλών ασθενειών, μειώνοντας τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η σύνθεση και η μελέτη τροποποιημένων νουκλεοσιδίων και συγκεκριμένα φθοροθειονουκλεοσιδίων για την εύρεση νέων αντικαρκινικών, αντιικών φαρμάκων με μεγαλύτερη εκλεκτικότητα και λιγότερα ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα από τα μέχρι τώρα κλινικά χρησιμοποιούμενα. Έρευνες των τελευταίων ετών έδειξαν ότι: S Η εισαγωγή ενός ατόμου φθορίου στο σάκχαρο των νουκλεοσιδίων μεταβάλλει με διάφορους τρόπους τη βιολογική δραστικότητα των διαφόρων κυττάρων και ενζύμων, συμπεριλαμβανομένου των κινασών, DNA πολυμερασών, ριβονουκλεοτιδίων, αναγωγασών/22^ Η αντικατάσταση του υδρογόνου με φθόριο έχει ερευνηθεί εκτενώς στη βιοχημεία φαρμάκων και έχει διαπιστωθεί ότι ενισχύει τη βιολογική δραστικότητα και αυξάνει την χημική ή μεταβολική σταθερότητα καθότι: * Έχει μικρή Wan der Waals ακτίνα (1.35 Α) που μοιάζει πολύ με την ακτίνα του υδρογόνου (1.20 Α). * Η μεγάλη ηλεκτραρνητικότητά του ενισχύει τις ιδιότητες του μορίου. * Η αυξημένη σταθερότητα και η μεγαλύτερη ισχύς του δεσμού άνθρακα-φθορίου αναστέλλει τον μεταβολισμό με αποτέλεσμα την αύξηση του χρόνου ημιζωής του μορίου. * Αυξάνει το λιπόφιλο χαρακτήρα του μορίου διευκολύνοντας έτσι τη διαπερατότητα της διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. (23> S Η εισαγωγή ενός ατόμου θείου τόσο στον δακτύλιο του σακχάρου ενός νουκλεοσιδίου όσο και ως υποκαταστάτης κάποιου άνθρακα του δακτυλίου αλλάζει σημαντικά την συμπεριφορά της διαμόρφωσης του μορίου, τη χημική του δραστικότητα, τον μοριακό εντοπισμό του από πρωτεΐνες καθώς και τη μεταβολική του σταθερότητα. Η αντικατάσταση του οξυγόνου με θείο έχει διαπιστωθεί ότι προσδίδει ιδιαίτερες χημικές ιδιότητες στο μόριο και αλλάζει τη βιολογική δραστικότητα καθότι: 19

* Είναι μεγαλύτερο σαν άτομο από το οξυγόνο και πιο πολώσιμο. * Ο δεσμός άνθρακα-θείου είναι πιο μακρύς [C-S 1.82 A (0.182 nm) C-0 1.43 A (0.143 nm)], πιο ασθενής καθώς και λιγότερο πολικός από αυτόν του άνθρακαοξυγόνου. * Η γωνία C-S-C (95-100 ) είναι πιο έντονη από αυτή του C-0-C.(29) Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το 1-(2-δεοξυ-2-φθορο-/?-0- αραβινοφουρανόζυλο) νουκλεοσίδιο της κυτοσίνης (FAC) του οποίου η δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων αυξάνεται σημαντικά με την αντικατάσταση του ατόμου του οξυγόνου του δακτυλίου από ένα άτομο θείου, προκύπτοντας έτσι ένα νέο πιο δραστικό ανάλογο, το 1-(2-δεοξυ-2-φθορο-4-θείο-β-ϋ-αραβινοφουρανόζυλο) νουκλεοσίδιο της κυτοσίνης (4-thio-FAC)/2^ Εικόνα 15. 1-(2-δεοξυ-2-φθορο-4-θείο-β-0-αραβινοφουρανόζυλ) κυτοσίνη (4-thi.o-FAC)^ Επιπλέον, η εισαγωγή του ατόμου του θείου, όπως και του φθορίου, μεταβάλλει τη βιολογική δραστικότητα ενζύμων των κυττάρων, όπως κινασών και DNA πολυμερασών. Έρευνες έχουν δείξει ότι ανάμεσα σε ποικίλα ανάλογα νουκλεοσιδίων, τα 5-αλκυλοθειονουκλεοσίδια έχουν δράση μη ανταγωνιστικών αναστολέων της κυτταροπλασματικής κινάσης της θυμιδίνης (C-TK), του απαραίτητου προάγγελου στις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές/22'1 Βασιζόμενοι στα ανωτέρω στοιχεία, θεωρήθηκε πολύ σημαντική η σύνθεση μιας νέας τάξης φθοροθειονουκλεοσιδίων (εικόνα 14), συνδυάζοντας έτσι τη δράση των δύο ατόμων του φθορίου και του θείου. Η νέα τάξη των νουκλεοσιδίων αυτών θα έχει θυμίνη σαν ετεροκυκλική βάση, φθόριο στη θέση 3 του σακχάρου και θείο στη θέση 5. 20

ο Εικόνα 16. 1-(3-δεοξυ-3-φθορο-5-8-ακέτυλο-5-θειο-β-0-ξυλοφουρανόζυλ) Ουμίνη Μεθοδολογία σύνθεσης Ξεκινώντας με την ένωση 1,2: 5,6-Di-O-isopropylidene-a-D-glucofuranose 1, η οποία είναι εμπορικά διαθέσιμη, και ακολουθώντας τρεις διαδοχικές πορείες γίνεται η σύνθεση της 3-deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-a-D-glucofuranose 2. Στη συνέχεια η ένωση 2 οξειδώνεται και πραγματοποιείται αναγωγή της αλδεϋδης που προκύπτει δίνοντας την ένωση 3-deoxy-3-fluoro-l, 2-O-isopropylidene-a-D-xylofuranose 3. Σουλφονυλίωση της ένωσης 3 παρουσία toluene-p-sulphonyl chloride και πυριδίνης οδηγεί στο σχηματισμό της 3-deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-5-0-tosyl-a-D-xylofuranose 4, η οποία έχει μορφή λευκού στερεού. Μετά την προσθήκη potassium thioacetate στην διαλυμένη σε Λζ A-dimethylfbrmamide τοσυλιωμένη ένωση 4, προκύπτει το αντίστοιχο παράγωγο 3-deoxy-3-fluoro-l,2-0-isopropylidene-5-0-acetyl-5-deoxy-a-D-xylofuranose 5, το οποίο στο φάσμα υπερύθρου έχει μία χαρακτηριστική κορυφή απορρόφησης στα 1697 cm'1 (0-acetyl group). Η χαρακτηριστική αυτή κορυφή αποδεικνύει την ύπαρξη δακτυλίου πεντόζης και όχι εξόζης. Στη συνέχεια πραγματοποιείται ακετόλυση της ένωσης 5 και απευθείας ακετυλίωση του ενδιάμεσου προϊόντος που προκύπτει μετά την ακετόλυση. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη MeOH που διασπά τον οξικό ανυδρίτη δίνοντας έτσι την ένωση 3-deoxy-3-fluoro-l,2-Di-0-acetyl-5-»S -acetyl-5-deoxy-dxylofuranose 6. Ακολουθεί σύζευξη της 6 με τη βάση θυμίνη παρουσία του διαλύτη CH3CN, των hexamethyldisilazane και trimethylsilyl trifluoromethane-sulfonate η δράση των οποίων έγκειται στη σιλιλίωση της βάσης δίνοντας τελικά το φθοροθειονουκλεοσίδιο l-(3-deoxy-3-fluoro-5-0'-acetyl-5-thio- β-d- xylofuranosyl) thymine 7 όπως φαίνεται στο σχήμα 1. Στην ένωση 6, το ακετύλιο στη θέση Γ είναι ανωμερές, βρίσκεται είτε ως α- είτε ως β- ανωμερές. 21

h 3c Σχήμα, 1. Μεθοδολογία, σύνθεσης 22

3.ΣΥΝΘΕΣΗ ΦΘΟΡΟΘΕΙΟΝΟΥΚΛΕΟΣΙΛΙΩΝ 3.1 ΓΕΝΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1.1 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΧΑΡΤΟΥ (TLC: Thin Layer Chromatography) Οι αντιδράσεις ελέγχονται με χρωματογραφία χάρτου, με πλάκες Silica gel (Merck Kieseilel 60F250). Γενικά, τα χρωματογραφήματα εμφανίζονται με ψεκασμό με διάλυμα θειικού οξέος 30%. Τα συστήματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα Α: Οξικός αιθυλεστέρας / Εξάνιο 20 / 80 Διάλυμα Β: Οξικός αιθυλεστέρας / Εξάνιο 10/90 Διάλυμα Γ: Οξικός αιθυλεστέρας / Εξάνιο 80 / 20 3.1.2 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΑΗΣ Η χρωματογραφία στήλης, επιτεύχθηκε με την εισαγωγή αέρα υπό πίεση σε silica gel (Merck grade ) (flash chromatography) και οι διαλύτες έκλουσης που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι παρακάτω: Διάλυμα Α: Οξικός αιθυλεστέρας / Εξάνιο 20 / 80 Διάλυμα Β: Οξικός αιθυλεστέρας / Εξάνιο 10/90 Διάλυμα Γ: Οξικός αιθυλεστέρας / Εξάνιο 80 / 20 3.1.3 ΞΗΡΑΝΣΗ ΔΙΑΛΥΤΩΝ Χρησιμοποιούνται άνυδροι διαλύτες ακετονιτρίλιο (CH3CN), πυριδίνη και dimethylformamide (DMF). Η ξήρανση του CH3CN γίνεται παρουσία υδριδίου του ασβεστίου με reflux overnight. Στη συνέχεια γίνεται απόσταξη υπό άζωτο και το απόσταγμα συλλέγεται σε φιάλη με μοριακά κόσκινα 3Ά (molecular sieves). To DMF φυλάσσεται σε φιάλη με μοριακά κόσκινα 3Α, καθώς και η πυριδίνη σε σφαιρίδια ΚΟΗ (pellets). 3.1.4 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΩΣΕΩΝ Η ταυτοποίηση των ενώσεων που συντέθηκαν έγινε με τη χρήση φάσματος πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού NMR (Nuclear Magnetic Resonance) και μέσω του φάσματος υπερύθρου (IR). Τα φάσματα 1HNMR μετρήθηκαν με Bruker 250 MHz. To tetramethylsilan (TMS) χρησιμοποιήθηκε ως σημείο αναφοράς και η πολλαπλότητα των καμπύλων φαίνεται με s (single), d (double), t (triple), q (quadruple), m (multiple). Oi συχνότητες J μετρήθηκαν σε Hz. 23

4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Η ένωση 1,2: 5,6-Di-O-isopropylidene-a-D-glucofuranose 1 είναν εμπορικά διαθέσιμη και χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση της 3-deoxy-3-fluoro-l, 2-(9-isopropylidene-a-Dglucofuranose 2 ακολουθώντας τρεις διαδοχικές πορείες. Η σύνθεση της ένωσης 2 πραγματοποιήθηκε από την κ. Μαντά. 4.1 Σύνθεση 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-a-D-xylofuranose (3) (27) Ένα διάλυμα της διόλης 3-deoxy-3-fluoro-l, 2-O-isopropylidene-a-D-glucofuranose 2 (5.0 g, 22.5 mmol) με μεθανόλη (79 ml) και απιονισμένο νερό (79 ml), αναδεύεται σε θερμοκρασία δωματίου με NalCL (5.09 g, 23.8 mmol) συνοδευόμενο από τη δημιουργία ιζήματος του NalCL. Η αντίδραση ελέγχεται με TLC (πίνακας 1). Μετά από μία ώρα, προστίθεται μία σταγόνα ethylene glycol, η οποία κατακρημνίζει κάθε περιοδικό κατάλοιπο. Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται για μία επιπλέον ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με NaBTL (2.0 g, 52.3 ηιιηο1),ουδετεροποιείται με υδατικό διάλυμα NaHCCL, και στη συνέχεια εκχυλίζεται με EtOAc (4 x 500 ml). Η οργανική φάση πλένεται με NaHSCL, προστίθεται anhydrous NaSCL, το διάλυμα διηθείται και συμπυκνώνεται. Ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το Διάλυμα Α και το Διάλυμα Β. Η ένωση συλλέγετας συμπυκνώνεται και λαμβάνεται καθαρή η ένωση 3 (4.0 g) με τη μορφή λευκού στερεού. Η σύνθεση της 3 είχε απόδοση 92%. TLC (Διάλυμα A) Rf=0.3 Απόδοση 92% Πίνακας 1. Αποτελέσματα σύνθεσης της 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-a-D-xylofuranose 24

4.2 Σύνθεση 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-6Lisopropylidene-5-6Mosyl-a-D-xylofuranose (4 f8) Σε ένα διάλυμα της ένωσης 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-a-D-xylofuranose 3 (4.0 g, 20.7 mmol) με πυριδίνη (53.1 ml) προστίθεται toluene-p-sulphonyl chloride (5.2 g, 27.6 mmol) και το διάλυμα αναδεύεται σε θερμοκρασία δωματίου για ένα βράδυ. Ο έλεγχος της αντίδρασης γίνεται με TLC (πίνακας 2). Μετά την ουδετεροποίηση με NaHCCh και την εκχύλιση με EtOAc (4 x 500 ml), στην οργανική φάση προστίθεται anhydrous NaSCL, το διάλυμα διηθείται και συμπυκνώνεται. Ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το Διάλυμα Β. Η ένωση συλλέγεται, συμπυκνώνεται και λαμβάνεται καθαρή η ένωση 4 (5.37 g) ως λευκό στερεό. Η σύνθεση της 4 είχε απόδοση 75%. TLC (Διάλυμα B) Rf=0.2 Απόδοση 75% Πίνακας 2. Αποτελέσματα σύνθεσης της 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-5-0-tosyl-a-D-xylofiiranose 4.3 Σύνθεση 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropyIidene-5-A-acetyl-5-deoxy-a-D- xylofuranose (S)(26) 25

Διάλυμα της τοσυλιωμένης ένωσης 4 (5.37 g, 15.5 mmol) και potassium thioacetate (2.4 g, 21 mmol) με Α,Α-dimethylfbrmamide (59 ml) αναδεύεται στους 100 C για μία ώρα. Η αντίδραση ελέγχεται με TLC (πίνακας 3). Το μίγμα της αντίδρασης ουδετεροποιείται με υδατικό διάλυμα NaHCCb έτσι ώστε το ph να μην ξεπερνά την τιμή του 7. Στη συνέχεια το μίγμα συμπυκνώνεται κάτω από συνθήκες μεγάλου κενού έτσι ώστε να εξατμιστεί όλος ο διαλύτης (DMF). Στη συνέχεια γίνεται εκχύλιση. Η υδατική φάση πλένεται με EtOAc και η οργανική με Η20. Στην οργανική φάση προστίθεται anhydrous NaSC>4 και το διάλυμα διηθείται και συμπυκνώνεται. Πραγματοποιείται χρωματογραφία στήλης με το Διάλυμα Β, δίνοντας καθαρή την ένωση 5 (3.3 g) με τη μορφή κίτρινου σιροπιού. Η σύνθεση της 5 είχε απόδοση 86%. TLC (Διάλυμα Β) Rf=0.3 Απόδοση 86% Πίνακας 3. Αποτελέσματα σύνθεσης της 3-Deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-5-.S,-acetyl-5-deoxy-a-D-xy]ofuranosc 4.4 Σύνθεση 3-deoxy-3-fluoro-l,2-Di-0-acetyl-5-A-acetyl-5-deoxy-D-xylofuranose (6f0) Διάλυμα της ένωσης 5 (3.3 g, 13.3 mmol) σε οξικό ανυδρίτη - οξικό οξύ - θειϊκό οξύ (57 ml, 70:30:1, ν/ν) αφήνεται σε ανάδευση για διάρκεια τριών ημερών. Η αντίδραση ελέγχεται με TLC (πίνακας 4). Μετά το πέρας των τριών ημερών, αιθέρας προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης, συνοδευόμενος από sodium acetate. Το διάλυμα φιλτράρεται και συμπυκνώνεται παρουσία toluene. Ακολουθεί χρωματογραφία στήλης με το Διάλυμα Α και το Διάλυμα Β. Η ένωση συλλέγετας συμπυκνώνεται και λαμβάνεται καθαρή η 3- deoxy-3-fluoro-l,2-di-(9-acetyl-5-0-acetyl-5-deoxy-d-xylofuranose 6 (2.9 g) ως λευκοί κρύσταλλοι. Η σύνθεση της 6 είχε απόδοση 75%. 26

TLC (Διάλυμα A) Rr=0.3 Απόδοση 75% Πίνακας 4. Αποτελέσματα σύνθεσης της 3-deoxv-3 -fluoro-1,2-di-0-acetyl-5 -.S'-acetyl-5 -deoxy-d-xylofuranosc 4.5 l-(3-deoxy-3-fluoro-5-a-acetyi-5-thio- β-d- xylofuranosyl) thymine (7) OAc CH3CN, hexamethyldisilazane, saccharine. AcS, trimethylsilyl trifluoromethane-sulfonate OAc 6 7 Ένα διάλυμα της θυμίνης (1.75 g, 13.86 mmol), του hexamethyldisilazane (3.6 ml, 17.1 mmol) και της saccharine (0.117 g, 0.46 mmol) σε CH3CN (48 ml) αναδεύεται για 20 λεπτά στους 120 C και αφότου γίνει διαυγές προστίθεται η 3-deoxy-3-fluoro-l,2-Di-0- acetyl-5-0 -acetyl-5-deoxy-d-xylofuranose 6 (2.9 g, 9.9 mmol) και το trimethylsilyl trifluoromethane-sulfonate (2.5 ml, 13.9 mmol). Η αντίδραση ολοκληρώνεατι στις 2 ώρες στους 80 C. Ο έλεγχος της αντίδρασης γίνεται με TLC (πίνακας 5). Στη συνέχεια γίνεται εκχύλιση. Η υδατική φάση πλένεται με EtOAc (1000 ml) και η οργανική με NaHCCL και Η20. Στην οργανική φάση προστίθεται anhydrous NaSCL και το διάλυμα διηθείται και συμπυκνώνεται. Πραγματοποιείται χρωματογραφία στήλης με το Διάλυμα Γ, δίνοντας καθαρή την ένωση 7 (1 g). Η σύνθεση της 7 είχε απόδοση 30%. Η ταυτοποίηση της ένωσης έγινε μέσω του φάσματος πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). (βλέπε σελ.) TLC (Διάλυμα Γ) Rf=0.35 Απόδοση 30% Πίνακας 5. Αποτελέσματα σύνθεσης της 1 -(3 -deoxy-3-fluoro-5-5 -acetvl-5 -thio- β-d- xylofuranosyl) thymine 27

5. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ME NMR ::*4-3 MW*\ f ^ ::#»?? :: :;wr guff san?.r im>~.v mmm'f'-r mtp i iwf.. mu- - mz*... M)6P WM f - 6ms ;&m... smv, r tm - i Me wm$ - ipm., tu0'9 6Wi mm. iii. t'mo miwv W/7 2/^7 mrr Mil mr «9 /ω%>ί7 28

6. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ME IR 29

7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας νέας τάξης φθοροθειονουκλεοσιδίων με πιθανή αντιική και αντικαρκινική δράση. Παρατηρήθηκε ότι με μια σχετικά εύκολη πειραματική διαδικασία με μικρά και σύντομα βήματα, είναι δυνατή η σύνθεση των φθορο-θειονουκλεοσιδίων. Οι τελικές αποδόσεις της σύνθεσης του τελικού φθορο-θειονουκλεοσιδίου είναι αρκετά καλές. Συγκεκριμένα, η σύνθεση της 3- deoxy-3-fluoro-l, 2-O-isopropylidene-a-D-xylofuranose 3 είχε απόδοση 92%, της 3- deoxy-3-fluoro-l, 2-0-isopropylidene-5-0-tosyl-a-D-xylofuranose 4 είχε απόδοση 75%, της 3-deoxy-3-fluoro-l,2-0-isopropylidene-5-0'-acetyl-5-deoxy-a-D-xylofuranose 5 είχε απόδοση 86%, της 3-deoxy-3-fluoro-l,2-Di-(9-acetyl-5-0'-acetyl-5-deoxy-D-xylofuranose 6 είχε απόδοση 75% και της l-(3-deoxy-3-fluoro-5-ls'-acetyl-5-thio- β-d- xylofuranosyl) thymine 7 είχε απόδοση 30%. Η ταυτοποίηση των παραπάνω ενώσεων έγινε μέσω του φάσματος πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), ενώ του τελικού προϊόντος έγινε και μέσω του φάσματος υπερύθρου. Η σύνθεση και η αξιολόγηση της βιολογικής δράσης των τροποποιημένων νουκλεοσιδίων με θυμίνη για ετεροκυκλική βάση, φθόριο στη θέση 3' του σακχάρου και θείο στη θέση 5' είναι σημαντική. Βρέθηκε ότι τα τροποποιημένα νουκλεοσίδια παίρνουν μέρος στην αντιμετώπιση και θεραπεία ασθενειών με τη δράση τους ως αντιικά και αντικαρκινικά φάρμακα. Τα φθορο-θειονουκλεοσίδια χρησιμοποιούνται στη φαρμακολογία ως αντιογκογονικά φάρμακα. Η ικανότητα αντικατάστασης του υδρογόνου με το φθόριο αλλάζει ελάχιστα τη λειτουργία του νουκλεοσιδίου. Το μέγεθος των δύο ατόμων είναι συγκρίσιμο, έχει μικρή Wan der Waals ακτίνα (1.35 Α) όμοια με την ακτίνα του υδρογόνου (1.20 Α). το φθόριο είναι πιο ηλεκτραρνητικό και η σταθερότητα του δεσμού C-F σε σύγκριση με το δεσμό C-H είναι μεγαλύτερη. Αυξάνει το λιπόφιλο χαρακτήρα του μορίου και διευκολύνει έτσι τη διέλευση από τις κυτταρικές μεμβράνες και την αντιμετώπιση ενδοεγκεφαλικών όγκων. Επιπλέον, έχει μεγάλο χρόνο ημιζωής και έτσι μεγαλύτερο χρόνο δράσης σε σχέση με άλλα ανάλογα νουκλεοσιδίων. Η εισαγωγή του θείου τόσο στον δακτύλιο του σακχάρου όσο και ως υποκαταστάτης κάποιου άνθρακα του δακτυλίου αυξάνει σημαντικά την δραστικότητα των νουκλεοσιδίων. Όπως και το φθόριο, έτσι και το θείο μεταβάλλει τη βιολογική 30

δραστικότητα ενζύμων των κυττάρων, όπως κινασών και DNA πολυμερασών, μειώνοντας το βαθμό στον οποίο τα νουκλεοσίδια αυτά χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα για τις ανθρώπινες κινάσες και πολυμεράσες. Ένα πετυχημένο αντιικό φάρμακο πρέπει να δρα με τέτοιο τρόπο με τον οποίο να καταστέλλει την αντιγραφή του ιού στο κύτταρο. Επιπλέον, να μην είναι τοξικό ή καρκινογόνο, να μην προκαλεί αλλεργίες, τερατογένεση και μεταλλάξεις. Η ανακάλυψη των αντιικών φαρμάκων έφερε εις πέρας τη θεραπεία πολλών ασθενειών. Ωστόσο, η χρήση τους μπορεί να έχει δυσμενή αποτελέσματα. Ένα μεγάλο μέρος της τοξικότητας των ανάλογων νουκλεοσιδίων, συσχετίζεται άμεσα με το βαθμό στον οποίο οι ενώσεις αυτές χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα για τις ανθρώπινες κινάσες και πολυμεράσες. Μερικοί από τους πρώτους αντιικούς παράγοντες χαρακτηρίστηκαν από ακραία φαινόμενα εμφάνισης τοξικότητας, και χρησιμοποιούνται αυτή την περίοδο μόνο τοπικά. Τα περισσότερα νουκλεοσίδια που χρησιμοποιούνται, παρουσιάζουν ήπια συμπτώματα όπως ναυτία, διάρροια, ίλιγγο, υπνηλία. Υπάρχει μια πιθανότητα τα ανάλογα νουκλεοσιδίων να μπορούν να ενσωματωθούν στο ανθρώπινο DNA, ή να εξασθενίσουν τη φυσιολογική αντιγραφή του DNA, γι αυτό πολλές από αυτές τις ενώσεις είναι πιθανό να προκαλέσουν καρκινογόνα αποτελέσματα. Στα νέα φθορο-θειονουκλεοσίδια πρέπει να γίνουν εντατικές βιολογικές μελέτες για τον προσδιορισμό της πιθανής αντιικής και αντιογκογονικής τους δράσης. Θα πρέπει επίσης να εξεταστούν για τη δυνατότητά τους να παρακινήσουν ανοσοαπάντηση με παρακολούθηση της ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων, των μακροφάγων και της έκκρισης των κυτοκινών. Τα φάρμακα βελτιώνουν την ποιότητα ζωής εκατομμυρίων ανθρώπων και προλαμβάνουν την ασθένεια στην παγκόσμια κλίμακα. Υπολογίζεται ότι τα φάρμακα έχουν προσθέσει 3-5 χρόνια στο μέσο όριο του προσδόκιμου ορίου επιβίωσης και έχουν επιφέρει την επανάσταση στη θεραπεία πολλών διαφορετικών νόσων. Όμως, οι σύγχρονοι φαρμακολόγοι αντιμετωπίζουν την επίκτητη ανάγκη εύρεσης νέων φαρμάκων για τη θεραπεία ασθενειών που θέτουν σε μεγάλο κίνδυνο την υγεία, όπως ο καρκίνος. Επιπλέον, αν και υπάρχουν αποτελεσματικά θεραπευτικά μέσα για ορισμένους μολυσματικούς οργανισμούς, η ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών είναι διαρκής. Επομένως, είναι και διαρκής η ανάγκη για την ανάπτυξη αποτελεσματικότερων φαρμάκων έναντι των λοιμώξεων. Η σύνθεση και βιολογική αποτίμηση μιας νέας τάξης φθορο-θειονουκλεοσιδίων είναι πιθανόν να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων εξειδικευμένων θεραπευτικών ενώσεων. 31

8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Vander, Μ. D. Sherman, Ph. D. Luciano, Ph. D. M. Tsakoulos, Φυσιολογία του ανθρώπου, μηχανισμοί λειτουργίας του οργανισμού 2. Page, Curtis, Sutter, Walker, Hoffman, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης,1997 : 4,26 3. Μ. C. Τ. Hartman, J. Κ. Coward, J. Am. Chem. Soc., 2001, 124, 10036 4. Wen Zhou, Giuseppe Gumina, Youhoon Chong, Jianing Wang, Raymond F, Schinazi, and Chung K. Chu, Synthesiw, Structure- Activity Relationships, and Drug Resistance of 3-D-3-Fluoro-2,3-Unsaturated Nucleosides as Anti-HIV Agents, Med. Chem., 2004, 47(13), 3399-3408. 5. http://www.hafreeclinics. org/drugs/index.html 6. http://www.idenix.com/science/sci_nucleosides. html 7. http://www.mpcfaculty.net/ron_rinehart/30b/na24/basetabl.html 8. Chong Y, Gumina G, Mathew JS, Schinazi RF, Chu CK, l-2,3-didehydro-2,3- dideoxy-3-fluoronucleosides: synthesis, anti-hiv activity, chemical and enzymatic stability, and mechanism of resistance, Med Chem. 2003 Jul 17;46(15):3245-56. 9. Lubert Stryer, Βιοχημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 1997: 347-354. 10. John McMurry, Οργανική Χημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2000 :151-152, 905. 11. John Μ. Clark, Jr and Robert L. Switzer, Πειραματική βιοχημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 1992. 12. Benjamin Lewin, Genes VIII: 6-8. 13. Christopher J. Burns, Human Immunodeficiency Virus (HIV) and Hepatitis C Virus (HCV), Current Medicinal Chemistry - Anti-Infective Agents, Vol. 4, No. 2, 2005. 14. http://www.answers.com/topic/zidovudine-1 15. http://www.answers.com/topic/zidovudine?hl:=zidovudine 16. http://www.pathmicro.med.sc.edu/lecture/chemo.html 17. http'.//'www.answers.com/topic/lamivudine 18. http://www,answers.com/topic/ddi 19. http://www.answers.com/topic/ddc 32

20. Christophe Thibaudeau, Janez Plavec, and Jyoti Chattopadhyaya, A New Generalized Karplus-Type Equqtion Relating Vicinal Proton-Fluorine Coupling Constants to H-C- C-F Torsion Angles, J. Org. Chem. 1998, 63, 4967-4982. 21. www.kcom.edu/...avebsite/lects/interfer.html. 22. Kyeong Lee, Yongseok Choi, Elizabeth Gullen, Susan Schlueter-Wirtz, Raymond F. Schinazi, Yung-Chi Cheng, and Chung K. Chu, Synthesis and Anti-HIV and Anti- HBV Activities of 2-Fluoro-2,3-unsaturated L-Nucleosides, J. Med. Chem., 1999, 42(7), 1320-1328. 23. Najim A. Al-Masoudi, Synthesis of 3-Deoxy-5-s-ethyl-5-thio-p-D-erythropentofuranosylthymine as Potential Antitumor Agent, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 4795-4796. 24. Miura, S. ; Yoshimura, Y. ; Endo, M. ; Machida, H. ; Matsuda, A. ; Tanaka, M. ; Sasaki, T., Antitumor activity of a novel orally effective nucleoside, l-(2-deoxy-2- fhioro-4-thio-p-d-arabinofuranosyl)cytosine, Cancer Lett. 1998, 129, 103-110. 25. Harada, K. ; Matulic-Adamic, J. ; Price, R.W.; Schinazi, R.F.; Watanabe, K.A.; Fox, J.J., Nucleosides. 139. Synthesis and Anticytomegalovirus and Antiherpes Simplex Virus Activity of 5-Modified Analogues of 2-Fluoroarabinosylpyrimidine Nucleosides, J. Med. Chem. 1987, 30, 226-229. 26. Hughes. A. N. ; Munkombwe Μ. N., Synthesis of 5-thio-D-arabinose and 5-thio-Dlyxose and their methyl glycopyranosides, Carbohydr. Res. 1985,136, 397-409. 27. Albrecht P. H.; Gordon H. J. ; Moffatt G. J., A general synthesis of isosteric phosphonate analogs of nucleoside 3-phosphates, Tetrahedron, 1984, 40, 79-85. 28. Foster B. A. ; Hems R. ; Webber M. J., Fluoronated Carbohydrates, Carbohydr. Res. 1967,5,292-301. 29. Jose G. Fernandez-Bolanos ; Najim A. Al-Masoudi; Ines Maya, Sugar Derivatives Having Sulfur in the Ring, Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry, Vol 57 30. Chung- Wai Chiu ; Roy L. Whistler, An alternative synthesis of 5-thio-D-glucose pentaacetate, J. Org. Chem. 1973, 38, 832-834. 33