ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΡΥΘΜΟΥ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΒΙΟΣΤΑΤΙΚΩΝ ΠΟΛΥΜΕΡΩΝ ΑΠΟ ΥΜΕΝΙΑ PMMA ΜΕ ΧΡΗΣΗ UV-VISIBLE ΚΑΙ SERS Γ. Μαθιουδάκης Τμήμα Χημείας,Πανεπιστήμιο Πατρών, GR-26500 Ρίο Πάτρας ΙΤΕ / ΙΕΧΜΗ, GR-265 04, Ρίο Πάτρας Soto Beobide, Γ. Α.Βογιατζής ΙΤΕ / ΙΕΧΜΗ, GR-265 04, Ρίο Πάτρας ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα εργασία είναι μια προσπάθεια για την παρακολούθηση του ρυθμού αποδέσμευσης βιοστατικών πολυμερών από πολυμερικά υμένια με την τεχνική SERS και η σύγκριση των αντίστοιχων αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από μία παραδοσιακή και πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική στην ποσοτική ανάλυση, όπως η απορρόφηση υπεριώδους ορατού (UV-Visιble). Στο πλαίσιο αυτό, βιοστατικά πολυμερή [δηλ PSSAmC16, PVBCHAM και P(SSAmC16-co-VBCHAM25)..], έχουν ενσωματωθεί σε πολυμερική μήτρα από πολυ (μεθακρυλικός μεθύλεστέρας), PMMA, και γίνεται η προσπάθεια προσδιορισμού του ρυθμού αποδέσμευσης των επιμέρους βιοστατικών πολυμερών. Αυτά τα υμένια είναι νέα πολυμερικά υλικά με βελτιωμένες και ελεγχόμενες αντιρρυπαντικές ιδιότητες, και είναι πολύ υποσχόμενα για νέες εφαρμογές στον τομέα των «καθαρών» επιφανειών, για λόγους υγιεινής ή εναλλακτικά ως υφαλοχρώματα για την αντιμετώπιση κρίσιμών οικολογικών και περιβαλλοντικών προβλημάτων σε θαλάσσιες εφαρμογές. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο όρος βιοστατικό αναφέρεται σε μια ουσία που δρα κυρίως αναστέλλοντας την ανάπτυξη μικροοργανισμών με επιβλαβείς συνέπειες, όχι μόνο για την ανθρώπινη υγεία, αλλά και στην ποιότητα των διαφόρων προϊόντων. Ο σχεδιασμός των νέων φιλικών προς το περιβάλλον ή περιβαλλοντικά αποδεκτά βιοστατικών πολυμερών αποτελούν μια πολύ εντατική βασική έρευνα πεδίου. Αυτή η έρευνα σχετίζεται με τις σύγχρονες τεχνολογικές απαιτήσεις, όπως για παράδειγμα την ανάπτυξη «καθαρών» επιφανειών για ευαίσθητες εφαρμογές σε είδη υγιεινής ή εναλλακτικά σε υφαλοχρώματα ώστε να αντιμετωπίζονται κρίσιμα οικολογικά και περιβαλλοντικά προβλήματα σε θαλάσσιες εφαρμογές. Ένα πεδίο εφαρμογής αυτών των υλικών είναι η υδατοκαλλιέργεια και κυρίως οι θαλάσσιες τεχνολογίες. Σε αυτές τις περιπτώσεις, το πρόβλημα που πρέπει να αντιμετωπιστεί είναι η θαλάσσια βιορύπανση, δηλαδή η συσσώρευση και η προσκόλληση των μικροοργανισμών, όπως στρείδια, σκουλήκια και φύκια, σε μια επιφάνεια που είναι σε επαφή με το νερό για μεγάλο χρονικό διάστημα. Έτσι, εκτεταμένη έρευνα διεξάγεται σε αυτό το τομέα, σχετικά με τα δίχτυα με βιοστατικές ιδιότητες (κυρίως στην περίπτωση της υδατοκαλλιέργειας) ή σε βαφές για βυθισμένες επιφάνειες των σκαφών (αντιρρυπαντικές βαφές). Στην παρούσα εργασία, γίνεται προσδιορισμός του ρυθμού αποδέσμευσης των βιοστατικών πολυμερών από πολυμερικές μήτρες με χρήση φασματοσκοπικών τεχνικών ακτινοβολίας υπεριώδους-ορατού (UV-Visible) και Raman. Η φασματοσκοπία Raman θεωρείται αξιόπιστη μέθοδος χαρακτηρισμού της μοριακής δομής της ύλης, εξαγωγής ποσοτικών μετρήσεων και ως ένα εργαλείο ανίχνευσης, ωστόσο το φαινόμενο Raman είναι αρκετά ασθενές καθιστώντας τα όρια ανίχνευσης της τεχνικής ιδιαίτερα χαμηλά. Η τεχνική SERS αυξάνει την ενεργό διατομή του φαινομένου κατά πολλές τάξεις μεγέθους και επομένως βελτιώνει αντίστοιχα και τα όρια ανίχνευσης της τεχνικής. Προϋπόθεση εμφάνισης του φαινομένου SERS είναι η γειτνίαση της εξεταζόμενης ουσίας με νανοσωματίδια αργύρου (Ag) ή χρυσού (Au). Τα νανοσωματίδια αυτά χρησιμοποιούνται είτε υπό μορφή κολλοειδών διαλυμάτων, είτε υπό την μορφή νανοδομημένων επιφανειών.[1,2] Σε αυτή η μελέτη γίνεται χρήση της τεχνικής SERS και UV-Vis μέσω ανάπτυξης ποσοτικής μεθοδολογίας για μελέτη του ρυθμού αποδέσμευσης [3] ενός βιοστατικού πολυμερούς από μία πολυμερική μήτρα. Αυτά τα υμένια είναι νέα πολυμερικά υλικά με βελτιωμένες και ελεγχόμενες αντιρρυπαντικές ιδιότητες, τα οποία επρόκειτο να χρησιμοποιηθούν για εφαρμογές στον τομέα των «καθαρών» επιφανειών, είτε για λόγους υγείας είτε ως αντιρύπανση. Πιο συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν υμένια από πολυμερική μήτρα PMMA με διάφορα βιοστατικά πολυμερή οπώς στυρενοσουλφονικό τριμεθυλοδεκαεξυλαμμώνιο (PSSAmC16), βρωμιούχο βινυλοβένζυλο διμεθυλοδεκαεξυλαμμώνιο (PVBCHAM) και P(SSAmC16-co-VBCHAM25). Σε αυτά τα υμένια μελετήθηκε ο ρυθμός αποδεσμευσης των βιοστατικών πολυμερών.
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σαν μήτρα χρησιμοποιούμε το PMMA και σαν μέσον πληρώσεως χρησιμοποιούμε τα βιοστατικά πολυμερή PSSAmC16, PVBCHAM και P(SSAmC16-co-VBCHAM25). Οι χημικές δομές φαίνονται στο Σχήμα 1και η σύσταση των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 που ακολουθεί. Πολυμερικά υμένια PMMA με ενσωματωμένα βιοστατικά πολυμερή παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της εξάτμισης του διαλύτη (film-casting). Πιο συγκεκριμένα, 0.27 g πολυμερούς PMMA υπό μορφή σκόνης και 0.03 g βιοστατικού πολυμερούς υπό μορφή σκόνης διαλύθηκαν σε διμεθυλακεταμίδιο (DMA) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία 80 o C. Στη συνέχεια, το διάλυμα μεταφέρθηκε σε τριβλιο από Pyrex, τοποθετήθηκε σε φούρνο με θερμοκρασία 80 o C και αφέθηκε να εξατμιστεί ο διαλύτης για 24h. Ύστερα ακολούθησε ξήρανση σε φούρνο κενού σε θερμοκρασία 80 o C. Προκύψανε δοκίμια πάχους ~100-120 μm. Για τη μελέτη του ρυθμού αποδέσμευσης, δοκίμια βάρους 80 mg εμβαπτίστηκαν σε 10 ml αποδεσμευοντος μέσου. Στην περίπτωση που η συνολική ποσότητα του ενεργού παράγοντα αποδεσμευόταν από τα υμένια στο αποδεσμεύον μέσο, θα προέκυπτε διάλυμα με συγκέντρωση 1 mg/ml. Οι μετρήσεις των φασμάτων απορρόφησης UV-Vis πραγματοποιήθηκαν με την απομάκρυνση 2 ml από το διάλυμα και στη συνέχεια, μετά την καταγραφή του φάσματος με μετάγγιση της ποσότητας αυτής πίσω στη φιάλη. Για τη μελέτη της αποδέσμευσης με την τεχνική του SERS, ποσότητες των 100 μl από το διάλυμα αφαιρούνταν χωρίς να είναι δυνατή η επιστροφή τους στη φιάλη. Σχήμα 1. Χημική δομή πολυμερικής μήτρας και βιοστατικών πολυμερών που χρησιμοποιήθηκαν για τα υμένια. Πίνακας 1.Σύσταση πολυμερικών υμενίων Υμένια Ποσοστά 1. PMMA 100 2. PMMA / PSSAmC 16 90/10 3. PMMA / PVBCHAM 90/10 4. PMMA / P(SSAmC16-co-VBCHAM25) 90/10
Τα αποτελέσματα της μελέτης αποδέσμευσης μέσω UV-Vis σε αιθανόλη 50% παρουσιάζονται παρακάτω. PMMA 1 Day Σχήμα 2. Φάσματα απορρόφησης UV-Vis για το PMMA/PSSAmC16 σε EtOH 50% και η χημική δομή του PMMA. PMMA / PSSAmC16 PMMA / PVBCHAM PMMA 8d PMMA 8days Σχήμα 3. Φάσματα απορρόφησης UV-Vis για το PMMA/PSSAmC16 και PMMA/PVBCHAM σε EtOH 50%. PMMA / P(SSAmC16-co-VBCHAM25) 5 hour PMMA 8 days 250 300 350 Σχήμα 4. Φάσματα απορρόφησης UV-Vis για το PMMA/P(SSAmC16-co-VBCHAM25) σε EtOH 50%. Στο σχήμα 2 παρουσιάζονται φάσματα UV-Vis του υμενίου που περιέχει σκέτο PMMA. Παρατηρούμε μια ασθενή απορρόφηση λόγω του ακρυλικού της μήτρας που παραμένει σταθερή με το πέρασμα του χρόνου. Αντίστοιχη εικόνα έχουμε και στα φάσματα του υμενίου PMMA / VBCHAM (Σχήμα 3). Σε αυτό το φάσμα απορρόφησης η απελευθέρωση του VBCHAM είναι αμελητέα ή/και η ευαισθησία αυτής της τεχνικής είναι αρκετά ασθενής ώστε να ανταποκριθεί στην αποδέσμευση. Αντιθέτως στα φάσματα UV-vis απορρόφησης, για τα υμένια PMMA/PSSAmC16 παρατηρείται σταδιακή αύξηση της ζώνης απορρόφησης στους ~260 nm με τον χρόνο. Πιο συγκεκριμένα, μετά από 8 μέρες η τιμή της
απορρόφηση είναι ~0.5 (Σχήμα 3) στους ~260nm, στο ίδιο σχήμα απεικονίζεται και η απορρόφηση της μήτρας PMMA στις 8 μέρες για σύγκριση. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η βιοστατική ομάδα PSSAmC16 εμφανίζει μία ζώνη απορρόφησης στα 250-280 nm. Μετά από την αφαίρεση της έντασης απορρόφησης της μήτρας (για 8 ημέρες) από την ένταση απορρόφησης του φάσματος του υμενίου PMMA/PSSAmC16, η ένταση της ζώνης απορρόφηση ~ 260 nm έχει απορρόφηση 0.2, που με βάση την καμπύλη βαθμονόμησης του PSSAmC16 (Σχήμα 5) προσδιορίζουμε την συγκέντρωση PSSAmC16 που έχει αποδεσμευτεί. Αυτή είναι 0.2mg/mL PSSAmC16.Η καμπύλη βαθμονόμηση (δεν παρουσιάζεται εδώ) έχει προκύψει από πρότυπα διαλύματα PSSAmC16 με γνωστή συγκέντρωση. Τέλος, στα UV-vis φάσματα του υμενίου PMMA / P(SSAmC16-co-VBCHAM25) παρατηρούμε υψηλές τιμές απορρόφησης στους ~260 nm σε πολύ χαμηλούς χρόνους. Οι κορυφές στα ~260nm αντιστοιχούν στην απορρόφηση του βιοστατικού πολυμερούς P(SSAmC16-co-VBCHAM25) από την μήτρα. Οι ψηλές απορροφήσεις είναι κάτι που αναμέναμε. Κατά την παρασκευή του συγκεκριμένου υμενίου παρατηρήσαμε ότι λόγο της κακής διάλυσης του P(SSAmC16-co-VBCHAM25) στο DMA η ποιότητα του υμενίου ήταν κακή και το βιοστατικό υποχωρεί από την μήτρα μόλις γίνει η εμβάπτιση του για αποδέσμευση. Επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε την αποδέσμευση του βιοστατικού πολυμερούς από την μήτρα και με την τεχνική Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Φάσματα SERS των υμενίων PMMA / βιοστατικό πολυμερές παρουσιάζονται στο σχήμα 6, επίσης παρουσιάζονται φάσματα SERS από τον περιβάλλον αποδέσμευσης των υμενίων, αιθανόλη 50%, και από την πολυμερική μήτρα για σύγκριση. Η κορυφή που βλέπουμε στο φάσμα του υμενίου PMMA / PSSAmC16 στους 2840 cm -1 οφείλετε στην βιοστατική ομάδα του PSSAmC16, το βρωμιούχο δεκαεξυλτριμεθυλαμμώνιο (CTAB) και πιο συγκεκριμένα στην δόνηση v(ch2). Αυτό πιστοποιείται από την καμπύλη βαθμονόμησης του CTAB που παρουσιάζεται στο σχήμα 6 (δεξιά). Τα φάσματα SERS που βλέπουμε για τα υπόλοιπα υμένια παρουσιάζουν πολύ μικρότερη κορυφή στα 2840 cm -1. Η αποδέσμευση του PVBCHAM είναι μικρότερη και βρίσκεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από UV-vis. 1.5 1.0 0.5 PMMA / PSSAmC16 22 hours 2 0,9 0,8 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 0.0 PMMA 8d 250 300 350 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 C PSSAmC16 (mg/ml) Σχήμα 5. Φάσματα απορρόφησης UV-Vis για το PMMA / PSSAmC16 και καμπύλη βαθμονόμησης (UV-vis) για το PSSAmC16. Με την καμπύλη βαθμονόμησης SERS που έχει προκύψει από φάσματα SERS για το CTAB (διαλυτό στο TDW) και παρουσιάζεται στο σχήμα 6, μπορούμε να προσδιορίσουμε την ακριβή συγκέντρωση του βιοστατικού πολυμερούς που έχει αποδεσμευτεί από την μήτρα. Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι η τεχνική UV-Vis σε συνδυασμό με την τεχνική SERS μπορούν να βοηθήσουν στην μελέτη αποδέσμευσης. Μπορούν να μας προσδιορίσουν το ρυθμό αποδέσμευσης και την ακριβή τιμή της συγκέντρωσης βιοστατικού πολυμερούς που αποδεσμεύεται από την μήτρα με μεγαλύτερη ευαισθησία της τεχνικής SERS. Η τεχνική SERS έχει αποδειχθεί ως μία ευαίσθητη μέθοδος για την ποσοτική παρακολούθηση της αποδέσμευσης βιοστατικών πολυμερών.
4500 4000 Relative Intensity 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Raman Shift, cm -1 PMMA/PSSAm PMMA/PVBCHAM PMMA EtOH 50% * 0.025 Σχήμα 6. Φάσματα SERS από το περιβάλλον αποδέσμευσης των υμενία κατά την 4 η μέρα πειράματος και καμπύλη βαθμονόμησης CTAB (biocide group of PSSAmC16). Relative Intensity 1500 2000 2500 3000 Raman Shift, cm -1 1mg/mL mg/ml 0,1 mg/ml 25 g/ml 10 g/ml 5 g/ml 1 g/ml ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Lee P.C. and Meisel D., Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols J. Phys. Chem. 86: 3391-3395 (1982). [2] Manikas A.C., Soto Beobide A. and Voyiatzis G.A., Quantitative analysis by Surface Enhanced Raman Scattering utilizing an oscillating-cell and right angle collection geometry Analyst 134: 587 592 (2009). [3] Anastasopoulos J.A., Soto Beobide A., Voyiatzis G.A., Quantitative Surface Enhanced Raman Scattering measurements at the early stage of active agent release processes J. Raman Spectrosc., 44: 401-405 (2013).